Summary
تصف هذه الورقة اثنين من الإضافات إيماجيج رواية لتحليل الصور "مسح الساعة". هذه الإضافات توسيع وظائف البرنامج البصري الأساسي 6 الأصلي، والأهم من ذلك، جعل البرنامج متاح لمجتمع بحثي كبير من خلال تجميعه مع إيماجيج مجانا حزمة برامج تحليل الصور.
Abstract
ويعد بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة لتحليل الصور أداة فعالة لتحديد متوسط كثافة البكسل داخل المنطقة الحدودية أو الخلفية (أو الخلفية) المغلقة أو المجزأة ذات الاهتمام المحدود، مما يؤدي إلى توليد متوسط التكامل البيني الشعاعي، الكثافة الشخصية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول أصلا في عام 2006، باعتباره البصرية الأساسية 6 النصي، ولكن على هذا النحو، كان توزيع محدود. لمعالجة هذه المشكلة والانضمام إلى جهود مماثلة مماثلة من قبل الآخرين، قمنا بتحويل الأصلي رمز بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة إلى اثنين من الإضافات المستندة إلى جافا متوافق مع نيه برعاية ومتاحة بحرية برامج تحليل الصور مثل إيماجيج أو فيجي إيماجيج. وعلاوة على ذلك، هذه الإضافات لديها العديد من الوظائف الجديدة، وزيادة توسيع مجموعة من قدرات البروتوكول الأصلي، مثل تحليل مناطق متعددة من الفائدة وصورة مداخن. الميزة الأخيرة للبرنامج مفيدة بشكل خاص في التطبيقات التي من المهم تحديد التغييرات ذات الصلةإلى الوقت والمكان. وهكذا، فإن تحليل المسح الضوئي على مدار الساعة من أكوام من الصور البيولوجية يمكن أن تطبق على نشر نا + أو كا ++ داخل خلية واحدة، وكذلك لتحليل النشاط انتشار (على سبيل المثال ، موجات كا ++ ) في السكان من سينابتيكالي متصلة أو الفجوة تقاطع الخلايا. هنا، ونحن تصف هذه الإضافات المسح الضوئي على مدار الساعة الجديدة وتظهر بعض الأمثلة على تطبيقاتها في تحليل الصور.
Introduction
والهدف من هذا العمل هو تقديم بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة التي هي منصة خالية ومتوفرة بحرية لأي باحث مهتم في هذا النوع من تحليل الصور. وقد تم تطوير بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة في الأصل في عام 2006 1 ، بهدف تحسين الطرق القائمة لقياس كثافة بكسل ضمن مناطق محدبة الشكل ذات الاهتمام (روي)، وهي الطريقة التي لديها قدرة تكامل أفضل وتحسين القرار المكاني. خلال عملية الاستحواذ، بروتوكول بالتتابع بجمع متعددة شعاعي بكسل الكثافة ملامح، الممسوحة ضوئيا من مركز روي إلى حدودها، أو إلى مسافة محددة سلفا خارج العائد على الاستثمار لغرض قياس "الخلفية" كثافة بكسل. بروتوكول موازين هذه التشكيلات وفقا لنصف قطر الخلية، ويقاس في اتجاه المسح الضوئي. وهكذا، فإن المسافة من المركز إلى حدود عائد الاستثمار من كل مسح شعاعي الفردية هو دائما 100٪ من نطاق X. وأخيرا، فإن البرنامج متوسط هذه إنديفيدووملامح الشخصية في واحد لا يتجزأ شعاعي بكسل كثافة شدة. بسبب التحجيم، يعني متوسط كثافة بكسل الشخصي، التي تنتجها "مسح كلوك"، لا يعتمد على حجم عائد الاستثمار ولا، في حدود معقولة، على شكل العائد على الاستثمار. تسمح هذه الطريقة بمقارنة مباشرة أو، عند الاقتضاء، المتوسط أو الطرح لمحات من مختلف عائد الاستثمار. يسمح البروتوكول أيضا تصحيح ملامح كثافة بكسل متكاملة، من أي كائن لضوضاء الخلفية، من خلال الطرح بسيط من كثافة متوسطة من بكسل تقع خارج الكائن. على الرغم من أنه قد تم اختباره فقط في العينات البيولوجية، ويوفر بروتوكول لدينا إضافة قيمة إلى غيرها من أدوات تحليل الصور الموجودة المستخدمة في دراسات الصور من العمليات الفيزيائية أو الكيميائية التي يتم ترتيبها حول نقطة المنشأ (مثل نشر المواد من مصدر نقطة ) 1 -
ومع ذلك، كان الحد الرئيسي من طريقة تحليل الصورة الأصلية أن البروتوكول كان ديف(VB6) (رمز، وبالتالي، كان يعتمد على منصة ويصعب توزيع (تتطلب VB6) لمعالجة هذه المشكلة والانضمام إلى جهود مماثلة مماثلة من قبل المحققين الآخرين 2 ، قمنا بتحويل VB6 ساعة المسح الضوئي رمز البرنامج إلى اثنين من الإضافات المستندة إلى جافا، متوافقة مع نيه برعاية ومتاح بحرية متاحة المصدر ومنصة مستقلة برامج تحليل الصور، إيماجيج 3 وفيجي إيماجيج 4. وعلاوة على ذلك، هذه الإضافات لديها الآن العديد من الوظائف الجديدة التي توسع القدرة من بروتوكول الأصلي لمعالجة العديد من روي وكومة مداخن العديد من تطبيقات تحليل الصور ليست سهلة الاستخدام، فيما يتعلق بإجراء تحليل إحصائي للكائنات متعددة، وبالتالي، وغالبا ما يتم عرض بيانات تمثيلية فقط.مع متعددة على مدار الساعة المسح الضوئي المساعد يماغيج، فمن الممكن لتسهيل تحليل كائنات متعددة في وقت واحد.تقييم إحصائي قوي للبيانات المجهري،فيما يتعلق بتوزيع كثافة الإشارة في خلايا / كائنات مفردة، أصبح من الممكن الآن مع هذا الملحق المساعد. هنا، نحن تصف الإضافات المسح الضوئي على مدار الساعة وعرض أمثلة من تطبيقاتها في تحليل الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تثبيت البرامج
- قم بتثبيت أحدث إصدارات جافا المجمعة وإيماجيج أو فيجي إيماجيج كما هو موصى به على مواقع الويب المعنية (انظر جدول المواد للروابط لمواقع الويب المقابلة). في النص أدناه، يشار إلى كلا البرنامجين باسم "إيماجيج".
