Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forutsi gensletting gjennom spatiotemporal kontroll av siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55803
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Summary

Vi presenterer en romanmetode som bruker fotobesvarende blokk-kopolymerer for effektivere spatiotemporal kontroll av genavstenging uten detekterbare off-target-effekter. I tillegg kan forandringer i genuttrykk forutsies ved bruk av enkle siRNA-frigivelsesanalyser og enkel kinetisk modellering.

Abstract

Nye materialer og metoder er nødvendig for bedre å kontrollere bindingen vs. frigjøring av nukleinsyrer til et bredt spekter av applikasjoner som krever nøyaktig regulering av genaktivitet. Spesielt vil nye stimuli-responsive materialer med forbedret spatiotemporal kontroll over genuttrykk oppheve oversettbare plattformer i narkotikaforskning og regenerativ medisinteknologi. Videre vil en forbedret evne til å kontrollere nukleinsyrefrigivelse fra materialer muliggjøre utvikling av strømlinjeformede metoder for å forutsi nanokarrieres effektivitet a priori , noe som fører til fremskyndet screening av leveringsfordeler. Her presenterer vi en protokoll for å forutsi genlydingseffektivitet og oppnå spatiotemporal kontroll over genuttrykk gjennom et modulært fotoresvarende nanocarrier-system. Små interfererende RNA (siRNA) komplekseres med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoksy) -2-nitrobenzylmetakrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tilRm stabile nanocarriers som kan styres med lys for å lette avstembar, on / off siRNA release. Vi skisserer to komplementære analyser som benytter fluorescenskorrelasjonsspektroskopi og gelelektroforese for nøyaktig kvantifisering av siRNA-frigjøring fra løsninger som imiterer intracellulære miljøer. Informasjon som er oppnådd fra disse analysene, ble innlemmet i en enkel RNA-interferens (RNAi) kinetisk modell for å forutsi de dynamiske tyderingsresponsene på forskjellige fotostimulusforhold. I sin tur tillater disse optimaliserte bestrålingsbetingelsene forfining av en ny protokoll for spatiotemporalt kontrollerende genavstenging. Denne metoden kan generere cellulære mønstre i genuttrykk med celle til celleoppløsning og ingen påviselige off-target-effekter. Samlet sett tilbyr vår tilnærming en brukervennlig metode for å forutsi dynamiske endringer i genuttrykk og nøyaktig kontroll av siRNA-aktivitet i rom og tid. Dette sett av analyser kan lett tilpasses for å teste et bredt utvalg av otHennes stimuli-responsive systemer for å møte viktige utfordringer som er relevante for en rekke bruksområder innen biomedisinsk forskning og medisin.

Introduction

Små interfererende RNAer (siRNAer) medierer post-transkripsjonalt gen silencing gjennom en katalytisk RNAi-vei som er svært spesifikk, kraftig og skikkelig for nesten ethvert målgen 1 . Disse lovende egenskapene har gjort det mulig for siRNA-terapeutika å utvikle seg i humane kliniske studier for behandling av mange sykdommer, inkludert metastatisk melanom og hemofili 2 , 3 . Men betydelige leveringsproblemer vedvarer som har hindret oversettelse 4 . Spesielt må transportmidler forbli stabile og beskytte siRNAer mot ekstracellulær nedbrytning, men frigjør også nyttelasten i cytoplasma 5 . Videre krever mange RNAi-applikasjoner forbedrede metoder for å regulere genavstenging i rom og tid 6 , som vil redusere bivirkninger i siRNA-terapeutikk 7 og muliggjøre transformativ aDvanser i applikasjoner som spenner fra cellemikroarrays for legemiddelforskning 8 til modulering av celleresponser i regenerative stillaser 9 . Disse utfordringene markerer behovet for nye materialer og metoder for bedre å kontrollere binding mot frigjøring i siRNA nanocarriers.

