Summary
이 프로토콜의 전반적인 목표는 비용 효율적인, 노트북에 대 한 기능 nanosensors을 합성 하 고의 급속 한 탐지는 자석 및 형광 방출 modalities의 결합을 통해 병원 성 박테리아에 특히 표적으로.
Abstract
둘 다 waterborne Enterohemorrhagic 대장균 O157:H7 연결 되었습니다 foodborne 병, 및 음식 및 물 심사 방법에도 불구 하 고 위협 사용 현재 남아 있다. 일반 세균 검출 방법, 동안과 같은 연쇄 반응 (PCR) 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) 특히 병원 성 오염 물질을 감지할 수 있습니다 그들은 필요 광범위 한 샘플 준비 및 긴 대기 기간. 또한, 이러한 관행 정교한 실험실 계기 및 설정, 요구 하 고 훈련 된 전문가 의해 실행 되어야 합니다. 여기에, 프로토콜은 나노 기반 플랫폼에 자석 및 형광 매개 변수의 독특한 조합을 제공 하는 간단 하 게 진단 기술에 대 한 제안. 제안 된 multiparametric 마그네틱 형광 nanosensors (MFnS) 대장균 O157:H7 오염 조금 1 식민지 형성 장치 솔루션 미만 1 시간 내에 검색할 수 있습니다. 또한, MFnS의 능력을 유지와 같은 매우 복잡 한 미디어 기능을 우유와 호수 물 확인 되었습니다. 또한 추가 특이성 분석만 특정 대상 박테리아도 비슷한 세균성 종의 존재를 감지 하는 MFnS의 능력을 보여 주기 위해 사용 되었다. 자석 및 형광 modalities의 페어링 검색 및 병원 체 오염 농도, 모두와 늦은-초기 오염 탐지에 그것의 고성능 전시의 넓은 범위에서의 정량화에 대 한 수 있습니다. 효율성, 경제성, 그리고는 MFnS의 이동성 있도록 세균성 오염 물질에 대 한 포인트의 케어 심사를 위한 이상적인 후보자 설정의 넓은 범위에서 상업적으로 포장된 식품을 수생 저수지에서.
Introduction
세균성 오염 둘 다의 지속적인 발생 상업적 식품 생산과 물 소스 점점 더 신속 하 고 구체적인 진단 플랫폼에 대 한 필요를 창조 했다. 1 , 2 일반적인 세균성 오염 물질 음식 및 물 오염에 대 한 책임의 일부는 살 모 넬 라, 황색, Listeria, 비 브리 오, 이질균, 균, 그리고 대장균 속에서 있습니다. 3 , 4 세균성 오염이 균에 의해 종종 열, 콜레라, 위장염, 설사 등 증상이 발생합니다. 4 오염 물 소스의 자주 충분히 필터링 된 물에 접근 없이 지역 사회에 크게 불리 한 효과 있으며 식품 오염 많은 질병 및 제품 회수 노력을 주도하 고 있다. 5 , 6
세균 오염으로 인 한 질병의 발생을 줄이기 위해 수는 물과 음식을 검색 될 수 있으며 효율적으로 이전 판매 또는 소비 하는 방법을 개발 하는 노력 되었습니다. 3 1,7,8,,910 ELISA,11,12 루프 중재 등온 증폭 (PCR 등 기법 램프),13,14 ,15,,1617,18,19,20,21, 22,,2324 최근 다양 한 병원 균의 검출에 대 한 사용 되었습니다. 전통적인 세균 배양 방법에 비해, 이러한 기술은 특이성 및 시간에 관하여 훨씬 더 효율적입니다. 그러나, 이러한 기술은 여전히 투쟁 가양성 및 원판, 복잡 한 절차 및 비용. 1 , 3 , 25 그것 세균 검출에 대 한 대체 방법으로 제안 하는 multiparametric 마그네틱 형광 nanosensors (MFnS)이 바로 그 이유입니다.
