Summary
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 נקשר שניהם waterborne והקאה מחלות ואת השרידים איום למרות השיטות מזון, מים-סינון בשימוש כיום. תוך כדי שיטות זיהוי חיידקים קונבנציונליים, כגון תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) יכול לזהות באופן ספציפי מזהמים פתוגניים, הם דורשים קליניים נרחבים ההמתנה ממושך. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות אלה דורשים מכשירי מעבדה מתוחכמת, הגדרות, צריך להתבצע על ידי אנשי מקצוע מיומנים. במסמך זה, פרוטוקול מוצע עבור טכניקה אבחון פשוט מציע שילוב ייחודי של הפרמטרים מגנטי, פלורסנט פלטפורמה מבוססת ננו-חלקיק. המוצע multiparametric מגנטו-פלורסנט nanosensors (MFnS) יכול לזהות זיהום O157:H7 e. coli , עם מעט ככל המושבה יוצרי יחידה 1 נוכח פתרון בתוך פחות משעה. יתר על כן, היכולת של MFnS להישאר פונקציונלי מאוד בתקשורת מורכבים כגון חלב אומת המים באגם. מבחני ירידה לפרטים נוספים שימשו גם להפגין את היכולת של MFnS רק לזהות חיידקים היעד הספציפי, אפילו בנוכחות מינים דומים חיידקי. הזיווג של שיטות מגנטי, פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של פתוגן זיהום במגוון רחב של ריכוזים, מפגין שלה ביצועים גבוהים בזיהוי זיהום שני, מאוחר-בשלב מוקדם. היעילות, מקלחון, ניידות של MFnS לבצע אותם מועמדת אידיאלית עבור בשלב של טיפול הקרנה של חיידקים מזהמים במגוון רחב של הגדרות, מאגרים ימיים מזונות ארוזים בצורה מסחרית.
Introduction
המופע מתמיד לזיהום חיידקי בשני בכמויות מסחריות מזון, מקורות המים יצרה צורך פלטפורמות אבחון יותר ויותר מהירה, מדויקת. 1 , 2 חלק נפוץ יותר חיידקים מזהמים אחראי לזיהום מים ואוכל הם סוגים סלמונלה, סטפילוקוקוס, ליסטריה, ויבריו, שיגלה, Bacillus ו Escherichia. 3 , 4 זיהום חיידקי על ידי פתוגנים אלה לעיתים קרובות תוצאות סימפטומים כגון חום, כולרה, דלקת הקבה והמעים, שלשול. 4 זיהום מקורות מים לעיתים קרובות יש תופעות לוואי דרסטית על קהילות ללא גישה למים מסוננים מספיק, ולא מזון וזיהום הוביל מספר רב של מחלות, המוצר אחזור המאמצים. 5 , 6
על מנת לצמצם את המופע של מחלות הנגרמת על ידי זיהום חיידקי, היו מספר המאמצים לפתח שיטות שבו מים ומזון ניתן ביעילות לסרוק לפני מכירה או הצריכה. 3 טכניקות כגון PCR,1,7,8,9,10 , אליסה,11,(בתיווך לופ הגברה איזותרמי12 המנורה),13,14 בין היתר,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 לאחרונה שימשו לצורך זיהוי של פתוגנים שונים. בהשוואה לבקטריאלי מסורתי culturing שיטות, טכניקות אלו יעילים הרבה יותר לגבי ירידה לפרטים וזמן. עם זאת, שיטות אלה עדיין מתקשים עם תוצאות false חיוביות, שליליות, הליכים מורכבים ועלות. 1 , 3 , 25 זה מהסיבה הזאת מגנטו-פלורסנט multiparametric nanosensors (MFnS) מוצעים כאמצעי חלופי לגילוי חיידקי.