- نسخ "Clock_Scan-1.0.1 جرة" و "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" الملفات المساعد باستخدام الارتباط المنصوص عليها في جدول المواد ولصقها في الدليل المساعد إيماجيج. بدلا من ذلك، استخدم "الإضافات | تثبيت البرنامج المساعد" خيار القائمة لتثبيت هذه الملفات بعد أن تم حفظها على القرص الصلب للكمبيوتر.
2. تحليل المسح الضوئي على مدار الساعة
- قياسي على مدار الساعة المسح الضوئي المساعد ( الشكل 1 ):
- استخدام الأمر "إيماجيج" ملف | فتح "القائمة لفتح صورة من الفائدة.
- انقر على أداة "المضلع" أو "اختيار الخط المجزأ"أداة، ومن ثم رسم على الصورة لتوضيح عائد الاستثمار بأكمله أو شريحة من هذه المنطقة. انظر الشكل 1 A للحصول على مثال لاختيار المضلع (مخطط داخلي متقطع).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أدوات اختيار أخرى، متوفرة في البرنامج (مستطيلة، بيضاوية وخط اليد الحرة). - حدد "الإضافات | مسح على مدار الساعة" من القائمة لفتح نافذة الاختيار نافذة بروتوكول المنبثقة القياسية على مدار الساعة. لاحظ أن هذا الأمر سيتم أيضا فتح نافذة إدارة عائد الاستثمار مع إضافة المخطط تلقائيا إليها.
- استخدم نافذة خيار المكون الإضافي للقيام بما يلي.
- مراجعة وتغيير إحداثيات X و Y من مركز عائد الاستثمار (يحسب تلقائيا كإحداثيات مركز الكتلة المادية) باستخدام أشرطة التمرير أو تغيير القيم في مربعات الإدخال المقابلة. انظر الشكل 1 ب .
- اعتمادا على كم من المنطقة الخلفية خارج الجسم شويتم تغطية أولد بواسطة المسح الضوئي، وضبط حدود المسح الضوئي باستخدام شريط التمرير "مسح المسح الضوئي". انظر الشكل 1 أ .
ملاحظة: حد المسح هو الرقم الكسري الذي يمثل إلى أي مدى ينبغي أن يمضي الفحص إلى ما وراء حدود الأجسام في أي اتجاه معين؛ فإن القيمة الافتراضية هي 1.20، مما يشير إلى أن طول المسح سيكون أطول بنسبة 20٪ من نصف قطر الكائن في اتجاه المسح الضوئي؛ انظر الشكل 1 A ، الخط المتقطع الخارجي). - تعديل الناتج من البرنامج المساعد باستخدام "دائرة نصف قطرها الحقيقي"، "طرح الخلفية"، "تحويل القطبية" و / أو "مؤامرة مع الانحراف المعياري" مربعات الاختيار.
- انقر على "موافق" لتشغيل المكون الإضافي. انظر الشكل 1 C-H .
ملاحظة: أمثلة من إخراج البروتوكول مع "مؤامرة مع الانحراف المعياري" و "تحويل القطبية" أو "دائرة نصف قطرها الحقيقي" و "القطبية ترانسفأورم "في الشكلين 1 C و 1 D والشكل 1 E و 1F على التوالي، علما بأن قيم الانحراف المعياري المحسوبة تمثل الاختلاف بين فحوصات شدة البكسل الشعاعية الفردية للكائن، كما تلاحظ" اختيار عائد الاستثمار طول "في نافذة البرنامج المساعد، والذي يعرض المعلومات على طول مخطط عائد الاستثمار المقاس بالبكسل.
- في إنشاء "مؤامرة المسح الضوئي على مدار الساعة"، استخدم الأمر "قائمة" لرسم القيم المعروضة في اثنين، X و Y أعمدة البيانات للصور مقياس رمادي وفي X وأربعة أعمدة Y من البيانات للصور رغب، منها Y0، سيتم ملء Y1، Y2 و Y3 أعمدة مع القيم الفردية والشاملة (الأحمر والأخضر والأزرق) كثافة كثافة بكسل اللون.
