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Bioengineering

फोटो-उत्तरदायी पॉलीमर नैनोकैरियर्स से सीआरएनए रिहाई के स्पैटिटमॉम्रल कंट्रोल के माध्यम से जीन मुंह की भविष्यवाणी करना

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55803
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Summary

हम एक उपन्यास पद्धति पेश करते हैं जो फोटो-प्रति संवेदनशील ब्लॉक कॉपोलीमर्स का उपयोग जीन मुंह बंद करने के अधिक कुशल स्पेटीओटेमप्राल नियंत्रण के लिए करता है, जिसमें कोई डिटेक्टेबल ऑफ-टास्क प्रभाव नहीं होता है। इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन सीधा सीआरएनए रिलीज एलेक्स और सरल कैनेटीक्स मॉडलिंग का उपयोग करके भविष्यवाणी की जा सकती है।

Abstract

बाध्यकारी बनाम को बेहतर नियंत्रण के लिए नई सामग्री और तरीकों की जरूरत है, जिनके लिए आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए न्यूक्लिक एसिड की रिहाई होती है जिनके लिए जीन गतिविधि का सटीक विनियमन आवश्यक होता है। विशेष रूप से, जीन की अभिव्यक्ति पर बेहतर स्टेटियोटेमोरल नियंत्रण वाले उपन्यास उत्तेजनात्मक-उत्तरदायी सामग्री दवा की खोज और पुनर्योजी दवाओं के प्रौद्योगिकियों में अनुवाद योग्य प्लेटफॉर्म को अनलॉक करेगी। इसके अलावा, सामग्री से न्यूक्लिक एसिड रिलीज को नियंत्रित करने की एक बेहतर क्षमता, नैनोकैरियर प्रभावोत्पादकता को प्राथमिकता देने के लिए सुव्यवस्थित तरीकों के विकास को सक्षम करेगी, जिससे डिलीवरी वाहनों की त्वरित जांच होनी चाहिए। इस के तहत, हम एक मॉड्यूलर फोटो-उत्तरदायी नैनोकायरियर सिस्टम के माध्यम से जीन मुंह की क्षमताओं की भविष्यवाणी और जीन अभिव्यक्ति पर स्पीतिओटेमपोरल नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। छोटे दखल आरएनए (एसआईआरएनए) एमपीईजी- बी- पोली (5- (3- (एमिनो) प्रोपॉक्सी) -2-नाइट्रोबैन्ज़ाइल मेथैक्लिलेट के साथ जटिल है (एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए)) के लिए पॉलिमरआरएम स्थिर नैनोआइरियर्स जिन्हें ट्यून करने योग्य, चालू / बंद सीआरएनए रिलीज की सुविधा के लिए प्रकाश से नियंत्रित किया जा सकता है। हम अंतरफलक वातावरण की नकल के समाधान से सीआरएनए रिहाई के सटीक मात्रा का ठहराव के लिए प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी और जेल वैद्युतकणसंचियों को रोजगार के दो पूरक एशेज की रूपरेखा करते हैं। इन एशेज से प्राप्त जानकारी को एक साधारण आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) काइनेटिक मॉडल में शामिल किया गया था ताकि विभिन्न फोटो उत्तेजना स्थितियों के लिए गतिशील मुंह प्रतिक्रियाओं का अनुमान लगाया जा सके। बदले में, इन अनुकूलित विकिरण शर्तों ने स्पीतिओमोग्राम रूप से जीन मुंह को नियंत्रित करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल की परिशोधन की अनुमति दी। यह पद्धति सेल-टू-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ जीन एक्सप्रेशन में सेलुलर पैटर्न उत्पन्न कर सकती है और ऑफ-लिक्विड प्रभावों का कोई भी पता नहीं लगा सकता। एक साथ लिया, हमारे दृष्टिकोण में जीन की अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तन की भविष्यवाणी और अंतरिक्ष और समय में ठीक से सीआरएनए गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एक आसान उपयोग की विधि प्रदान की जाती है। ओटी की एक विस्तृत विविधता का परीक्षण करने के लिए assays का यह सेट आसानी से अनुकूलित किया जा सकता हैबायोमेडिकल रिसर्च और मेडिसिन में कई अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों को संबोधित करने के लिए उनके उत्तेजना-उत्तरदायी सिस्टम।

Introduction

छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (सीआरएनए) एक उत्प्रेरक आरएनएआई मार्ग के माध्यम से पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल जीन मुंह बंद कर देते हैं जो लगभग किसी भी लक्षित जीन 1 के लिए अति विशिष्ट, शक्तिशाली, और सहायक है। ये होनहार विशेषताओं ने सीरियाएन चिकित्सा विज्ञान को मैथेटाटिक मेलेनोमा और हेमोफिलिया 2 , 3 सहित कई रोगों के उपचार के लिए मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में आगे बढ़ने में सक्षम बना दिया है। हालांकि, महत्वपूर्ण डिलीवरी के मुद्दे इस बात से बचे हुए हैं कि अनुवाद 4 में बाधा आई है विशेष रूप से, डिलीवरी वाले वाहनों को स्थिर होना चाहिए और सीआरएनए को बाहरी गिरावट से बचा जाना चाहिए, फिर भी यह कोशिका-कोशिका 5 में पेलोड जारी कर सकता है। इसके अलावा, कई आरएनएआई अनुप्रयोगों में अंतरिक्ष और समय 6 में जीन की चुप्पी को नियंत्रित करने के लिए सुधारित तरीकों की आवश्यकता होती है, जिससे सीआरएनए चिकित्सीय 7 में दुष्प्रभाव कम हो सकते हैं और ट्रांसफॉर्मिव एदवा शोध 8 के लिए सेल माइक्रोएरे से लेकर पुनर्योजी मचान के सेल प्रतिक्रियाओं के मॉड्यूलेशन के लिए 9 ये चुनौतियां नई सामग्री और तरीकों की आवश्यकता को उजागर करती हैं जो सीआरएनएनएनएएनआरएआरियर में बाध्यकारी बनाम रिलायंस को बेहतर नियंत्रण प्रदान करती हैं।