באופן ייחודי, אלה nanosensors זוג יחד הרפיה מגנטי ואופני פלורסנט, המאפשר פלטפורמה כפולה-זיהוי מהיר ומדויק. באמצעות e. coli O157:H7 כמו לדוגמה מזהם, הוא הפגין היכולת של MFnS לאתר CFU אחד בתוך דקות. נוגדנים ספציפיים הפתוגן משמשים כדי להגדיל ירידה לפרטים, השילוב של שיטות המגנטי והן פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של חיידקים מזהמים בטווחים בשני נמוך ולא גבוה-זיהום. 16 במקרה של זיהום חיידקי, nanosensors שוחים מסביב החיידקים בשל היכולות מיקוד של נוגדנים ספציפיים הפתוגן. האיגוד בין nanosensors מגנטי לבין חיידקים מגביל את האינטראקציה בין ליבת ברזל מגנטית של הפרוטונים במים שמסביב. זה גורם גידול טיימס הרפיה T2, כפי שנרשם על ידי relaxometer מגנטי. כמו ריכוז החיידקים בתמיסה עולה, nanosensors לפזר עם מספר גדל של חיידקים, וכתוצאה מכך T2 ערכים נמוכים יותר. לעומת זאת, פליטת קרינה פלואורסצנטית יגדל בפרופורציה עם ריכוז חיידקים, עקב מספר מוגברת של nanosensors קשורה ישירות הפתוגן. צנטריפוגה של הדגימות, ובידוד של בגדר חיידקי, יהיה רק לשמר על חלקיקים מחובר ישירות החיידקים, הסרת כל nanosensors לתרשים, ישירות מתאם את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם מספר חיידקים להציג פתרון. ייצוג סכמטי של מנגנון זה מיוצג באיור1.
הפלטפורמה MFnS תוכנן עם בשלב של טיפול הקרנה במוח, וכתוצאה מכך מאפיינים נמוכים ונייד. MFnS יציבים בטמפרטורת החדר, נדרשים רק בריכוזים מאוד נמוכים עבור איתור מדויק של חיידקים מזהמים. יתר על כן, לאחר סינתזה, השימוש MFnS היא פשוטה, ללא צורך בשימוש אנשי מקצוע מיומנים בתחום. לבסוף, הפלטפורמה האבחון מאפשר מיקוד להתאמה, מתן אמצעים על-ידי אילו זה פלטפורמה אחת עשוי לשמש כדי לזהות פתוגנים מכל הסוגים, הגדרות שונות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 סינתזה, Functionalization של מגנטו-פלורסנט רב פרמטרית Nanosensors (MFnS).
- סינתזה של תחמוצת ברזל פאראמגנטי חלקיקים (IONPs)
- כדי להתכונן סינתזה IONP, להכין את הפתרונות הבאים 3: פתרון 1: FeCl 3 (0.70 g) ו- FeCl 2 H 2 O (2 מ"ל), פתרון 2: NH 4 הו (מל ' 2.0, מ' 13.4) H 2 O (15 מ ל), ו- 3 פתרון: חומצה polyacrylic (0.855 גרם) ב- H 2 O (5 מ"ל).
- להוסיף 90 µL של 2 מ' חומצת מימן כלורי (HCl) פתרון 1, ואז מיד מערבבים עם 2 פתרון תוך כדי vortexing-875 סל ד. לאחר מכן להוסיף 3 פתרון. המשך vortexing עבור 60 דקות
- צנטריפוגה כעשרים דקות ב 1,620 x ג Centrifuge את תגובת שיקוע במשך 20 דקות ב- g x 2,880...
- לטהר את תגובת שיקוע הסופי באמצעות דיאליזה. להוסיף את תגובת שיקוע שקית דיאליזה (MWCO 6 − 8 K) ומניחים אותו בתוך המכיל פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.4) ובר ספין. תן לזה משרים למשך 12 שעות, החלפת מאגר טריים כל ה 2-3
- ההטיה של נוגדנים ספציפיים ליעד השטח של IONPs
- להכין את הפתרונות הבאים ארבע: פתרון א': 5 מ ג 1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ב- 250 µL MES [2-(N- חומצה ethanesulfonic מורפולינו)] מאגר (0.1 M, pH = 6.8), פתרון ב': 3 מ ג של N-Hydroxysuccinimide (NHS) ב- µL 250 MES מאגר (0.1 M, pH = 6.8), 5 c: הפתרון µg של IgG1, mAb e. coli, ב- µL 225 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (pH 7.4) , ואת הפתרון d: 4 מ ל IONP (5.0 mmol) ב 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4).