- متعددة العائد على الاستثمار على مدار الساعة المسح الضوئي المساعد - العمل مع عائد الاستثمار متعددة (
): - افتح صورة تحتوي على عائد استثمار متعدد.
- افتح مدير عائد الاستثمار من خلال النقر على "تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار".
- مخطط تفصيلي (انظر الخطوة 2.1.2) وإضافة كل عائد الاستثمار إلى مدير روي عن طريق النقر على "إضافة" في نافذة مدير روي. القيام بذلك لجميع عوائد الاستثمار داخل الصورة. استخدم الأمر "تحليل | قياس" إذا كانت مقاييس العائد على الاستثمار ذات أهمية.
- انظر الشكل 2 A للحصول على مثال على اختيارات خط مجزأة متعددة والشكل 2 E لمثال على اختيارات المضلعات المتعددة.
- حدد "المسح الضوئي على مدار الساعة متعددة" في القائمة "الإضافات" لفتح خيارات البروتوكول نافذة منبثقة.
- استخدم إطار خيار البروتوكول للقيام بما يلي.
- إذا لزم الأمر، إعادة تعيين حد المسح وفقا للخطوة 2.1.4.2. القيمة الافتراضية هي 1.20.
- إذا لزم الأمر، حدد اختيارأيون لرسم متوسط الملف الشخصي مسح على مدار الساعة مع أشرطة سد عن طريق التحقق من مربع "مؤامرة مع الانحراف المعياري". انظر الشكل 2 جيم ودال .
مالحظة: متثل قيم سد احملسوبة التباين بني املالمح املتكاملة ملسح امليقاتيات ملختلف األجسام. أيضا، لاحظ السطر في نافذة البرنامج المساعد عرض المعلومات على "عدد من روي المحدد". - انقر فوق "موافق" لتشغيل البروتوكول.
- في "المؤامرة على مدار الساعة مسح الملف الشخصي"، استخدم الأمر "قائمة" لرسم القيم المعروضة في نافذة "القيم مؤامرة". انظر "متعددة على مدار الساعة مسح الملف الشخصي مؤامرة" أسطورة نافذة لتسمية العمود عن طريق قناة اللون.
- لاحظ أن رويس مرقمة وملامحها على مدار الساعة مسح لأي قناة لون معين يتم رسمها في نفس تسلسل التي تم تحديدها روي وإضافتها إلى "مدير روي".
- مولتيبل روي على مدار الساعة المساعد المساعد - العمل مع كومة الصورة ( الشكل 3 ):
- فتح صورة مكدس من الفائدة.
- افتح مدير عائد الاستثمار من خلال النقر على "تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار".
- مخطط عائد الاستثمار من الصور داخل المكدس وإضافته إلى مدير العائد على الاستثمار كما هو موضح في الخطوات 2.1.2 و 2.2.3. استخدم الأمر "تحليل | قياس" إذا كانت مقاييس عائد الاستثمار ذات أهمية.
- حدد "المسح الضوئي على مدار الساعة متعددة" في القائمة "الإضافات" لفتح خيارات البروتوكول نافذة منبثقة.
- استخدم إطار خيار البروتوكول للقيام بما يلي.
- إعادة تعيين حد المسح كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.2؛ القيمة الافتراضية هي 1.20.
- حدد الخيار لرسم ملف تعريف المسح الضوئي على مدار الساعة مع أشرطة سد عن طريق التحقق من مربع "مؤامرة مع الانحراف المعياري".
ملاحظة: سوف تمثل قيم سد المحسوبة الاختلاف بين مثيلات مختلفة من الكائن المحدد في الصورة ستاالمسيخ. أيضا، لاحظ السطر في نافذة البرنامج المساعد عرض المعلومات على "عدد الصور في المكدس". - انقر فوق "موافق" لتشغيل البروتوكول.
- في نافذة "مسح المؤامرة على مدار الساعة"، انقر فوق "قائمة" لرسم القيم المعروضة في نافذة "قيم المؤامرة"، حيث يمثل رقم العمود Y موضع الصورة داخل المكدس - 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصور التي يتم استخدامها هنا لغرض التوضيح، تؤخذ من قواعد البيانات التي تم إنشاؤها خلال دراستنا السابقة الخلايا والأنسجة البيولوجية 5 ، 6 ، 7 ومن أطلس الدماغ ألين ماوس 8 . تم اختبار كل من الإضافات بنجاح باستخدام إيماجيج 1.50i / جافا 1.8.0_77، إيماجيج 2.0.0-أرسي-44 / 1.50e / جافا 1.8.9_66 وفيجي إيماجيج 2.0.0-rc54 / 1.51g / جافا 1.8.0_66 بيئة البرنامج.