सीआरएनए रिहाई को नियंत्रित करने और स्पीतिओटेम्पोरल विनियमन को बढ़ाने के लिए सबसे अधिक संभावनाजनक रणनीतियों में से एक है उत्तेजना-उत्तरदायी सामग्री 10 का उपयोग उदाहरण के लिए, बायोडेटरीज की विविधता को बदलते रेडॉक्स क्षमता या पीएच, या चुंबकीय क्षेत्र, अल्ट्रासाउंड या हल्के 11 के जवाब में परिवर्तनशील न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी आत्मीयता के साथ इंजीनियर किया गया है। यद्यपि इन प्रणालियों में से कई न्यूक्लिक एसिड गतिविधि पर बेहतर नियंत्रण प्रदर्शित करते हैं, एक ट्रिगर के रूप में प्रकाश का उपयोग इसकी तात्कालिक अस्थायी प्रतिक्रिया, सटीक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और ट्यूनिटाइटी में आसानी के कारण फायदेमंद है 13 , 14 , 15 वितरित करने में कठिनाइयों को विनियमित करते हैं। फोटो-उत्तरदायी सीआरएनए नैनोकैरियरों इन कमियों को दूर करने के लिए आदर्श हैं और जीन एक्सप्रेशन 16 , 17 , 18 के अनुसार स्पीतिओम के लिए सरल और अधिक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। दुर्भाग्य से, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन पछाड़ना प्रतिक्रिया का सही ढंग से अनुमान लगाने के तरीके मायावी रहते हैं

एक प्रमुख चुनौती यह है कि सीआरएनए रिहाई के मात्रात्मक मूल्यांकनदुर्लभ 19 , 20 , और जब ये मूल्यांकन किया जाता है, तब भी वे siRNA / प्रोटीन टर्नओवर डायनेमिक्स के विश्लेषण के लिए युग्मित नहीं हुए हैं। दोनों सीआरएनए जारी किए गए हैं और इसकी दृढ़ता / आजीवन परिणामस्वरूप जीन चुप्पी गतिशीलता के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं; इसलिए, इस तरह की जानकारी का अभाव एक प्रमुख डिस्कनेक्ट है जो आरएनएआई 21 में खुराक-प्रतिक्रिया के सटीक भविष्यवाणी को रोकता है। इस चुनौती को संबोधित करते हुए नैनोआरेरिअर्स में उपयुक्त संरचना-फ़ंक्शन रिलेशन तैयार करने में तेजी आएगी और जैव सामग्री डिजाइन 22 को बेहतर सूचना देगा। इसके अलावा, ऐसे दृष्टिकोण से अधिक प्रभावी siRNA खुराक प्रोटोकॉल का विकास सक्षम होगा। गतिशील गतिशील प्रतिक्रिया को समझने के प्रयास में, कई समूहों ने आरएनएआई 23 , 24 , 25 के गणितीय मॉडल की जांच की है। ये चौखटे थेजीन की अभिव्यक्ति में सीआरएनए-मध्यस्थता परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और दर-सीमित चरणों की पहचान करने में सफल 26 हालांकि, इन मॉडलों को केवल व्यावसायिक जीन डिलीवरी सिस्टम ( उदाहरण के लिए , लिपोफोटेमाइन और पॉलीथिलेमेनिन (पीई)) को लागू किया गया है जो नियंत्रित सीआरएनए जारी करने में सक्षम नहीं हैं, और मॉडलों की जटिलता ने उनकी यूटिलिटी 27 को गंभीर रूप से सीमित कर दिया है। इन कमियों में सुव्यवस्थित और आसानी से उपयोग की जाने वाली भविष्यवाणियों काइनेटिक मॉडल के साथ संयुक्त रूप से ट्यून करने योग्य सीआरएनए रिहाई के लिए सक्षम नई सामग्रियों के लिए एक अनम्यूट आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है।

हमारा तरीका इन सभी चुनौतियों को एक प्रकाश संवेदी नैनोकैरियर प्लेटफॉर्म के एकीकरण के माध्यम से मुक्त siRNA और मॉडल आरएनएआई गतिशीलता को मापने के लिए युग्मित तरीकों के साथ संबोधित करता है। विशेष रूप से, हमारे प्लेटफार्म के ठीक से नियंत्रित सीआरएनए रिहाई 28 को दो पूरक तरीकों से नजर रखी जाती है जो सही ढंग से समसामयिक बनाम संयुक्तबाध्य सीआरएनए इन assays के प्रायोगिक डेटा एक सरल गतिज मॉडल में प्रवेश कर रहे हैं जीन चुप्पी की क्षमता की भविष्यवाणी एक priori 29 अंत में, सेलुलर लम्बाई स्केल पर स्थानिक नियंत्रण के साथ जीन एक्सप्रेशन में सेल पैटर्न उत्पन्न करने के लिए नैनोएरियरों की ऑन / ऑफ़ प्रकृति का आसानी से शोषण किया जाता है। इस प्रकार, यह पद्धति विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में जीन मुंह को नियंत्रित करने और भविष्यवाणी करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय विधि प्रदान करती है जो कि सेल व्यवहार के स्पीतिओटेम्पोरल विनियमन से लाभान्वित होंगे।

