Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att syntetisera funktionella nanosensorer för bärbart, kostnadseffektiv och snabb påvisande av specifikt riktade patogena bakterier genom en kombination av magnetiska avkoppling och fluorescens utsläpp formerna.
Abstract
Entrohemoragiska Escherichia coli O157: H7 har kopplats till både vattenburen och livsmedelsburna sjukdomar och förblir ett hot trots de mat - och vatten-screeningmetoder används för närvarande. Medan konventionella bakteriell detektionsmetoder, såsom polymeras-kedjereaktion (PCR) och enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kan särskilt upptäcka patogena föroreningar, kräver de omfattande provberedning och långa väntetider. Dessutom, dessa metoder kräver sofistikerade laboratorieutrustning och inställningar och måste utföras av utbildad personal. Häri, föreslås ett protokoll för en enklare diagnostisk teknik som erbjuder en unik kombination av magnetiska och fluorescerande parametrar i en nanopartikel-baserad plattform. Den föreslagna multiparametric magneto-fluorescerande nanosensorer (MFnS) kan upptäcka E. coli O157: H7 kontaminering med så lite som 1 kolonibildande enhet finns i lösning inom mindre än 1 h. Dessutom MFnS förmåga att förbli mycket funktionella i komplexa media såsom mjölk och sjövatten har verifierats. Ytterligare specificitet analyser användes också till att demonstrera möjligheten för MFnS att endast identifiera specifika bakterier, även i närvaro av liknande bakteriearter. Hopkoppling av magnetiska och fluorescerande formerna möjliggör detektering och kvantifiering av patogen förorening i ett brett utbud av koncentrationer, uppvisar sin höga prestanda i både tidigt och sent-stadium kontaminering upptäckt. Den effektivitet, överkomliga priser och portabilitet av MFnS gör dem en perfekt kandidat för point-of-care screening för bakteriella föroreningar i en mängd olika inställningar, från vattenlevande reservoarer för att kommersiellt förpackade livsmedel.
Introduction
Persistent förekomst av bakteriell kontamination i både kommersiellt producerad mat och vattentäkter har skapat ett behov av alltmer snabba och specifika diagnostiska plattformar. 1 , 2 några av de vanliga bakteriella föroreningarna som är ansvarig för mat och vatten förorening är från Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus och Escherichia släktena. 3 , 4 bakteriell kontamination av dessa patogener ofta resulterar i symtom såsom feber, kolera, gastroenterit och diarré. 4 förorening av vattentäkter ofta har drastiska och negativa effekter på samhällen utan tillgång till tillräckligt filtrerat vatten och livsmedelskontaminering har lett till ett stort antal sjukdomar och produkten recall ansträngningar. 5 , 6
För att minska förekomsten av sjukdomar som orsakas av bakteriell kontamination, har förekommit ett antal insatser för att utveckla metoder som vatten och mat kan effektivt skannas innan försäljning eller konsumtion. 3 tekniker såsom PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 loop-medierad isotermiska amplifiering ( LAMPA),13,-14 bland annat15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 har nyligen använts för olika patogener. Jämfört med traditionella bakteriell odling metoder, är dessa tekniker mycket effektivare när det gäller specificitet och tid. Dock kämpar dessa tekniker fortfarande med falska positiva och negativa, komplicerade förfaranden och kostnad. 1 , 3 , 25 det är denna anledning att multiparametric magneto-fluorescerande nanosensorer (MFnS) föreslås som en alternativ metod för bakteriell upptäckt.
