Summary
Vi presenterar en ny metod som använder fotokänsliga block-sampolymerer för effektivare spatiotemporal kontroll av genavstängning utan detekterbara off-target-effekter. Dessutom kan förändringar i genuttryck förutspås med användning av enkla siRNA-frisättningsanalyser och enkel kinetisk modellering.
Abstract
Nya material och metoder behövs för att bättre kontrollera bindningen vs. frisättning av nukleinsyror för ett brett spektrum av tillämpningar som kräver en exakt reglering av genaktivitet. I synnerhet skulle nya stimuli-responsiva material med förbättrad spatiotemporal kontroll över genuttryck låsa upp översättningsbara plattformar i läkemedelsforskning och regenerativ medicinteknik. Vidare skulle en förbättrad förmåga att kontrollera nukleinsyrafrigörande från material möjliggöra utveckling av strömlinjeformade metoder för att förutsäga nanokarrier effektivitet a priori , vilket leder till snabbare screening av leveransfordon. Här presenterar vi ett protokoll för att förutsäga genavstämningseffektivitet och uppnå spatiotemporal kontroll över genuttryck genom ett modulärt fotoresvarligt nanocarrier-system. Små interfererande RNA (siRNA) komplexeras med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobensylmetakrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tillRm stabila nanocarriers som kan kontrolleras med ljus för att underlätta avstämd, on / off siRNA-frisättning. Vi skisserar två komplementära analyser med användning av fluorescenskorrelationsspektroskopi och gelelektrofores för korrekt kvantifiering av siRNA-frisättning från lösningar som liknar intracellulära miljöer. Information som erhölls från dessa analyser inkorporerades i en enkel RNA-interferens (RNAi) -kinetisk modell för att förutsäga de dynamiska tystningsresponserna på olika fotostimulansförhållanden. I sin tur möjliggjorde dessa optimerade bestrålningsbetingelser förfining av ett nytt protokoll för spatiotemporalt kontroll av genavstängning. Denna metod kan generera cellulära mönster i genuttryck med cell-till-cellupplösning och inga detekterbara off-target-effekter. Tillsammans erbjuder vårt tillvägagångssätt en lättanvänd metod för att förutsäga dynamiska förändringar i genuttryck och justera siRNA-aktivitet i rymden och tiden. Denna uppsättning analyser kan lätt anpassas för att testa ett stort antal otHennes stimuli-responsiva system för att ta itu med viktiga utmaningar som är relevanta för en mängd applikationer inom biomedicinsk forskning och medicin.
Introduction
Små störande RNA (siRNA) mediera post-transkriptionell gen tysta genom en katalytisk RNAi väg som är mycket specifik, potent och skräddarsys till praktiskt taget vilken målgen 1. Dessa lovande egenskaper har gjort det möjligt för siRNA-terapeutika att utvecklas i humana kliniska prövningar för behandling av många sjukdomar, inklusive metastatiskt melanom och hemofili 2 , 3 . Men betydande leveransproblem kvarstår som har hindrat översättning 4 . I synnerhet måste leveransfordon vara stabila och skydda siRNA från extracellulär nedbrytning, men frigöra även nyttolasten i cytoplasma 5 . Vidare kräver många RNAi-applikationer förbättrade metoder för att reglera genavstämning i rymden och tid 6 , vilket kommer att minska bieffekterna i siRNA-terapeutika 7 och möjliggöra transformativ aDvanser i applikationer som sträcker sig från cellmikroarrays för läkemedelsupptäckt 8 till modulering av cellsvar i regenerativa byggnadsställningar 9 . Dessa utmaningar lyfter fram behovet av nya material och metoder för att bättre kontrollera bindning mot frisättning i siRNA nanokarrier.