이러한 nanosensors 고유 쌍을 함께 자석 및 형광 modalities, 신속 하 고 정확한 이중 탐지 플랫폼에 대 한 허용. 샘플 오염으로 대장균 O157:H7를 사용 하 여, 분 이내 작은 1 CFU를 검색 하는 MFnS의 기능 설명 했다. 병원 체 특정 항 체 특이성, 증가 하는 데 사용 되 고 자석 및 형광 modalities의 조합 탐지 및 정량화 모두 낮은 높은 오염 범위에서 세균 오염 물질의 허용 합니다. 16 세균 오염에의 경우는 nanosensors 박테리아 병원 체 특정 항 체의 대상 능력 때문에 주위 메뚜기 것 이다. 마그네틱 nanosensors 및 박테리아 사이의 바인딩 자석 철 코어와 주변의 물 양성자 간의 상호 작용을 제한합니다. 그러면 증가 T2 이완 시간에 자석 relaxometer를 기준으로 기록 됩니다. 솔루션에는 박테리아의 농도 상승으로 nanosensors 박테리아, t 2 값의 결과로의 증가 수와 분산. 반대로, 형광 방출 박테리아, 병원 체에 직접 바인딩된 nanosensors의 증가 수의 농도와 비례하여에서 증가 합니다. 샘플, 원심 분리 및 절연 세균 펠 릿의 나노 박테리아, 어떤 부동성 nanosensors를 제거 하 고 직접 상호 연결의 수와 형광 방출에 직접 연결을 절약만 것입니다. 솔루션에 있는 박테리아. 이 메커니즘의 도식 대표는 그림 1에 표시 됩니다.
이 MFnS 플랫폼은 마음, 낮은-비용 및 휴대용 특성에 따른 포인트의 케어 상영과 함께 설계 되었습니다. MFnS, 실내 온도에 안정 하 고 세균 오염 물질의 정확한 탐지에 대 한 매우 낮은 농도에서 필요만. 또한, 합성, 후는 MFnS의 사용은 간단 하 고 분야에서 훈련 된 전문가의 사용을 필요로 하지 않습니다. 마지막으로,이 진단 플랫폼 고도로 사용자 정의 대상으로,이 의해 하나의 플랫폼 사용할 수 있습니다 많은 다른 설정에서 모든 종류의 병원 체를 검출 하는 수단을 제공 가능 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 합성 및 다중 파라미터 자기 형광 Nanosensors (MFnS)의 기능화.
- 합성 superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (IONPs)
- IONP 합성에 대 한 준비가
- 준비 다음 3 솔루션: 솔루션 1: FeCl 3 (0.70 g) FeCl 2에서 H 2 O (2 mL), 솔루션 2: NH 4 오 (2.0 mL, 13.4 M) H 2 O (15 mL), 및 솔루션 3: polyacrylic 산 (0.855 g) H 2 O (5 mL).
- 는 솔루션 1 2 M 염 산 (HCl)의 90 µ L을 추가 하 고 즉시 875 rpm에서 vortexing 동안 솔루션 2와 혼합. 그런 다음 추가 솔루션 3. 60 분에 대 한 vortexing 계속
- 1,620 x g.에서 20 분 동안 원심 분리기 원심 2880 x g.에서 20 분 동안 상쾌한
- 정화 투 통해 최종 상쾌한. 투 석의 가방에는 상쾌한 추가 (MWCO 6 − 8 K) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 포함 하는 비 커에 (pH = 7.4)와 스핀 바. 모든 2 3 h. 신선한 버퍼 교체 12 h 동안 담가 보자
- IONPs의 표면에 항 체 특정 대상의 활용
- 준비 하는 다음 4 개의 솔루션: 솔루션 a: 5 mg 1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 250 µ L MES에에서 [2-(N- morpholino) ethanesulfonic 산] 버퍼 (0.1 m M, pH 6.8 =), MES 버퍼의 250 µ L에서 솔루션 b: 3 mg N Hydroxysuccinimide (NHS)의 (0.1 m M, pH 6.8 =), 솔루션 c: 5 µ g IgG1, 대장균 mAb의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (pH 7.4)의 225 µ L의 그리고 IONP의 솔루션 d: 4 mL (5.0 m m o l) 1 ml의 PBS (pH 7.4).
- 추가 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic 산 (MES) 솔루션, 버퍼 즉시 추가할 솔루션 솔루션 D 15에서 작은 단위로 혼합 각 추가 후에 해결책을 반전 하는 s.
- 즉시 3 분 동안 조금씩에서 솔루션 d 솔루션 B를 추가 하기 시작 합니다. 각 추가 후에 해결책을 반전 하 여 믹스.
- 솔루션 혼합 각 추가 후 반전 5 µ L의 단위로 솔루션 솔루션 C 추가.
- 반응 실 온에서 3 h 동안 계속 계속는 외피 4 ° C에서 하룻밤 허용.
- 정화 PBS를 사용 하 여 자기 열 통해 결과 Ab 활용 된 IONPs (pH 7.4, 최종 [Fe] = = 3.5 mmol) 어떤 결합형된 항 체를 제거 하.