En av de mest lovende strategiene for å kontrollere siRNA-frigjøring og øke spatiotemporal regulering er bruk av stimuli-responsive materialer 10 . For eksempel har et bredt utvalg av biomaterialer blitt konstruert med foranderlig nukleinsyrebindingsaffinitet som respons på endret redokspotensial eller pH, eller påførte magnetfelter, ultralyd eller lys 11 . Selv om mange av disse systemene viser forbedret kontroll over nukleinsyreaktivitet, er bruk av lys som en utløser spesielt fordelaktig på grunn av sin øyeblikkelige tidsrespons, presis romlig oppløsning og enkel avstemningsevne. 13 , 14 , 15 . Foto-responsive siRNA nanocarriers er ideelle for å overvinne disse ulempene og gi en enklere og mer robust tilnærming til å spatiotemporalt modulere genuttrykk 16 , 17 , 18 . Dessverre forblir metoder for nøyaktig å forutsi den resulterende protein-knockdown-responsen unnvikende.

En viktig utfordring er at kvantitative evalueringer av siRNA-utgivelsen erSjeldne 19 , 20 , og selv når disse evalueringene utføres, har de ikke blitt koblet til analyser av siRNA / proteinomsetningsdynamikk. Både mengden siRNA utgitt og dets utholdenhet / levetid er viktige determinanter for den resulterende gentykkelsesdynamikken; Derfor er mangel på slik informasjon en stor frakobling som utelukker nøyaktig prediksjon av doserespons i RNAi 21 . Å adressere denne utfordringen vil fremskynde formuleringen av passende strukturfunksjonsforhold i nanokarrierene og bedre informere biomaterialedesigner 22 . Videre vil slike tilnærminger muliggjøre utvikling av mer effektive siRNA-doseringsprotokoller. I et forsøk på å forstå den dynamiske stillingsresponsen har flere grupper undersøkt matematiske modeller av RNAi 23 , 24 , 25 . Disse rammene varVellykket med å gi innsikt i siRNA-medierte endringer i genuttrykk og identifisere hastighetsbegrensende trinn 26 . Imidlertid har disse modellene kun blitt brukt på kommersielle genleveranser (for eksempel lipofektamin og polyetylenimin (PEI)) som ikke er i stand til kontrollert siRNA-utgivelse, og kompleksiteten til modellene har sterkt begrenset deres bruksgrad 27 . Disse manglene fremhever et ufullstendig behov for nye materialer som er i stand til nøyaktig innstillbar siRNA-utgivelse kombinert med strømlinjeformede og brukervennlige prediktive kinetiske modeller.

Vår metode retter seg mot alle disse utfordringene gjennom integrering av en lysfølsom nanocarrier-plattform med koblede metoder for å kvantifisere fri siRNA og modell RNAi-dynamikk. Spesielt blir vår plattforms nøyaktig kontrollerte siRNA-utgivelse 28 overvåket av to komplementære metoder for nøyaktig kvantifisering av innkapslet vs.Bundet siRNA. De eksperimentelle dataene fra disse analysene blir inngått i en enkel kinetisk modell for å forutsi gen-lyddempingseffektivitet a priori 29 . Til slutt utnyttes nanokarrierens on / off-natur lett for å generere cellemønstre i genuttrykk med romlig kontroll på cellelengden. Således gir denne metoden en lett tilpasningsbar metode for å kontrollere og forutsi genavstenging i en rekke applikasjoner som ville ha nytte av spatiotemporal regulering av celleadferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Formulering av siRNA nanokarrierer

  1. Forbered separate løsninger av siRNA og mPEG- b -P (APNBMA) med like mengder fortynnet i 20 mM 4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etansulfonsyre (HEPES) buffer ved pH 6,0.
    1. Tilsett siRNA i en konsentrasjon på 32 μg / ml til 20 mM HEPES-oppløsning.
      MERK: siRNA var en ikke-målrettet, universell negativ kontrollsekvens; SiRNA kan imidlertid utformes for å målrette mot noe gen av interesse.
    2. Oppløs mPEG- b -P (APNBMA) polymerer i en 20 mM HEPES-løsning. Legg til en passende mengde mPEG- b -P (APNBMA) for å lage en 220 μg / ml løsning slik at N / P-forholdet (N, amingrupper på mPEG- b -P (APNBMA), P, fosfatgrupper på siRNA) Er 4.
      MERK: Den syntetiske protokollen for polymerene mPEG- b- P (APNBMA) er rapportert andre steder 30 .
  2. Tilsett mPEG- b -P (APNBMA) -oppløsningen dråpevis til en lik volumE av siRNA-løsningen mens du blander forsiktig på en vortexmaskin. Fortsett å virvel i 30 s etter polymertilsetning. Inkuber prøvene i mørket ved romtemperatur i 30 minutter.