ويبين الشكل 1 نتائج تمثيلية لتحليل الصور مع معيار المسح الضوئي على مدار الساعة. لكل من المكونات الإضافية، التعليمات البرمجية الأساسية والخطوات الرئيسية لإجراء مسح على مدار الساعة هي في الأساس نفسه كما هو موضح في البروتوكول الأصلي 1 . لفترة وجيزة، بعد عائد الاستثمار أو جزء من العائد على الاستثمار موجزة على الصورة ( الشكل 1 A ، مخطط الأصفر الداخلي) ويتم تحديد مركز المخطط (تلقائيا أو يدويا، وذلك باستخدام نافذة الخيار المساعد؛ الشكل 1 B )، يبدأ المسح شعاعي من كثافة بكسل في اتجاه من المركز إلى بكسل الأول من مخطط الخلية ويستمر في اتجاه عقارب الساعة بكسل عن طريق بكسل على طول الخطوط العريضة ( الشكل 1 A ؛ ناقلات على التوالي والسهم المنحني، على التوالي) حتى يتم مسح جميع عيار الاستثمار روي. ولتحديد شدة خلفية عائد الاستثمار، يمكن تحديد طول كل مسح شعاعي لتتجاوز نصف قطر عائد الاستثمار في اتجاه المسح بواسطة رقم كسري مسبق (0،2 أو 20٪ من نصف القطر في القيمة الافتراضية لقيمة المسح الضوئي على مدار الساعة) ، الخط الأصفر الخارجي في الشكل 1 A ). ثم يتم محاذاة ملامح شعاعي جمعها عن طريق التحجيم إلى شعاع المقابلة ومتوسط لإنتاج ملف تعريف كثافة دقيقة على مدار الساعة مسح في 256 مستويات كثافة وحدات مقياس الرمادية ( الشكل 1 C ). بالنسبة إلى صور رغب، فإن كلا المكونين تلقائيا ينتجان ملفات شخصية مستقلة لشدة بكسل نصف قطرية لكل قناة ملونة (256 درجة كثافة الألوان الحمراء والأخضر والأزرق) بالإضافة إلى ملف شخصي ملون.
وبصفة مفترضة، يمثل مقياس x للمسح الضوئي ملامح كثافة بيكسل نصف قطر عائد الاستثمار المعتاد، مع 100٪ من المقياس الذي يمثل وحدات بكسل تقع عند حدود عائد الاستثمار ( الشكل 1 C ). تم إنشاء التشكيل الجانبي الموضح في الشكل 1 C مع الخيار "مؤامرة مع الانحراف المعياري" المحدد، وبالتالي يعرض الرسم البياني أيضا سد محسوبة لكل نقطة بيانات على طول X- مقياس من التشكيل الجانبي. عندما يتم تحديد الخيار "طرح الخلفية"، يتم تصحيح الملف الشخصي كثافة بأكمله للخلفية لاإيس بواسطة نقطة تلو نقطة الطرح من كثافة متوسطة من بكسل تقع بين الحد من عائد الاستثمار وحدود المسح الضوئي (الخط الأصفر الخارجي في الشكل 1 A ؛ البيانات غير معروضة). إذا تم تحديد الخيار "تحويل القطبية"، يقوم المساعد المسح الضوئي على مدار الساعة بإنشاء نافذة إخراج إضافية. أنه يحتوي على تحويل القطبية من الصورة من المنطقة المحددة بما في ذلك منطقة الحد المسح الضوئي، حيث يتم تعديل الصورة في كل اتجاه المسح شعاعي في مثل هذه الطريقة أن المسافة من المركز إلى حدود الكائنات دائما تطبيع إلى 100 ٪ ويمثل 100 بكسل. وبصرف النظر عن الحجم الفعلي للكائن، فإن الأبعاد الرأسية والأفقية لصورة التحويل القطبي هي ضعف حد المسح بالبكسل (240 بكسل × 240 بكسل في المثال الموضح في الشكل 1 D ). وأخيرا، فإن اختيار "نصف قطرها الحقيقي" الخيار يؤدي إلى توليد بيأر مسح ساعةوصورة التحويل القطبي، وتحجيمها في نصف قطر الكائن الفعلي وفي وحدات المعايرة المكانية للصورة الأصلية ( الشكلان 1E و F ، على التوالي).
يوضح الشكلان 1G و H خيارات إضافية لتحليل الصور باستخدام التحويل القطبي المستقل من حيث الحجم والشكل والأوامر والأدوات المتكاملة من إيماجيج. أمثلة من الأوامر، والتي قد تعتبر مفيدة لأنواع معينة من تحليل الصور، هي أداة خط مجزأة و "تحليل | مؤامرة الملف الشخصي" الأمر ( الشكل 1 G ) و "تحليل | سطح المؤامرة" الأمر ( الشكل 1 H ).
أرقام 2 و 3 تظهر نتائج تمثيلية لتحليل الصور مع البرنامج المساعد المسح الضوئي على مدار الساعة متعددة. إخراجمتعددة المسح الضوئي على مدار الساعة المساعد يتكون من اثنين من الرسوم البيانية: يظهر الرسم البياني الأول ملامح مسح على مدار الساعة الفردية للكائنات المحددة ( الشكل 2 C )، ويعرض الرسم البياني الثاني متوسط هذه الشخصية ملامح مسح على مدار الساعة (± سد، اختياري؛ الشكل 2 D ) . بالنسبة إلى صور رغب ( الشكل 2 E )، يتم عرض ملف المسح الضوئي على مدار الساعة المحسوب لكل قناة ألوان فردية لكل عائد استثمار محدد ( الشكل 2 F )، ويتم حساب المتوسط في قناة معينة لجميع الكائنات المحددة ( الشكل 2 G ) . وبالمثل، يتم عرض ملامح مسح على مدار الساعة الفردية والمتوسط للكائنات في كومة الصورة بعد إجراء تحليل المسح الضوئي على مدار الساعة من المكدس ( أرقام 3A-3D ، لم يتم عرض ملف تعريف المسح على مدار الساعة). كما ذكر من قبل، الرقميةوتستخدم البيانات آل لتوليد هذه المؤامرات من خلال تنفيذ المؤامرة "قائمة" الأمر.