En av de mest lovande strategierna för kontroll av siRNA-frisättning och förbättring av spatiotemporal reglering är användningen av stimuli-responsiva material 10 . Till exempel har en mängd olika biomaterial konstruerats med föränderlig nukleinsyrabindningsaffinitet som svar på förändrad redoxpotential eller pH, eller applicerade magnetfält, ultraljud eller ljus 11 . Även om många av dessa system uppvisar förbättrad kontroll över nukleinsyraaktivitet är användningen av ljus som en utlösare särskilt fördelaktig på grund av dess momentana tidsmässiga respons, exakt rymdupplösning och lätthet av avstämningsförmåga 13 , 14 , 15 . Foto-responsiva siRNA nanocarrier är idealiska för att övervinna dessa nackdelar och tillhandahålla ett enklare och mer robust tillvägagångssätt för att spatiotemporalt modulera genuttryck 16 , 17 , 18 . Tyvärr förblir metoder för att exakt förutsäga det resulterande proteinknutningsreaktionen elusiva.
En viktig utmaning är att kvantitativa utvärderingar av siRNA-frisläppandet ärSällsynta 19 , 20 , och även när dessa utvärderingar utförs, har de inte kopplats till analyser av siRNA / proteinomsättningsdynamik. Både mängden siRNA som frigörs och dess persistens / livstid är viktiga determinanter för den resulterande genljuddynamiken; Därför är en brist på sådan information en stor avbrytning som utesluter exakt förutsägelse av dosrespons i RNAi 21 . Att ta itu med denna utmaning skulle påskynda formuleringen av lämpliga struktur-funktionsrelationer i nanokarrier och bättre informera biomaterialmönster 22 . Vidare skulle sådana tillvägagångssätt möjliggöra utveckling av effektivare siRNA-doseringsprotokoll. I ett försök att förstå det dynamiska tystnadssvaret har flera grupper undersökt matematiska modeller av RNAi 23 , 24 , 25 . Dessa ramar varLyckad med att ge insikter i siRNA-medierade förändringar i genuttryck och identifiera hastighetsbegränsande steg 26 . Emellertid har dessa modeller endast applicerats på kommersiella genleveranssystem ( t.ex. lipofektamin och polyetylenimin (PEI)) som inte kan kontrolleras siRNA-frisättning, och komplexiteten hos modellerna har allvarligt begränsat deras användbarhet 27 . Dessa brister framhäver ett oupplöst behov av nya material som kan justera justerbart siRNA-utsläpp kombinerat med strömlinjeformade och lättanvända prediktiva kinetiska modeller.
Vår metod behandlar alla dessa utmaningar genom integrering av en ljuskänslig nanocarrierplattform med kopplade metoder för att kvantifiera fri siRNA och modell RNAi-dynamik. I synnerhet övervakas vår plattforms exakt kontrollerade siRNA-frisättning 28 genom två komplementära metoder för att exakt kvantifiera inkapslade vsBunden siRNA. Experimentella data från dessa analyser ingås i en enkel kinetisk modell för att förutsäga genavstämningseffektiviteter a priori 29 . Slutligen utnyttjas nanokärrarnas på / av-natur lätt för att generera cellmönster i genuttryck med rumslig kontroll på celllängdskalan. Således tillhandahåller denna metod en lätt anpassningsbar metod för att styra och förutsäga genavstängning i en mängd olika tillämpningar som skulle gynna spatiotemporal reglering av cellbeteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Formulering av siRNA-nanokarrier
- Förbered separata lösningar av siRNA och mPEG- b -P (APNBMA) med lika stora volymer utspädd i 20 mM 4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra (HEPES) buffert vid pH 6,0.
- Tillsätt siRNA i en koncentration av 32 μg / mL till 20 mM HEPES-lösning.
OBS: siRNA var en icke-riktade, universell negativ kontrollsekvens; SiRNA kan emellertid utformas för att rikta sig mot någon gen av intresse. - Lös upp mPEG- b -P (APNBMA) polymerer i en 20 mM HEPES-lösning. Lägg till en lämplig mängd mPEG- b -P (APNBMA) för att göra en 220 μg / ml lösning så att N / P-förhållandet (N, amingrupper på mPEG- b -P (APNBMA), P, fosfatgrupper på siRNA) Är 4.