2. Måling av siRNA-frigjøring ved hjelp av gelelektroforese

  1. Formuler nanokarrierene i henhold til trinnene 1.1-1.2, og skala volumene for å imøtekomme antall ønskede prøver.
  2. Bland nanocarrier med natriumdodecylsulfat (SDS).
    1. Lag en 1 mg / ml oppløsning av SDS i vann. Aliquot ut mengden SDS-løsning som trengs for å produsere løsninger med et S / P forhold (S, sulfatgrupper på SDS, P, fosfatgrupper på siRNA) på 15.
      MERK: Hvis polyplexløsningen inneholder 1 μg siRNA, må 13 μg SDS tilsettes for å oppnå et S / P-forhold på 15.
    2. Legg SDS-løsningen til hver nanocarrier-løsning dråpevis mens du blander forsiktig på en virvelmaskin. Fortsett å virvel i 30 s etter SDS tillegg.
  3. Kalibrere og sett en UV-laser med et 365 nm filter til en intensitet på 200 W / m. Kontroller at lysintensiteten måles fra stedet der bunnen av prøveoppløsningen sitter.
  4. Legg nanocarrier / SDS-løsningen i et glasskammer bestående av glideskinner, skilt av en gummipakning.
    1. Forvaske glassglass i en 7: 3 (v / v) etanol / vannoppløsning i vann og tørk helt. Klipp et hull (~ 2 x 3 cm rektangel) i en gummipakning. Plasser gummipakningen på en glidelås.
    2. Pipetter nanocarrier / SDS-løsningen på glassruten i hullet til gummipakningen. Legg et overskudd av oppløsning (20 μL i overskudd) på glassruten mens du unngår kontakt med gummipakningen.
      MERK: Visse væsker vil gå tapt under de påfølgende trinnene.
    3. Sett det andre glassetSkyv på toppen av glidelåsen. For å unngå luftboblingsgenerering, plasser den ene enden av lysbildet først og senk sakte senke.
    4. Fest bindemiddelklipsene til hver side av glasskammeret for å holde den lukket.
  5. Bestråle prøvene for ønsket lengde ( f.eks . 0-60 min) ved å bruke UV-laseren med et 365 nm filter med en intensitet på 200 W / m. Fjern bindemiddelklemmene og åpne kammeret.
  6. Pipetter 25 μl av de bestrålede nanocarrier / SDS-prøvene i et mikrocentrifugerør. Inkuber løsningene i mørket ved romtemperatur i 30 minutter.
  7. Forbered en 2 vekt% agarosegel pre-stained med 0,5 μg / ml etidiumbromid i Tris / Borat / EDTA (TBE) bufret løsning i henhold til standardprotokollene 31 . Forbered en lastebuffer bestående av 3: 7 (volum / volum) glyserol / vann.
  8. Tilsett 5 μL av lastebufferløsningen til 25 μl av hver nanokarrier / SDS-prøve. Inkuber prøvene i mørket påRomtemperatur i 10 min.
  9. Last 30 μl av hver nanokarrier / SDS-prøve i 2% agarosegelen. Kjør gelen i mørket ved 100 V i 30 minutter. Bild gelen ved hjelp av et gelbildesystem med etidiumbromidfiltre. Lagre gelbildefilene og fortsett til trinn 2.10 for kvantitetskvalitet. Sørg for at båndintensitetene er lyse nok til å tydeligvis visualisere, men ikke for lyse at signalene er mettede.
  10. Kvantifiser båndintensiteten ved hjelp av offentlig tilgjengelig ImageJ-programvare 32 .
    1. Ved hjelp av avkastningsverktøyet til ImageJ, bestemme fluorescensintensiteten til de frie siRNA-båndene i hver bane ved å tegne et rektangel rundt hvert bånd. Plot intensitetskurver av hver bane, og integrere området under kurvene ved å tegne en horisontal linje over intensitetskurver og klikke sporstaven inne i de vedlagte områdene.
    2. Beregn relativ intensitet av hver bane ved å dele området under cuRve av hver prøve av området under kurven for siRNA positiv kontroll (ingen mPEG- b- P (APNBMA) tilsatt og ingen SDS tilsatt). Rapporter prosentandelen siRNA utgitt som normalisert båndintensitet for hver prøve.