- PBS (1 mL)와 자기 열 세척
- . 자기 접시에 열을 연결 하 고 IONP 해결책을 추가 하십시오.
- 다시 PBS (1 mL)와 자기 열 세척. 자석 접시에서 자기 열을 제거 합니다. PBS는 열을 추가 하 고 솔루션을 수집 합니다. 4 ° C에서 저장소
- Dropwise 2.0 추가 IONPs의 4 ml, DiI 염료 (2 mmol) 1100 rpm에서 연속 혼합과 DMSO의 100 µ L의 µ L.
- PBS, [철]의 최종 철 농도와 최종 MFnS 솔루션을 만들기에 대 한 결과 솔루션 (MWCO 6-8 KDa, 12 h) dialyze = 2 mmol.
- spectrophotometric 분석를 사용 하 여 플레이트 리더 595에서 형광 방출으로 캡슐화 된 DiI 염료 검출 nM.
- 동적 빛 산란
- 장소 샘플 MFnS 솔루션의 평균 크기는 MFnS의 표면 충전 확인 하 zetasizer.
참고: 여기, 평균 크기와 기능 MFnS의 표면 충전 했다 발견 77.09 및-22.3 mV, 각각.
- 장소 샘플 MFnS 솔루션의 평균 크기는 MFnS의 표면 충전 확인 하 zetasizer.
2. 세균성 Culturing 및 재고 솔루션 준비
- 세균 배양
- 영양 국물의 1 mL에 동결된 펠 릿 (대장균 O157:H7)를 수 화와 국물의 추가 5 mL를 추가 합니다.
- 한 천 배지 및 행진을이 솔루션의 적용 100 µ L 24 h. 위해 37 ° C에 외피 다음 살 균 접종 루프를 사용 하 여
- 후 24 h, 한 천 배지에서 고립 된 식민지 선택한 문화 국물의 15 mL를 추가 합니다. 광학 밀도 값을 모니터링 하는 동안 4-6 h 37 ° C에서 품 어 (흡 광도 600 nm).
- 0.1의 광학 밀도 값을 얻은 배양, 중지 하 고 수행 하는 직렬 희석.
- 직렬 희석
- 8 살 균 microcentrifuge 튜브 영양 국물의 추가 900 µ L.
- 첫 번째 튜브 (희석 10 -1)에 세균 현 탁 액의 추가 100 µ L.
- 걸릴 100 µ L 처음부터 튜브와 10 -2의 희석을 얻기 위해 두 번째 그것을 추가 합니다. 10 -8의 마지막 희석 끝나는 나머지 튜브에 대 한이 패턴을 계속.
- 전송 100 µ L에서 각 튜브를 분리 한 천 배지, 그리고 37에서 24 h에 대 한 품 어 ° c.
- 다음 날, 각 접시에 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지를 계산 합니다. ~ 100 CFUs와 플레이트를 선택 합니다. 해당 희석을 사용 하 여 추가 실험을 위한 (100 µ L = 100 ~ CFUs).
참고: 여기 그것은 귀착되 었 다 ~ 100 CFUs 10 -6 희석.
3. MFnS를 사용 하 여 급속 한 탐지의 E. 대장균 O157:H7
- 스파이크 1-100에서 CFU 범위 결과 10 -6 세균성 주식 양의 증가 함께 다양 한 PBS 솔루션 (1 X, pH 7.4, 300 µ L). MFnS의 일관 된 금액을 추가 (100 µ L) 이러한 솔루션을.
- PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ L)만 포함 한 초기 솔루션 및 MFnS (100 µ L).
- 37 ° C에서 30 분에 대 한 솔루션을 품 어 하 고 실내 온도에 냉각 하도록 허용 다음.
- 자석 relaxometer (0.47 테슬라)와 휴식 시간 (T2) 각 솔루션에는 CFUs에 상대적인 레코드 변경 전송 개별 솔루션.
- T2 값에 변화를 기록, PBS와 MFnS 포함 된 기준 솔루션의 T2 값을 측정 하 여 시작
- .
- 장소는 자석에서 솔루션
- relaxometer. 열고 해당 소프트웨어를 선택 합니다 " T2 이완 " 설정 및 프레스 " 측정. "
- 장소는 자석에서 솔루션
- T2 값 추가 솔루션을 다양 한 아군은의 측정 다음 T2, 기준선의 컬렉션 박테리아의 농도.
참고: t 2에서 변화는 초기 아군 t2에서 감 t 2.