Dessa nanosensorer para unikt ihop magnetiska avkoppling och fluorescerande modaliteter, möjliggör en dual-detection-plattform som är både snabb och noggrann. Med E. coli O157: H7 som en prov-förorening, demonstreras MFnS förmåga att upptäcka så lite som 1 CFU inom minuter. Patogen-specifika antikroppar används för att öka specificiteten och kombinationen av både magnetiska och fluorescerande formerna möjliggör detektering och kvantifiering av bakteriella föroreningar i både låg - och hög-förorening spänner. 16 när det gäller bakteriell kontamination, nanosensorer kommer att vimla runt bakterierna på grund av de inriktning förmågor av patogen-specifika antikroppar. Bindningen mellan magnetiska nanosensorer och bakterier begränsar samspelet mellan den magnetisk järnkärna och omgivande vatten protonerna. Detta orsakar en ökning i T2 avkoppling times, som registreras av en magnetisk relaxometer. När koncentrationen av bakterier i lösning stiger, skingra nanosensorer med det ökade antalet bakterier, vilket resulterar i lägre T2 värden. Omvänt, fluorescens utsläpp kommer att öka i proportion med koncentrationen av bakterier, på grund av det ökade antalet nanosensorer direkt bunden till patogen. Centrifugering av proverna och isolering av den bakteriella pelleten, kommer att endast bevara de nanopartiklar som direktansluten till bakterier, ta bort eventuella friflytande nanosensorer och direkt korrelera fluorescens utsläpp med antalet bakterier som finns i lösningen. En schematisk representation av denna mekanism är representerade i figur 1.
Denna MFnS plattform har utformats med point-of-care screening i åtanke, vilket leder till låg kostnad och bärbara egenskaper. MFnS är stabila i rumstemperatur och krävs endast i mycket låga koncentrationer för korrekt upptäckt av bakteriella föroreningar. Dessutom efter syntes, användning av MFnS är enkel och kräver inte användning av utbildad personal inom området. Avslutningsvis tillåter detta diagnostiska plattform för mycket anpassningsbara inriktning, att tillhandahålla ett sätt av som denna en plattform kan användas för att upptäcka patogener av alla slag, i många olika inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes och funktionalisering av flera parametriska Magneto-fluorescerande nanosensorer (MFnS).
- Syntes av superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (IONPs)
- att förbereda för IONP syntes, förbereda följande 3 lösningar: lösning 1: FeCl 3 (0.70 g) och FeCl 2 H 2 O (2 mL), lösning 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) i H 2 O (15 mL), och lösning 3: polyakryl syra (0.855 g) i H 2 O (5 mL).
- Lägga till 90 µL 2 M saltsyra (HCl) i lösning 1 och sedan blanda omedelbart med lösning 2 medan vortexa på 875 rpm. Lägg sedan till lösning 3. Fortsätt vortexa för 60 min.
- Centrifugera i 20 min vid 1.620 x g. Centrifugera supernatanten i 20 min vid 2 880 x g.
- Rena slutliga supernatanten via dialys. Lägga till supernatanten till en dialys väska (MWCO 6 − 8 K) och placera det i en bägare som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH = 7.4) och spin bar. Låt den blöta i 12 h, ersätta med färsk buffert varje 2-3 h.
- Konjugation av mål-specifika antikroppar mot ytan av IONPs
- förbereda följande fyra lösningar: lösning A: 5 mg 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) i 250 µL MES [2-(N- morpholino) ethanesulfonic syra] buffert (0,1 M, pH = 6,8), lösning B: 3 mg av N-Hydroxysuccinimide (NHS) i 250 µL MES buffert (0,1 M, pH = 6,8), lösning C: 5 µg av IgG1, det E. coli mAb, i 225 µL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7,4) , och lösning D: 4 mL IONP (5,0 mmol) i 1 mL PBS (pH 7,4).
- Lägga till 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert lösning A, sedan omedelbart lägga till lösning A i lösning D i små steg inom 15 s, Invertera lösningen efter varje tillsats för blandning.
- Börja omedelbart lägga till lösning B till lösning D i små steg under en tre-minuters period. Blanda genom att vända lösningen efter varje tillsats.
- Lägga till lösning C till lösning i steg om 5 µL, Invertera lösningen efter varje tillsats för blandning.
- Tillåta reaktion att fortsätta för 3 h i rumstemperatur och sedan fortsätta inkubering vid 4 ° C över natten.
- Renar de resulterande Ab-konjugerad IONPs via magnetiska kolumn använder PBS (pH = 7.4, slutlig [Fe] = 3,5 mmol) ta bort några okonjugerat antikroppar.
- Tvätta den magnetiska kolumnen med PBS (1 mL). Tillmäter magnetbordet kolumnen och lägger till IONP lösning.