3. Måling av siRNA-frigivelse ved bruk av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS)

  1. Oppnå siRNA merket med en enkelt fluorofor ved 5'-enden av følelsesstrengen.
    MERK: SiRNA kan kjøpes pre-annealed med etikettene konjugert på ønsket sted. Fluorforen bør være fotostabil og absorbere / avgis mellom 450 og 750 nm for å unngå UV-lysslokking og energioverføring med mPEG- b -P (APNBMA).
  2. Formuler nanokarrierene i henhold til trinnene 1.1-1.2 ved å bruke det merkede siRNA. Skala volumene for å imøtekomme antall ønskede prøver.
  3. Inkuber løsningene i SDS og bestrål i ønsket tidsrom i henhold til trinn 2.2-2.6.
  4. FORBEREDELSERAtion av FCS prøvekammer.
    1. Vask en glidelås med en 7: 3 (v / v) etanol / vannoppløsning og tørk glasset helt med en tørk og en luftstrøm.
    2. Fjern papirbitene fra et dobbeltsidet klebemiddelavstand for å eksponere det dobbeltsidige klebemiddelavstandsstykket. Fest spaceren til et glassdeksel.
    3. Pipetter nanocarrier / SDS-løsningen på dekselet i midten av hullet fra klebemiddelavstanden.
    4. Sett glassruten på toppen av dekselet. Skyv glassrullen for å sikre at glassruten og dekslet er godt festet og danner en tetning.
  5. Bruk et konfokalmikroskop til FCS-målinger 33 . Bruk et 40X vanndypende apokromatmål med en numerisk blenderåpning på 1,2. Bruk riktig eksitasjonskanalkanal (488 nm) for å samle minst 30 målinger på 10 s hver pr. Prøve 34 . Kontroller at laserintensiteten og detektorjusteringen forblirDet samme for hver prøve.
    1. I tillegg til forsøksprøver måles kontroller, inkludert: en blindprøve uten merket siRNA; Og en fri siRNA-prøve med merket siRNA men ingen mPEG- b -P (APNBMA).
  6. Analyser dataene ved hjelp av FCS-spesifikk programvare. Identifiser baseline tellehastigheten for hver prøve ved å bestemme den stabile tellehastigheten i løpet av en tid da ingen nanokarrier passerer gjennom konfokalvolumet 29 .
    1. Subtrahere tellefrekvensen for blindprøven fra hver prøveverdien av basisverdien. Normaliser de resulterende verdiene til den frie siRNA-kontrollen for å beregne prosent av gratis siRNA 35 .