참고: 테스트 반복 될 수 있다 결과 섹션에 설명 된 대로 호수 물, 우유 등을 포함 한 다른 용 매를 사용 하 여
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFnS 행동의 메커니즘은 그림 1에 표시 됩니다. 세균 오염 물질의 표면 주위 MFnS의 클러스터링 방해는 MFnS의 magnetic cores와 주변 수소 핵 사이 상호 작용. 이 클러스터링, 자기 휴식의 결과로 값이 증가합니다. 세균 오염 물질의 농도 증가, 클러스터링, 줄이고 T2 값에 변화를 감소. 따라서, 형광 적임의 결정적 이다. 세균성 농도 증가, MFnS에 의해 생산 하는 형광 신호 증가, 모두 낮은 높은 농도 범위에서 세균 오염 물질의 민감한 감지에 대 한 허용 합니다.
프로토콜, 다음16 MFnS 합성 되었고 처음 PBS (1 X, pH 7.4)의 솔루션에서 테스트. 검색, 자기 휴식에 사용 되는 초기 양식 적임 T2 값에 변화를 기록 하기 위해 사용 되었다. 프로토콜에 따라 샘플은 다음 centrifuged 하 고 펠 릿 했다 resuspended 형광 데이터 수집 했다. 해당 ΔT2 및 형광 방출 값은 그림 2에 표시 됩니다. 같이, ΔT2 값 세균 오염, 낮은 농도에서 최고의 이었고 대략 20 CFUs에서 채도 도달 했습니다. 형광 방출, 다른 한편으로, 더 정확 하 게에 되었다 > 20 CFUs, 이러한 두 형식은 결합의 중요성을 표시. 이러한 기본 분석에 따라 비슷한 테스트 호수 물과 우유를 포함 하 여 복잡 한 매체에서 실시 되었다. 이 nanosensors 더 복잡 한 미디어에 여전히 유효 하도록 이루어졌다. 이 분석 실험에서 수집 된 데이터 그림 3 에 제시 하 고 PBS에서 실시 하는 분석 실험에 매우 비슷합니다. 이러한 nanosensors 복잡 한 미디어에서 유효 확인할 수 있습니다.
확인 후 MFnS가 간단 하 고 복잡 한 미디어에서 세균 오염 물질의 존재를 감지할 수 있는, 테스트의 수는 nanosensors에 의해 유지 하는 특이성의 레벨을 다음 실시 했다. 이 위해, MFnS는 대상 박테리아, 대상 열 살해 박테리아, 비 대상 박테리아 (비 병원 성 대장균 과 S. typhimurium)와 혼합물을 포함 하는 솔루션에서 incubated 했다. 이것이 특이성 분석 결과, 혼자 자기 휴식 데이터의 수집 충분 했다, 그리고 해당 하는 데이터는 그림 4에 표시 됩니다. 볼 수는 MFnS만 대장균 O157:H7, 라이브에 바인딩된 다른 열 사망 또는 비 표적 박테리아를 하지. 특이성의이 수준은 활용된 대상 항 체에 기인한 다 고 더 MFnS도 비 병원 성 세균 종 존재, 특정 병원 체 오염 물질 검출에 더 효과적일 것입니다 확인 합니다.
