Summary
Эндотелия строго контролирует лейкоцита вербовки. Неадекватные лейкоцита кровоподтек способствует воспалительных заболеваний человека. Таким образом Поиск новых нормативных элементов эндотелиальной активации необходимо разработать более терапии воспалительных заболеваний. Здесь мы описываем всеобъемлющей методологии характеризовать Роман эндотелиальной регуляторов, которые можно изменять, лейкоцитарные людьми во время воспаления.
Abstract
Эндотелиального слоя имеет важное значение для поддержания гомеостаза в организме, контролируя много различных функций. Регуляции воспалительной реакции эндотелиального слоя имеет решающее значение для эффективной борьбы против вредных материалов и помощи в восстановлении поврежденных участков. Когда эндотелиальные клетки подвергаются воспалительным среде, например компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, липополисахарида (LPS), они выражают растворимых провоспалительных цитокинов, таких как Ccl5, Cxcl1 и Cxcl10 и вызвать Активация циркулирующих лейкоцитов. Кроме того экспрессии молекул адгезии VCAM-1 E-селектина и ИКАМ-1 на поверхности эндотелиальных позволяет взаимодействия и адгезии активации лейкоцитов эндотелиального слоя, и в конечном итоге кровоподтек на воспаленные ткани. В этом случае Эндотелиальная функция должна быть жестко регулируется потому, что чрезмерное или дефектных активации лейкоцитов наборе может привести к расстройств, связанных с воспалительным. Поскольку многие из этих расстройств не имеют эффективного лечения, Роман стратегии с упором на сосудистой слоя должны быть расследованы. Мы предлагаем всеобъемлющий анализов, которые полезны для поиска Роман эндотелиальной регуляторов, которые изменяют функции лейкоцитов. Мы анализируем эндотелиальной активации с помощью конкретным выражением целей участвующих в лейкоцитарной вербовки (например, цитокины, chemokines и молекулы адгезии) с несколько методов, в том числе: реального времени количественные полимеразной цепной реакции ( RT-qPCR), Западная блот, поток цитометрии и адгезии анализов. Эти подходы определения функции эндотелия в контексте воспалительных и очень полезны для выполнения анализов скрининг характеризовать Роман эндотелиальной воспалительных регуляторов, которые потенциально ценные для проектирования новых терапевтических стратегий.
Introduction
Воспаление является полезной биологической реакции против инфекционных агентов, с основной целью ликвидации возбудителя и ремонта поврежденных тканей. При определенных условиях, например, хронические инфекции или аутоиммунные заболевания воспаление не решить. Вместо этого есть ненормальная реакция с постоянной инфильтрации лейкоцитов, в длительной иммунной реакции, что приводит в результате повреждения тканей, фиброз, потеря функции и в целом, инвалидности и в некоторых случаях смерти пациента. Эти человеческие расстройств, каталогизированы как воспалительные заболевания, все связаны кровеносных сосудов для контроля лейкоцитов кровоподтек1,2.
Эндотелиальные клетки играют основополагающую роль в регуляции воспалительной реакции, контролируя лейкоцита людьми. Когда эндотелиального слоя подвергается воспалительных медиаторов таких ПЛАСТИНОК, отдыхая эндотелия активирует и выражает провоспалительных цитокинов (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 и т.д.) и молекул адгезии (E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1) что пользу набор циркулирующих лейкоцитов к месту инфекции. Лейкоциты, затем загрунтовать выпустила цитокинов посредником прокатки и взаимодействие с эндотелиального слоя через корреспондентские клей партнеров: PSGL-1-селектина, α4β1 Интегрин VCAM-1 и αLβ2 Интегрин ИКАМ-1. Наконец Лейкоциты мигрируют через сосудистую к фокус воспаления3.
Существенную роль эндотелия в регуляции воспалительной реакции была продемонстрирована на мышах, которые были генетически изменены выразить LPS рецепторов, Толл подобный рецептор 4 (TLR4), только на эндотелиальных клеток. Эти животные эндотелия TLR4 были в состоянии реагировать на LPS-опосредованной воспаление и выявления инфекции, сформированное после прививки бактерии и поэтому добиться разрешения инфекции и выживания на аналогичных уровнях как мышей дикого типа4 , 5.
Для пути эндотелий регулируемых воспалительной реакции были постулируется, что ингибирование на некоторых этапах взаимодействия лейкоцита эндотелия приведет к сокращению транс эндотелиальная миграции и лучше прогноз воспалительных заболеваний. В самом деле несколько стратегий, ориентация эндотелиальной активации и лейкоцитов эндотелия взаимодействия были разработаны для препятствовать кровоподтек иммунных клеток для лечения воспалительных заболеваний6,7.