OBS: Det syntetiska protokollet för polymererna mPEG- b -P (APNBMA) rapporteras någon annanstans 30 .
- Tillsätt siRNA i en koncentration av 32 μg / mL till 20 mM HEPES-lösning.
- Tillsätt mPEG- b -P (APNBMA) -lösningen droppvis till samma volymE av siRNA-lösningen medan du försiktigt blandar på en virvelmaskin. Fortsätt att virvel i 30 s efter polymertillägg. Inkubera proven i mörkret vid rumstemperatur i 30 minuter.
2. Mätning av siRNA-frisättning med användning av gelelektrofores
- Formulera nanokarrier enligt steg 1.1-1.2 och skala volymerna för att tillgodose antalet önskade prov.
- Blanda nanocarrier med natriumdodecylsulfat (SDS).
- Förbered en 1 mg / ml lösning av SDS i vatten. Aliquot ut hur mycket SDS-lösning som behövs för att producera lösningar med ett S / P-förhållande (S, sulfatgrupper på SDS, P, fosfatgrupper på siRNA) av 15.
OBS! Om polyplexlösningen innehåller 1 μg siRNA måste 13 μg SDS tillsättas för att uppnå ett S / P-förhållande av 15. - Lägg SDS-lösningen till varje nanokarrierlösning droppvis medan du blandar försiktigt på en virvelmaskin. Fortsätt att virvel i 30 s efter SDS-tillsats.
- Förbered en 1 mg / ml lösning av SDS i vatten. Aliquot ut hur mycket SDS-lösning som behövs för att producera lösningar med ett S / P-förhållande (S, sulfatgrupper på SDS, P, fosfatgrupper på siRNA) av 15.
- Kalibrera och sätt en UV-laser med ett 365 nm filter till en intensitet på 200 W / m. Kontrollera att ljusintensiteten mäts från platsen där provlösningens botten sitter.
- Ladda nanokarrier / SDS-lösningen i en glaskammare bestående av glasskivor separerade med en gummitätning.
- Förtvättglas glider i en 7: 3 (v / v) etanol / vattenlösning i vatten och torkas helt. Skär ett hål (~ 2 x 3 cm rektangel) i en gummipackning. Placera gummitätningen på en glasskiva.
- Pipettera nanocarrier / SDS-lösningen på glasskivan inuti gummipackningens hål. Ladda ett överskott av lösningen (20 μL i överskott) på glasskivan och undvik kontakt med gummipackningen.
OBS: Vissa vätskor kommer att gå vilse under de följande stegen. - Placera det andra glasetGlida ovanpå glidpackningen. För att undvika luftbubbelgenerering, placera ena änden av bilden ner först och sedan sakta sakta ned den andra änden.
- Fäst bindarklämmorna på vardera sidan av glaskammaren för att hålla den stängd.
- Bestråla proverna för önskad tid ( t.ex. 0-60 min) med UV-lasern med ett 365 nm filter med en intensitet på 200 W / m. Ta bort bindemedelsklämmorna och öppna kammaren.
- Pipettera 25 μl av de bestrålade nanocarrier / SDS-proven i ett mikrocentrifugrör. Inkubera lösningarna i mörkret vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Förbered en 2 vikt% agarosgel förfärgad med 0,5 μg / ml etidiumbromid i Tris / Borat / EDTA (TBE) buffrad lösning i enlighet med standardprotokoll 31 . Förbered en laddningsbuffert bestående av 3: 7 (volym / volym) glycerol / vatten.
- Tillsätt 5 μL av laddningsbuffertlösningen till 25 μl av varje nanokarrier / SDS-prov. Inkubera proverna i mörkret vidRumstemperatur i 10 min.