그림 1 : 마그네틱 형광 탐지 메커니즘. MFnS 합성 및 세균 검출의 듀얼-모달 메커니즘의 도식 적인 표현입니다. 짧은 잠복기 (30 분), 다음 MFnS 자기 공명과 형광 방출의 조합을 통해 대상 박테리아를 민감하게 감지할 수 있습니다. 세균 오염 물질의 표면 주위 MFnS의 클러스터링는 자석 relaxometer에 의해 감지 자석 휴식 값에 변화를 발생 합니다. 또한, 형광 신호 직접 세균 오염에 바인딩된 MFnS에서 수집할 수 있습니다. 이 모두 낮은 높은 농도 범위에서 검출 세균 오염 물질의 수 듀얼-모달 검색 플랫폼을 제공합니다. 16 이 그림에서 권한이 수정 되었습니다. 16
그림 2 : 증거의 개념. A) 자기 휴식 데이터 (ΔT2)의 E. 콜라이 O157:H7 (1-100 CFU) PBS 용 매에 희석에서 처음 수집 (1 X, pH = 7.4). 박테리아의 미스터 검출 되었다 매우 낮은 CFU 카운트에 민감한 (삽입: 1-20 CFU에서 배열). 그러나, ΔT2 수치가 높은 세균성 농도 포화 되었다 (> 20 CFU), 미스터 더 검색 및 초기 단계 세균 오염의 정량화에 대 한 가치 임을 나타냅니다. B) 형광 방출 데이터에서 같은 아군 PBS 솔루션 (삽입: 선형 음모). 결과 형광 탐지 방법 낮은 CFU 샘플에 대 한 감도에 부족 하는 동안 더 높은 CFU 카운트에 민감한는 보여주었다. 함께, 이러한 데이터를 감지 하 여 세균 오염에-그리고 늦은-초기 세균 오염의 계량 자석 및 형광 modalities의 능력을 보여 줍니다. 16 3 측정의 평균 값은 묘사 ± 표준 오차. 이 그림에서 권한이 수정 되었습니다. 16
그림 3 : 복잡 한 매체에서 세균 검출. A) 호수를 포함 하 여 더 복잡 한 매체에서 자기 이완 ΔT2 데이터 수집 물, 우유 B). 이전 PBS 솔루션에서 수집 된 데이터와 마찬가지로, 그것은 지적 했다 세균성 오염 물질의 검출은 1-20 CFU (음각)의 범위에 더 민감한. C 해당 형광 방출 데이터 수집) 호수 물과 D) 우유 샘플 (인세트: 선형 음모)는 CFU 카운트를 증가 함께 더 높은 감도 보여주었다. 다시 한번,이 데이터는 각 양식 적임 다른 보완 효과 입증 하 고 복잡 한 미디어 기능을 유지 하는 능력을 확인. 16 3 측정의 평균 값은 묘사 ± 표준 오차. 이 그림에서 권한이 수정 되었습니다. 16
그림 4 : MFnS 특이성. MFnS의 특이성 세균성 교차-오염 물질과 혼합, 그리고 B) 열 비활성화의 A)는 수를 포함 하는 영양 국물 솔루션에 미스터 분석을 사용 하 여 테스트 했다 E. 콜라이 O157:H7. 같이, 그것은 분명은 nanosensors 작은 없습니다 바인딩 대상 비 박테리아와 대상 박테리아, 다른 오염 물질의 존재를 감지의 수는 심사의이 형태를 통해 될 것 이라고 보장비 병원 성 세균의 수를 포함 하는 복잡 한 미디어에 사용 하기 위해 경. Isotype 항 체와 MFnS을 합성 하 여 실시 했다 C) 추가 특이성 테스트 (빨간색 원: 안티-대장균 O111), 약간 O157:H7 항 체 활용 된 MFnS (검은 사각형)에 비해 아무 바인딩 결과. 이러한 데이터는 MFnS만 반응 가능한 대상 박테리아, 추가 포인트의 케어 진단 플랫폼으로 그들의 효과 확인 하는 방법을 보여 줍니다. 16 3 측정의 평균 값은 묘사 ± 표준 오차. 이 그림에서 권한이 수정 되었습니다. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜 단순히 완전 한 기능 MFnS을 생산 하도록 설계 되었습니다 가능한. 그러나, 많은 핵심 포인트를 변경 하는 프로토콜의 사용자의 최종 목표에 따라 유용할 수 있습니다 있다. 예를 들어 다른 항 체를 사용 하 여 다른 많은 병원 체의 허용 것 이다. 또한,이 프로토콜 분자를 대상으로 항 체의 사용에 국한 되지 않습니다. 호스트 세포 수용 체, 등 대상 병원 체에 대 한 특정 바인딩 선호도 어떤 분자는 분자를 대상으로 사용할 수 있습니다. 대상 분자는 1 차 아민 또는 알콜 그룹, 또는 하나도 functionalized 수, EDC/NHS 활용 화학 프로토콜에 따라 산화 철 나노 입자의 표면에 활용 수 있습니다. 둘째, 각 탐지 솔루션에 사용 되는 MFnS의 금액을 다양 한 될 수 있습니다. (용 매 및 대상 병원 체 없이 nanosensor 포함) 기준 솔루션에 대 한 T2 값 100-250 양 범위에 경우 기준 값 100, T2 값의 변화는 덜 민감한 것 충분히 사용 하는 것이 중요 하다 nanosensor의 과잉 때문. 기준선 T2 값 인상, nanosensor 솔루션에서는 감소 합니다. 그러나 경우,, 250 위에, 그것은 지나치게 민감한 되 고 오판 가능성이 더 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 기준 솔루션 100-250 ms 사이의 T2 값에 대 한 목표 제안.