В настоящем докладе мы описываем тщательное группы методов в vitro полностью охарактеризовать эндотелиальной деятельности в ответ на воспалительные стимул ПЛАСТИНОК и его роль в активации лейкоцитов и адгезии сосудистого слоя. Эндотелиальных клеток модель, используемая в этой рукописи был линии эндотелиальных клеток мыши легких (ТЗЭТ-04), как описано в Hortelano и др. 8. линия клетки ТЗЭТ-04 протестирована в литературе быть надлежащей системы для изучения эндотелиальной активации9,10. Основываясь на научных интересов, эти подходы могут быть легко экстраполированы на любом эндотелия или лейкоцитарные системы и воспалительных профиль. После того, как определены эндотелиальных параметров в выбранных условиях, система может проверить роман наркотиков на предлагаемых экспериментов для оценки сосудистой активации. В этом контексте воспалительных клетки эндотелия, протестированы с соединения интереса можно сравнить с условий управления клеток и разногласий результирующей может информировать наркотиков прогнозных результатов развития и прогрессирования воспаления. В заключение, мы предлагаем соответствующие системы для характеристики новых лекарственных препаратов на эндотелиальных клеток, которые могут повлиять на дизайн Роман терапии сосудистых конкретных против воспалительных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. эндотелиальных клеток культуры
- культуры ткани лечение плиты
- пальто 100 мм культуры ткани пластины с желатином 2,5 мл раствора (газобетона, 0,1% желатина в дистиллированной воде) для 30 минут при 37 ° C; это могут быть экстраполированы на требуемый формат хорошо. Аспирационная раствор желатина и оставить пластины высохнуть в культуре ткани капюшоном.
- Культуры ткани условия
- культивировать ТЗЭТ-04 клетки внутри биологических инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2). Рост клеток в полной СМИ Дульбекко ' s Modified Eagle средний: питательной смеси F-12 (DMEM/F-12) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл (P/S).
- Подсчитать количество ячеек стандартным методом камеры Нойбауэр и добавьте ТЗЭТ-04 клетки желатин лечение пластины 100 мм в 10 мл полный СМИ, на низкой плотности 2-11 x 10 4 клетки/см 2. Разбить ячейки 1:3, когда они достигают слияния.
Примечание: Обычно это происходит после двух-трех дней в культуры. - Субкультура клетки путем промывки пластин с 10 мл стерильной фосфат буфер солевой (PBS) следуют добавления 2 мл раствора трипсина ЭДТА (трипсин 0.25%, 5 мм ЭДТА) и Инкубируйте 3 мин при 37 ° с.
- Остановить трипсина ЭДТА реакции и восстановить подвесной клетки путем добавления 10 мл полный СМИ. Спин вниз клетки (300 x g, 5 мин), удалить супернатант, Ресуспензируйте сотовой гранулы в полной СМИ и субкультуры надлежащим.
2. LPS лечения и посредников
- пластины ТЗЭТ-04 клетки в полной СМИ на суб впадения в формате хорошо: 7 x 10 5 клеток/также на 6-ну пластины и 2,5 x 10 5 клеток/колодец на 96-луночных пластин.
- Инкубировать культуру для 6 h в инкубатор клетки (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2). Переключитесь клетки неполной СМИ (DMEM-F12, P/S) и оставить ночь (на) для синхронизации и снизить активность клеток.
- Удалить средства массовой информации и проверить Роман фармакологических соединений путем инкубации эндотелиальных клеток с (или без) препарата (например DT 10) разводят в неполной СМИ (30 мин., 37 ° C); добавить 1.4 мл/хорошо для 6-ну пластины или 0,14 Мл/хорошо для 96-луночных планшетов).
- Вызов клетки путем добавления LPS инкубации СМИ (100 нг/мл, конечная концентрация) на период времени, указанный в каждом assay. Использовать как элемент управления PBS.
3. Оценка транскрипционный анализ профиля на активированный эндотелий, RT-ПЦР
- семян ТЗЭТ-04 клетки в суб слияния в культуре 6-ну пластины (7 x 10 5 клеток/хорошо). Проинкубируйте 6 ч (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2) и потом приступить к сыворотке голода (инкубировать на).
- Удалить средства массовой информации и лечить (или не лечить) эндотелиальных клеток культур с наркотиками интерес разводят в неполной СМИ (инкубировать 30 мин., 37 ° C); добавить 1.4 мл/хорошо для 6-ну пластины (30 мин., 37 ° C).