4. Kinetisk modellering for å forutsi gensynkronisering

  1. Lag skript i et matematisk programmeringsspråk ved hjelp av det enkle settet av vanlige differensialligninger for å forutsi genavstenging 29.
    MERK: Skript kan gjøres tilgjengelig på forespørsel.
    1. Skriv settet av ordinære differensialligninger som:
      Ligning 1 (1)
      Ligning 2 (2)
      Ligning 3 (3)
      MERK: For ligningene 1-3 er betingelsene k mRNA , k siRNA og k prot , hastighetskonstantene for produksjonen av henholdsvis mRNA, siRNA og protein. Begrepene km, deg , ks , deg og kp , deg er hastighetskonstantene for nedbrytningen av henholdsvis mRNA, siRNA og protein. Nedbrytningshastighetskonstanter beregnes på grunnlag av komponenthalveringstidene, og produksjonshastighetskonstanter er egnet for å sikre at mRNA og protein steady-state-verdier blir nådd i fravær oF siRNA.
      1. Bestem halveringstidene for mRNA og protein for det eller de genene av interesse, enten eksperimentelt som beskrevet i referanse 36 eller fra litteraturen (se diskusjonen ). Også bestemme doblingstiden for cellelinjen. Skriv inn disse verdiene i de riktige nedbrytningshastighetsuttrykkene.
      2. Still produksjonshastighetskonstantene slik at genuttrykkningsnivåene forblir stabile ved en normalisert verdi på 100 dersom ingen siRNA blir introdusert. Spesifikt sett [siRNA] til null og variere verdiene for k mRNA , k siRNA og k prot produksjonshastighetskonstanter til [mRNA] og [protein] forblir innenfor 1% av den innledende normaliserte verdien på 100% i løpet av varigheten av Simuleringen.
      3. Ved å bruke de relative mengder av siRNA frigitt fra de tidligere beskrevne gelelektroforese og FCS-analyser som estimater, juster den opprinnelige relative konsentrasjonen av siRNA i skriptet. Spesifikt, variere [siRNA] å være proporsjonal med den relative mengden frigitt siRNA, med en verdi på 100 som svarer til maksimumsmengden 29 .

5. Cell Culture og In Vitro siRNA Delivery

  1. Kultur NIH / 3T3 murine embryonale fibroblaster i henhold til protokollene fra leverandøren.
    1. Voks cellene i vekstmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin). Opprettholde cellene ved 37 ° C i et fuktig miljø med 5% CO 2 .
  2. Sæd cellene i 6-brønne vevskulturbehandlede plater.
    1. Følg anbefalte subculturing prosedyren fra leverandøren. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn cellene i supplert vekstmedium til en konsentrasjon på 75.000 celler / ml.
    2. Tilsett 2 ml cellesuspensjon (75 000 celleS / ml) til hver brønn på 6-brønnplaten. La cellene kle seg og utvinne i 24 timer i inkubatoren.
  3. Klargjør cellene for transfeksjon ved vasking med fosfatbuffert saltvann (PBS) og tilsetning av 1,5 ml serum- og antibiotikumfritt transfeksjonsmedium (se tabell over materialer ) til hver brønn.
  4. Formuler siRNA nanocarrierene i henhold til trinnene 1.1-1.2. Tilsett 25 μl nanokarrieroppløsning inneholdende 30 pmol siRNA til hver brønn. Forsiktig pipetter mediet opp og ned for å blande. Plasser cellene i inkubatoren i 3 timer.
  5. Fjern transfeksjonsmediet og vask hver brønn med PBS. Tilsett 1 ml supplert vekstmedium og plasser cellene i inkubatoren for å gjenvinne i 30 minutter.
  6. For å forberede cellene til behandling med en fotostimulus, fjern de supplerte vekstmediene. Tilsett 1 ml transfeksjonsmedium (uten fenolrød) til hver brønn.
    MERK: Pass på at transfeksjonsmediet ikke inneholder fenolrødt.
  7. Kalibrere og sett en UV-laser med et 365 nm filter til en intensitet på 200 W / m. Kontroller at lysintensiteten måles fra stedet der bunnen av celleplaten sitter.
  8. Plasser cellene på en kokeplate satt til 37 ° C. Fjern platedekselet på cellene. Bestråle cellene fra toppen av platen for ønsket tid (opptil 20 minutter) ved å bruke UV-laseren med et 365 nm filter ved en intensitet på 200 W m -2 .
  9. Fjern transfeksjonsmediet og tilsett 2 ml supplert vekstmedium. Plasser i inkubatoren til videre analyse ( f.eks . 24 timer for qPCR og 48 timer for Western blotting).
    1. Mål endringer i genuttrykk ved hjelp av en rekke teknikker som Western blotting 37 og qPCR. 38 For gener med synlige signaler, for eksempel GFP, bruk fluorescensmikroskopi 29 .
      MERK: Disse teknikkene foreslås på grunn av deres brukervennlighet og nøyaktighetI kvantifiserende genuttrykk