- להוסיף 2 (N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר פתרון A, לאחר מכן מיד להוסיף פתרון A D פתרון במרווחים קטנים בתוך 15 s, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.
- מיד להתחיל להוסיף פתרון B D פתרון במרווחים קטנים במשך שלוש דקות. מיקס על ידי היפוך הפתרון לאחר כל הוספה.
- להוסיף פתרון C פתרון, במרווחים של 5 µL, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.
- לאפשר תגובה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשך הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לטהר IONPs מצומדת Ab הנוצרת באמצעות מגנטי עמודה תוך שימוש PBS (ה-pH = 7.4, גמר [Fe] = 3.5 mmol) כדי להסיר את כל הנוגדנים unconjugated.
- שטיפת העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל). הצמד את העמודה לוח מגנטי, והוסף פתרון IONP.
- לרחוץ את העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל) שוב. הסר את העמודה מגנטי צלחת מגנטית. להוסיף העמודה PBS ולאסוף את הפתרון. החנות ב 4 ° C
- ומגעים פלורסנט 1, 1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-צבע פרכלורט Tetramethylindocarbocyanine (DiI) לתוך הציפוי חומצה (במספר דוכנים) polyacrylic של IONPs מצומדת נוגדן באמצעות שיטת דיפוזיה הממס.
- כדי 4 מיליליטר IONPs, להוסיף dropwise 2.0 µL של DiI צבע (2 mmol) ב- µL 100 של דימתיל סולפוקסיד עם ערבוב רציף ב 1100 סל ד.
- Dialyze הפתרון שיתקבל (KDa MWCO 6-8, 12 שעות) נגד PBS, יצירת פתרון MFnS אחרון עם ריכוז הברזל הסופי של [Fe] = 2 mmol.
- אפיון של MFnS
- לניתוח spectrophotometric, להשתמש בקורא את הצלחת לזהות צבע DiI שעברו אנקפסולציה עם פליטת קרינה פלואורסצנטית-595 nM.
- אור דינאמי פיזור
- למקם מדגם של הפתרון MFnS zetasizer כדי לקבוע את גודל ממוצע ואת משטח פיקוד MFnS.
הערה: כאן, גודל ממוצע ודמי פני השטח של MFnS תפקודית נמצאו 77.09 nm ו-22.3 mV, בהתאמה.
- למקם מדגם של הפתרון MFnS zetasizer כדי לקבוע את גודל ממוצע ואת משטח פיקוד MFnS.
2. חיידקי Culturing והכנות פתרון מניות
- Culturing חיידקי
- מימה גלולה הליחה (e. coli O157:H7) ב 1 מ ל מרק מזין ולאחר מכן להוסיף אוטם 5 נוספים מרק.
- 100 להחיל µL של פתרון זה צלחת אגר, פס באמצעות לולאה חיסון סטרילי, ואחריו הדגירה ב 37 ° C עבור 24h.
- לאחר 24 שעות, בחר של המושבה מבודד מהצלחת אגר ולהוסיף אותו 15 מ ל מרק תרבות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 ה', תוך מעקב אחר הערך צפיפות אופטית (ספיגת על 600 nm).
- ברגע מתקבל ערך צפיפות אופטית של 0.1, תפסיק culturing ולבצע דילולים טורי.
- דילולים טורי
- µL 900 להוסיף מרק מזין כדי 8 צינורות סטרילי microcentrifuge.
- להוסיף 100 µL של חיידקי התליה אל הצינור הראשון (דילול 10 -1).
- לקחת 100 µL מהרגע הראשון צינור והוסף אותו השנייה, כדי להשיג לדילול של 10 -2. להמשיך את הדפוס הזה עד שהשפופרות הנותרים, המסתיימים לדילול הסופי של 10 -8-
- העברת 100 µL מהצינור כל להפריד בין פלטות אגר, ולאחר תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת, לספור את המושבה יוצרי יחידות (CFUs) על כל צלחת. בחר את הצלחת עם ~ 100 CFUs. השתמש דילולים התואם לניסויים נוספים (100 µL = ~ 100 CFUs).