- Вызов клетки путем добавления 100 нг/мл LPS инкубирован СМИ (как описано в шаге 2.3) и инкубировать на 6 ч. прекратить реакции путем промывания дважды с холодной PBS и держать пластины на-80 ° C до обработки образца.
- РНК добыча
- оттепель пластины и добавьте 1 mL/хорошо РНК добыча буфера (38% фенола и 0,8 М Гуанидиновые Изотиоцианаты; см. таблицу материалов). Оставить на 30 минут при комнатной температуре (RT) под агитации и собирать огневки в 1,5 мл пробирок.
- Добавить 200 мкл хлороформе и нежно агитировать за 15 с. инкубировать на 3 мин в RT и центрифуги (11 600 x g, 15 мин, 4 ° C).
- Передавать другой 1,5 мл водной фазе. Осадок РНК, добавив 500 мкл изопропиловый спирт, а затем 10 минут инкубации на RT и затем центрифугирования (11600 x g, 4 ° C).
- Удалить супернатант и помыть лепешка с 75% этанола, вихревой агитации и затем центрифугирования (7500 g x, 4 ° C).
- Воздушно-сухой гранулы и солюбилизировать последнего РНК в 25 мкл чисто H 2 O по инкубации за 10 мин при 55 ° C. держать РНК-80 ° c до обработки образца.
- Количество и чистоты РНК
- количественного определения концентрации РНК путем измерения оптической плотности образца на 260 Нм в спектрофотометр (см. Таблицу материалы).
- Мера на 230 Нм и 280 Нм для определения чистоты РНК.
Примечание: Коэффициент на 260/280 указывает белка или фенол загрязнения. Соотношение близко к 2 является приемлемым. Коэффициент на 260/230 указывает ЭДТА, углеводы или примеси фенола. Допустимы значения между 2.0-2.2.
- РНК, проверка целостности
- Бег 2 мкг всего РНК и РНК лестница на 1,5%, Денатурирующий гель агарозы; визуализировать на гель системы документации (см. Таблицу материалы).
Примечание: 2:1 соотношение четкие и резкие 28S и 18S рРНК полосы указывает нетронутыми РНК. Частично деградировавших РНК решает как размытый вид.
- Бег 2 мкг всего РНК и РНК лестница на 1,5%, Денатурирующий гель агарозы; визуализировать на гель системы документации (см. Таблицу материалы).
- RT-ПЦР
- синтезировать комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) от одного мель РНК после стандарт протокола (см. Таблицу материалов) 11.
- Вычислить выражение гена по RT-ПЦР
- подготовить реакционной смеси для каждого образца: микс 2 мкл cDNA, 7 мкл флуоресцентные соединение, 300 Нм вперед грунт и 300 Нм обратный грунтовка (Таблица 1) в Окончательный объем 13 мкл и добавить к 96-луночных реакции пластины (см. Таблицу материалы).
- Уплотнение пластину с оптической клей крышкой, центрифуги (300 x g, 1 мин) и запустить реакции в системе PCR реального времени (горячий старт 95 ° C 20 s следуют 40 циклов: 95 ° C 3 s и 60 ° C за 30 s) (см. Таблицу материалы).
- Анализировать результаты по относительной количественный, используя метод сравнительного 2 -ΔΔCt с уборки генов Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) или кислой рибосомных фосфоропротеид P0 (36B4) 12 .
4. Оценка эндотелиальной активации подачей Cytometry
- лечения следующих условий, описанных в разделе 2 клетки ТЗЭТ-04 и оценить изменения в эндотелиальных поверхности белки подачей cytometry.
- Отсоединение клетки после 6 h LPS стимуляции с трипсина ЭДТА методом, описанным в шаг 1.2.3 и мыть с неполной СМИ на 4 ° C.
- Подсчитать ячейки с помощью метода камеры Нойбауэр и 10 х 10 4 клетки в 96-ну u-поддоны. Центрифуга (300 x g, 5 мин) и удалить супернатант на 180° оснастки запястья сверху вниз и быстрое восстановление в первоначальное положение.
- 50 мкл выбранного антитела, разбавляют в неполной СМИ (10 мкг/мл, конечная концентрация) в клетки и инкубировать (30 мин., 4 ° C) и.
- Мыть дважды w клеткиITH неполной СМИ после процедуры, описанные в шаг 4.3, и инкубировать с 50 мкл на 10 мкг/мл соответствующие вторичные антитела и в сочетании с FITC или аналогичные конъюгата (30 мин., 4 ° C в темном пространстве).