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Protocol

1. एसआईआरएनए नैनोकायरियर्स का निर्माण

  1. सीआईआरएनए और एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) के अलग-अलग समाधान तैयार करें जो पीएच 6.0 पर 20 एमएम 4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) पपीरैनीन -1 ईथेनसल्फोनिक एसिड (हेपीस) बफर में पतला बराबर मात्रा के साथ तैयार होते हैं।
    1. 32 माइक्रोग्राम / एमएल से 20 मिमी HEPES समाधान की एकाग्रता में सीआरएनए जोड़ें।
      नोट: siRNA एक गैर लक्षित, सार्वभौमिक नकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम था; हालांकि, siRNA को हित के किसी भी जीन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है।
    2. एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) पॉलिमर को 20 मिमी एचईपीईएस समाधान में भंग कर दें। एक 220 μg / mL समाधान बनाने के लिए उचित मात्रा में एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) जोड़ें ताकि एन / पी अनुपात (एमएपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) पर एन, एमिन समूह, सीआरएनए पर पी, फॉस्फेट समूह) 4 है
      नोट: एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) पॉलिमर के लिए सिंथेटिक प्रोटोकॉल 30 में कहीं और बताया गया है।
  2. एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) समाधान ड्रॉप डाउन एक बराबर वॉल्यूम में जोड़ेंईआरआरएनए समाधान के ई जबकि धीरे से एक भंवर मशीन पर मिश्रण। 30 एस के निम्नलिखित बहुलक इसके अलावा के लिए भंवर जारी रखें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूने सेते हैं

2. मापने siRNA रिलीज जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते हुए

  1. चरण 1.1-1.2 के अनुसार नैनोकारियरों को तैयार करना, और वांछित नमूनों की संख्या को समायोजित करने के लिए वॉल्यूम को स्केल करें।
  2. सोडियम डाोडेसील सल्फेट (एसडीएस) के साथ नैनोकैरियर को मिलाएं।
    1. पानी में एसडीएस का 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें। एसडीएस समाधान की मात्रा बाहर विभाजित करने के लिए एक एस / पी अनुपात (एस एसडीएस पर पी, सल्फेट समूह, पी, एसएफआरए पर फॉस्फेट समूह) का समाधान करने के लिए आवश्यक 15।
      नोट: यदि पॉलीप्लेक्स समाधान में 1 μg siRNA शामिल है, तो एसडीएस के 13 μg को 15 / एस अनुपात प्राप्त करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए।
    2. धीरे-धीरे भंवर मशीन पर मिश्रण करते हुए प्रत्येक नैनोकारियर समाधान के नीचे एसडीएस समाधान जोड़ें। 30 एस के निम्नलिखित एसडीएस अतिरिक्त के लिए भंवर जारी रखें।
  3. एक यूवी लेजर को 365 एनएम फिल्टर के साथ 200 W / एम की तीव्रता में कैलिब्रेट करें और सेट करें सुनिश्चित करें कि प्रकाश की तीव्रता को उस स्थान से मापा जाता है जिस पर नमूना समाधान के नीचे बैठे होंगे।
  4. रबर गैसकेट द्वारा अलग किए गए गिलास स्लाइड्स के गिलास कक्ष में नैनोकैरियर / एसडीएस समाधान लोड करें
    1. पानी में एक 7: 3 (वी / वी) इथेनॉल / पानी के समाधान में कांच के स्लाइड्स को प्री-वॉश करें और पूरी तरह से शुष्क करें। एक रबड़ गैसकेट में एक छेद (~ 2 x 3 सेंटीमीटर आयत) काटें। एक गिलास स्लाइड पर रबर गैसकेट रखें
    2. रबर गैसकेट के छेद के अंदर ग्लास स्लाइड पर नैनोकैरियर / एसडीएस समाधान को पिपेट करें रबर गैसकेट के साथ संपर्क से परहेज करते समय कांच की तरफ अधिक समाधान (अतिरिक्त में 20 μL) लोड करें
      नोट: कुछ तरल बाद के चरणों में खो जाएंगे।
    3. दूसरा ग्लास रखेंस्लाइड-गैसकेट के ऊपर स्लाइड हवाई बबल पीढ़ी से बचने के लिए, स्लाइड के एक छोर को पहले नीचे रखें और फिर दूसरे छोर को धीरे-धीरे कम करें
    4. इसे बंद रखने के लिए ग्लास चेंबर के प्रत्येक किनारे पर बाइंडर क्लिप संलग्न करें।
  5. यूवी लेजर का 200 W / एम की तीव्रता में एक 365 एनएम फिल्टर के साथ वांछित लम्बाई के समय के नमूनों को विचलित करें ( जैसे , 0-60 मिनट) बाइंडर क्लिप निकालें और कक्ष खोलें
  6. विकिरणित नैनोकैरियर / एसडीएस नमूनों के 25 μL को माइक्रोप्रोसेफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में समाधान सेते हैं
  7. मानक प्रोटोकॉल 31 के अनुसार ट्रिस / बोराटे / ईडीटीए (टीबीई) बफ़र समाधान में 0.5 μg / एमएल एथिडियम ब्रोमाइड के साथ पूर्व में 2% watt% agarose जेल तैयार करें। 3: 7 (वी / वी) ग्लिसरॉल / पानी से युक्त लदान बफर तैयार करें
  8. प्रत्येक नैनोकैरियर / एसडीएस नमूने के 25 μL को लदान बफर समाधान के 5 μL जोड़ें। अंधेरे में नमूने सेते हैं10 मिनट के लिए कमरे का तापमान
  9. 2% agarose जेल में प्रत्येक नैनोकारियर / एसडीएस नमूना के 30 μL लोड करें। अंधेरे में जेल को 30 मिनट के लिए 100 वी पर चलाएं एथिडियम ब्रोमाइड फिल्टर के साथ एक जेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर जेल छवि। जेल छवि फ़ाइलों को सहेजें और बैंड तीव्रता मात्रा का ठहराव के लिए चरण 2.10 पर आगे बढ़ें। सुनिश्चित करें कि बैंड की तीव्रता स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए उज्ज्वल है लेकिन बहुत उज्ज्वल नहीं है कि संकेत संतृप्त हैं।
  10. सार्वजनिक रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ़्टवेयर 32 का उपयोग करके बैंड की तीव्रता को बढ़ाएं।
    1. ImageJ के आरओआई टूल का उपयोग करना, प्रत्येक बैंड के चारों ओर एक आयताकार चित्रण करके प्रत्येक लेन में मुफ्त सीआरएनए बैंड के प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करता है। प्रत्येक लेन की तीव्रता घटता करें, और तीव्रता घटता में एक क्षैतिज रेखा खींचकर और संलग्न क्षेत्रों के अंदर ट्रेसिंग की छड़ी पर क्लिक करके घटता के नीचे क्षेत्र को एकीकृत करें।
    2. क्यू के तहत क्षेत्र को विभाजित करके प्रत्येक लेन की सापेक्ष तीव्रता की गणना करेंसीआरएनए पॉजिटिव कंट्रोल (कोई एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) जोड़ा और कोई एसडीएस जोड़ा नहीं) की वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा प्रत्येक नमूने का उतार प्रत्येक नमूने के सामान्यीकृत बैंड तीव्रता के रूप में जारी siRNA के प्रतिशत की रिपोर्ट करें