- Tvätta magnetiska kolonnen med PBS (1 mL) igen. Ta bort kolumnen magnetiska från magnetbordet. Lägga till PBS i kolumnen och samla lösningen. Förvaras vid 4 ° C
- inkapsling av fluorescerande 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiI) färgämne i polyakryl syra (PAA) beläggning av de antikropp-konjugerad IONPs med en lösningsmedel diffusion metod.
- 4 mL av IONPs, tillsätt droppvis 2.0 µL av DiI färgämne (2 mmol) i 100 µL av DMSO med kontinuerlig blandning vid 1100 rpm.
- Dialyze den resulterande lösningen (MWCO 6-8 KDa, 12 h) mot PBS, skapa en sista MFnS-lösning med en slutlig järn koncentration av [Fe] = 2 mmol.
- Karakterisering av MFnS
- för spektrofotometrisk analys, Använd en tallrik läsare för att upptäcka inkapslade DiI färgämne med fluorescens utsläpp på 595 nM.
- Dynamisk ljus spridning
- Placera ett prov av den MFnS lösningen i en zetasizer att fastställa genomsnittliga storleken och ytladdning av MFnS.
Obs: Här, den genomsnittliga storleken och ytladdning av funktionella MFnS befanns vara 77.09 nm och -22,3 mV respektive.
- Placera ett prov av den MFnS lösningen i en zetasizer att fastställa genomsnittliga storleken och ytladdning av MFnS.
2. Bakteriella Culturing och lager lösning förberedelse
- bakteriell odling
- återfukta en frystorkade pellets (E. coli O157: H7) i 1 mL av näringsämne buljong och Lägg sedan till ytterligare 5 mL buljong.
- Tillämpa 100 µL av lösningen till en agarplatta och streak med hjälp av en steril inympning loop, följt av inkubation vid 37 ° C under 24 h.
- Efter 24 h, Välj en isolerad koloni från agarplattan och lägga till den i en 15 mL av kultur buljongen. Inkubera vid 37 ° C i 4-6 h, medan övervakning värdet optiska densitet (absorbans vid 600 nm).
- När en optisk densitet värde av 0,1 erhålls, stoppa odling och utföra seriespädningar.
- Seriespädningar
- lägga till 900 µL av näringsämne buljong till åtta sterila mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 100 µL av bakteriesuspensionen till första röret (utspädning 10 -1).
- Ta 100 µL från första röret och lägga till den andra, att få en utspädning av 10 -2. Fortsätter detta mönster för resterande rören, slutar med en slutspädning av 10 -8.
- Överföra 100 μl från varje tub att separera agarplattor, och Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C.
- Nästa dag räknas den kolonibildande enheter (CFUs) på varje tallrik. Välj plattan med ~ 100 CFUs. Använda de motsvarande spädningarna för ytterligare experiment (100 µL = ~ 100 CFUs).
Obs: Här var det 10 -6 utspädning som resulterade i ~ 100 CFUs.
3. Snabb upptäckt av E. coli O157: H7 med hjälp MFnS
- Spike olika PBS lösningar (1 X, pH 7,4, 300 µL) med ökande mängder 10 -6 bakteriell beståndet, vilket resulterar i CFU varierar från 1-100. Lägga till en konsekvent mängd MFnS (100 µL) till dessa lösningar.
- Skapa en originalplan lösning som innehåller endast PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) och MFnS (100 µL).
- Inkubera lösningar under 30 minuter vid 37 ° C och låt dem svalna till rumstemperatur.
- Överföring individuella lösningar till de magnetiska relaxometer (0.47 Tesla) och registrera förändringar i avkoppling gånger (T2) i förhållande till CFUs i varje lösning.
- Att registrera förändringar i T2 värden, börja med att mäta T2 värdet av baslinjen lösningen som innehåller endast PBS och MFnS.
- Plats lösningen i den magnetiska relaxometer. Öppna programvaran respektive, Välj den " T2 avkoppling " inställning och tryck på " mäter. "
- efter insamlingen av baslinjen T2, mäta T2 värdena av de ytterligare lösningar som var spetsat med olika koncentrationer av bakterier.
Obs: Motsvarar förändringen i T2 baslinjen T2 subtraheras från den spetsiga T2.
- Att registrera förändringar i T2 värden, börja med att mäta T2 värdet av baslinjen lösningen som innehåller endast PBS och MFnS.