- Ladda 30 μl av varje nanokarrier / SDS-prov i 2% agarosgelén. Kör gelén i mörkret vid 100 V i 30 minuter. Bilda gelén med ett gelbilds system med etidiumbromidfilter. Spara gelbildsfilerna och fortsätt till steg 2.10 för kvantitet av bandintensitet. Se till att bandintensiteterna är ljusa nog att tydligt visualisera men inte för ljusa att signalerna är mättade.
- Kvantifiera bandintensiteterna med hjälp av allmänt tillgänglig ImageJ-programvara 32 .
- Med hjälp av ROI-verktyget i ImageJ bestämmer du fluorescensintensiteten hos de fria siRNA-banden i varje bana genom att rita en rektangel runt varje band. Plotta intensitetenskurvorna för varje bana och integrera området under kurvorna genom att dra en horisontell linje över intensitetskurvorna och klicka på spårväggen inuti de inneslutna områdena.
- Beräkna den relativa intensiteten för varje lane genom att dela området under cuRve för varje prov av området under kurvan för siRNA-positiv kontroll (ingen mPEG- b- P (APNBMA) tillsatt och ingen SDS tillsatt). Rapportera procentandelen siRNA som släpptes som normaliserad bandintensitet för varje prov.
3. Mätning av siRNA-frisättning med användning av fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)
- Hämta siRNA märkt med en enda fluorofor vid 5'-änden av känslorsträngen.
OBS: SiRNA kan köpas förhäftas med etiketterna konjugerade på önskad plats. Fluoroforen bör vara fotostabil och absorbera / avge mellan 450 och 750 nm för att undvika UV-ljussläckning och energiöverföring med mPEG- b -P (APNBMA). - Formulera nanokarrier enligt steg 1.1-1.2 med användning av det märkta siRNA. Skala volymerna för att tillgodose antalet önskade prov.
- Inkubera lösningarna i SDS och bestråla i önskad längd enligt steg 2.2-2.6.
- FÖRBEREDELSEAtjon av FCS provkammare.
- Tvätta en glasskiva med en 7: 3 (v / v) etanol / vattenlösning och torka glaset helt med en torka och en luftström.
- Ta bort pappersbitarna från ett dubbelhäftande limstycke för att exponera dubbelsidigt adhesiv distansorgan. Fäst avståndet på ett glaslock.
- Pipettera nanokarrier / SDS-lösningen på locket i mitten av hålet från limstycket.
- Placera glasskivan ovanpå täckglaset. Tryck på glasskivan för att säkerställa att glasskyddet och täckglaset är väl fastsatta och bilda en tätning.
- Använd ett konfokalmikroskop för FCS-mätningar 33 . Använd ett 40 x vattendämpande apokromatmål med en numerisk bländare på 1,2. Använd lämplig excitationslaserkanal (488 nm) för att samla minst 30 mätningar av 10 s vardera per prov 34 . Kontrollera att laserintensiteten och detektorns justering förblirSamma för varje prov.
- Utöver de experimentella proven mäter kontrollerna, inklusive: ett blankt prov utan märkt siRNA; Och ett fritt siRNA-prov med märkt siRNA men ingen mPEG- b -P (APNBMA).
- Analysera data med hjälp av FCS-specifik programvara. Identifiera baslinjeantalet för varje prov genom att bestämma den stabila räkningshastigheten under en tid då inga nanokarrier passerar genom konfokalvolymen 29 .
- Subtrahera räknehastigheten för blankprovet från varje provbasvärdesräkningskursvärde. Normalisera de resulterande värdena till den fria siRNA-kontrollen för att beräkna procenten av fri siRNA 35 .
4. Kinetisk modellering för att förutse gensläckning
- Skapa skript i ett matematiskt programmeringsspråk med hjälp av den enkla uppsättningen vanliga differentialekvationer för att förutsäga genavstängning 29.