- Мыть клетки один раз с неполной СМИ, следуют PBS мыть. Восстановить клетки с 300 мкл PBS с помощью 1 мл наконечники и место в трубы цитометрии.
- Оценить образцы в системе цитометрии потока (см. Таблицу материалы). Отрегулируйте популяции клеток вперед и параметры рассеяния стороне. Ворота населения интерес. Отрегулируйте ворота, основанные на отрицательный контроль от клетки инкубировали с изотипа управления. Анализировать результаты как процент положительных клеток или означают интенсивности флуоресценции 8.
5. Оценка эндотелиальной активации на западной помарке
- семян эндотелия в суб слияния в 6-ну культуры пластины (7 x 10 5 клеток/а) и лечения с ЛПС, как описано в разделе 2. Проанализировать выражение воспалительные белки Протоколом следующие западную помарку.
- Остановить стимуляцию LPS в разное время точках, чтобы прояснить различные аспекты эндотелиального ответа:
- определить профиль воспалительные белки после 6 h стимуляции LPS.
- Определить ячейки, сигнализации каждые 15 мин через период 60 мин.
- В обоих случаях остановить реакции, мыть дважды с холодной PBS и хранить образцы на-80 ° C до обработки образца.
- Lyse клеток и экстракции белка
- добавить 200 мкл лизис буфер для каждой скважины (1% неионные ПАВ, 10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, натрия хлорида 150 мм, Пирофосфат натрия 30 мм, фторид натрия 50 мм, 2.1 мм натрия Ортованадат на pH 7,6, дополнена ингибитор протеазы коктейль) (см. таблицу материалов).
- Инкубировать 15 мин при температуре 4 ° C под агитации, скрести скважин с кончиком пипетки и собирать огневки в 1,5 мл пробирок.
- Центрифуга трубы на 11600 x g на 4 ° C.
- Хранить супернатант в чистой 1.5 мл пробирок на-80 ° C до обработки.
- Мера, концентрацию белка, bicinchoninic кислоты assay после стандарт протокола (см. таблицу материалов) 13.
- Решить 30 мкг общего белка lysate для каждого образца, стандартный метод 0,1% натрия лаурилсульфат, 10% геля полиакриламида электрофореза (SDS-PAGE) 14. Запуск образцов с 10 мм β-меркаптоэтанол (сокращение условия) или без (-уменьшение условия) в зависимости от антитела используются для обнаружения протеина интереса.
- Передачи разлученных белки от геля полиакриламида винилидена фторид (PVDF) передачи мембраны с 0,45 мкм поры с помощью стандартной процедуры.
- После переноса, Промойте мембрану дважды с PBS, 0.1% Полисорбат-20 (PBS-T) и блокировать сайты неспецифических привязки, добавив 20 мл 2% BSA разводят в PBS-T для обнаруженных фосфолипопротеиновый или 5% обезжиренное сухое молоко в PBS-T для всего белки, под агитации (90 мин., RT).
- Развести выбранного антитела в 10 мл соответствующие блокировки буфера на рекомендуемая концентрация и Проинкубируйте мембрану под агитации (ON, 4 ° C). Кроме того, место мембраны в запечатанных полиэтиленовых пакетах и используется 5 мл разбавленной антитела.
- Следующий день, мыть мембраны, три раза (избыток PBS-Т, 15 мин, RT).
- Мембраны под агитации (30 мин., RT) с 10 мл корреспондент вторичные антитела обязан пероксидазы (ПХ) разводят в мэм в соответствующий блокирующий буфер инкубировать.
- Мыть мембраны три раза под агитации (избыток PBS-Т, 15 мин, RT).
- Проинкубируйте мембрану за 1 мин с 0,1 мл/см 2 пероксидазы субстрат усиленной хемилюминесценции (ЭСЛ). Место в осушенных мембрану между двумя прозрачные пластиковые листы и вставить его в системе обнаружения хемилюминесценции, которая включает в себя Charged-Coupled устройство камеры (CCD).
- Использовать камеры на ПЗС для обнаружения сигнала и его программное обеспечение для записи изображения с накопительной программы (изображения отображение накопленной сигнала на каждые 30 s воздействия на период всего 15 мин).
- Количественно группа интенсивности, денситометрия с использованием ImageJ программного обеспечения после протокол, описанных в руководстве пользователя 15.
- Открыть образец в ImageJ программного обеспечения и выберите группы, представляющих интерес с помощью инструмента Прямоугольное выделение.
- Выберите как первый переулок и нажмите Печать полос для получения профиля участков.
- Разграничить области пиков с прямой отбор.
- Измерить размер каждой группы, щелкнув внутри каждого пика.
