Summary
我们提出一种新的方法,使用光响应嵌段共聚物更有效的时空控制基因沉默,没有可检测的脱靶效应。此外,可以使用简单的siRNA释放测定法和简单的动力学建模来预测基因表达的变化。
Abstract
需要新的材料和方法来更好地控制需要精确调节基因活性的广泛应用的核酸的结合与释放。特别地,具有改进的基因表达时空控制的新型刺激响应材料将在药物发现和再生医学技术中解锁可翻译平台。此外,增强的控制从材料释放核酸的能力将使得能够开发精简的方法来先验地预测纳米载体功效,从而加速输送载体的筛选。在这里,我们提出了一种通过模块化光响应纳米载体系统预测基因沉默效率和实现基因表达的时空控制的方案。小干扰RNA(siRNA)与mPEG- b-聚(甲基丙烯酸5-(3-(氨基)丙氧基)-2-硝基苄酯)(mPEG- b- P(APNBMA))聚合物与聚rm稳定的纳米载体,可以用光控制,以促进可调谐,开/关siRNA释放。我们概述了使用荧光相关光谱和凝胶电泳的两种互补测定法,用于从模拟细胞内环境的溶液中精确定量siRNA释放。从这些测定中获得的信息被并入到简单的RNA干扰(RNAi)动力学模型中,以预测对各种光刺激条件的动态沉默反应。反过来,这些优化的照射条件允许改进用于时空控制基因沉默的新方案。该方法可以产生具有细胞至细胞分辨率的基因表达中的细胞模式,并且不产生可检测到的脱靶效应。总之,我们的方法提供了一种易于使用的方法来预测基因表达的动态变化并精确控制空间和时间的siRNA活性。这组测定可以容易地适应于测试各种各样的她的刺激反应系统,以解决与生物医学研究和医学中众多应用相关的关键挑战。
Introduction
小干扰RNA(siRNA)通过催化RNAi途径介导转录后基因沉默,该途径对于几乎任何靶基因1具有高度特异性,有效性和可裁剪性。这些有希望的特性已启用siRNA治疗在众多疾病,包括转移性黑素瘤和血友病2,3治疗人类临床试验来推进。然而,重大的交付问题仍然存在,妨碍了翻译4 。特别是,送货车辆必须保持稳定和保护的siRNA从细胞外降解,但也释放有效载荷进入细胞质5。此外,许多RNAi应用需要改进的方法来调节空间和时间6中的基因沉默,这将减少siRNA治疗药物7中的副作用,并使得能够转化应用范围从药物发现的细胞芯片8到再生支架中细胞反应调节的应用9 。这些挑战强调需要新的材料和方法来更好地控制siRNA纳米载体中的结合和释放。
控制siRNA释放和增强时空调节的最有希望的策略之一是使用刺激响应材料10 。例如,响应于改变的氧化还原电位或pH或施加的磁场,超声波或光11 ,已经将各种各样的生物材料设计成具有可变核酸结合亲和力。尽管许多这些系统证明改进了对核酸活性的控制,但由于其瞬时瞬时响应,精确的空间分辨率和易调节性,使用光作为触发器是特别有利的13,14,15遭受困难。光响应siRNA的纳米载体是非常适合克服这些缺点,并提供一种更简单,更可靠的方法来时空调节基因表达16,17,18。不幸的是,准确预测所得到的蛋白质敲低反应的方法仍然难以捉摸。
一个关键的挑战是定量评估siRNA释放罕见19,20,甚至当执行这些评估,它们还没有被耦合到的siRNA /蛋白质周转动力学分析。 siRNA的释放量及其持久性/寿命都是所得基因沉默动力学的重要决定因素;因此,缺乏这样的信息是一个重大的断开,排除RNAi 21中剂量反应的准确预测。解决这一挑战将加快制定纳米载体中适当的结构 - 功能关系,并更好地告知生物材料设计22 。此外,这种方法将能够开发出更有效的siRNA给药方案。在试图了解动态响应沉默,几组已经研究RNAi的23,24,25的数学模型。这些框架是成功地提供对siRNA介导的基因表达变化的认识并鉴定速率限制步骤26 。然而,这些模型仅被应用于不能控制siRNA释放的商业基因递送系统( 例如 ,Lipofectamine和聚乙烯亚胺(PEI)),并且模型的复杂性严重限制了其实用性27 。这些缺点突显出了能够精确调整siRNA释放的新材料与流线型易于使用的预测动力学模型的未满足需求。