OBS! Skript kan göras tillgängliga på begäran.- Skriv uppsättningen vanliga differentialekvationer som:
(1) 
(2) 
(3)
OBS: För ekvationerna 1-3 är termerna k mRNA , k siRNA och k prot, hastighetskonstanterna för framställning av mRNA, siRNA respektive protein. Termerna km, deg , ks , deg och kp , deg är hastighetskonstanterna för nedbrytningen av mRNA, siRNA respektive protein. Nedbrytningshastighetskonstanter beräknas på grundval av halveringstiden för komponenten och produktionshastighetskonstanter är lämpliga för att säkerställa att mRNA och protein steady-state-värden uppnås i frånvaro oF siRNA.- Bestäm halveringstiderna för mRNA och protein för den eller de genen av intresse, antingen experimentellt enligt beskrivningen i referens 36 eller från litteraturen (se diskussionen ). Fastställ också fördubblingstiden för cellinjen. Ange dessa värden i lämpliga nedbrytningshastighetsuttryck.
- Ställ in produktionshastighetskonstanterna så att genuttrycksnivåerna förblir stabila vid ett normaliserat värde av 100 om inget siRNA införs. Särskilt sätt [siRNA] till noll och variera värdena för k mRNA , k siRNA och k prot produktionshastighetskonstanter tills [mRNA] och [protein] förblir inom 1% av det initiala normaliserade värdet på 100% under varaktigheten av Simuleringen.
- Användning av de relativa mängderna siRNA som frigörs från de tidigare beskrivna gelelektroforesen och FCS-analyserna som uppskattningar, justerar den initiala relativa koncentrationen av siRNA i manuset. Specifikt, variera [siRNA] vara proportionell mot den relativa mängden frisatt siRNA, med ett värde av 100 motsvarande den maximala mängden 29 .
- Skriv uppsättningen vanliga differentialekvationer som:
(1) 
(2) 
(3) 5. Cellkultur och In Vitro siRNA-leverans
- Kultur NIH / 3T3 murina embryonala fibroblaster enligt protokoll från leverantören.
- Växa cellerna i tillväxtmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin). Bibehålla cellerna vid 37 ° C i en fuktig miljö med 5% CO2.
- Säd cellerna i behandlade plattor med 6 brunnar.
- Följ rekommenderad subkultureringsprocedur från leverantören. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Späd cellerna i kompletterat tillväxtmedium till en koncentration av 75 000 celler / ml.
- Tillsätt 2 ml cellsuspension (75 000 cellerS / ml) till varje brunn i 6-brunnsplattan. Låt cellerna klistra fast och återhämta sig i 24 h i inkubatorn.
- Beredda cellerna för transfektion genom att tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätta 1,5 ml serum- och antibiotikumfritt transfektionsmedium (se tabell över material ) till varje brunn.
- Formulera siRNA nanocarrier enligt steg 1.1-1.2. Tillsätt 25 μl nanokarrierlösning innehållande 30 pmol siRNA till varje brunn. Tryck försiktigt media upp och ner för att blanda. Placera cellerna i inkubatorn i 3 timmar.
- Ta bort transfektionsmediet och tvätta varje brunn med PBS. Tillsätt 1 ml tillsatt tillväxtmedium och placera cellerna i inkubatorn för att återvinna i 30 min.
- För att förbereda cellerna för behandling med en fotostimulans, ta bort det kompletterade tillväxtmediet. Tillsätt 1 ml transfektionsmedia (utan fenolröd) till varje brunn.
OBS: Se till att transfektionsmediet inte innehåller fenolrött. - Kalibrera och sätt en UV-laser med ett 365 nm filter till en intensitet på 200 W / m. Kontrollera att ljusintensiteten mäts från platsen där cellplattans botten sitter.
- Placera cellerna på en varmplåt som är inställd på 37 ° C. Ta bort cellens plåtlock. Bestråla cellerna ovanför plattan i önskad tid (upp till 20 min) med hjälp av UV-lasern med ett 365 nm filter vid en intensitet av 200 W m -2 .