הערה: כאן זה היה דילול 10 -6 שתוצאתם ~ 100 CFUs.
3. מהיר O157:H7 הזיהוי של אי קולי באמצעות MFnS
- ספייק פתרונות PBS שונים (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) עם הגדלת כמויות של המניה חיידקי 10 -6, וכתוצאה מכך ב CFU נע בין 1 ל- 100. להוסיף כמות עקבית של MFnS (100 µL) לפתרונות אלה.
- ליצור פתרון בסיסי אחד המכיל רק PBS (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) ו MFnS (100 µL).
- דגירה פתרונות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ואז.
- פתרונות ייחודיים העברה מגנטי relaxometer (0.47 טסלה), שינויים בתקופות רגיעה (T2) ביחס CFUs כל פתרון.
- כדי להקליט שינויים בערכי T2, להתחיל על ידי מדידת הערך T2 של הפתרון בסיסית המכילה רק PBS ואת MFnS.
Relaxometer
- המקום הפתרון ב המגנטי. פתח את התוכנה המתאימים, בחר " T2 הרפיה " בהגדרה ולחץ " מידה. "
- בעקבות אוסף המוזיאון של התוכנית הבסיסית T2, למדוד את הערכים T2 של הפתרונות נוספים היו מתובל שונים ריכוזי חיידקים.
הערה: השינוי ב T2 שווה ל בסיסית T2 המופחת של T2 מחודדים.
- כדי להקליט שינויים בערכי T2, להתחיל על ידי מדידת הערך T2 של הפתרון בסיסית המכילה רק PBS ואת MFnS.
Relaxometer
- להסיר דגימות relaxometer מגנטי, centrifuge הצינורות ב g x 2880 במשך 10 דקות
- Decant את תגובת שיקוע, resuspend כדורי חיידקי ב 100 µL ל- PBS (1 X, ה-pH 7.4).
- 80 להוסיף µL של כל resuspension צלחת 96-ובכן, עוצמות קרינה פלואורסצנטית הרשומה ב- 595 nM.
הערה: בדיקות שניתן לחזור על שימוש ממיסים שונים, כולל אגם מים, חלב ואחרים כפי שמתואר במקטע תוצאות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מנגנון הפעולה MFnS מיוצג באיור1. קיבוץ באשכולות של MFnS סביב השטח של חיידקים מזהמים משבש האינטראקציות בין את magnetic cores של MFnS גרעינים מימן שמסביב. בעקבות זה הרפיה קיבוץ באשכולות, מגנטי ערכים להגדיל. ריכוז חיידקים מזהמים גודלת, קיבוץ באשכולות מפחית, מקטין השינוי בערכים T2. לפיכך, התוספת של פלורסנט מודאליות חיוני. ריכוז חיידקי גודלת, מגביר עוצמת האות פלורסנט המיוצר על ידי MFnS, המאפשרות זיהוי חיידקים מזהמים בטווחים הן ריכוז נמוך וגבוה רגיש.
בעקבות הפרוטוקול,16 MFnS היו מסונתז, קודם נבדק בפתרונות ל- PBS (1 X, ה-pH 7.4). המודאליות הראשונית המשמש לצורך זיהוי, הרפיה מגנטי, שימש להקלטה שינויים בערכי T2. על פי הפרוטוקול, הדגימות היו אז centrifuged, כדורי היו resuspended, קרינה פלואורסצנטית הנתונים שנאספו. ΔT2 המתאים וערכי פליטת קרינה פלואורסצנטית מוצגים באיור2. כפי שמוצג, הערך ΔT2 היה הגדול בריכוזים נמוכים של זיהום חיידקי, והגיע רוויה-CFUs 20 בערך. פליטת קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, הפך להיות מדויק יותר-> 20 CFUs, מציג את חשיבות השילוב בין שני האופנים האלה. בעקבות אלה מבחני העיקרי, נערכו בדיקות דומות בתקשורת מורכבים, כולל אגם מים וחלב. זה נעשה כדי להבטיח כי nanosensors עדיין יעיל בתקשורת מורכבים יותר. הנתונים שנאספו ממבחני אלה מוצגים באיור 3, דומים מאוד מבחני שנערך ב- PBS. זה מוודא כי nanosensors אלה יישארו יעיל בתקשורת מורכבים.