3. प्रतिरूपण सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) का उपयोग करते हुए सीआरएनए रिलीज को मापना

  1. भावना किनारे के 5 'अंत में एक फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किया गया siRNA प्राप्त करें
    नोट: सीआरएनए को वांछित स्थान में संयुग्मित किए गए लेबल के साथ प्री-एनील खरीदा जा सकता है। फ्लोरोफोरे को फोटो-स्थिर होना चाहिए और एमवीजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) के साथ यूवी प्रकाश शमन और ऊर्जा हस्तांतरण से बचने के लिए 450 और 750 एनएम के बीच अवशोषित होना चाहिए।
  2. लेबल siRNA का उपयोग करते हुए चरण 1.1-1.2 के अनुसार नैनोकारियरों को तैयार करें। अपेक्षित नमूनों की संख्या को समायोजित करने के लिए वॉल्यूम स्केल करें
  3. एसडीएस में समाधान सेते हैं और चरण 2.2-2.6 के अनुसार वांछित लम्बाई के लिए विचलित करें।
  4. preparएफसीएस नमूना कक्ष का आयन
    1. एक 7: 3 (वी / वी) इथेनॉल / पानी के समाधान के साथ एक ग्लास स्लाइड धोएं और पोंछे और एक वायु प्रवाह का उपयोग करके कांच का पूरी तरह से सूखा लें।
    2. डबल पक्षीय चिपकने वाला स्पेसर को बेनकाब करने के लिए एक डबल पक्षीय चिपकने वाला स्पेसर से कागज के टुकड़े निकालें। स्पेसर को एक ग्लास कंसलिप से संलग्न करें
    3. चिपकने वाला स्पेसर से छेद के बीच में कवर स्लिप पर नैनोकैरियर / एसडीएस समाधान को पिपेट करें।
    4. कवर्लिप के ऊपर ग्लास स्लाइड रखें। ग्लास स्लाइड पर पुश करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि गिलास स्लाइड और कंसलिप अच्छी तरह से जुड़े हुए हैं और सील बनाते हैं।
  5. एफसीएस मापन 33 के लिए एक confocal सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें 1.2 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40 एक्स पानी विसर्जन apochromat उद्देश्य का उपयोग करें। उचित उत्तेजना लेजर चैनल (488 एनएम) का प्रयोग करें ताकि प्रत्येक प्रति नमूना 34 में कम से कम 30 माप 10 एस हो सके। सुनिश्चित करें कि लेजर की तीव्रता और डिटेक्टर संरेखण बने रहेंप्रत्येक नमूने के लिए एक ही है।
    1. प्रयोगात्मक नमूनों के अलावा, माप नियंत्रण सहित: बिना किसी लेबल के सीआरएनएनए रिक्त नमूना; और लेबल siRNA के साथ एक मुक्त सीआरएनए नमूना लेकिन कोई एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) नहीं है।
  6. एफसीएस-विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें। प्रत्येक नमूने की आधारभूत गणना दर को उस समय के दौरान स्थिर गिनती दर का निर्धारण करने के लिए पहचानें जब कोई नैनोकारियर confocal volume 29 से गुजर रहे हों
    1. प्रत्येक नमूना बेसलाइन गणना दर मान से रिक्त नमूने की गणना दर घटाएं। मुक्त siRNA 35 के प्रतिशत की गणना करने के लिए मुक्त सीआरएनए नियंत्रण के लिए परिणामी मानों को सामान्य करें।