- Ta prover från den magnetiska relaxometer och centrifugera rören vid 2880 x g i 10 min.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera bakteriell pellets i 100 µL av PBS (1 X, pH 7,4).
- Lägga till 80 µL av varje resuspension en plattan med 96 brunnar och rekord fluorescens intensiteter på 595 nM.
Obs: Testning kan upprepas med olika lösningsmedel, inklusive sjön vatten, mjölk och andra som beskrivs i resultatavsnittet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFnS verkningsmekanismen är representerade i figur 1. Klustring av MFnS runt ytan av bakteriella föroreningar stör samspelet mellan magnetic cores av MFnS och den omgivande väte kärnan. Till följd av detta kluster, magnetiska avkoppling ökar värden. Koncentrationen av bakteriella föroreningar ökar, klustring minskar, och förändringen i T2 värden minskar. Tillägg av en fluorescerande modalitet är därför avgörande. När bakteriell koncentrationen ökar, ökar styrkan i fluorescerande signalen produceras av MFnS, möjliggör känslig detektion av bakteriella föroreningar i både låg och hög koncentration spänner.
Efter protokollet,16 MFnS var syntetiseras och först testade i lösningar av PBS (1 X, pH 7,4). Den inledande modalitet som används för identifiering, magnetiska avkoppling, användes för att registrera ändringar i T2 värden. I enlighet med protokollet, proverna var sedan centrifugeras, pellets var resuspended och fluorescens uppgifterna samlades in. Motsvarande ΔT2 och fluorescens utsläppsvärden presenteras i figur 2. Som visad, ΔT2 värdet var störst vid lägre koncentrationer av bakteriell kontamination, och nått mättnad på ungefär 20 CFUs. Fluorescens utsläpp, däremot, blev mer exakt på > 20 CFUs, visar vikten av att kombinera dessa två modaliteter. Efter dessa primära analyser, liknande utfördes i komplexa media, inklusive sjön vatten och mjölk. Detta gjordes för att säkerställa att nanosensorer är fortfarande effektiva i mer komplexa media. De insamlade från dessa analyser presenteras i figur 3 och är mycket liknande till de analyser som utförts i PBS. Detta verifierar att dessa nanosensorer förblir effektiv i komplexa media.
När du har bekräftat att MFnS kunde upptäcka förekomsten av bakteriella föroreningar i både enkla och komplexa media, utfördes sedan ett antal tester för att bestämma nivån på specificitet som underhålls av nanosensorer. I detta syfte inkuberades MFnS i lösningar som innehåller målet bakterier, värmeavdödade målet bakterier, icke-målorganismer bakterier (icke-patogena E. coli och S. typhimurium) och en blandning. Eftersom detta var bara en specificitet assay, insamling av magnetiska avkoppling ensam var tillräcklig, och motsvarande data presenteras i figur 4. Som kan ses, MFnS bunden endast för att leva E. coli O157: H7, och inte andra värmeavdödade eller icke-målarter bakterierna. Denna nivå av specificitet tillskrivs de konjugera antikropparna som inriktning, och ytterligare bekräftar att MFnS kommer att vara effektiva på att upptäcka specifika patogener föroreningar, även när i närvaro av icke sjukdomsalstrande bakterieart.