6. Styring av gensletting i en spatiotemporal måte

  1. Kultur, frø og transfektceller i henhold til trinnene 5.1-5.7.
  2. Klargjør en fotomask som helt blokkerer 365 nm lys og minimerer refleksjoner.
    MERK: I dette tilfellet ble 10 x 10 cm stykker aluminiumsfolie og sort konstruksjonspapir brukt til å blokkere lyset og å redusere refleksjoner, henholdsvis. Aluminiumsfolie og byggepapir ble limt sammen for å danne en enkelt enhet.
    1. Kutt / punch / maskiniser ønsket form i fotomasken. For eksempel, bruk et skarpt blad og en hullpuncher for å danne et rett mønster (~ 5 cm lang) og et sirkulært mønster (~ 7 mm diameter) i fotomasken.
  3. Lim fotomasken til bunnen av 6-brønnplaten med mønsteret sentrert under brønnen som inneholder cellene med den antireflekterende siden ( f.eks . Svart cOppbyggingspapir) vendt mot platen. Kontroller at limet ikke er plassert nær kanten (innenfor ~ 3 mm) av mønsteret.
  4. Sett opp to ringstativer ca. 25 cm fra hverandre og fest en plattform til hver ringestand, slik at plattformene er like høye. Stopp celleplaten mellom de to stativene ved å legge platen på toppen av plattformene. Pass på at platen er på nivå.
  5. Bestråle cellene fra under prøven for den ønskede tid (opp til 20 minutter) ved bruk av UV-laser med et 365 nm filter med en intensitet på 200 W / m2.
  6. Fjern transfeksjonsmediet og tilsett 2 ml supplert vekstmedium. Plasser i inkubatoren for å gjenvinne i minst 24 timer. Bildene cellene bruker fluorescensmikroskopi som beskrevet 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter formuleringen av nanokarrierene ble det utført siRNA-frigivelsesanalyser for å informere bestrålingsbetingelsene som skal anvendes i in vitro transfeksjonene. Ulike doser av lys ble anvendt for å bestemme prosenten av siRNA som ble frigjort. Den første analysen benyttet gelelektroforese for å separere de frie siRNA-molekylene fra siRNA-molekylene som fortsatt er kompleksdannet / assosiert med polymeren. Nanokarrier som ikke ble behandlet med lys, forblir stabile og frigjorde ikke noe siRNA. Etter hvert som varigheten av bestrålingstiden økte, økte fluorescensintensiteten til de frie siRNA-båndene. Kvantifisering av båndintensiteten ved hjelp av bildeanalyseprogram viste at ~ 15% av siRNA ble frigjort etter 20 minutter med lyseksponering.

Den andre siRNA-frigivelsesanalysen brukte FCS til å måle prosentandelen av siRNA-molekyler som fritt diffunderte i solution. Baseline tellerratene av prøvene som inneholdt nanokarrierene som ikke ble utsatt for lys var de samme som tellehastighetene til blindbuffertkontrollprøven, hvilket indikerer at ingen fri siRNA var tilstede. Basertalltallene økte ettersom bestrålingstiden økte. Prosenten av fri siRNA ble beregnet og funnet å være i samsvar med målingene oppnådd fra gelelektroforese. Generelt var estimatene fra de to teknikkene innenfor feil av hverandre (p> 0,05 ved Studentens t-test) og indikerte at prosentvis frigitt siRNA ikke økte signifikant med mer enn 20 min bestråling. Det er viktig å merke seg at gelelektroforese og FCS ble brukt til å kvantifisere siRNA-frigivelse fordi de er enkle å bruke, relativt raske å analysere og gir nøyaktige resultater.