- Представляют собой результаты в отношении загрузки элемента управления белка (β-актина, тубулин и т.д.).
6. Оценивать эндотелиальный фактор освобожден от активации лейкоцитарной адгезии анализов
- получить эндотелиальной кондиционером СМИ.
- Лечения ТЗЭТ-04 клетки, как указано в разделе 2 и собирать супернатанта культуры после 24 ч стимуляции с ПЛАСТИНОК (100 нг/мл).
- Собирать кондиционером СМИ от обработанной ТЗЭТ-04 клетки и центрифуги (600 x g). Храните супернатант в 0,5 мл аликвоты-80 ° c до использования.
- Лейкоцитарной адгезии Пробирная
- пальто 96-луночных пластины с 50 мкл/хорошо выбранной внеклеточного матрикса белков, разбавленных в PBS (за исключением коллагена, который разводится в уксусной кислоте 0,1 М): фибронектина (1-10 мкг/мл ), Ламинин (1-10 мкг/мл) и коллаген типа I (10-40 мкг/мл). Отпуск на 4 ° c.
- Отменить покрытием СМИ и блокировать сайты неспецифических привязки на скважинах с 150 мкл PBS, 1% BSA инактивированная тепла (1 мин., 100 ° C) 90 мин на RT.
- Мыть скважин дважды с PBS и добавить 100 мкл ранее собранные эндотелиальной кондиционером СМИ (раздел 6.1) к скважинам.
Примечание: Пластины готовы для выполнения адгезии assay. - Культура линии клеток Моноцит макрофагального мыши J774 в биологических инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2) с Roswell парк Мемориальный институт среднего (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Примечание: J774 клетки растут в суспензии. - Собирать J774 клетки в 15 мл трубки и центрифуги (300 x g, 5 мин). Отменить супернатант и Ресуспензируйте сотовой лепешка с 10 мл сыворотки свободных СМИ. Подсчитать ячейки в камере Нойбауэр. Центрифуга клетки (300 x g, 5 мин), удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в сыворотке свободных СМИ в 15 х 10 4 J774 клеток на 50 мкл СМИ.
- Добавить 15 х 10 4 J774 клетки к каждому хорошо в 50 мкл сыворотки свободных средств массовой информации и Инкубируйте 15 мин при 4 ° C, следуют 1 ч при 37 ° C в инкубаторе клеток CO 2.
- Мыть скважин дважды, осторожно добавив теплых PBS; центрифуги (300 x g, 5 мин) и удалить супернатант на 180° оснастки запястья сверху вниз и быстрое восстановление в первоначальное положение. Исправить прилагаемый ячейкиs 100 мкл/колодец параформальдегида 4% (PFA), добавив в PBS и инкубировать (10 мин., RT) и.
- Отменить СМИ мягко и нежно разрушения клеток с 2% метанола в PBS на 2 мин на RT. Discard СМИ и запятнать клетки, добавляя 50 мкл/хорошо Фиолетовый Кристалл 0.5% в 20% метанола для 90 s на RT.
- Мыть тарелку с обильной проточной водой, отбросить лишнюю жидкость и оставить его для воздушно-сухой. Доклад прилагаемый клеток в сочетании с световой микроскоп цифровой фотоаппарат.
- Развести клеток, окрашивание, добавив 100 мкл/хорошо цитрата натрия 0,1 М, 50% этанола. Мера, поглощения в 545 Нм и представляют результаты в произвольных единицах поглощения или процент адгезии, рассматривая 100% качестве клеточной адгезии достигло скважин покрытием с большей концентрацией лигандом
7. Испытания эндотелиальной активации Assay Сопредседатель адгезии лейкоцитов-эндотелия
- лечения ТЗЭТ-04 клетки на 96-луночных пластины, как описано в разделе 2 и проинкубируйте с ПЛАСТИНОК (6 ч., 37 ° C).
- Дневно обозначить J774 клетки с Карбоксифлуоресцеина Succinimidyl эфира (CSFE).
- Мыть J774 клетки в PBS после процедуры в разделе 6.2.5. Количество клеток Нойбауэр камерная метод и Ресуспензируйте на 1 x 10 6 клеток/мл в PBS, 0.1% BSA.
- Инкубации клеток с CFSE (5 мкм, конечная концентрация) для 20 минут при 37 ° C. добавить 5 мл неполной СМИ и инкубировать (5 мин., 4 ° C) и.
- Мыть раз с неполной СМИ, как описано в разделе 6.2.5., Ресуспензируйте в 15 х 10 4 клетки/100 мкл и приступить к assay Сопредседатель адгезии.