4. गन मुहर लगने की भविष्यवाणी करने के लिए काइनेटिक मॉडलिंग

  1. साधारण अंतर समीकरणों के सरल सेट का उपयोग कर 2 सायलेंसिंग जीन की भविष्यवाणी करने के लिए एक गणितीय प्रोग्रामिंग भाषा में स्क्रिप्ट बनाएं9
    नोट: अनुरोध पर लिपियों को उपलब्ध कराया जा सकता है।
    1. साधारण अंतर समीकरणों का सेट लिखें:
      समीकरण 1 (1)
      समीकरण 2 (2)
      समीकरण 3 (3)
      नोट: 1-3 समीकरणों के लिए, क्रमशः एमआरएनए, सीआरएनए, और प्रोटीन के उत्पादन के लिए दर कण एमआरएनए , के सीआरएनए , और कश्मीर प्रोस्ट दर स्थिरांक हैं शब्द के एम, डीजे , के एस, डीजे , और पी पी, डीजे क्रमशः एमआरएनए, सीआरएनए, और प्रोटीन की गिरावट के लिए दर स्थिर हैं। गिरावट दर स्थिरांक घटक आधा जीवों के आधार पर गिना जाता है, और उत्पादन दर स्थिरांक यह सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त हैं कि अनुपस्थिति में एमआरएनए और प्रोटीन स्थिर-राज्य मानों तक पहुंचे।एफ siRNA
      1. रुचि के जीन (एस) के लिए एमआरएनए और प्रोटीन का आधा जीवन निर्धारित करें, या तो प्रयोगात्मक रूप में संदर्भ 36 में वर्णित है या साहित्य से ( चर्चा देखें)। इसके अलावा, सेल लाइन के लिए दोहरीकरण का समय निर्धारित करें। इन मूल्यों को उचित गिरावट दर अभिव्यक्ति में इनपुट करें।
      2. उत्पादन दर स्थिरांक ट्यून करें ताकि जीन की अभिव्यक्ति का स्तर 100 के सामान्यीकृत मान पर स्थिर रहे, यदि कोई सीआरएएनएनए शुरू नहीं किया गया है। विशेष रूप से, [एसयूआरएनए] को शून्य में सेट करें और केआरएमआरए , के सीआरएनए , और कश्मीर प्रोट उत्पादन दर स्थिरांक [एमआरएनए] और [प्रोटीन] तक के मूल्यों को बदलते समय की अवधि के लिए 100% के प्रारंभिक सामान्य मान के 1% सिमुलेशन
      3. पहले वर्णित जेल वैद्युतकणसंचियों और एफसीएस एशेज से अनुमानित रूप से जारी होने वाले सीआरएनएनए की रिश्तेदार मात्रा का प्रयोग करते हुए स्क्रिप्ट में सीआरएनएनए की शुरुआती रिश्तेदार एकाग्रता को समायोजित करना। विशेष रूप से, भिन्न [siRN]ए] जारी किए गए सीआरएनए की सापेक्ष मात्रा के बराबर होने के लिए, 100 के मान के साथ अधिकतम राशि 29 के अनुरूप होगा।

5. सेल संस्कृति और विट्रो siRNA डिलिवरी में

  1. सप्लायर से प्रोटोकॉल के अनुसार संस्कृति एनआईएच / 3 टी 3 मूरीन भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट।
    1. विकास माध्यमों (10% ताप-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) के पूरक के साथ विकासशील मध्यम कोशिकाओं (दल्बेईको के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) बढ़ो। 5% सीओ 2 के साथ आर्द्रीकृत वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें
  2. 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर वाले इलाज प्लेटों में कोशिकाओं को बीज मिलाएं।
    1. आपूर्तिकर्ता से अनुशंसित उपसंकलन प्रक्रिया का पालन करें। एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें 75,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए पूरक विकास मीडिया में कोशिकाओं को पतला।
    2. सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें (75,000 सेलएस / एमएल) 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए कोशिकाओं का पालन करें और इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए पुनर्प्राप्त करें।
  3. फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ धुलाई करके अभिकर्मकों के लिए कोशिकाओं को तैयार करें और 1.5 एमएल का सीरम और एंटीबायोटिक-मुक्त अभिकर्मक माध्यम (प्रत्येक तालिका में सामग्री की तालिका देखें) को जोड़ दें।
  4. चरण 1.1-1.2 के अनुसार सीआरएनएनएनए एनएनाइओरियरों को तैयार करें। प्रत्येक कूल्हे में 30 ℃ के सीएनआरएनएन वाले नैनोकैरिअर समाधान के 25 μL जोड़ें। धीरे से मीडिया को ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए विंदुक। 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखें
  5. अभिकर्मक मीडिया को निकालें और पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोएं। पूरक वृद्धि मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए पुनर्प्राप्त करें।
  6. फोटो-उत्तेजना के साथ इलाज के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, पूरक विकास मीडिया को हटा दें। प्रत्येक खैर को 1 एमएल का अभिकर्मक मीडिया (फिनोल लाल के बिना) जोड़ें
    नोट: सुनिश्चित करें कि अभिकर्मक मीडिया में फिनोल लाल नहीं है।
  7. एक यूवी लेजर को 365 एनएम फिल्टर के साथ 200 W / एम की तीव्रता में कैलिब्रेट करें और सेट करें सुनिश्चित करें कि प्रकाश की तीव्रता को उस स्थान से मापा जाता है जिस पर सेल प्लेट के नीचे बैठा होगा।
  8. कोशिकाओं को एक गर्म प्लेट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कोशिकाओं के प्लेट कवर को निकालें 200 डिग्री एम -2 की तीव्रता में 365 एनएम फिल्टर के साथ यूवी लेजर का उपयोग करके इच्छित समय (अधिकतम 20 मिनट) तक प्लेट से ऊपर की कोशिकाओं को विचलित करना
  9. अभिकर्मक मीडिया को निकालें और पूरक वृद्धि मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। आगे के विश्लेषण तक इनक्यूबेटर में रखें ( उदाहरण के लिए , क्यूपीसीआर के लिए 24 घंटे और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए 48 घंटे)।
    1. पश्चिमी ब्लॉटिंग 37 और qPCR जैसे विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए जीन एक्सप्रेशन में परिवर्तनों को मापें 38 दृश्य संकेतों के साथ जीनों के लिए, जैसे जीएफपी, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 29 का उपयोग करें।
      नोट: इन तकनीकों का उपयोग और सटीकता में आसानी के कारण सुझाव दिया गया हैजीन अभिव्यक्ति की मात्रा बढ़ाते हुए