- Ta bort transfektionsmediet och tillsätt 2 ml tillsatt tillväxtmedium. Placera i inkubator tills vidare analys ( t.ex. 24 h för qPCR och 48 h för Western blotting).
- Mät förändringar i genuttryck med användning av en mängd olika tekniker, såsom Western blotting 37 och qPCR. 38 För gener med synliga signaler, såsom GFP, använd fluorescensmikroskopi 29 .
OBS: Dessa tekniker föreslås på grund av användarvänlighet och noggrannhetVid kvantifiering av genuttryck
- Mät förändringar i genuttryck med användning av en mängd olika tekniker, såsom Western blotting 37 och qPCR. 38 För gener med synliga signaler, såsom GFP, använd fluorescensmikroskopi 29 .
6. Reglering av gensläckning i en spatiotemporal form
- Kultur, frö och transfektceller enligt steg 5.1-5.7.
- Förbered en fotomask som helt blockerar 365 nm ljus och minimerar reflektioner.
OBS! I detta fall användes 10 x 10 cm aluminiumfolie och svart konstruktionspapper för att blockera ljuset och minska reflektionerna. Aluminiumsfolien och konstruktionspapper limmades samman för att bilda en enda enhet.- Klipp / stans / maskinera önskad form i fotomasken. Använd till exempel ett skarpt blad och en hålslagare för att bilda ett rakmönster (~ 5 cm långt) respektive ett cirkulärt mönster (~ 7 mm diameter) i fotomasken.
- Limm fotomasken på botten av 6-brunnsplattan med mönstret centrerat under brunnen som innehåller cellerna med den reflekterande sidan ( t.ex. svart cUppläggspapper) vänd mot plattan. Se till att limet inte ligger nära kanten (inom ~ 3 mm) på mönstret.
- Ställ upp två ringen står ungefär 25 cm från varandra och fäst en plattform till varje ringen så att plattformarna är lika stora. Stäng cellplattan mellan de två stativen genom att vila plattan ovanpå plattformarna. Se till att plattan är jämn.
- Bestråla cellerna under provet under önskad tid (upp till 20 minuter) med UV-lasern med ett 365 nm filter med en intensitet på 200 W / m 2 .
- Ta bort transfektionsmediet och tillsätt 2 ml tillsatt tillväxtmedium. Placera i inkubatorn för att återvinna i minst 24 timmar. Bild cellerna med hjälp av fluorescensmikroskopi enligt beskrivningen 29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter formuleringen av nanokarriererna utfördes analyser av siRNA-frisättning för att informera bestrålningsbetingelserna som skall användas vid transfektionerna in vitro . Olika doser av ljus applicerades för bestämning av procenten av siRNA som frisläpptes. Den första analysen användes gelelektrofores för att separera de fria siRNA-molekylerna från siRNA-molekylerna som fortfarande är komplexa / associerade med polymeren. Nanokarrier som inte behandlades med ljus var stabila och släppte inte något siRNA. När strålningstiden var ökad ökade fluorescensintensiteten hos de fria siRNA-banden. Kvantifiering av bandintensiteterna med hjälp av bildanalysprogramvara visade att ~ 15% av siRNA befriades efter 20 min ljusexponering.
Den andra siRNA-frisättningsassayen använde FCS för att mäta procenten av siRNA-molekyler som fritt diffunderar i solution. Baslinjeantalet av proverna innehållande nanokarrierema som inte exponerades för ljus var desamma som räknehastigheterna för blindbuffertkontrollprovet, vilket indikerar att inget fritt siRNA var närvarande. Baslinjans räntesatser ökade när bestrålningstiden ökade. Procenten av fri siRNA beräknades och befanns vara överens med mätningarna erhållna från gelelektrofores. Generellt var uppskattningarna från de två teknikerna inom fel av varandra (p> 0,05 av studentens t-test) och indikerade att procenten av frigivet siRNA inte ökade signifikant med mer än 20 min bestrålning. Det är viktigt att notera att gelelektrofores och FCS användes för att kvantifiera siRNA-frisättning eftersom de är lätta att använda, relativt snabba att analysera och ger exakta resultat.