לאחר שנוכח כי MFnS יכול לזהות הנוכחות של חיידקים מזהמים בתקשורת פשוטים ומורכבים, מספר בדיקות נערכו אז כדי לקבוע את רמת היחודיות המתוחזקים על-ידי nanosensors. למטרה זו, MFnS היו מודגרות בפתרונות המכיל תערובת חיידקים שאינם-יעד (פתוגניים שאינם e. coli ו- S. typhimurium), חיידקים היעד חום-נהרג, חיידקים היעד. מאחר וזה היה רק assay ירידה לפרטים, די היה האוסף של נתונים הרפיה מגנטי לבד, הנתונים המתאימים מוצג באיור4. כפי שניתן לראות, MFnS קשורות רק לחיות O157:H7 e. coli , ולא על חיידקים אחרים נהרגו-חום או הלא-יעד. זו רמת היחודיות מיוחס הנוגדנים מיקוד מצומדת, עוד יותר מאשר כי MFnS יהיה אפקטיבי על גילוי מזהמים פתוגן מסוים, אפילו כאשר בנוכחות מינים חיידקים פתוגניים שאינם.
איור 1 : מנגנון זיהוי מגנטו-פלורסנט. ייצוג סכמטי של סינתזה MFnS, מנגנון כפול-מודאלי של זיהוי חיידקים. לאחר תקופת דגירה קצרה (30 דקות), MFnS הם מסוגלים לזהות ברגישות של חיידקים היעד באמצעות שילוב של תהודה מגנטית פליטת קרינה פלואורסצנטית. קיבוץ באשכולות של MFnS סביב השטח של חיידקים מזהמים גורם שינויים בערכים הרפיה מגנטי, אשר ניתן לזהות על ידי relaxometer מגנטי. בנוסף, אותות פלואורסצנט שייאסף מ MFnS קשורה ישירות חיידקים מזהמים. זה מספק פלטפורמה כפולה-מודאלי זיהוי מסוגל זיהוי חיידקים מזהמים בטווחים הן ריכוז נמוך וגבוה. 16 איור זה השתנה, ברשות. 16
איור 2 : הוכחת הרעיון. א) הרפיה מגנטי נתונים (ΔT2) היה הראשון שנאסף דילולים של e. coli O157:H7 (1-100 CFU) ב- PBS הממס (1 X, pH = 7.4). מר זיהוי של חיידקים היה מאוד רגיש-ספירות CFU התחתון (שיבוץ: החל CFU 1-20). עם זאת, הממצאים ΔT2 הפך רווי בריכוזים גבוהים חיידקי (> 20 CFU), המציינת כי מר יקר יותר זיהוי, כימות של זיהום בקטריאלי בשלב מוקדם. ב) קרינה פלואורסצנטית נתוני פליטת זהה עלה פתרונות PBS (שיבוץ: מגרש ליניאריות). התוצאות הראו בשיטת הזיהוי פלורסצנטיות רגיש יותר-ספירות CFU גבוהה יותר, בעוד זה חסר רגישות לדוגמאות CFU נמוך. יחד, נתונים אלה מדגימים את היכולת של שיטות המגנטי והן פלורסנט כדי לזהות ולכמת זיהום חיידקי בולא מאוחר-בשלבים המוקדמים של זיהום חיידקי. 16 ממוצע של ערכים של שלוש מדידות הם מתוארים ± שגיאה סטנדרטית. דמות זו שונתה באישור. 16
איור 3 : זיהוי חיידקים בתקשורת מורכבים. הרפיה מגנטי ΔT2 נתונים שנאספו ממדיה מורכבים יותר, כולל א) אגם מים, חלב מלא ב). בדומה הנתונים שנאספו מן הפתרונות PBS הקודם, צוין כי זיהוי של חיידקים מזהמים היה רגיש יותר בטווח של 1-20 CFU (כניסות). הנתונים המתאימים של פליטת קרינה פלואורסצנטית נאסף עבור C) אגם מים ו- D) דגימות חלב (כניסות: ליניאריות חלקות), אשר הראתה רגישות גבוהה יותר עם הגדלת CFU ספירות. שוב, נתונים אלה להדגים את היעילות שבה כל מודאליות משלים את השני, ולאמת את יכולתם להישאר פונקציונלי בתקשורת מורכבים. 16 ממוצע של ערכים של שלוש מדידות הם מתוארים ± שגיאה סטנדרטית. דמות זו שונתה באישור. 16