Figur 1 : Magneto-fluorescerande upptäckt mekanismen. Schematisk bild av MFnS syntes och dual-modal mekanismen av bakteriell upptäckt. Efter en kort inkubationstid (30 min) är MFnS känsligt identifiera målet bakterier via en kombination av magnetisk resonans och fluorescens utsläpp. Klustring av MFnS runt ytan av bakteriella föroreningar orsakar förändringar i magnetiska avkoppling värden, som kan detekteras genom en magnetisk relaxometer. Dessutom kan fluorescerande signaler samlas in från den MFnS som direkt bunden till bakteriella föroreningar. Detta ger en dual-modal upptäckt plattform som kan upptäcka bakteriella föroreningar i både låg och hög koncentration spänner. 16 denna siffra har ändrats med tillstånd från. 16
Figur 2 : Proof of Concept. (A) magnetiska avkoppling data (ΔT2) samlades först från utspädningar av E. coli O157: H7 (1-100 CFU) i PBS lösningsmedel (1 X, pH = 7.4). Herr påvisande av bakterier var mycket känsliga på lägre CFU räknas (infälld: alltifrån 1-20 CFU). Dock ΔT2 avläsningarna blev mättad vid högre bakterie koncentrationer (> 20 CFU), vilket indikerar att MR är värdefullare för påvisande och kvantifiering av tidig bakteriell kontamination. (B) fluorescens utsläppsdata från samma spetsade PBS lösningar (infälld: linjäritet tomt). Resultaten visade att fluorescens detektionsmetod är känsligare på högre CFU räknas, medan det saknas i känslighet för låga CFU prover. Tillsammans, Visa dessa data förmåga både magnetiska och fluorescerande modaliteter att påvisa och kvantifiera bakteriell kontaminering i tidig - och sena-stadier av bakteriell kontamination. 16 genomsnittet värderar av tre mätningar är avbildade ± medelfel. Denna siffra har ändrats med tillstånd från. 16
Figur 3 : Bakteriell upptäckt i komplexa Media. Magnetiska avkoppling ΔT2 data som samlats in från mer komplexa media, inklusive A) sjön vatten och B) helmjölk. Liknar de insamlade från PBS lösningarna, det noterades att detektion av bakteriella föroreningar var känsligare i spänna av 1-20 CFU (indragen). Motsvarande fluorescens utsläppsdata samlades för C) sjövatten och D) mjölk prover (indragen: linjäritet tomter), som visade högre känslighet med ökande CFU räknas. Återigen, dessa data visar effektiviteten med vilken varje modalitet kompletterar den andra, och validera deras förmåga att förbli funktionella i komplexa media. 16 genomsnittet värderar av tre mätningar är avbildade ± medelfel. Denna siffra har ändrats med tillstånd från. 16
Figur 4 : MFnS specificitet. Specificiteten av MFnS testades med hjälp av herr analys i näringsämne buljong lösningar innehållande) ett antal bakteriella cross-föroreningar och en blandning, och B) värme-inactivating E. coli O157: H7. Som visad, är det tydligt att nanosensorer har liten till ingen bindande icke öronmärkt bakterier och att de fortfarande kan upptäcka mål bakterierna i närvaro av andra föroreningar, att säkerställa att denna form av screening skulle vara viaBLE för användning i komplexa media som innehåller ett antal icke-patogena bakteriearter. (C) ytterligare specificitet testning utfördes av syntetisera MFnS med en isotypen antikropp (röda cirklar: Anti -E. coli O111), vilket resulterade i lite att inga bindande jämfört med den O157: H7 antikropp-konjugerad MFnS (svarta fyrkanter). Dessa data visar att MFnS endast reagerar med livskraftiga målet bakterier, att ytterligare kontrollera deras effektivitet som en point-of-care diagnostiska plattform. 16 genomsnittet värderar av tre mätningar är avbildade ± medelfel. Denna siffra har ändrats med tillstånd från. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har utformats för att producera fullt fungerande MFnS så enkelt som möjligt. Dock finns det många viktiga punkter som ändring av protokollet kan vara användbar, beroende på användarens slutmål. Exempelvis skulle användning av olika antikroppar möjliggöra för inriktning av många andra patogener. Dessutom är detta protokoll inte begränsat till användning av antikroppar som inriktning molekyler. Varje molekyl som har specifik affinitet för målpatogener, såsom värd cellreceptorer, kan också användas som inriktning molekyler. Så länge inriktning molekylen har en primär Amin eller alkohol, eller kan vara functionalized för att ha en, kan det vara konjugerat till ytan av järnoxid nanopartiklar enligt EDC/NHS konjugation kemi som anges i protokollet. För det andra kan mängden MFnS som används i varje upptäckt lösning varieras. Det är viktigt att använda tillräckligt så att T2 värdet för baslinjen lösningen (som endast innehåller lösningsmedel och nanosensor utan mål patogen) är i intervallet 100-250 ms. om utgångsvärdet är under 100, då förändringarna i T2 värden blir mindre känsliga , på grund av ett överflöd av nanosensor. För att höja baslinjen T2 värde, minska mängden nanosensor i lösning. Om baslinjen är dock över 250, det blir alltför känslig och falsklarm kan bli mer sannolikt. Av dessa skäl föreslås det för att sikta på en baslinje lösning T2 värde mellan 100-250 ms.
Nuvarande begränsningar av detta protokoll, när man överväger dess användning som en point-of-care diagnostik, är beroendet av den nuvarande bänkmonterade magnetiska relaxometer. Medan effektiva och stabila, kunde denna magnetiska avkoppling plattform minskas i storlek för att öka dess portabilitet. Detta skulle öka den lätthet med vilken denna plattform kan användas i olika miljöer, såsom på vattentäkter eller livsmedelsbutiker marknaderna, för effektiv Hotellets bakteriell screening. Detta kunde också minska kostnaden för denna maskin, vilket gör det mer genomförbart för upptäckt av point-of-care patogen.
När det gäller sjukdom diagnos och patogen upptäckt i resurssnål inställningar har denna plattform potential att vara mer effektiv än aktuella patogenen diagnos tekniker som används idag, inklusive PCR och ELISA. Medan dessa traditionella tekniker har visat sig vara till stor del effektivt, är de mycket komplexa, dyra och långsamma. Som sådan, finns det ett behov för en korrekt diagnostiska plattform som kan utvecklas för användning i resurssnål inställningar för point-of-care upptäckt av patogener och sjukdomsdiagnos. Denna plattform är relativt enkel att använda, kostnadseffektiv och snabb. Bortsett från initiala etableringskostnaderna för de nödvändiga maskinerna (relaxometer och plattan läsare) är de faktiska MFnS relativt billigt och mycket stabil. Dessutom, insamling av T2 värden är enkel och kräver inte en professionell laboratorietekniker.
I framtiden, kommer samarbete med kemiska och biologiska ingenjörer att fortsätta för att utforma en mer portabel, handhållen enhet som kan användas för både magnetiska och fluorescerande upptäckt av bakteriell kontamination med MFnS. Utvecklingen av en mindre enhet skulle bidra till att ytterligare minska kostnaderna i samband med denna upptäckt plattform och öka dess effektivitet i fältet. Denna plattform har dessutom potential att användas för att analysera effektiviteten av utveckla biocid agenter. Som visas i våra data, vår MFnS kunde bara att binda med live-riktade bakterier och producerat lite till ingen signal när inkuberas med värmeavdödade bakterier. Baserat på detta, vår plattform kunde användas för att testa effektiviteten av biocid kandidater, och vi planerar att utforska detta ytterligare i framtiden.
Kritiska steg i detta protokoll har inledande syntesen av MFnS och insamling av T2 data. Det är viktigt att ordentligt rena MFnS för att säkerställa att fritt flytande antikroppar inte interfererar med T2 datainsamling. Dessutom måste mängden MFnS som placeras i varje prov vara konsekvent, eftersom förändringar i MFnS koncentrationen kommer att förändra T2 värden, att riskera falska positiva/negativa.
Avslutningsvis MFnS är ett nytt steg framåt i kampen mot bakteriell kontamination, och kommer att utvecklas ytterligare som inriktningen av ytterligare patogener uppnås och design mer bärbara maskiner bedrivs. Låg kostnad och låg-komplexiteten förknippade med användning av MFnS gör dem en livskraftig kandidat att användas för hotellets upptäckt av bakteriell kontamination. Syntesen av dessa nanosensorer kräver noggranna förberedelser, deras faktiska användning är relativt enkel, och ger dem möjligheter att minska livsmedelsburna och vattenburna sjukdomar. Med ytterligare utveckling, genomförandet av dessa nanosensorer kan ses i screening av vattenreservoarer och kommersiellt producerade livsmedel vid förpackning platser, intressanta försäljning och kanske till och med hem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Påvisade tillämpningen av denna nanoteknik ännu inte har godkänts av FDA.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av K-INBRE P20GM103418, Kansas sojabönor kommissionen (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 och PSU polymer kemi start fund, alla till SS. Vi tackar universitet videographer, Mr Jacob Anselmi, för hans enastående arbete med video. Vi tackar också Mr Roger Heckert och Mrs Katha Heckert för deras generösa stöd för forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