De relativa mängderna av siRNA som släpptes efter olika doser av ljus infördes som den ursprungliga siRNEn koncentration i den kinetiska modellen. Såsom visas i Figur 1A , kördes modellen för att förutsäga koncentrationerna av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) -mRNA, -protein och -siRNA som en funktion av tiden under varje bestrålningstillstånd. Modellprognoserna för GAPDH-proteinuttrycksnivåerna överensstämde med de experimentellt bestämda uttrycksnivåerna erhållna genom Western blotting ( Figur 1B ). I synnerhet minskade nivån av GAPDH-protein som uttrycktes när bestrålningstiden ökade. Celler som bestrålades under den längsta tidsperioden (20 min) uppvisade de största förändringarna i genuttryck eftersom större mängder siRNA frisläppades. Det är viktigt att celler som inte utsattes för ljus uppvisade ingen genknockdown, vilket indikerar att nanokarriererna upprätthöll dormitet och inte släppte något siRNA om inte utlöses av fotostimulansen. Cytotoxicitetsanalyser visade att NIH / 3T3-cellernaUpprätthålls ≥ 90% viabilitet efter behandling med nanokarrier och 20 min bestrålning 28 .
Figur 1 : Kinetiska modelleringsförutsägelser kontra experimentellt bestämda förändringar i proteinuttryck. ( A ) siRNA-frisättningsdata erhållen från gelelektrofores användes för att modulera initialkoncentrationen av siRNA i den kinetiska modellen. Dessa diagram representerar modellutgången för celler som tar emot 20 min bestrålning. ( B ) De relativa mängderna siRNA från varje bestrålningstillstånd infördes i den kinetiska modellen för att förutsäga förändringar i proteinuttryck. Dessa förutsägelser jämfördes med GAPDH-proteinuttrycknivåer erhållna från Western blotting-analyser. Resultaten visas som medelvärdet ± standardavvikelsen för dAta erhållen från tre oberoende prover. Experimentella data återges delvis med tillstånd från referens 29 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
För att kontrollera genavstängning på ett spatiotemporalt sätt användes en fotomask för att begränsa specifika cellpopulationer till fotostimulansen. Som visas i figur 2 kontrollerades GFP-uttryck i cellerna rumsligt i ett cirkulärt mönster. Celler som skyddades från ljuset uppvisade fluorescensintensiteter som var oskiljbara från kontrollprover som inte behandlades med siRNA och ljus. Emellertid uppvisade nästan alla celler i det cirkulära mönstret inget GFP-uttryck, vilket indikerar effektiv siRNA-frisättning och genknockdown. Dessutom möjliggjorde användningen av ljus som en triggare genuttryck att vara kontrollLedde på celllängdskalor.
Figur 2 : Spatial kontroll över gensläckning. NIH / 3T3-celler samtransfekterades med GFP-pDNA-innehållande lipoplexer och GFP-riktade siRNA / mPEG- b- P (APNBMA) nanokarrier. En cirkulär fotomask applicerades före bestrålning med 365 nm ljus under 20 minuter. Cellerna avbildades på ett fluorescensmikroskop 48 h efter transfektion. Den streckade röda linjen representerar fotomaskens kant och skalfältet representerar 1 mm. Anpassad med tillstånd från referens 29 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns några steg i den metod som är särskilt kritisk. Vid formulering av nanokarriererna är ordningen för komponenttillägg och blandningshastighet två viktiga parametrar som påverkar effekten 39 . Detta protokoll kräver att den katjoniska komponenten, mPEG- b -P (APNBMA), sättes till den anjoniska komponenten, siRNA, på droppvis sätt under virvelbildning. Beroende på den totala formuleringsvolymen tar denna blandningsprocess 3-6 s. För att testa om nanokarrierema formades ordentligt, mäta storleksfördelningen med hjälp av en teknik som dynamisk ljusspridning. MPEG- b -P (APNBMA) / siRNA nanokarrier med ett N / P-förhållande av 4 har en medeldiameter av ~ 140 nm och polydispersitet av ~ 0,2 28 . Vidare kan N / P-förhållandet varieras för att erhålla polyplexer med olika storlekar / stabiliteter. Ett N / P-förhållande av 4 valdes i dessa studier eftersom det var det lägsta förhållandet som möjliggjorde fullständig sekvestration och eliMinering av etidiumbromidfärgning.