我们的方法通过将光敏纳米载体平台与耦合方法整合来量化免费的siRNA和模型RNAi动力学来解决所有这些挑战。特别地,我们的平台的精确控制的siRNA释放28通过两种互补方法进行监测,用于精确定量封装对比结合siRNA。这些测定的实验数据被输入到一个简单的动力学模型,以预测基因沉默效率先验 29 。最后,纳米载体的开/关性质容易被利用以在细胞长度尺度上产生具有空间控制的基因表达中的细胞模式。因此,该方法提供了一种易于适应的方法来控制和预测将受益于细胞行为的时空调节的各种应用中的基因沉默。
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Protocol
1. siRNA纳米载体的制备
- 在pH 6.0下,以等体积稀释于20mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)缓冲液中制备siRNA和mPEG- b- P(APNBMA)的单独溶液。
- 加入浓度为32μg/ mL至20 mM HEPES溶液的siRNA。
注意:siRNA是非靶向的通用阴性对照序列;然而,siRNA可以设计成靶向任何感兴趣的基因。 - 将mPEG- b- P(APNBMA)聚合物溶解到20mM HEPES溶液中。加入适量的mPEG- b- P(APNBMA)制成220μg/ mL溶液,使得N / P比(N,mPEG- b- P(APNBMA)上的胺基团; siRNA上的P,磷酸基团)是4。
注意:mPEG- b- P(APNBMA)聚合物的合成方案在其他地方报道30 。
- 加入浓度为32μg/ mL至20 mM HEPES溶液的siRNA。
- 将mPEG- b- P(APNBMA)溶液逐滴添加至相等的体积e的siRNA溶液,同时在涡流机上轻轻混合。加入聚合物后继续涡旋30秒。在室温下将样品在黑暗中孵育30分钟。
2.使用凝胶电泳测量siRNA释放
- 根据步骤1.1-1.2制备纳米载体,并缩放体积以适应所需的样品数量。
- 将纳米载体与十二烷基硫酸钠(SDS)混合。
- 制备1 mg / mL SDS的水溶液。等分出产生S / P比(S,SDS上的硫酸根; siRNA上的磷酸酯基团)为15的溶液所需的SDS溶液的量。
注意:如果polyplex溶液含有1μgsiRNA,则必须加入13μgSDS以达到15的S / P比。 - 将SDS溶液滴加到每个纳米载体溶液中,同时轻轻混合在涡流机上。 SDS添加后继续涡旋30秒。
- 制备1 mg / mL SDS的水溶液。等分出产生S / P比(S,SDS上的硫酸根; siRNA上的磷酸酯基团)为15的溶液所需的SDS溶液的量。
- 校准并设置具有365nm滤光片的UV激光器至200W / m的强度。确保从样品溶液的底部就座的位置测量光强度。
- 将纳米载体/ SDS溶液装载到由橡胶垫片分隔开的玻璃片组成的玻璃室中。
- 在7:3(v / v)乙醇/水溶液中预先洗涤玻片在水中,并彻底干燥。将一个孔(约2 x 3厘米长方形)切成橡胶垫圈。将橡胶垫圈放在玻璃滑块上。
- 将纳米载体/ SDS溶液吸取到橡胶垫片孔内的玻璃载玻片上。将过量的溶液(剩余20μL)装入玻璃载片上,同时避免与橡胶垫圈接触。
注意:有些液体会在后续步骤中丢失。 - 放第二块玻璃在滑动垫片的顶部滑动。为了避免产生气泡,首先将滑块的一端放下,然后缓慢降低另一端。
- 将夹子夹在玻璃室的每一侧以将其封闭。
- 使用具有365nm滤光器的UV激光以200W / m的强度将样品辐照所需的时间长度( 例如 ,0-60分钟)。拆下夹子夹并打开腔室。