ويوضح الشكل 4 تطبيق إضافي واحد لخيار تحويل القطبية في المساعد على مدار الساعة المسح الضوئي: مدى ملاءمتها لتسجيل الصور وعمليات تراكب. في هذا الشكل، استخدمت روي التحولات القطبية الشكل وشكل مستقل لمقارنة توزيع التسمية مضان من الخلايا العصبية معربا عن α3 الصوديوم / البوتاسيوم-أتباس مضخة بين مختلف المناطق القشرية الماوس، مع صورة الأطلس تبين الحدود والتنظيم التشريحي من هذه المناطق ( أرقام 4A-4B ). مع بروتوكول المسح على مدار الساعة، تسجيل مرجع (أطلس) والصور الفعلية المطلوبة لمثل هذه المقارنة تقتصر على إجراء بسيط من محاذاة الصور، وتحديد هيكل الفائدة في كل من الصور، ومن ثم توليد العائد على الاستثمار، تحويلات قطبية مستقلة.في المثال المبين في الشكل 4 ، مقارنة بين التحولات القطبية يدل بوضوح على توزيع غير موحد للخلايا المسمى في قشرة الدماغ الماوس، مع كثافتها تكون مرتفعة على وجه التحديد في المناطق السطحية من طبقة 2 / 3rds من القشرة الحركية، الجزء الظهري من القشرة الحبيبية القاعدية، والقشرة المدارية الجانبية، وفي طبقات عميقة من القشرة الحركية ( أرقام 4C-4D ).
الشكل 1 : مثال ممثل لتطبيق المسح الضوئي على مدار الساعة المساعد لتحليل الصور. ( A ) صورة ضوء الفلورسنت من قسم من الفئران جذر ظهري العقدة إمونوستيند ل إيسوفورم α3 من نا + / K + - أتباس (α3 نكا، انظر شنايدر وآخرون 3 لتفاصيل معالجة الأنسجة وتلطيخ).واحدة من ملامح الخلايا العصبية، مع حدودها المسمى بشكل كبير ل α3 نكا (أبيض)، ويرد باستخدام أداة خط المضلع (الخط الأصفر الداخلي). تم تعيين حدود المسح الشعاعي (السهم الأبيض) إلى 120٪ من نصف قطر الكائن، من مركز الكائن (النقطة البيضاء) إلى البكسل الأول للمخطط، كما هو مبين في اللوحة B (شريط التمرير بحد المسح الضوئي). ( B ) لقطة من نافذة الخيار الرئيسي من البرنامج المساعد المسح الضوئي على مدار الساعة. ( C ) قطعة من التشكيل الجانبي المتكامل لشدة البكسل للخلية المبينة في اللوحة A (متوسط 706 ملامح مسح شعاعي، انظر طول الخطوط العريضة في B؛ والقضبان العمودية هي أشرطة سد). ( D ) - صورة التحويل القطبي للخلايا المدروسة. ( E ) مسح على مدار الساعة الشخصية من الخلية نفسها التي تم الحصول عليها مع "نصف قطرها الحقيقي" الخيار المحدد. لاحظ أنه على عكس التشكيل الجانبي الموضح في C، يعرض المقياس x من هذا الملف الشخصي وحدات معايرة مكانية حقيقية (ميكرون). ( F ) التحول القطبية من نفس الخلية التي تم الحصول عليها مع تم تحديد الخيار "نصف قطر حقيقي". لاحظ أن حجم هذا التحول هو الآن في وحدات المعايرة المكانية الحقيقية (ميكرون). ( G ) تم تحديد حدود التحول القطبي، الموضحة في D، باستخدام أداة الخط المجزأة (تم تعيين سمك الخط إلى 10 بكسل أو 10٪ من طول المسح الشعاعي) وتحليلها. تم تنفيذ الأمر "أناليز | بلوت بروفيل" لقياس التغيرات في متوسط كثافة الملصقات على طول حدود الكائن (تمثل كل نقطة بيانات في الرسم البياني متوسط شدة جميع البكسل عبر عرض خط التحديد). ( H ) تم تطبيق الأمر "أناليز | سورفيس بلوت" على صورة التحويل القطبي المعروضة في اللوحة D لإنشاء تمثيل ثلاثي الأبعاد لشدة وضع العلامات للكائن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
e 2 "كلاس =" زفيجيمغ "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
الشكل 2 : مثال ممثل تطبيق استخدام متعددة على مدار الساعة المسح الضوئي المساعد لتحليل الصور. ( A ) تم القبض على أربعة مجالات نظر داخل قسم من الفئران ظهري جذر العقدة إمونوستيند ل α3 نكا (انظر الشكل 1 أسطورة). لتبسيط استخدام البرنامج المساعد المسح الضوئي على مدار الساعة، وضعت هذه الصور في كومة ثم تحويلها إلى صورة واحدة باستخدام "إيماج | أكوام | جعل المونتاج" الأمر. تشير الخطوط والأرقام الحمراء إلى اختيارات خط مقسمة إلى خمس مناطق ذات اهتمام بهذه الصورة. ( B ) يظهر لقطة من نافذة المسح الضوئي على مدار الساعة متعددة عند استخدام البرنامج المساعد لتحليل صورة على نطاق رمادي. ( C ) ملامح المسح الضوئي على مدار الساعة الفردية من خمسة عوائد الاستثمار "المبينة في لوحة A. ( D ) متوسط لمحة على مدار الساعة