En annan kritisk parameter i metoden involverar tillsats av SDS till nanocarrierlösningarna i siRNA-frisättningsanalyserna. SDS, ett anjoniskt ytaktivt medel, användes för att bättre simulera intracellulära miljöer innehållande höga koncentrationer av lipidmembran och polyanjoner 29 , 40 . S / P-förhållandet måste vara tillräckligt högt för att efterlikna överflöd av anjoniska lipider närvarande i celler, men inte så bra att nanokarriererna demonteras före fotostimulans och ytterligare analyser. Ett antal S / P-förhållanden bör testas med gelelektrofores för att identifiera den maximala mängden SDS som kan tillsättas utan att siRNA frigörs. Detta protokoll använde ett relativt högt S / P-förhållande av 15.
En potentiell begränsning av denna metod är relaterad till den kinetiska modelleringen. Modellen kräver inmatning av mRNA- och proteinhalveringstiden för den aktuella genen. TurnovPriserna på gener som har studerats väl kan hittas i litteraturen. Denna information är dock inte tillgänglig för alla gener. För att kringgå detta problem kan halveringstiderna för liknande gener hittas i litteraturen för att ge uppskattningar. Alternativt kan omsättningsgraden för den specifika genen av intresse bestämmas experimentellt 36 . Det är också viktigt att notera att information för tusentals gener kan hittas i sammanställda dataset 41 .
En annan viktig parameter i denna metod är celltyp. NIH / 3T3 fibroblaster användes i dessa studier som modellcellslinje eftersom de har studerats omfattande, är lätta att arbeta med och kan tillämpas på ett antal regenerativa medicinapplikationer. Protokollet kan dock tillämpas på andra celltyper av intresse. Nanocarrierformuleringen kan behöva optimeras för den specifika celltypen.
Sammanfattningsvis, denna metod enBeror på den snabba bestämningen av bestrålningsbetingelser för att spatiotemporalt kontrollera siRNA-frisättning och förutsäga genavstängning a priori . Denna metod skulle lätt kunna anpassas till andra fotoresvarliga nukleinsyraavgivningssystem. Exempelvis kan mPEG- b- P (APNBMA) -polymererna modifieras genom att stämma blocklängderna och / eller funktionella delar för att skräddarsy det fotokänsliga beteendet hos nanokarrierema 42 . Att använda detta protokoll skulle bidra till att belysa struktur-funktionsrelationerna som styr nanocarrierens stabilitet och effektivitet. Dessa mekaniska insikter kan möjliggöra tillämpningar i regenerativ medicin som kräver spatiotemporal kontroll över genavstängning. På grund av det inneboende penetrationsdjupet av 365 nm ljus i vattenhaltiga vävnader är dessa formuleringar väl lämpade för behandling av sjukdomar som manifesteras på kroppsytan, såsom hudcancer och aktuella sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar National Institute of General Medical Sciences i National Institute of Health (NIH) för ekonomiskt stöd genom ett Institutional Development Award (IDeA) under bidragsnummer P20GM103541 samt bidragsnummer P20GM10344615. Uttalandena häri återspeglar inte NIH: s åsikter. Vi erkänner också Delaware Biotechnology Institute (DBI) och Delaware Economic Development Office (DEDO) för ekonomiskt stöd genom Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -priset (12A00448).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