6. स्पिटेओटेमपोरल मैनर में जीन मुंह बंद करने पर नियंत्रण

  1. 5.1-5.7 के चरणों के अनुसार संस्कृति, बीज और ट्रांसफ़ेक्ट सेल।
  2. एक फोटोमास्क तैयार करें जो कि पूरी तरह से 365 एनएम प्रकाश को ब्लॉक करता है और प्रतिबिंबों को कम करता है।
    नोट: इस मामले में, एल्यूमीनियम पन्नी के 10 x 10 सेमी टुकड़े और काली निर्माण कागज का उपयोग प्रकाश को रोकने और प्रतिबिंब को कम करने के लिए किया गया था, क्रमशः। एक इकाई बनाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और निर्माण कागज एक साथ चिपकाए गए थे।
    1. काट / पंच / मशीन फोटोग्राफिक में वांछित आकार। उदाहरण के लिए, सीधे-रेखा पैटर्न (~ 5 सेमी लंबा) और एक सर्कुलर पैटर्न (~ 7 मिमी व्यास) को क्रमशः photomask में बनाने के लिए एक तेज-धार वाले ब्लेड और छेद-छिद्र का प्रयोग करें।
  3. 6-अच्छी तरह से थाली के तल पर फोटोमास्क को गोंद करें, जो कि विरोधी-चिंतनशील पक्ष के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से युक्त पैटर्न के साथ केंद्रित करता है ( जैसे , काली सीOnstruction कागज) प्लेट का सामना करना पड़ सुनिश्चित करें कि पैटर्न के किनारे (~ 3 मिमी के भीतर) के पास गोंद नहीं रखा गया है
  4. दो अंगूठी सेट अप लगभग 25 सेमी अलग रखता है और प्रत्येक अंगूठी खड़ा करने के लिए एक मंच संलग्न ताकि प्लेटफार्म समान ऊंचाई के हैं प्लेटों के शीर्ष पर प्लेट को आराम करके दो खड़े के बीच सेल प्लेट को निलंबित करें। यह सुनिश्चित करें कि प्लेट स्तर है।
  5. 200 W / m 2 की तीव्रता में 365 एनएम फिल्टर के साथ यूवी लेजर का उपयोग करके इच्छित समय (20 मिनट तक) के लिए नमूने से नीचे के कक्षों का विचरण करें।
  6. अभिकर्मक मीडिया को निकालें और पूरक वृद्धि मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। कम से कम 24 घंटे के लिए पुनर्प्राप्त करने के लिए इनक्यूबेटर में रखें छवि के रूप में वर्णित 29 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं।

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Representative Results

नैनोआरेरिअर्स के निर्माण के बाद, इन विट्रो ट्रांसफ़ेक्शन में इस्तेमाल होने वाली विकिरण की स्थिति को सूचित करने के लिए सीआरएनए रिहाई एल्स आयोजित किए गए थे। सीआरएनए के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए प्रकाश के विभिन्न खुराकों को लागू किया गया था जो जारी किया गया था। पहले परख जेल वैद्युतकणसंचिकित्सा का इस्तेमाल किया गया था जो अभी भी जटिल / बहुलक के साथ जुड़ा हुआ siRNA अणुओं से मुक्त siRNA अणुओं को अलग कर सकता है। प्रकाश के साथ इलाज नहीं किया गया था कि नैनोकायरियरों स्थिर बने रहे और किसी भी siRNA जारी नहीं किया चूंकि विकिरण के समय में वृद्धि हुई, मुफ्त सीआरएनए बैंड की प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए बैंड तीव्रता का मात्रा दर्शाता है कि ~ 60% प्रकाश प्रदर्शन के बाद siRNA का ~ 15% मुक्त था।

दूसरी सीआरएनएनए रिहाई परख एफसीएस का उपयोग सीआरएनए अणुओं के प्रतिशत को मापने के लिए करता है जो स्वतंत्र रूप से सपाट में फैल रहे थेसंविधान। प्रकाश के संपर्क में नैनोकारियर्स वाले नमूनों की आधारभूत गणना दर रिक्त बफर नियंत्रण नमूने की गिनती दर के समान थीं, यह दर्शाता है कि कोई भी मुक्त आरआरएनए मौजूद नहीं था। इर्रेडिएशन समय में वृद्धि के रूप में बेसलाइन गणना दर में वृद्धि हुई। मुक्त सीआरएनए का प्रतिशत गणना और जेल वैद्युतकणसंचलन से प्राप्त मापन के साथ समझौते में पाया गया था। आम तौर पर, दो तकनीकों का अनुमान एक-दूसरे की त्रुटि (पी> 0.05 विद्यार्थी के टी-परीक्षण) के बीच होता था और संकेत दिया था कि सीआरएनए जारी की गई प्रतिशत में 20 मिनट से अधिक विकिरण के साथ उल्लेखनीय वृद्धि नहीं हुई थी। यह ध्यान रखना जरूरी है कि जेल वैद्युतकणसंचलन और एफसीएस का उपयोग सीआरएनए जारी करने के लिए किया गया क्योंकि वे उपयोग करना आसान, विश्लेषण करने के लिए अपेक्षाकृत तेजी से, और सटीक परिणाम प्रदान करते हैं।