De relative mengder av siRNA frigitt etter forskjellige doser av lys ble oppgitt som den opprinnelige siRNEn konsentrasjon i den kinetiske modellen. Som vist i figur 1A ble modellen kjørt for å forutsi konsentrasjonene av glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA, protein og siRNA som en funksjon av tiden under hver bestrålingsbetingelse. Modellforutsigelsene for GAPDH-proteinuttrykkningsnivåene var i samsvar med de eksperimentelt bestemte uttrykksnivåene oppnådd gjennom Western blotting ( Figur 1B ). Spesielt ble nivået av GAPDH-protein redusert ettersom bestrålingstiden økte. Celler som ble bestrålt over lengre tid (20 min) viste de største endringene i genuttrykk fordi større mengder siRNA ble frigjort. Det er viktig at celler som ikke ble utsatt for lys, ikke viste noe gen-nedslag, noe som indikerte at nanokarrierene opprettholde dvalemodus og ikke frigjorde noen siRNA med mindre det ble utløst av fotostimulus. Cytotoksisitetsanalyser viste at NIH / 3T3-celleneOpprettholdt ≥ 90% levedyktighet etter behandling med nanokarrierene og 20 min bestråling 28 .

Figur 1
Figur 1 : Kinetiske modelleringsforutsigelser vs. eksperimentelt bestemte endringer i proteinuttrykk. ( A ) siRNA-frigivelsesdata oppnådd fra gelelektroforese ble brukt til å modulere initialkonsentrasjonen av siRNA i den kinetiske modellen. Disse grafene representerer modellutgangen for celler som mottar 20 min bestråling. ( B ) De relative mengder av siRNA fra hver bestrålingsbetingelse ble inngått i den kinetiske modellen for å forutsi endringer i proteinuttrykk. Disse spådommene ble sammenlignet med GAPDH-proteinekspresjonsnivåer oppnådd fra Western blotting-analyser. Resultatene vises som gjennomsnittlig ± standardavvik av dAta oppnådd fra tre uavhengige prøver. Forsøksdataene ble delvis tilbakestilt med tillatelse fra referanse 29 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å kontrollere genavstenging på en spatiotemporal måte ble en fotomask brukt til å begrense bestemte cellulære populasjoner til fotostimulus. Som vist i figur 2 , var GFP-ekspresjon i celler regulert romlig i et sirkulært mønster. Celler som var beskyttet mot lyset, viste fluorescensintensiteter som ikke kunne skelnes fra kontrollprøver som ikke ble behandlet med siRNA og lys. Imidlertid viste nesten alle celler i det sirkulære mønsteret ingen GFP-ekspresjon, noe som indikerer effektiv siRNA-frigivelse og genknockdown. Videre gjorde bruken av lys som en trigger aktivert genuttrykk for å være kontrollLedet på mobil lengde skalaer.

Figur 2
Figur 2 : Spatial kontroll over gensletting. NIH / 3T3-celler ble ko-transfektert med GFP pDNA-holdige lipoplekser og GFP-targeting siRNA / mPEG- b -P (APNBMA) nanocarrier. En sirkulær fotomask ble påført før bestråling med 365 nm lys i 20 minutter. Cellene ble avbildet på et fluorescensmikroskop 48 timer etter transfeksjon. Den stiplede røde linjen representerer kanten av fotomasken, og skalestaven representerer 1 mm. Tilpasset med tillatelse fra referanse 29 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er noen få skritt i metoden som er spesielt kritisk. Ved formulering av nanocarrierene er rekkefølgen av komponenttilsetning og blandingshastighet to viktige parametere som påvirker effekten 39 . Denne protokollen krever at kationisk komponent, mPEG- b -P (APNBMA), settes til den anioniske komponenten, siRNA, dråpevis mens vortexing. Avhengig av totalformuleringsvolumet tar denne blandeprosessen 3-6 s. For å teste om nanokarrierene ble dannet på riktig måte måler du størrelsesfordelingen ved hjelp av en teknikk som dynamisk lysfordeling. MPEG- b -P (APNBMA) / siRNA nanocarrierene med et N / P-forhold på 4 har en gjennomsnittlig diameter på ~ 140 nm og polydispersitet på ~ 0,2 28 . Videre kan N / P-forholdet varieres for å oppnå polyplexer med forskjellige størrelser / stabiliteter. Et N / P-forhold på 4 ble valgt i disse studiene fordi det var det laveste forholdet som muliggjorde fullstendig sekvestrasjon og eliMinering av etidiumbromidfarging.