مسح لعينات الاستثمار المختارة (لوحةأ) مع أشرطة سد (الخيار "مؤامرة مع الانحراف المعياري" المحدد). ( E ) صورة رغب من المستزرعة الماوس الليمفاوية بريبي، المسمى مع 4،6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي، وصمة عار النووية والأزرق) ومع الأجسام المضادة المسمى فلورزنتلي ل β1-إنتغرين (الأخضر) و F- أكتين (الأحمر ؛ انظر دوبريتسوف وآخرون 7 لتقنية زراعة الخلايا ويوريف وآخرون 11 لتفاصيل تلطيخ). تم تحديد 11 خلية (انظر تصنيفات الأرقام) باستخدام أداة اختيار المضلع إيماجيج. تعرض اللوحات الموجودة على اليمين عرض القناة الخضراء والحمراء للخلية رقم 7 (اختيار مستطيل على اللوحة اليمنى) بعد تنفيذ وظيفة القائمة "إيماج | اللون | قنوات مقسمة". ( F ) الفردية على مدار الساعة خلية المسح الضوئي ملامح (مركب والأحمر والأخضر والأزرق ملامح قناة اللون وتظهر خطوط الأسود والأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي). ( G ) يعني ملامح مسح على مدار الساعة لجميع عائد الاستثمار أحد عشر مختارة في لوحةهاء. التعيينات الملونة كما في لوحة G (لم يتم استخدام أي مؤامرة مع خيار الانحراف المعياري أثناء إجراء المسح الضوئي على مدار الساعة المتعددة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : متعددة على مدار الساعة المسح الضوئي المساعد وتحليل مداخن الصورة. ( A ) المونتاج مختارة و "حفظ ككومة" إطارات الصور. صورة من الخلايا العصبية الجذرية الظاهرة العقدة القبض عليها مع التدخل التفاضلي يظهر التباين (ديك) المجهري في الإطار الأول. تم الحصول على إطارات لاحقة باستخدام إيبي إضاءة مضان المجهري لرصد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في فترات زمنية مختلفة، قبل وبعد التحفيز الكهربائي للخلية. أرقام بجانب ريسبكتيفه صورة تشير إلى الوقت في مس 6 . وحددت حدود الخلية باستخدام صورة ديك من المكدس (الإطار العلوي الأيسر؛ علامة النجمة تشير إلى ماصة التصحيح المشبك المستخدمة لتسجيل وملء الخلية مع الصبغة الحساسة للكالسيوم أوريغون الأخضر بابتا-1 (أوغب-1) )، ثم تستخدم لتشغيل إجراء المسح الضوئي على مدار الساعة المتعددة على الصور المتبقية. ( B ) لقطة شاشة من نافذة المسح الضوئي على مدار الساعة متعددة، عند تشغيل البرنامج على كومة من الصور. ( C ) ملامح مسح على مدار الساعة من أوغب-1 إشارة الفلورسنت على مسافات مختلفة من مركز الخلية (٪ من دائرة نصف قطرها) وفي أوقات مختلفة قبل وبعد التحفيز الكهربائي (أسطورة، في مس). لإعداد هذه الرسوم البيانية استخدمت الرسوم البيانية المهنية البرمجيات. ( D ) التغيرات في شدة إشارة أوغب-1 مع مرور الوقت في الغشاء الفرعي والمناطق أعمق الخلايا السيتوبلازمية (الدوائر والخطوط الحمراء والسوداء، على التوالي). للحصول على هذه البيانات، تم حساب المتوسط و سد لكل موقع نقطة بياناتبين 20-40٪ و 70-90٪ من المقياس x من كل ملف تعريف مسح على مدار الساعة هو مبين في لوحة C (المناطق المظللة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : مثال على استخدام البرنامج المساعد لمسح الساعة في تسجيل الصور وتراكبها. ( A و B ) لقطات من لوحة 29 من القسم الاكليلية (ألين الماوس أطلس الدماغ) وقسم فيبراتوم سميكة 200 ميكرون من قطع الدماغ الماوس جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين في ما يقرب من نفس مستوى صورة الأطلس. الفأرة المعدلة وراثيا المستخدمة في هذا المثال كان التعبير عن البروتين زغرين الفلورسنت تحت المروج من α3NKA، لتحديد α3NKA معربا عن الخلايا العصبية 2 . لتحديد الالمناطق القشرية التي أثرت خصيصا مع هذه الخلايا العصبية (النقاط المضيئة على الصورة في لوحة B)، تم تحديد المنطقة القشرية بأكملها (خطوط متقطعة الصفراء) بدءا من كل من الصور مع نفس النقطة المرجعية (منتصف الحدود بين القشرة والشمية لمبة؛ السهام). ( C ) لوحات تمثل (من اليسار إلى اليمين): على مدار الساعة مسح القطبية يحول عائد الاستثمار، مختارة ضمن صورة الأطلس (لوحة A)، داخل صورة قسم الدماغ الماوس (لوحة B) وتراكب هذين الصور تحويل ("صورة | تراكب | إضافة صورة "الأمر مع 50٪ التعتيم الإعداد). ( D ) نفس