प्रकाश की विभिन्न मात्रा के बाद जारी siRNA की रिश्तेदार मात्रा प्रारंभिक सीआरएन के रूप में दर्ज की गई थीकैनेटीक्स मॉडल में एकाग्रता चित्रा 1 ए में दिखाए गए अनुसार, मॉडल को प्रत्येक विकिरण की स्थिति के तहत समय के एक फ़ंक्शन के रूप में ग्लिसराइडहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच) एमआरएनए, प्रोटीन, और सीआरएनएनए की सांद्रता का अनुमान लगाया गया था। GAPDH प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए मॉडल भविष्यवाणियां पश्चिमी ब्लॉटिंग ( चित्रा 1 बी ) के माध्यम से प्राप्त प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक समझौते में थीं। विशेष रूप से, जीएपीएएचएच प्रोटीन का स्तर कम हो गया क्योंकि विकिरण का समय बढ़ा है। जिन कोशिकाओं को सबसे लंबी अवधि (20 मिनट) के लिए विकिरणित किया गया था, जीन अभिव्यक्ति में सबसे बड़े परिवर्तनों को प्रदर्शित किया गया क्योंकि सीआरएनए की अधिक मात्रा जारी की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, कोशिकाओं को प्रकाश में उजागर नहीं किया गया था जो कोई जीन पछाड़ना प्रदर्शित नहीं करता, यह दर्शाता है कि नैनोकारियरों ने निश्चिंतता को बनाए रखा है और किसी भी सीआरएएनएन जारी नहीं किया है, जब तक कि फोटो-उत्तेजना द्वारा ट्रिगर नहीं किया गया। साइटोसॉक्सीसिटी एनाशियों ने एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाओं का प्रदर्शन कियाबनाए रखा ≥ 90% व्यवहार्यता नैनोआरेरिअर्स और 20 मिनट की विकिरण 28

आकृति 1
चित्रा 1 : काइनेटिक मॉडलिंग भविष्यवाणियां बनाम प्रोटीन अभिव्यक्ति में प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित परिवर्तन। ( ए ) जेल वैद्युतकणसंचिकरण से प्राप्त सीआरएनए रिहाई डेटा का उपयोग कैनेटीक्स मॉडल में एसआईआरएनए की प्रारंभिक एकाग्रता को व्यवस्थित करने के लिए किया गया था। ये ग्राफ़ 20 मिनट का विकिरण प्राप्त करने वाले कोशिकाओं के लिए मॉडल आउटपुट का प्रतिनिधित्व करता है। ( बी ) प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की भविष्यवाणी करने के लिए प्रत्येक विकिरण की स्थिति से सीआरएनएन की सापेक्ष मात्रा गतिशील मॉडल में दर्ज की गई थी। इन भविष्यवाणियों की तुलना पश्चिमी खामियों के विश्लेषण से प्राप्त जीएपीडीएच प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर से की गई थी। परिणाम डी के मानक ± मानक विचलन के रूप में दिखाए जाते हैंएटा तीन स्वतंत्र नमूने से प्राप्त प्रायोगिक आंकड़ों को संदर्भ 2 में से अनुमति के साथ भाग में पुनः प्रकाशित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

स्टेटीओटेमोरल तरीके से जीन मुंह को नियंत्रित करने के लिए, फोटोमास्क विशिष्ट सेलुलर आबादी को फोटो-उत्तेजना तक सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, कोशिकाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति एक परिपत्र पैटर्न में स्पेसलीय नियंत्रित थी। कोशिकाओं जो प्रकाश से प्रतिरक्षित प्रतिदीप्ति तीव्रता से संरक्षित किया गया था जो नियंत्रण नमूने से अप्रभेद्य थे siRNA और प्रकाश के साथ इलाज नहीं। हालांकि, परिपत्र पैटर्न के लगभग सभी कक्षों में कोई जीएफपी अभिव्यक्ति नहीं दिखाई गई, जो कुशल सीआरएनए रिहाई और जीन पछाड़ना दर्शाती है। इसके अलावा, एक ट्रिगर के रूप में प्रकाश का उपयोग जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए किया जाता हैसेलुलर लंबाई के पैमाने पर नेतृत्व किया।

चित्र 2
चित्रा 2 : जीन मुंह बंद करने पर स्थानिक नियंत्रण। एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाओं को जीएफपी पीडीएनए युक्त लिपोप्लेक्स और जीएफपी-लक्ष्यीकरण सीआरएनए / एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) नैनोएरियरों के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। एक परिपत्र फोटोमास्क 20 मिनट के लिए 365 एनएम प्रकाश के साथ विकिरण से पहले लागू किया गया था। कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 48 घंटे के बाद अभिकर्मक पर चित्रित किया गया था। धराशायी लाल रेखा, फोटॉमॉस्क के किनारे का प्रतिनिधित्व करता है, और पैमाने बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। संदर्भ 29 से अनुमति के साथ अनुकूलित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

ऐसी विधि में कुछ कदम हैं जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। जब nanocarriers तैयार करने, घटक अलावा और मिश्रण गति के आदेश प्रभावकारिता 39 को प्रभावित करने के लिए दो महत्वपूर्ण मापदंड हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है कि cationic घटक, एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए), एनोनिक घटक, सीआरएनए में जोड़ा जाता है, एक ड्रॉप-डाउन फैशन में जबकि भंवरेबाजी कुल निर्माण मात्रा के आधार पर, यह मिश्रण प्रक्रिया 3-6 एस लेती है जांच करने के लिए कि नैनोकारियर्स ठीक से बनाए गए थे, गतिशील प्रकाश बिखरने जैसे तकनीक का उपयोग करके आकार वितरण को मापें। 4 के एन / पी अनुपात के साथ एमपीईजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) / सीआरएनएनए एनएनाइएरियरों का औसत व्यास ~ 140 एनएम और पॉलीइडिस्प्रेसिटी 0.2 ~ 28 है । इसके अलावा, एन / पी अनुपात विभिन्न आकारों / स्थिरता वाले पॉलीप्लेक्स प्राप्त करने के लिए अलग-अलग हो सकते हैं। इन अध्ययनों में 4 का एक एन / पी अनुपात चुना गया क्योंकि यह सबसे कम अनुपात था, जो पूर्ण सिकुड़न और एली को सक्षम करता थानैदानिक ​​ब्रोमाइड धुंधला हो जाना