- После лечения эндотелия, промыть скважин три раза с неполной СМИ. Добавьте CFSE-J774 клетки (15 х 10 4 клетки/100 мкл) для каждой эндотелиальной покрытием хорошо. Инкубировать пластину для 10 мин при 4 ° C, после чего 60 мин 37 ° C.
- Промыть лунки нежно, как описано в 6.2.7., используя утепленные PBS и сообщить эндотелиального слоя J774 адгезии, следующие два метода:
- Лизируйте клетки в 0,1 М трис-HCl рН 8,8, 1% SDS (100 мкл/а) и измерения CFSE-J774 сигнал флюометрия (возбуждения/выбросов = 492 Нм/517 Нм). Представляют собой результаты как условные единицы интенсивности флуоресценции или процент сцепления в отношении позитивного управления (сигнал от общей ячейки, добавленные в каждой скважине).
- Исправить клетки в 4% PFA и доклад вложение CFSE-J774 клеток эндотелия, визуализации под флуоресцентным микроскопом (возбуждения/выбросов = 492 Нм Нм/517).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка LPS-индуцированной эндотелиальных клеток активации RT-ПЦР
Сыворотка голодали ТЗЭТ-04 клетки были простимулированы 100 нг/мл ПЛАСТИНОК для 6 h, и выражение эндотелиальной гена была оценена с помощью RT-ПЦР, сравнивая выражение маркеров активации в состояние покоя. Как показано на рисунке 1A, клетки инкубировали LPS ТЗЭТ-04 индуцированную экспрессию мРНК выбранных сцепления молекул, участвующих в лейкоцитарной набора в течение воспалительной реакции (E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1). PECAM-1 был использован как внутреннего управления, потому что выражение неизмененной под это экспериментальное лечение. Рисунок 1B представляет эндотелиальной активации LPS, измеряется увеличение выражение mRNA цитокинов, Ccl5, Cxcl10 и Cxcl1. Эти молекулы участвуют в активации циркулирующих лейкоцитов, включая их оборот эндотелиального слоя и позднее кровоподтек на сайте воспаления. Цитокинов, IL4, использовался в качестве внутреннего контроля под это экспериментальное лечение.
Рисунок 1: оценки LPS-индуцированной эндотелиальные клетки активации по RT-ПЦР. ТЗЭТ-04 клетки были стимулировали 100 нг/мл ПЛАСТИНОК для 6 h (красные столбики) по сравнению с контролем состояния (синие столбики), и выражение гена был проанализирован RT-ПЦР. Графики показывают раза индукции мРНК в отношении управления состояние выбранных эндотелиальной сцепления молекул (A) и цитокинов (B) участвует в активации лейкоцитов и вербовки в течение воспалительной реакции. PECAM-1 и IL4 использовались как негативный контроль под это условие. Результаты выражаются как означает ± SEM от одного эксперимента, из трех выполнена, осуществляется в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Выражение протеина молекул адгезии на LPS-лечение эндотелиальных клеток
Воспалительные стимуляции проводилась на клетки ТЗЭТ-04 как описано в предыдущем разделе, и выражение протеина было расследовано методом иммуноблоттинга. Упокоения эндотелия представляет практически неопределяемого уровня молекул адгезии VCAM-1 и ИКАМ-1 (помечены как-). Присутствии ПЛАСТИНОК (+) эндотелиальные активированные фенотип проявляется upregulation выражение описанных маркеров (рис. 2). Мембраны были нормализованы по β-актина обнаружения, который использовался в качестве элемента управления загрузкой для расчета плотности относительные группы после анализа денситометрия.
Рисунок 2: белка экспрессии молекул адгезии на LPS-лечение эндотелиальных клеток. Представитель западной помарке оценки ИКАМ-1 и VCAM-1 выражение протеина в покоя (-) по сравнению с LPS-лечение (+) ТЗЭТ-04 клетки. Β-актина был использован как элемент управления загрузки. Молекулярная масса каждого белка находится в скобках. Значения представляют собой полу количественная оценка относительной группы плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Эндотелиальные поверхностных маркеров в LPS-опосредованной воспаление
Эндотелиальные активации в контексте воспалительных оценивалась подачей cytometry после 6 час стимуляции, LPS (100 нг/мл). В этом состоянии оценивалась обнаружения клей связанных молекул, участвующих в лейкоцитарной взаимодействия. В левой панели Рисунок 3A представляет базальной выражение указанного маркеров в клетках покоя ТЗЭТ-04 (красный твердый гистограмма) по сравнению с изотипа отрицательный контроль (черный пунктирная гистограмма). Правая панель Рисунок 3A показывает результаты, полученные от стимулировали ТЗЭТ-04. LPS лечения значительно upregulated экспрессии молекул адгезии, E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1 в плазматической мембраны (красный твердый гистограмма) по сравнению с состояние покоя (черный пунктирная гистограмма). Как показано в цитометрии профилей и привел прежде, выражение PECAM-1 остается неизменным в этой экспериментальной состоянии. Рисунок 3B показывает количественная оценка значения, используемые в качестве ссылки для оценки возможных посредников эндотелиальной воспалительной реакции. %: процент положительных клеток; МФО: означают интенсивности флуоресценции.