איור 4 : ירידה לפרטים MFnS. ייחודה של MFnS נבדקה באמצעות ניתוח מר בפתרונות נזיד מזין המכיל א) מספר של חיידקי קרוס-מזהמים, תערובת ו- B) חום-inactivating e. coli O157:H7. כפי שמוצג, ברור שיש nanosensors הקטן ללא איגוד עם חיידקים שאינם במיקוד, והם עדיין מסוגלת לאתר של חיידקים היעד בנוכחות אחרים מזהמים, המבטיח כי צורה זו של ההקרנה תהיה באמצעותטבלת לשימוש בתקשורת מורכבים המכילים מספר מינים חיידקים פתוגניים שאינם. ג) נוסף ירידה לפרטים הבדיקות בוצעו על ידי סינתזה MFnS עם נוגדן isotype (עיגולים אדומים: אנטי -e. coli O111), אשר הביא מעט לא מחייב בהשוואה MFnS מצומדת נוגדנים (ריבועים שחורים) O157:H7. נתונים אלה מדגימים כי MFnS רק להגיב עם חיידקים היעד קיימא, עוד יותר מאמת את האפקטיביות שלהם כפלטפורמה האבחון בשלב של טיפול. 16 ממוצע של ערכים של שלוש מדידות הם מתוארים ± שגיאה סטנדרטית. דמות זו שונתה באישור. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה תוכנן כדי לייצר MFnS תקינים הכי פשוט ככל האפשר. עם זאת, ישנם רבים נקודות מפתח בו שינוי בפרוטוקול עשוי להיות שימושי, בהתאם למטרה הקצה של המשתמש. לדוגמה, השימוש של נוגדנים שונים תאפשר מיקוד של רבים פתוגנים אחרים. בנוסף, פרוטוקול זה אינה מוגבלת לשימוש של נוגדנים כמו פילוח מולקולות. כל מולקולה אשר יש זיקה מחייבת ספציפי עבור פתוגנים היעד, כגון קולטני התא המארח, עשוי לשמש גם פילוח מולקולות. כל עוד המולקולה מיקוד amine הראשי או אלכוהול קבוצה, או יכול להיות functionalized אחד, זה עשוי להיות מצומדת השטח של חלקיקי תחמוצת ברזל לפי הכימיה ההטיה EDC/NHS רשום בפרוטוקול. שנית, כמות MFnS בשימוש כל פתרון זיהוי יכול להיות מגוונים. חשוב להשתמש מספיק כך הערך T2 עבור הפתרון בסיסית (מכיל רק הממס, ננו-חיישן ללא מטרה פתוגן) היא בטווח של 100-250 גב' אם הערך בסיסית מתחת 100, ואז השינויים בערכי T2 יהיו פחות רגישים , עקב עודף של ננו-חיישן. כדי להעלות את התוכנית הבסיסית ערך T2, להפחית את כמות ננו-חיישן בפתרון. אם, לעומת זאת, הבסיס הוא מעל 250, הוא הופך להיות רגיש, תוצאות חיוביות שגויות עשוי להיות סביר יותר. מסיבות אלו, הוא הציע לכוון פתרון בסיסית T2 ערך בין 100-250 ms.
מגבלות הנוכחי של פרוטוקול זה, כאשר בוחנים את השימוש בשם אבחון בשלב של טיפול, הן ההסתמכות על relaxometer המגנטי הנוכחי benchtop. בזמן יעיל ויציב, פלטפורמה זו הרפיה מגנטי יכול להצטמצם גודל כדי להגדיל את הטלטלות. זה יהיה להגביר את הקלות שבה פלטפורמה זו יכולה לשמש בסביבות שונות, כגון מקורות מים או בשווקים מכולת, להקרנה חיידקי באתר יעיל. זה גם יכול להפחית את העלות של מחשב זה, שהופך אותו יותר ריאלי עבור זיהוי הפתוגן בשלב של טיפול.