- 将25μL经辐射的纳米载体/ SDS样品吸取到微量离心管中。将溶液在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 准备根据标准方案31在Tris /硼酸盐/ EDTA(TBE)缓冲溶液中用0.5μg/ mL溴化乙锭预染色的2重量%琼脂糖凝胶。制备由3:7(v / v)甘油/水组成的加载缓冲液。
- 将5μL加载缓冲溶液加入到每个纳米载体/ SDS样品的25μL中。在黑暗中孵育样品室温10分钟。
- 将每个纳米载体/ SDS样品加入到2%琼脂糖凝胶中。在100 V的黑暗中运行凝胶30 min。使用凝胶成像系统对溴化乙锭过滤器进行成像。保存凝胶图像文件,并进行步骤2.10进行带强度量化。确保频带强度足够亮以清晰可视,但不要太亮,信号饱和。
- 使用公开的ImageJ软件32来量化频带强度。
- 使用ImageJ的ROI工具,通过在每个条带周围绘制一个矩形来确定每条泳道中游离siRNA条带的荧光强度。绘制每个通道的强度曲线,并通过在强度曲线上绘制水平线并点击封闭区域内的追踪棒来整合曲线下面积。
- 计算每个车道的相对强度,除以下面积的面积通过siRNA阳性对照曲线下的面积(不添加mPEG- b- P(APNBMA)并且不添加SDS)的每个样品的rve。报告每个样品的标准化带强度释放的siRNA百分比。
3.使用荧光相关光谱(FCS)测量siRNA释放
- 获得在有义链的5'末端用单个荧光团标记的siRNA。
注意:可以购买预先与所需位置缀合的标记物进行退火的siRNA。荧光团应该是光稳定的并且吸收/发射在450和750nm之间以避免UV光淬灭和与mPEG- b- P(APNBMA)的能量转移。 - 使用标记的siRNA根据步骤1.1-1.2制备纳米载体。缩放体积以适应所需的样品数量。
- 在SDS中孵育溶液,并按照步骤2.2-2.6照射所需的时间长度。
- PreparFCS样品室。
- 用7:3(v / v)乙醇/水溶液洗涤玻片,并使用擦拭物和空气流将玻璃完全干燥。
- 从双面粘合隔离物上取下纸张以露出双面粘合隔离物。将间隔件连接到玻璃盖玻片上。
- 将纳米载体/ SDS溶液从粘合间隔物移到孔的中间的盖板上。
- 将玻璃滑块放在盖玻片的顶部。推上玻璃滑块,以确保玻璃滑块和盖玻片安装良好并形成密封。
- 使用共焦显微镜进行FCS测量33 。使用数值孔径为1.2的40X水浸式复消色差物镜。使用适当的激发激光通道(488 nm),每个样品34采集至少30次测量值为10 s。确保激光强度和检测器对准保持不变对于每个样品也是一样的。
- 除实验样品外,测量对照包括:无标记siRNA的空白样品;和具有标记的siRNA但不含mPEG- b- P(APNBMA)的游离siRNA样品。
- 使用FCS专用软件分析数据。通过确定在没有纳米载体通过共焦体积29的时间内的稳定计数率来识别每个样品的基线计数率。
- 从每个样本基准计数率值中减去空白样本的计数率。将得到的值归一化为游离siRNA对照,以计算游离siRNA 35的百分比。
4.动力学建模以预测基因沉默
- 使用简单的普通微分方程组建立数学编程语言脚本来预测基因沉默29。
注意:可根据要求提供脚本。- 将普通微分方程组写为:
(1)
(2)
(3)
注意:对于等式1-3,术语k mRNA ,k siRNA和k prot是分别产生mRNA,siRNA和蛋白质的速率常数。术语k m,deg ,k s,deg和k p,deg分别是mRNA,siRNA和蛋白质降解的速率常数。降解速率常数基于组分半衰期计算,生产速率常数适合于确保在不存在o时达到mRNA和蛋白质稳态值f siRNA。- 确定感兴趣的基因的mRNA和蛋白质的半衰期,如参考文献36或文献所述的实验(参见讨论 )。此外,确定细胞系的倍增时间。将这些值输入到适当的降解率表达式中。