الصور كما في لوحة C ولكن مع حدود المناطق القشرية الرئيسية (كما هو موضح في الأطلس) المبينة في صورتين تحويل أخرى باستخدام المضلع إيماجيج، أدوات اختيار خط مجزأة و "تحليل | أدوات | مزامنة ويندوز" أمر. الاختصارات هي نفسها كما في أطلس الدماغ الأصلي صورة: المحرك الابتدائي والثانوي (موب، وزارة الخارجية)، الحبيبية إنسولار، دور(إيد)، المداري الجانبي، البطني الجانبي والوسطي (أوربي، أوربفل، أوربم)، بريمبيبيك (بل)، الأمامي سينغولات، الجزء الظهري (أكاد) القشرة. الأرقام في منطقة موس تشير إلى الطبقات القشرية الرئيسية، والتي يمكن تمييزها في القشرة الحركية الماوس على مستوى الدماغ الإكليلي المناسب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة: بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة هو أداة سريعة وبسيطة لتحليل الصور. وقد وصفت مزايا هذا البروتوكول، بالمقارنة مع النهج المشتركة القائمة لتحليل الصور (مثل المسح الضوئي كثافة بكسل الخطي أو حساب متوسط كثافة بكسل للعائد على الاستثمار) في التفاصيل في المنشورات السابقة 1 ، 9 . باختصار، فإن هذا البروتوكول يسمح لتوليد ملامح شعاعي بكسل كثافة شعاعي من خلال تحديد شدة بكسل تقع على مسافات مختلفة من مركز عائد الاستثمار مثل الحدود الكائن، أو موقع محدد مسبقا خارج الكائن (الخلفية). وبسبب هذا الأخير، يمكن دائما تصحيح ملامح مسح مدار الساعة لكل عائد استثمار لخلفيته المباشرة، والتي (في التطبيقات البيولوجية) يجعل هذا الملف الشخصي أقل اعتمادا على المحلية، داخل العينة أو عينة إلى عينة، وعدم الاتساق في وضع العلامات / تلطيخ، فضلا عن عدم الاستقرار فيوكثافة مصدر الضوء المجهر أو الفلورسنت مرات التعرض للضوء. حجم الكائن وشكل استقلالية على مدار الساعة مسح ملامح مزيد من توسيع مجال تطبيق هذا البروتوكول من خلال تمكين المقارنات من الكائنات المختلفة، وكذلك التصحيح من قبل نقطة تلو نقطة الطرح لمحات من السيطرة "الإيجابية" و "السلبية" شاء.
على مدار الساعة المسح الضوئي الإضافات: كان الحد الرئيسي لتوزيع وتقاسم البروتوكول الأصلي منصة الاعتماد من التعليمات البرمجية التي تم تطويرها مع فيسوال باسيك 6.0 (ف) 1 ، 9 . وقد تم تناول هذه المشكلة مؤخرا من قبل واحدة من المجموعات البحثية في معهد لايبنيز من علم الأدوية الجزيئي، ألمانيا، من خلال تطوير فوجي إيماجيج ساعة المسح الضوئي المساعد الإضافي 2 . البرنامج المساعد معهد لايبنيز يستنسخ الأصلي على مدار الساعة مسح الوظائف الأساسية في قدرتها على توليد إنتملامح مسح شعاعي جرال لعائد الاستثمار محدب الشكل العائد على الاستثمار، وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن معالجة شرائح من الخطوط العريضة (الأقواس). ومع ذلك، لا يمكن تعيين حد المسح من التشكيل الجانبي التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج المساعد فقط إلى 100٪ (حدود الكائن)، مما يعني، أن كثافة بكسل الخلفية لا يمكن قياسها. وعلاوة على ذلك، ليس لديها القدرة على توليد تحويلات القطبية، للعمل مع قنوات الألوان المختلفة في الصور رغب، أو للعمل مع أكوام من الصور ومعالجة روي متعددة. على سبيل المقارنة، وهما الإضافات الجديدة، الموصوفة هنا، تتكاثر تماما قدرة رمز ف الأصلي ( أي جيل من التكامل على مدار الساعة مسح ملامح كثافة بكسل مع عرض اختياري من سدز و / أو الطرح الخلفية، وكذلك معالجة قنوات الألوان المختلفة من رغب الصور). وبالإضافة إلى ذلك، فإنها يمكن تحليل شريحة / قوس على شكل قوس الاستثمار (وظيفة أدخلت في البرنامج المساعد فوجي إيماجيج وضعت في معهد لايبنيز من علم الأدوية الجزيئي 2 ). وعلاوة على ذلك، ثالإضافات إيس توسيع فائدة البرامج السابقة من خلال توليد العائد على الاستثمار، وشكل مستقل الاستقطاب عوائد الاستثمار روي القطبية، والتي يمكن استخدامها في التطبيقات التي تتطلب تسجيل الصور. وأخيرا، المساعد المسح الضوئي على مدار الساعة على نحو فعال يسهل مسح على مدار الساعة من روي متعددة تقع داخل نفس الصورة أو في كومة الصورة. الميزة الجديدة الأخيرة من البرنامج مفيدة بشكل خاص في التطبيقات التي من المهم تحديد التغييرات المتعلقة الوقت والمكان.