En annen kritisk parameter i metoden innebærer tilsetning av SDS til nanocarrier-løsningene i siRNA-frigivelsesanalysene. SDS, et anionisk overflateaktivt middel, ble brukt til å bedre simulere intracellulære miljøer med høye konsentrasjoner av lipidmembraner og polyanioner 29 , 40 . S / P-forholdet må være tilstrekkelig høyt til å etterligne overflaten av anioniske lipider som finnes i celler, men ikke så stor at nanokarrierene demonteres før fotostimuleringen og videre analyser. En rekke S / P-forhold bør testes ved hjelp av gelelektroforese for å identifisere den maksimale mengden SDS som kan tilsettes uten å frigjøre siRNA. Denne protokollen brukte et relativt høyt S / P-forhold på 15.

En potensiell begrensning av denne metoden er relatert til den kinetiske modelleringen. Modellen krever inngang av mRNA og proteinhalveringstid for genet av interesse. TurnovEr priser for gener som har blitt godt studert finnes i litteraturen; Denne informasjonen er imidlertid ikke tilgjengelig for alle gener. For å omgå dette problemet kan halveringstidene til lignende gener finnes i litteraturen for å gi estimater. Alternativt kan omsetningshastighetene for det spesifikke gen av interesse bestemmes eksperimentelt 36 . Det er også viktig å merke seg at informasjon for tusenvis av gener finnes i kompilerte datasett 41 .

En annen viktig parameter i denne metoden er celletype. NIH / 3T3 fibroblaster ble brukt i disse studiene som modellcellelinje fordi de har blitt grundig studert, er lette å jobbe med, og gjelder for en rekke regenerative medisinapplikasjoner. Protokollen kan imidlertid brukes til andre celletyper av interesse. Nanocarrierformuleringen må kanskje optimaliseres for den spesifikke celletypen.

Sammendrag, denne metoden enAnvender den hurtige bestemmelsen av bestrålingsbetingelser for å spatiotemporalt kontrollere siRNA-frigivelse og forutsi genavstivning a priori . Denne metoden vil lett kunne tilpasses til andre fotoresvarlige nukleinsyreavgivelsessystemer. For eksempel kan mPEG- b -P (APNBMA) -polymerene modifiseres ved å justere blokklengder og / eller funksjonelle delene for å skreddersy den fotosensitive oppførselen til nanokarrierene 42 . Bruk av denne protokollen vil bidra til å belyse strukturfunksjonsforholdene som styrer stabiliteten og effekten av nanocarrier. Disse mekaniske innsiktene kan muliggjøre applikasjoner i regenerativ medisin som krever spatiotemporal kontroll over genavstenging. Videre, på grunn av den inneboende penetrasjonsdybden på 365 nm lys i vandige vev, er disse formuleringene velegnet for behandling av sykdommer som manifesteres på kroppsoverflaten, slik som hudkreft og aktuelle sår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (NIH) for økonomisk støtte gjennom en institusjonell utviklingspris (IDeA) under bevilgningsnummer P20GM103541 samt stipendnummer P20GM10344615. Uttalelsene heri gjenspeiler ikke NIHs synspunkter. Vi anerkjenner også Delaware Biotechnology Institute (DBI) og Delaware Economic Development Office (DEDO) for økonomisk støtte gjennom Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -prisen (12A00448).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Tags

Bioengineering Polyplex kinetisk modellering blokk-kopolymer nukleinsyrefrigivelse fluorescenskorrelasjonsspektroskopi celle-mønster RNAi lysfølsom
Forutsi gensletting gjennom spatiotemporal kontroll av siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greco, C. T., Epps, III, T. H.,… More

Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter