Summary
L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.
Abstract
Enteroemorragica Escherichia coli O157: H7 è stato collegato ad entrambi a base acquosa e malattie di origine alimentare e resta una minaccia nonostante i metodi di screening di cibo e di acqua utilizzata attualmente. Mentre i metodi convenzionali di rilevazione batterica, come reazione a catena della polimerasi (PCR) e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) in grado di rilevare specificamente patogeni contaminanti, richiedono preparazione dei campioni ampi e lunghi periodi di attesa. Inoltre, queste pratiche richiedono impostazioni e strumenti di laboratorio sofisticati e devono essere eseguite da professionisti qualificati. Nel presente accordo, un protocollo è proposto per una più semplice tecnica diagnostica che caratterizza la combinazione unica di parametri magnetici e fluorescente in una piattaforma basata su nanoparticelle. La proposta multiparametrica magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) in grado di rilevare e. coli O157: H7 contaminazione con appena 1 unità formanti colonie presenti in soluzione entro meno di 1 h. Inoltre, la capacità di MFnS di rimanere altamente funzionale in supporti complessi come latte ed acqua del lago è stata verificata. Ulteriori specificità analisi inoltre sono state usate per dimostrare la capacità di MFnS di rilevare solo i batteri specifici, anche in presenza di specie batteriche simili. L'abbinamento delle modalità magnetica e fluorescente permette per la rilevazione e la quantificazione di contaminazione da agenti patogeni in una vasta gamma di concentrazioni, esibendo le sue alte prestazioni nella rilevazione di contaminazione sia precoce e tardiva-stadio. L'efficacia, convenienza e portabilità della MFnS li rendono un candidato ideale per lo screening di point-of-care per contaminanti batterici in una vasta gamma di impostazioni, dai bacini acquatici per gli alimenti in commercio confezionati.
Introduction
La presenza persistente di contaminazione batterica in entrambi il cibo prodotto commercialmente e fonti d'acqua ha creato la necessità di piattaforme diagnostiche sempre più rapide e specifiche. 1 , 2 alcuni dei più comuni contaminanti batterici responsabili della contaminazione di cibo e acqua sono dei generi Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus ed Escherichia. 3 , 4 contaminazione batterica di questi agenti patogeni spesso provoca sintomi quali febbre, colera, gastroenterite e diarrea. 4 contaminazione delle fonti d'acqua spesso ha effetti drastici e negativi sulle comunità senza accesso all'acqua sufficientemente filtrata e contaminazione degli alimenti ha portato ad un gran numero di malattie e sforzi di richiamo del prodotto. 5 , 6
Al fine di ridurre l'occorrenza di malattie causate dalla contaminazione batterica, ci sono stati una serie di sforzi per sviluppare metodi che acqua e cibo possono essere efficientemente acquisiti prima della vendita o consumo. 3 tecniche come la PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 (amplificazione isotermica mediata da loop LAMPADA),13,14 , tra gli altri,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente sono state usate per il rilevamento di vari agenti patogeni. Rispetto al tradizionale batteriche metodi di coltura, queste tecniche sono molto più efficiente per quanto riguarda la specificità e l'ora. Tuttavia, queste tecniche ancora lottano con falsi positivi e negativi, procedure complesse e costo. 1 , 3 , 25 è per questo motivo che multiparametriche magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) sono proposti come metodo alternativo per rilevazione batterica.
Questi nanosensori unicamente insieme coppia rilassamento magnetico e modalità fluorescente, permettendo per una piattaforma dual-rilevazione che sia rapida e accurata. Utilizzando e. coli O157: H7 come contaminante campione, la capacità di MFnS per rilevare appena 1 CFU in minuti è dimostrata. Patogeno-specifiche anticorpi sono usati per aumentare la specificità e la combinazione delle modalità sia magnetiche che fluorescente permette per la rilevazione e quantificazione di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di bassa e alta contaminazione. 16 nel caso di contaminazione batterica, i nanosensori saranno sciame intorno i batteri a causa della capacità di targeting degli anticorpi patogeni specifici. L'associazione tra i nanosensori magnetico e batteri limita l'interazione tra il nucleo di ferro magnetico e i protoni dell'acqua circostante. Questo provoca un aumento i tempi di rilassamento T2, come registrato da una relaxometer magnetica. Come la concentrazione di batteri in soluzione aumenta, i nanosensori disperdono con l'aumento del numero di batteri, con conseguente più bassi valori di T2. Al contrario, l'emissione di fluorescenza aumenterà in proporzione con la concentrazione dei batteri, dovuto il numero aumentato di nanosensori direttamente legati al patogeno. Centrifugazione dei campioni e l'isolamento del pellet batterico, conserverà solo le nanoparticelle direttamente collegate ai batteri, rimuovendo qualsiasi nanosensori digalleggiante e direttamente correlare l'emissione di fluorescenza con il numero di batteri presenti nella soluzione. Una rappresentazione schematica di questo meccanismo è rappresentata nella Figura 1.
Questa piattaforma di MFnS è stata progettata con lo screening di point-of-care nella mente, con conseguente caratteristiche portatile e a basso costo. MFnS sono stabili a temperatura ambiente e sono necessarie solo in concentrazioni molto basse per accuratezza nel rilevamento di contaminanti batterici. Inoltre, dopo la sintesi, uso del MFnS è semplice e non richiede l'utilizzo di professionisti qualificati nel settore. Infine, questa piattaforma diagnostica permette per il targeting altamente personalizzabile, fornendo un mezzo da cui questa una piattaforma può essere utilizzata per rilevare gli agenti patogeni di tutti i tipi, in molti contesti diversi.
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Protocol
1. sintesi e funzionalizzazione di multi-parametrico Magneto-fluorescente nanosensori (MFnS).
- Sintesi di ossido di ferro superparamagnetico nanoparticelle (IONPs)
- per preparare per la sintesi IONP, preparare le seguenti 3 soluzioni: soluzione 1: FeCl 3 (0,70 g) e FeCl 2 H 2 O (2 mL), soluzione 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) in H 2 O (15 mL) e soluzione 3: acido poliacrilico (0,855 g) H 2 O (5ml).
- µ L 90 di 2 M di acido cloridrico (HCl) alla soluzione 1 e quindi miscelare immediatamente con soluzione 2 mentre nel Vortex a 875 giri/min. Quindi aggiungere la soluzione 3. Continuare su vortex per 60 min.
- Centrifugare per 20 min a 1.620 x g. Centrifugare il surnatante per 20 min a 2.880 x g.
- Purificare il surnatante finale tramite dialisi. Aggiungere il surnatante di un sacchetto di dialisi (MWCO 6 − 8 K) e posizionarlo in un becher contenente tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.4) e spin bar. Lasciare in ammollo per 12 h, sostituendo con tampone fresco ogni 2-3 h.
- Coniugazione degli anticorpi specifici per la destinazione alla superficie del IONPs
- preparare le seguenti quattro soluzioni: soluzione a: 5 mg di 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide cloridrato (EDC) in 250 µ l MES [2-(N- buffer di morpholino) ethanesulfonic acido] (0,1 M, pH = 6,8), soluzione b: 3 mg di N-Idrossisuccinimide (NHS) a 250 µ l di tampone MES (0,1 M, pH = 6,8), soluzione c: 5 µ g di IgG1, il mAb di e. coli, in 225 µ l di tampone fosfato salino (PBS) (pH 7.4) e soluzione d: 4 mL di IONP (5,0 mmol) in 1 mL di PBS (pH 7,4).
- Aggiungere 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) del buffer alla soluzione A, quindi immediatamente aggiungere soluzione alla soluzione D in piccoli incrementi entro 15 s, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.
- Immediatamente iniziare ad aggiungere soluzione B alla soluzione D in piccoli incrementi per un periodo di tre minuti. Mix invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta.
- Aggiungere soluzione C soluzione con incrementi di 5 µ l, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.
- Consentire reazione continuare per 3 ore a temperatura ambiente e poi continuare l'incubazione a 4 ° C durante la notte.
- Purificare il IONPs Ab-coniugato risultante tramite colonna magnetica utilizzando PBS (pH = 7,4, finale [Fe] = 3,5 mmol) per rimuovere eventuali anticorpi non coniugate.
- Lavare la colonna magnetica con PBS (1 mL). Fissare la colonna alla piastra magnetica ed aggiungere la soluzione IONP.
- Lavare nuovamente la colonna magnetica con PBS (1 mL). Rimuovere la colonna magnetica dalla piastra magnetica. Aggiungere la colonna di PBS e raccogliere la soluzione. Conservare a 4 ° C
- incapsulamento di 1,1 fluorescente ' - Diottadecilbis - 3,3,3 ', 3 '-colorante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) nel rivestimento (PAA) l'acido poliacrilico dell'anticorpo coniugato IONPs utilizzando un Metodo di diffusione di solvente.
- A 4 mL della IONPs, aggiungere goccia a goccia 2.0 µ l di colorante DiI (2 mmol) in 100 µ l di DMSO con miscelazione continua a 1100 giri/min.
- Dializzare la soluzione risultante (MWCO 6-8 KDa, 12h) contro PBS, creando una soluzione di MFnS finale con una concentrazione di ferro finale di [Fe] = 2 mmol.
- Caratterizzazione di MFnS
- per l'analisi spettrofotometrica, utilizzare un lettore di piastre per rilevare incapsulato DiI tintura con l'emissione di fluorescenza a 595 nM.
- Dynamic Light Scattering
- inserire un esempio della soluzione MFnS in un zetasizer per determinare la dimensione media e la carica superficiale della MFnS.
Nota: Qui, la dimensione media e la carica superficiale di MFnS funzionale sono stati trovati per essere 77.09 nm e -22,3 mV, rispettivamente.
- inserire un esempio della soluzione MFnS in un zetasizer per determinare la dimensione media e la carica superficiale della MFnS.
2. Batterica Culturing e preparazione di soluzione Stock
- coltura batterica
- idratare un pellet liofilizzato (e. coli O157: H7) in 1 mL di brodo nutritivo e quindi aggiungere un ulteriore 5 mL di brodo.
- Applicare 100 µ l di questa soluzione a una piastra di agar e striscia utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, seguito da incubazione a 37 ° C per 24 h.
- Dopo 24 h, selezionare una colonia isolata dalla piastra di agar e aggiungerlo a un 15 mL di brodo di coltura. Incubare a 37 ° C per 4-6 h, mentre si controlla il valore di densità ottica (assorbanza a 600 nm).
- Una volta ottenuto un valore di densità ottica di 0,1, interrompere la coltura ed eseguire diluizioni seriali.
- Diluizioni seriali
- aggiungere 900 µ l di brodo nutritivo per otto microcentrifuga sterile.
- Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica al primo tubo (diluizione 10 -1).
- Prendere 100 µ l dalla prima provetta e aggiungerlo al secondo, per ottenere una diluizione di 10 -2. Proseguire in questo modo per i rimanenti tubi, terminando con una diluizione finale di 10 -8.
- Trasferire 100 µ l da ciascuna provetta per separare le piastre di agar e incubare per 24 h a 37 ° C.
- Il giorno successivo, contare la Colonia formando unità (CFUs) su ogni piatto. Selezionare il piatto con CFUs ~ 100. Utilizzare le diluizioni corrispondente per ulteriori esperimenti (100 µ l = ~ 100 CFUs).
Nota: Qui era la diluizione di 10 -6 che ha provocato CFUs ~ 100.
3. Rapido rilevamento di E. coli O157: H7 utilizzando MFnS
- Spike varie soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) con quantità crescenti di stock batterici 10 -6, conseguente CFU varia da 1-100. Aggiungere una quantità costante di MFnS (100 µ l) di queste soluzioni.
- Creare una soluzione di base che contiene solo PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).
- Incubare soluzioni a 37 ° C per 30 minuti e poi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.
- Trasferimento soluzioni individuali per la relaxometer magnetica (0,47 Tesla) e registrare le modifiche in tempi di rilassamento (T2) riguardante il CFUs in ogni soluzione.
- Per registrare le modifiche nei valori di T2, iniziare misurando il valore di T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS.
Relaxometer
- posto la soluzione in magnetico. Aprire il rispettivo software, selezionare il " rilassamento T2 " impostazione e premere " misura. "
- dopo la raccolta della linea di base T2, misurare i valori di T2 delle soluzioni aggiuntive che sono stati diluiti con vari concentrazioni di batteri.
Nota: Il cambiamento in T2 è equivalente al basale T2 sottratto dal T2 spiked.
- Per registrare le modifiche nei valori di T2, iniziare misurando il valore di T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS.
Relaxometer
- Rimuovere i campioni dalla relaxometer magnetica e centrifugare le provette a 2880 x g per 10 min.
- Decantare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 100 µ l di PBS (1 X, pH 7.4).
- Aggiungere 80 µ l di ogni risospensione di una piastra a 96 pozzetti e intensità di fluorescenza record a 595 nM.
Nota: Test può essere ripetuto utilizzando solventi vari, tra cui Lago di acqua, latte e altri come descritto nella sezione risultati
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Representative Results
Nella Figura 1è rappresentato il meccanismo di azione di MFnS. Il clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici interferisce con le interazioni tra i nuclei del MFnS e i nuclei di idrogeno circostante. A seguito di questo rilassamento clustering, magnetico i valori aumentano. Man mano che aumenta la concentrazione di contaminanti batterici, clustering riduce, e il cambiamento nei valori di T2 diminuisce. Pertanto, l'aggiunta di una modalità fluorescente è fondamentale. La concentrazione batterica aumenta, aumenta la forza del segnale fluorescente prodotta da MFnS, consentendo la rilevazione sensibile di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta.
In seguito il protocollo,16 MFnS sono stati sintetizzati e analizzati in soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4). La modalità iniziale utilizzata per il rilevamento, rilassamento magnetico, è stata utilizzata per registrare le modifiche nei valori di T2. Conformemente al protocollo, i campioni sono stati poi centrifugati, pellet sono state risospese e fluorescenza dati sono stati raccolti. Il corrispondente ΔT2 e valori di emissione di fluorescenza sono presentati nella Figura 2. Come illustrato, il valore di ΔT2 era più grande alle concentrazioni più basse di contaminazione batterica e raggiunto la saturazione a circa 20 CFU. L'emissione di fluorescenza, d'altra parte, è diventato più preciso alle > 20 CFU, l'importanza di combinare queste due modalità di visualizzazione. A seguito di queste analisi primarie, prove simili sono stati condotti in supporti complessi, compresi latte e acqua del lago. Questo è stato fatto per garantire che i nanosensori sono ancora efficaci nei mezzi di comunicazione più complesse. I dati raccolti da queste analisi sono presentati nella Figura 3 e sono molto simili per le analisi condotte in PBS. Ciò consente di verificare che questi nanosensori rimangano efficaci nel complesso media.
Dopo aver confermato che MFnS potrebbe rilevare la presenza di contaminanti batterici nei media sia semplici che complessi, una serie di test poi sono stati condotti per determinare il livello di specificità mantenuto dai nanosensori. A tal fine, MFnS sono state incubate in soluzioni contenenti batteri bersaglio, batteri bersaglio calore-ucciso, non bersaglio batteri (non patogeni di e. coli e S. typhimurium) e una miscela. Questa era solo un'analisi della specificità, la raccolta di dati di rilassamento magnetico da solo era sufficiente, e i dati corrispondenti sono presentati nella Figura 4. Come si può vedere, il MFnS associato solo a vivere e. coli O157: H7 e non per gli altri batteri calore-ucciso o non bersaglio. Questo livello di specificità è attribuito agli anticorpi coniugati targeting e conferma ulteriormente che MFnS sarà efficace nel rilevare contaminanti patogeni specifici, anche quando in presenza di specie di batteri non patogeni.
Figura 1 : Meccanismo di rilevamento di magneto-fluorescente. Rappresentazione schematica della sintesi di MFnS e il meccanismo dual-modal di rilevazione batterica. Dopo un periodo di incubazione breve (30 min), MFnS sono in grado di rilevare con sensibilità i batteri di destinazione tramite una combinazione di risonanza magnetica e l'emissione di fluorescenza. Clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici provoca cambiamenti nei valori di rilassamento magnetico, rilevabili da una relaxometer magnetica. Inoltre, i segnali fluorescenti possono essere raccolti da MFnS direttamente associato a contaminanti batterici. Questo fornisce una piattaforma dual-modal rilevamento capace di contaminanti batterici di rilevamento in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta. 16 questa figura è stata modificata con il permesso. 16
Figura 2 : Proof of Concept. A) dati magnetico relax (ΔT2) in primo luogo è stato raccolto da diluizioni di e. coli O157: H7 (1-100 CFU) in solvente PBS (1 X, pH = 7.4). Signor rilevazione dei batteri era altamente sensibile a bassa conta CFU (inserto: che vanno da 1-20 CFU). Tuttavia, le letture di ΔT2 è diventato saturo alle più alte concentrazioni batteriche (> 20 CFU), che indica che il signor è più prezioso per la rilevazione e la quantificazione della fase iniziale di contaminazione batterica. B) dati di emissione di fluorescenza dallo stesso spillo soluzioni PBS (inserto: trama di linearità). I risultati hanno mostrato che il metodo di rilevazione di fluorescenza è più sensibile al più alto numero di CFU, mentre è privo di sensibilità per Bassi campioni di CFU. Insieme, questi dati dimostrano la capacità di modalità sia magnetiche che fluorescente per rilevare e quantificare la contaminazione batterica in precoce e tardiva-fasi di contaminazione batterica. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
Figura 3 : Rilevazione batterica nel complesso Media. Rilassamento magnetico ΔT2 dati raccolti dai mezzi più complessi, compreso A) Lago acqua e B) di latte intero. Simile ai dati raccolti dalle precedenti soluzioni di PBS, è stato notato che la rilevazione di contaminanti batterici era più sensibile nella gamma di 1-20 CFU (inserti). Corrispondenti dati di emissione di fluorescenza è stato raccolto per la C) acqua del lago e D) campioni di latte (inserti: trame di linearità), che ha mostrato maggiore sensibilità con l'aumento del numero di CFU. Ancora una volta, questi dati dimostrano l'efficacia con cui ogni modalità complementare a altro e convalidare la loro capacità di rimanere funzionale in supporti complessi. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
Figura 4 : MFnS specificità. La specificità del MFnS è stata testata utilizzando analisi signor nelle soluzioni di brodo nutritivo contenente A) un numero di croce-contaminanti batterici e una miscela e B) calore inattivanti Escherichia coli O157: H7. Come illustrato, è chiaro che i nanosensori non hanno poco o nessuna associazione con batteri non mirati e sono ancora in grado di rilevare i batteri di destinazione in presenza di altri contaminanti, assicurando che questa forma di screening sarebbe viaBLE per uso nei mezzi di comunicazione complessi che contengono un numero di specie di batteri non patogeni. C) ulteriore specificità test è stato condotto mediante la sintesi di MFnS con un isotipo dell'anticorpo (cerchi rossi: Anti -Escherichia coli O111), che ha provocato poco a nessuna associazione rispetto alla MFnS di anticorpo coniugato O157: H7 (quadrati neri). Questi dati dimostrano che MFnS solo reagire con batteri bersaglio praticabile, ulteriormente verificando la loro efficacia come una piattaforma diagnostica point-of-care. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
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Discussion
Questo protocollo è stato progettato per produrre completamente funzionale MFnS semplicemente come possibile. Tuttavia, ci sono molti punti chiave in cui alterazione del protocollo può essere utile, a seconda dell'obiettivo finale dell'utente. Ad esempio, l'uso di anticorpi differenti consentirebbe per il targeting di molti altri agenti patogeni. Inoltre, questo protocollo non è limitato all'uso di anticorpi come molecole di targeting. Qualsiasi molecola che ha affinità di legame specifico per agenti patogeni bersaglio, come recettori di host, può essere utilizzato anche come molecole di targeting. Purché la molecola targeting è un'ammina primaria o gruppo alcolico, o possa essere funzionalizzata per avere uno, può essere coniugato alla superficie delle nanoparticelle di ossido di ferro secondo la chimica di coniugazione di EDC/NHS elencata nel protocollo. In secondo luogo, la quantità di MFnS utilizzato in ogni soluzione di rilevamento può essere variata. È importante usare abbastanza in modo che il valore di T2 per la soluzione di base (contenente solo il solvente e il nanosensore senza agente patogeno bersaglio) è nella gamma di 100-250 ms. se il valore basale è inferiore a 100, allora i cambiamenti nei valori di T2 sarà meno sensibili , a causa di una sovrabbondanza di nanosensori. Per aumentare il valore di T2 della linea di base, ridurre la quantità di nanosensori in soluzione. Se, tuttavia, la linea di base è superiore a 250, diventa eccessivamente sensibile, e falsi positivi possono diventare più probabile. Per questi motivi, si consiglia di puntare ad una soluzione di base valore T2 tra 100-250 ms.
Attuali limiti del presente protocollo, se si considera il suo uso come una diagnostica point-of-care, sono la dipendenza la corrente relaxometer magnetico benchtop. Mentre stabile ed efficace, questa piattaforma di rilassamento magnetico potrebbe essere ridotto nelle dimensioni per aumentare la portabilità. Questo aumenterebbe la facilità con cui questa piattaforma potrebbe essere utilizzata in ambienti diversi, come alle fonti d'acqua o nei mercati di generi alimentari, per lo screening batterico in loco efficace. Questo potrebbe anche ridurre il costo di questa macchina, rendendola più fattibile per il rilevamento del patogeno di point-of-care.
Per quanto riguarda l'individuazione della malattia diagnosi e patogeno nelle impostazioni di risorse limitate, questa piattaforma ha il potenziale per essere più efficace del patogeno diagnosi tecniche correnti utilizzati oggi, tra cui PCR ed ELISA. Mentre queste tecniche tradizionali hanno dimostrato di essere in gran parte efficiente, sono altamente complesso, costoso e lento. Come tale, c'è bisogno di una piattaforma diagnostica accurata che poteva essere sviluppato per l'uso nelle impostazioni di risorse limitate per il rilevamento di point-of-care degli agenti patogeni e diagnosi della malattia. Questa piattaforma è relativamente semplice da usare, conveniente e rapida. A parte costi di messa in servizio delle macchine richieste (lettore di piastra e relaxometer), il MFnS reale sono relativamente a buon mercato e molto stabile. Inoltre, l'insieme di valori di T2 è semplice e non richiede un tecnico di laboratorio professionale.
In futuro, sarà perseguito collaborazione con gli ingegneri chimici e biologici per la progettazione di un dispositivo più portatile, tenuto in mano che possa essere utilizzato per entrambi il rilevamento magnetico e fluorescente di contaminazione batterica utilizzando MFnS. Lo sviluppo di un dispositivo più piccolo contribuirebbe a ridurre i costi associati a questa piattaforma di rilevamento ulteriormente e aumentare la sua efficacia nel campo. Inoltre, questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzato per analizzare l'efficacia di sviluppare agenti biocidi. Come illustrato nella nostra banca dati, nostri MFnS erano solo in grado di legarsi con targeting per vivere i batteri e non prodotto poco o nessun segnale quando incubati con calore-ucciso i batteri. Sulla base di questo, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzato per testare l'efficacia dei candidati di biocida, e abbiamo intenzione di esplorare questo ulteriormente in futuro.
Punti critici in questo protocollo sono la sintesi iniziale di MFnS e raccolta dei dati di T2. È importante purificare correttamente il MFnS per garantire che gli anticorpi digalleggiante non interferiscano con raccolta dati T2. Inoltre, la quantità di MFnS collocato in ogni campione deve essere coerenza, come cambiamenti nella concentrazione MFnS modificherà i valori di T2, rischiando di falsi positivi/negativi.
In conclusione, MFnS sono un nuovo passo avanti nella lotta contro la contaminazione batterica e sarà ulteriormente sviluppato come il targeting di ulteriori agenti patogeni è raggiunto e il design più portatile macchine sono perseguita. Il basso costo e bassa complessità associati all'uso di MFnS li rende un valido candidato per essere utilizzato per il rilevamento in loco di contaminazione batterica. Mentre la sintesi di questi nanosensori richiede un'attenta preparazione, loro uso effettivo è relativamente semplice e dà loro il potenziale di ridurre di origine alimentare e le malattie a base acquosa. Con ulteriore sviluppo, l'implementazione di questi nanosensori può essere visti nello screening di serbatoi d'acqua e cibi nei centri di confezionamento, punti vendita e forse anche case di prodotti commercialmente.
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Disclosures
L'applicazione ha dimostrato di questa nanotecnologia non è stato ancora approvato dalla FDA.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da K-INBRE P20GM103418, Kansas soia Commissione (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polimero chimica avvio fondo, tutti a SS. Ringraziamo il videografo di università, il signor Jacob Anselmi, per il suo eccezionale lavoro con il video. Ringraziamo anche il signor Roger Heckert e la signora Katha Heckert per il loro generoso sostegno per la ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
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