בנוגע למחלות זיהוי הפתוגן ואבחון בהגדרות נמוך-משאב, פלטפורמה זו יש פוטנציאל להיות יותר יעיל מאשר הנוכחי הפתוגן אבחון טכניקות המשמשות כיום, כולל PCR ELISA. בעוד טכניקות מסורתיות אלו הוכיחו להיות יעיל במידה רבה, הם מורכבים מאוד, יקר ואיטי. בתור שכזה, יש צורך פלטפורמה אבחון מדויק כי ניתן לפתח לשימוש בהגדרות נמוך-משאב לגילוי בשלב של טיפול של פתוגנים ואבחון מחלות. פלטפורמה זו היא יחסית פשוטה לשימוש, חסכוני ומהיר. מלבד עלויות ההפעלה הראשונית של המכונות נדרש (relaxometer וצלחת קורא), MFnS בפועל הן זולות יחסית יציב מאוד. בנוסף, האוסף של T2 ערכים היא פשוטה, לא דורשת טכנאי מעבדה מקצועית.
בעתיד, שיתוף פעולה עם מהנדסים כימיים וביולוגיים להיות נרדף לעצב מכשיר נייד יותר, כף יד יכול לשמש הן מגנטי, פלורסנט איתור לזיהום חיידקי באמצעות MFnS. הפיתוח של מכשיר קטן יותר אני אשמח עוד יותר להפחית את עלויות המשויכות הפלטפורמה זיהוי, להגביר את היעילות שלו בתחום. יתר על כן, פלטפורמה זו יש פוטנציאל לשמש כדי לנתח את האפקטיביות של פיתוח biocide סוכנים. כפי שמוצג הנתונים שלנו, MFnS שלנו היו רק מסוגל לקשור עם חיידקים חיים ממוקדות, והפיק קטן ללא האות כאשר מודגרות עם חום-נהרג חיידקים. בהתבסס על זה, הפלטפורמה שלנו יכול לשמש כדי לבדוק את האפקטיביות של המועמדים biocide, אנו מתכוונים לחקור את זה יותר בעתיד.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים הסינתזה הראשונית של MFnS, איסוף נתונים T2. חשוב לטהר כראוי את MFnS על מנת להבטיח כי נוגדנים לתרשים לא יפריעו איסוף נתונים T2. בנוסף, כמות MFnS להציב בכל מדגם הבדיקה חייב להיות עקבי, כמו שינויים בריכוז MFnS תשנה ערכי T2, מסכן את תוצאות חיוביות/שליליות כוזבות.
לסיכום, MFnS הן הרומן צעד במאבק נגד זיהום חיידקי, יתפתחו בהמשך כפי הפגיעה המכוונת של פתוגנים נוספים מושגת, העיצוב מכונות יותר נייד הוא נרדף. עלות נמוכה והמורכבות נמוך-הקשורים לשימוש של MFnS גורם להם מועמדת מתאימה לשמש לזיהוי באתר של זיהום חיידקי. בזמן הסינתזה של אלה nanosensors דורש הכנה זהירה, השימוש בפועל שלהם הוא פשוט יחסית, ונותן להם פוטנציאל להפחית את והקאה, המחלות waterborne. עם להמשך פיתוח, היישום של nanosensors אלה ניתן לראות ההקרנה של מאגרי מים, בכמויות מסחריות מזונות בבית אריזה אתרים, נקודות מכירה, ואולי גם בתים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
היישום והפגינו של ננו-טכנולוגיה זו היא לא אושרו על ידי ה-FDA.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי K-INBRE P20GM103418, קנזס סויה הנציבות (הדיסקברי/ספק כח 1663), ACS PRF 56629-UNI7 כח פולימר כימיה הפעלה קרן, כל אס. אנו מודים הצלם האוניברסיטה, מר יעקב Anselmi, עבור עבודתו מצטיינים עם הווידאו. אנו מודים גם מר רוג'ר Heckert ואת גברת קאתה Heckert על תמיכתם הנדיבה למחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