Рисунок 3: эндотелиальной поверхностных маркеров воспаления LPS-опосредованной. Поток цитометрии профили молекул адгезии клеток на отдых и LPS-стимулирует ТЗЭТ-04 клетки. Панели слева показывает выражение протеина на отдых клетки (антиген помечены красным гистограмма) отношении изотипа соответствием контроля (Ctrl черный гистограммы). Правой панели сравнивает выражение белка клеточной поверхности управления (черный гистограммы) LPS-лечение эндотелиальных клеток (красная гистограмма). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Сигнальные пути, вызванных LPS стимуляции в эндотелиальных клетках
Механизмы, участвующие в сосудистой отсека активации во время воспаления исследованы путем оценки ключевых сигнальных молекул. Клетки ТЗЭТ-04, стимулируется с ПЛАСТИНОК в разные периоды были обработаны для извлечения белков, и была проанализирована степень активации методом иммуноблоттинга. Рисунок 4 показывает, что IκB-α репрессор NF-κB сигнализации фосфорилированных после 15 минут LPS-инкубации и возвращается в базальные уровни после 1 час. С другой стороны, ЛПС активирует Эрк 1/2 сигналов через 15 мин, который устанавливает основные пути, участвующие в эндотелиальных активации в течение воспалительной реакции. Мембраны были нормализованы по β-актин или Эрк обнаружения 1/2, которые были использованы в качестве контроля загрузки для расчета плотности относительные группы после анализа денситометрия.
Рисунок 4: сигнальные пути, вызванные LPS на эндотелиальных клеток. Клетки ТЗЭТ-04, стимулируется с 100 нг/мл LPS раз указано на рисунке, и сигнальных путей Эрк 1/2 (P-Эрк 1/2) и NF-kB (через P-IκBα) были оценены западную помарку. Эрк 1/2 всего и β-актина были использованы в качестве управления в каждом условии загрузки. Молекулярный вес для каждого белка находится в скобках. Значения представляют собой полу количественная оценка относительной группы плотности. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюЭта цифра.
Регулирование поведения лейкоцитов, эндотелий стимулируется с ПЛАСТИНОК
Биологических актуальность регулирования эндотелиальной активации на прогрессирование воспалительной реакции определяется функциональных анализов показателей лейкоцитов. Как описано в разделе протокол, два различных подхода для тестирования функции лейкоцитов, регулируется эндотелиальных клеток. Хотя анализов допросить различные аспекты воспалительной реакции (RT-ПЦР для эндотелиальной цитокинов, выпущенный активации лейкоцитов и западную помарку для молекул эндотелиальной адгезии лейкоцитов взаимодействия), полученные данные являются обе оценки микроскопических деталей лейкоцита вложения. Лейкоцита активации эндотелиальной растворимых факторов имеет важное значение для разработки эффективной воспалительной реакции, как он способствует клеточной адгезии к нескольких субстратов. Рисунок 5A показывает J774 клеточной адгезии 0,5 мкг/мл фибронектин покрытием скважин в ответ на ранее собранные кондиционером СМИ от элемента управления или ПЛАСТИНОК лечение эндотелиальных клеток. Светлые области изображения и спектрофотометрические измерения показывают, что факторы, выпущенный в кондиционированном СМИ от эндотелия LPS-лечение достаточно эффективно побудить J774 активации, как показано в индукции клетки привязанность к фибронектин. Рисунок 5B представляет совместно адгезии пробирного для оценки способности сосудистой слоя для поддержки фирмы адгезии лейкоцитов, Роман экспрессии молекул адгезии эндотелия. Кратко голодали сыворотки subconfluent культур клеток ТЗЭТ-04, стимулируется с ПЛАСТИНОК для 6 h были промывают несколько раз и совместно инкубировали с линией лейкоцитов, которые J774 ранее помечены флуоресцентного зонда, CFSE. Как показано в микроскопии и spectrofluorometric измерений, LPS-сосудистой стимуляции способствует взаимодействие CFSE-J774 клеток эндотелия монослоя.