- 调整生产速率常数,使得如果不引入siRNA,基因表达水平保持稳定在标准化值100。具体来说,将[siRNA]设定为零,并且改变k mRNA ,k siRNA和k prot生成速率常数的值,直到[mRNA]和[蛋白质]保持在初始标准化值的1%的1%内,持续时间为模拟。
- 使用从前述凝胶电泳和FCS测定法释放的siRNA的相对量作为估计值,调整脚本中siRNA的初始相对浓度。具体来说,[siRNA]与释放的siRNA的相对量成比例,其值为100,对应于最大量29 。
- 将普通微分方程组写为:
细胞培养和体外 siRNA递送
- 根据供应商的方案培养NIH / 3T3鼠胚胎成纤维细胞。
- 在生长培养基(Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养细胞,补充有10%热灭活的胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素)。保持细胞在37℃在5%CO 2的加湿环境中。
- 将细胞种植在6孔组织培养处理板中。
- 按照供应商推荐的传代培养程序。使用血细胞计数器计数细胞。将补充生长培养基中的细胞稀释至75,000个细胞/ mL的浓度。
- 加入2 mL细胞悬浮液(75,000个细胞s / mL)到6孔板的每个孔。让细胞在培养箱中粘附并恢复24小时。
- 通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并向每个孔中加入1.5mL无血清和无抗生素的转染培养基(参见材料表 )来准备转染细胞。
- 根据步骤1.1-1.2制备siRNA纳米载体。向每个孔中加入25μL含有30pmol siRNA的纳米载体溶液。轻轻移动媒体上下混合。将细胞置于培养箱中3小时。
- 取出转染培养基,并用PBS清洗各孔。加入1 mL补充生长培养基,将细胞置于培养箱中30分钟。
- 为了制备细胞用光刺激治疗,去除补充的生长培养基。向每个孔中加入1mL转染培养基(无酚红)。
注意:确保转染介质不含酚红。 - 校准并设置具有365nm滤光片的UV激光器至200W / m的强度。确保从单元板底部的座位位置测量光强度。
- 将细胞置于37℃的热板上。取下电池板盖。使用具有365nm滤光片的UV激光以200Wm -2的强度从板上方照射细胞达所需时间(长达20分钟)。
- 取出转染培养基,加入2 mL补充生长培养基。置于培养箱中直至进一步分析( 例如 ,qPCR为24 h,Western blotting为48 h)。
- 使用各种技术测量基因表达的变化,如Western blotting 37和qPCR。 38对于基因的可见信号,例如GFP,使用荧光显微镜29。
注意:由于其易用性和准确性,建议使用这些技术在量化基因表达
- 使用各种技术测量基因表达的变化,如Western blotting 37和qPCR。 38对于基因的可见信号,例如GFP,使用荧光显微镜29。
6.控制基因沉默在时空的方式
- 根据步骤5.1-5.7的培养,种子和转染细胞。
- 准备一个完全阻挡365nm光并使反射最小化的光掩模。
注意:在这种情况下,使用10 x 10厘米的铝箔和黑色建筑纸分别阻挡光并减少反射。将铝箔和建筑纸胶合在一起以形成单个单元。- 将所需的形状切割/打孔/加工到光掩模中。例如,使用锋利边缘的刀片和打孔机分别在光掩模中形成直线图案(〜5cm长)和圆形图案(〜7mm直径)。
- 将光掩模胶合到6孔板的底部,图案集中在包含具有防反射侧的孔的孔下( 例如 ,黑色c打印纸)面对板。确保胶水不放置在图案边缘(在〜3 mm内)附近。