القيود واستكشاف الأخطاء وإصلاحها: الحد الرئيسي من طريقة المسح الضوئي على مدار الساعة هو شرط لتحديد عائد الاستثمار محدب الشكل. سيكون الملف الشخصي مسح على مدار الساعة لا معنى لها في الحالات عندما يعبر أي من المسح الشعاعي عائد الاستثمار مخطط أكثر من مرة. وهذا من شأنه أن يجعل تطبيع طول هذا المسح شعاعي فيما يتعلق المسافة من مركز إلى عائد الاستثمار المستحيل. وثمة قيد آخر هو أن المعلومات مسح المعلومات الشخصية على مدار الساعة هو بروجريزانخفضت بشكل حاد في عائد الاستثمار تفتقر إلى التماثل شعاعي. ومع ذلك، على الأقل جزئيا، يمكن التغلب على هذين القيدين من خلال تحليل شرائح مختارة (أقواس) من عوائد الاستثمار المعقدة وغير المتماثلة. ويوصى باستخدام مسح شريحة أيضا في الحالات التي تحتوي فيها أقسام من خلفية المنطقة ميزات المسمى، والتي قد تؤثر على إجراء الطرح الخلفية (انظر الشكل 2A للحصول على مثال للاختيار لتحليل تلك القطاعات الخلية التي لا تواجه خلايا أخرى المسمى). وأخيرا، إذا كان هناك حاجة إلى تحليل الصور المركبة التي تحتوي على أكثر من 3 قنوات ملونة، يجب تقسيم قنوات الألوان من هذه الصور قبل تشغيل البرنامج المساعد.
الاتجاهات المستقبلية: سوف التحسين في المستقبل من وظائف هذه الإضافات تشمل، ولكن لا تقتصر على تحديث التعليمات البرمجية للجمع بين وظيفة من المسح الضوئي على مدار الساعة ومتعددة على مدار الساعة المسح الضوئي الإضافات في البرنامج المساعد واحد. لون خوارزميات التعريب المشترك (مثل خوارزميات بسإد على حسابات ارتباط بيرسون أو معاملات تقسيم الماندرز)، وتطوير المكون الإضافي ليصبح قادرا على العمل مع عديد من روي التي يتم اختيارها في صور مختلفة أو في شرائح مختلفة في كومة الصورة (الإصدار الحالي من الإضافات يسمح تحليل عدة سيتم تنفيذ عائد الاستثمار المحدد ضمن صورة واحدة أو عائد استثمار واحد محدد لجميع الصور في المكدس). المؤلفين سوف نقدر أيضا أي اقتراحات من المستخدمين البرنامج المساعد وتقارير أي مشاكل واجهتها أثناء استخدام الإضافات الموجودة.
الخلاصة: تحليل المسح على مدار الساعة هو أداة واعدة للدراسات التصوير في العديد من مجالات البيولوجيا، من تحليل وضع العلامات خلية ثابتة مع علامات مختلفة لدراسات انتشار نا + أو كا ++ ، داخل خلية واحدة وكذلك ل تحليل انتشار النشاط (على سبيل المثال ، موجات كا ++ ) في السكان من الخلايا المرتبطة متشابك 10 ، 11 أو الفجوة تقاطع-- اقتران الخلايا 12 . وتشمل المجالات المحتملة الأخرى لتطبيق تحليل المسح الضوئي على مدار الساعة تحليل الصورة الطبية (صور الموجات فوق الصوتية للأوعية الدموية، والصور المقطعية المقطعية والعظام العرضية العظام)، علم الفلك (دوامة والتصوير المجرة شعاعي) والكيمياء (نشر من مصدر نقطة)، (تحليل نمط الانعراج)، والحراجة (تحليل حلقة الجذع الشجري لتحديد عمر الشجرة، فضلا عن فترات الطقس الجاف وسوء التسميد) والهندسة (تآكل الأنابيب المعدنية) وعلم المناخ (تحليل صورة رادار الطقس).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
Acknowledgments
نشكر الدكتور تانيا ماريتزن والدكتور فابيان فيوتلينسك (معهد لايبنيز من علم الأدوية الجزيئي، برلين، ألمانيا) لتقاسم معنا نسختهم من فوجي إيماجيج ساعة المسح الضوئي المساعد والملهم لنا لتطوير هذا الإصدار من البرنامج. ونحن ممتنون أيضا للدكتور فريتز ميلشيرز (قسم تنمية الخلايا الليمفاوية، معهد ماكس بلانك لعلم الأحياء العدوى) لإذنه الكريمة لاستخدام الصور من قاعدة بيانات قسمه لغرض اختبار وتحسين البرنامج المساعد. الدعم: مركز العلوم العصبية متعدية؛ منحة المعاهد الوطنية للصحة: P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1 (2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).