इस पद्धति में एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर में एसआरएस को एनआरओ रिले एल्स में नैनोकैरियर समाधान में शामिल किया गया है। एसडीएस, एक एनोनिक सर्फेटेंट , लिपिड झिल्ली और polyanions 29 , 40 के उच्च सांद्रता वाले इंट्रासेल्युलर वातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कोशिकाओं में मौजूद एनीऑनिक लिपिड की प्रचुरता की नकल करने के लिए एस / पी अनुपात पर्याप्त रूप से उच्च होना चाहिए, लेकिन नैनोकारियरों को फोटो-उत्तेजना और आगे के विश्लेषण से पहले अलग करना नहीं है। सीआरएनए जारी किए बिना जोड़ा जा सकता है एसडीएस की अधिकतम राशि की पहचान करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एस / पी अनुपात की एक श्रेणी का परीक्षण किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल ने 15 के एक अपेक्षाकृत उच्च एस / पी अनुपात का इस्तेमाल किया

इस पद्धति का एक संभावित सीमा कैनेटीक्स मॉडलिंग से संबंधित है। मॉडल में रुचि के जीन के एमआरएनए और प्रोटीन आधा जीवन के इनपुट की आवश्यकता होती है। Turnovजिन जीनों का अच्छा अध्ययन किया गया है उनके लिए एआर रेट साहित्य में पाए जा सकते हैं; हालांकि, यह जानकारी सभी जीनों के लिए उपलब्ध नहीं हो सकती है इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, अनुमानों को प्रदान करने के लिए साहित्य में समान जीन के आधे जीवन पाए जा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की विशिष्ट जीन के लिए टर्नओवर दर निर्धारित रूप से 36 निर्धारित किया जा सकता है यह भी नोट करना महत्वपूर्ण है कि संकलित डेटा सेटों में हजारों जीनों के लिए जानकारी मिलती है 41

इस विधि में एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर सेल प्रकार है। इन अध्ययनों में एनआईएच / 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट का प्रयोग मॉडल सेल लाइन के रूप में किया गया क्योंकि उनका व्यापक अध्ययन किया गया है, साथ काम करना आसान है, और कई पुनर्योजी दवाओं के अनुप्रयोगों के लिए लागू है हालांकि, प्रोटोकॉल अन्य सेल प्रकार के ब्याज के लिए लागू किया जा सकता है। विशिष्ट सेल प्रकार के लिए नैनोकैरियर तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है।

संक्षेप में, यह विधि एनसीरानिया रिसाई को नियंत्रित करने और जीन को एक प्राथमिकता को मुंह बंद करने की भविष्यवाणी करने के लिए स्तरीय विकिरण शर्तों के तेजी से दृढ़ संकल्प को आगे बढ़ाता है। यह विधि अन्य फोटो-प्रतिक्रियात्मक न्यूक्लिक एसिड डिलीवरी सिस्टम के लिए आसानी से अनुकूलनीय होगी। उदाहरण के लिए, एनएपीएजी- बी- पी (एपीएनबीएमए) पॉलिमर को नैनोआरेरर्स 42 के फोटो-संवेदी व्यवहार को बनाने के लिए ब्लॉक की लंबाई और / या कार्यात्मक मयियतों को ट्यूनिंग द्वारा संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को नियोजित करने से नैनोकैरिअर स्थिरता और प्रभावकारिता को नियंत्रित करने वाले संरचना-समारोह रिश्तों को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी। ये यंत्रवत् अंतर्दृष्टि पुनर्योजी दवाओं में अनुप्रयोगों को सक्षम कर सकती हैं जिनकी जीन मुंह बंद करने पर स्पीतिओटेम्पोरल नियंत्रण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, जलीय ऊतकों में 365 एनएम प्रकाश की अंतर्निहित प्रवेश की गहराई के कारण, ये फार्मूलियां शरीर की सतह पर प्रकट रोगों के उपचार के लिए उपयुक्त हैं जैसे कि त्वचा के कैंसर और सामयिक घाव।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

लेखकों ने अनुदान संख्या P20GM103541 के साथ-साथ अनुदान संख्या P20GM10344615 के तहत संस्थागत विकास पुरस्कार (आईडीईए) के माध्यम से वित्तीय सहायता के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज का धन्यवाद किया है। यहां दिए गए विवरण एनआईएच के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। हम डेलावेयर बायोटेक्नोलॉजी इंस्टीट्यूट (डीबीआई) और डेलावेयर इकोनॉमिक डेवलपमेंट ऑफिस (डीईडीओ) को बायोसाइंस सेंटर फॉर एडवांस्ड टेक्नोलॉजी (बायोसाइंस कैट) अवार्ड (12 ए 00448) के माध्यम से वित्तीय सहायता के लिए भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media

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References

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फोटो-उत्तरदायी पॉलीमर नैनोकैरियर्स से सीआरएनए रिहाई के स्पैटिटमॉम्रल कंट्रोल के माध्यम से जीन मुंह की भविष्यवाणी करना
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Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).

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