- 设置大约25厘米的两个环架,并将平台连接到每个环架上,使平台的高度相等。通过将平板固定在平台的顶部,将两个支架之间的悬挂板悬挂在两个支架之间。确保平板是平的。
- 使用具有365nm滤光片的UV激光以200W / m 2的强度从样品下方照射细胞所需的时间(长达20分钟)。
- 取出转染培养基,加入2 mL补充生长培养基。置于培养箱中至少恢复24小时。使用荧光显微镜对细胞进行成像,如29所述。
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Representative Results
在制备纳米载体之后,进行siRNA释放测定以通知用于体外转染的照射条件。应用各种剂量的光以确定被释放的siRNA的百分比。第一个测定法使用凝胶电泳将游离的siRNA分子与仍然与聚合物复合/相关的siRNA分子分离。没有用光处理的纳米载体保持稳定并且不释放任何siRNA。随着照射时间的延长,游离siRNA带的荧光强度增加。使用图像分析软件对带强度的定量表明,在20分钟的曝光后,约15%的siRNA被释放。
第二次siRNA释放测定使用FCS来测量在溶胶中自由扩散的siRNA分子的百分比ution。含有未暴露于光的纳米载体的样品的基线计数率与空白缓冲液对照样品的计数率相同,表明不存在游离的siRNA。基线计数率随照射时间的增加而增加。计算游离siRNA的百分比,发现与从凝胶电泳获得的测量值一致。一般来说,两种技术的估计值彼此误差(Student's t检验为p> 0.05),表明随着照射超过20分钟,siRNA释放的百分比没有显着增加。重要的是注意,使用凝胶电泳和FCS来定量siRNA释放,因为它们易于使用,分析相对较快,并提供准确的结果。
将不同剂量的光释放的siRNA的相对量作为初始siRN进入动力学模型中的浓度。 如图1A所示,运行该模型以在每种照射条件下预测作为时间的函数的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA,蛋白质和siRNA的浓度。 GAPDH蛋白表达水平的模型预测与通过Western印迹获得的实验确定的表达水平一致( 图1B )。特别是,随着照射时间的增加,GAPDH蛋白的表达水平下降。最长时间(20分钟)照射的细胞表现出最大的基因表达变化,因为更多的siRNA被释放。重要的是,没有暴露于光的细胞没有表现出基因敲低,这表明纳米载体保持休眠,并且不会释放任何siRNA,除非由光刺激引发。细胞毒性测定显示NIH / 3T3细胞在纳米载体处理后照射20分钟后维持≥90%的活力28 。
图1 :动力学建模预测与实验确定的蛋白质表达变化。 ( A )从凝胶电泳获得的siRNA释放数据用于调节动力学模型中siRNA的初始浓度。这些图表示接收20分钟照射的细胞的模型输出。 ( B )将每种照射条件下siRNA的相对量输入动力学模型,以预测蛋白质表达的变化。将这些预测与从Western印迹分析获得的GAPDH蛋白表达水平进行比较。结果显示为d的平均值±标准偏差ata从三个独立样品获得。实验数据部分转载自参考文献29的许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
为了以时空方式控制基因沉默,使用光掩模来限制特定细胞群体的光刺激。 如图2所示,细胞中的GFP表达以圆形图案空间控制。被保护免受光照的细胞表现出与未用siRNA和光照处理的对照样品无区别的荧光强度。然而,圆形图案中的几乎所有细胞都没有显示GFP表达,表明有效的siRNA释放和基因敲低。此外,使用光作为触发使得基因表达得以控制带领细胞长度尺度。