포인트의 케어 진단으로 그것의 사용을 고려할 때이 프로토콜의 현재 한계는 현재 벤치탑 자석 relaxometer에 대 한 의존도. 효과적이 고 안정, 하는 동안이 자기 휴식 플랫폼의 이식성을 증가 하는 크기에서 감소 수 있었다. 이는이 플랫폼으로 사용 될 수 다른 환경에서 같은 물에서 또는 효과적인 현장 세균 검사에 대 한 식료품 시장에서 쉽게를 증가할 것입니다. 이 또한 포인트의 케어 병원 체 탐지에 대 한 더 많은 가능한 만들기이 컴퓨터의 비용을 줄일 수 있습니다.
낮은 리소스 설정에서 질병 진단 및 병원 체 검출에 관하여이 플랫폼 현재 병원 체 진단 기술 사용 오늘, PCR과 ELISA를 포함 하 여 보다 더 효과적일 가능성이 있다. 이러한 전통적인 기술을 크게 효율적인 것으로 입증 되었습니다, 그들은 매우 비용이 많이 드는, 복잡 하 고 느린입니다. 따라서, 병원 균과 질병 진단의 포인트의 케어 탐지에 대 한 낮은 자원 설정에 사용 하기 위해 개발 될 수 있는 정확한 진단 플랫폼에 대 한 필요가 있다. 이 플랫폼은 상대적으로 비용 효과적인 사용을 간단 하 고 빠른. 필요한 기계 (relaxometer 및 플레이트 리더)의 초기 비용, 이외에도 실제 MFnS 상대적으로 저렴 하 고 매우 안정적인 있습니다. 또한, T2 값의 컬렉션은 간단 하 고 전문 실험실 기술자 필요 하지 않습니다.
미래에, 화학 및 생물 학적 엔지니어와 협력 더 휴대용, 휴대용 장치 MFnS를 사용 하 여 세균 오염의 자석 및 형광 검출에 사용 될 수 있는 디자인을 추구 것입니다. 작은 장치 개발 더이 탐지 플랫폼와 관련 된 비용을 절감 하 고 분야에 그것의 효과 증가를 도울 것입니다. 또한,이 플랫폼에서는 에이전트 개발의 효율성을 분석 하는 데 사용 될 가능성이 있다. 우리의 데이터 같이 우리의 MFnS만 라이브-타겟 박테리아와 바인딩할 수 있었고 열 살해 박테리아와 알을 품을 때 더 작은 신호를 생산. 이 바탕으로, 우리의 플랫폼 사용할 수에서는 후보자의 효과 테스트 하 고 우리는 이것을 미래에 더 찾아보기 계획.
이 프로토콜의 중요 한 단계 MFnS의 초기 합성 등 T2 데이터의 컬렉션입니다. 그것은 제대로 부동성 항 체 t 2 데이터 수집을 방해 하지 않습니다 있도록 MFnS 정화 해야 합니다. 또한, 각 테스트 샘플에 배치 하는 MFnS의 금액 MFnS 농도 변화 T2 값, 잘못 된 긍정/부정적인 위험 변경으로 일관 되어야 합니다.
끝으로, MFnS 세균 오염에 대 한 싸움에서 앞으로 새로운 단계 이며 이루어집니다 추가 병원 체의 대상으로 추가 개발 및 디자인 더 휴대용 기계 추구. 낮은 비용 및 MFnS의 사용과 관련 된 낮은 복잡성은 그들이 세균 오염의 현장 검출에 사용 될 유력한 후보. 이러한 nanosensors의 합성 주의 준비 해야, 하는 동안 그들의 실제 사용은 비교적 간단 하 고 그들에 게 음식 관련와 waterborne 질병을 줄이기 위해 잠재력을 제공. 추가 개발,이 nanosensors의 구현 물이 저수지의 심사에서 볼 수 있습니다와 상업적으로 포장, 판매, 그리고 아마도 심지어 가정에서 식품을 생산.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
이 나노기술의 검증 된 응용 프로그램은 아직 FDA에 의해 승인 되지.
Acknowledgments
이 작품은 K-INBRE P20GM103418, 캔자스 콩 위원회 (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7와 PSU 폴리머 화학 시작 기금, SS에 모두에 의해 지원 됩니다. 우리는 비디오와 그의 뛰어난 작품에 대 한 대학 동영상을, 씨 야 곱 Anselmi, 감사합니다. 우리는 또한 감사 로저 주었는지 씨와 부인 Katha 주었는지 연구에 대 한 그들의 관대 한 지원에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