图2 :基因沉默的空间控制。用含GFP pDNA的脂质复合物和GFP靶向siRNA / mPEG- b- P(APNBMA)纳米载体共转染NIH / 3T3细胞。在365nm光照射20分钟之前应用圆形光掩模。细胞在转染48小时后的荧光显微镜下成像。虚线红线表示光掩模的边缘,刻度尺表示1mm。适应参考29的许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该方法中有几个步骤特别重要。当配制纳米载体,组分添加和混合速度的顺序是影响功效39的两个重要参数。该方案要求在涡旋下将阳离子组分mPEG- b- P(APNBMA)以滴加方式加入到阴离子组分siRNA中。取决于总制剂体积,该混合过程需要3-6秒。为了测试纳米载体是否正确形成,使用诸如动态光散射的技术来测量尺寸分布。所述的mPEG-b -P(APNBMA)/ siRNA的纳米载体与4的N / P比具有〜140纳米的平均直径和多分散性的〜0.2 28。此外,可以改变N / P比以获得具有不同尺寸/稳定性的复合物。在这些研究中选择了N / P比为4,因为它是能够完全隔离和最终的最低比例灭菌溴化乙锭染色。
该方法中的另一个关键参数包括在siRNA释放试验中向纳米载体溶液中加入SDS。 SDS,阴离子表面活性剂,使用以更好地模拟含有高浓度脂质膜和聚阴离子29,40的细胞内环境。 S / P比必须足够高以模拟细胞中存在的阴离子脂质的丰度,但不太大,以至于在光刺激和进一步分析之前纳米载体分解。应使用凝胶电泳测试一系列S / P比值,以确定不释放siRNA时可加入的最大量的SDS。该协议使用相对较高的S / P比为15。
这种方法的潜在限制与动力学建模有关。该模型需要感兴趣的基因的mRNA和蛋白质半衰期的输入。图尔诺夫已经被很好地研究的基因的呃率可以在文献中找到;然而,这些信息可能不适用于所有基因。为了规避这个问题,可以在文献中找到类似基因的半衰期来提供估计。或者,感兴趣的特定基因的周转率可以通过实验确定36 。重要的是要注意,可以在编译的数据集41中找到数千个基因的信息。
该方法的另一个关键参数是单元格类型。 NIH / 3T3成纤维细胞在这些研究中被用作模型细胞系,因为它们被广泛研究,易于使用,并且适用于许多再生医学应用。然而,该协议可以应用于感兴趣的其他小区类型。可能需要针对特定细胞类型优化纳米载体制剂。
总而言之,这种方法en禁止进入快速测定照射条件,以时空对照siRNA释放和预测的基因沉默的先验 。该方法将易于适应于其它光敏反应核酸递送系统。例如,可以通过调整嵌段长度和/或官能部分来修饰mPEG- b -P(APNBMA)聚合物,以调整纳米载体42的光敏性能。使用该协议将有助于阐明控制纳米载体稳定性和功效的结构 - 功能关系。这些机械学的见解可能使需要对基因沉默进行时空控制的再生医学中的应用。此外,由于水性组织中365nm光的固有穿透深度,这些制剂非常适合于治疗表现在身体表面上的疾病,例如皮肤癌和局部创伤。
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Disclosures
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢美国国家卫生研究院国家卫生研究院(NIH)通过授权号P20GM103541的机构发展奖(IDeA)以及拨款号P20GM10344615提供财政支持。本文中的声明不反映NIH的观点。我们还通过生物科学高级技术中心(Bioscience CAT)奖(12A00448),承认特拉华生物技术研究所(DBI)和特拉华州经济发展办公室(DEDO)的财务支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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