Рисунок 5: лейкоцитарные взаимодействие LPS-инкубировали эндотелиальной монослоя, Сопредседатель адгезии пробирного. (A) световой микроскопии изображений показаны Фиолетовый Кристалл окрашивание J774 клеток, придает 0,5 мкг/мл фибронектин покрытием скважин в ответ кондиционером СМИ от управления или LPS-лечение эндотелиальных клеток. Линейки, 50 мкм. Спектрофотометрический анализ, показано ниже указывает измерения оптической плотности, выраженный условные единицы (а.е.) ± SEM для представителя эксперимент, в трех экземплярах. (B) флуоресцентной микроскопии Показать придает CFSE-J774 клетки управления или LPS-лечение ТЗЭТ-04 клетки оценивается совместно адгезии пробирного. Шкалы бар = 50 мкм. Флуориметрический анализ, показано ниже показывает интенсивность флуоресценции, выраженный условные единицы (а.е.) ± SEM для представителя эксперимент, в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Цель | NCBI RefSeq ID | Вперед последовательности (5´-3´) | Обратной последовательности (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ЗАКОН GTG ГАТ GGC КХЦ TCT GG3 | TGA CCT ТГК ОСО CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | АГА ТГК СМЖЛ АГА TCC ГЦА T | ГЦГ CTT GCC CAT CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | УГА AGC УВД CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT КЛЯП ГАА TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT КТГ CAG КТГ КХЦ TCA CC | TCT TGA АКК CAC ТУЦ ТУЦ TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA ТГК AAG КТГ AA | КТГ TAC AGC ОБЩ GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | АГТ ГЦА ГЦА АГА КТК TGG TAC CTA | АГТ TCC ACA GAC ATT ТГК TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | КТГ GAC AAC ATA КТГ CTA АКК G | GGG CAT CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA ТГК ГАТ GGT GTA TAA CG | TGT CAC КТК CTT TTT GTC ЦАГ |
| E-селектин | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ГПТ ACG АГА GA | GTC ОБЩ GTG TTC КТГ TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC ОСО GA | CCG ATT TGA ГЦА ATC ГЦГ TT |
| ИКАМ-1 | NM_010493.3 | CCG CTA ОСО TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Таблица 1: Список грунты, используемые в данном исследовании.
| Отдыхает | LPS | |||
| % | МФО | % | МФО | |
| Ctrl | 1.79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| E-селектин | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ИКАМ-1 | 99,76 | 114.81 | 99,82 | 363.89 |
Таблица 2: эндотелиальной поверхностных маркеров воспаления LPS-опосредованной. Количественная оценка выражения молекул адгезии клеток на покоя и LPS-стимулирует клетки ТЗЭТ-04 cytometry анализ потока. Представитель значения для каждого маркера, соответствующий процент положительных клеток (%) и интенсивности (MFI) означает флуоресценции в покоя и LPS-стимулирует эндотелиальных клеток. PECAM-1 был использован как отрицательный контроль в этих экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот эндотелиальной протокол описывает пошаговая технология, которая устанавливает основу для изучения новых механизмов, участвующих в регуляции воспалительной реакции. Эти подходы основаны на исследование эндотелиальной активности стимулируется ПЛАСТИНОК и оценить критические шаги, участвует в лейкоцитарной набора в течение воспалительной реакции, в частности: релиз эндотелиальной цитокинов, эндотелиальных адгезии молекулы выражение и лейкоцитарной адгезии сосудистой слоя. Как только эндотелия параметры установлены, система может искать Роман соединений, участвующих в регуляции функции эндотелия и, следовательно, воспалительных прогрессии. Эти нормативные наркотики потенциально может представлять интерес для фармацевтического рынка. Основные проекция этого последовательный протокол – создать основу для расширения этих исследований для различных типов эндотелия и стимулирующие условия, регулируя их относительная активность сосудистой параметров.
Наркотики, отобранных этой проверки будет являться интересных кандидатов для проектирования роман терапевтических стратегий борьбы против воспалительных заболеваний. С одной стороны соединений, которые пользу эндотелиального ответа и способствовать лейкоцита набора будет перспективным для иммунодефицита условий16,17. С другой стороны ингибиторы эндотелиальных станет отличным лечения для хронических воспалительных заболеваний10.
Характеристика цитокинов, выраженные стимулировали эндотелия прогнозирует развитие воспаления. Цитокины, маленькие белки, выпущенная эндотелиального слоя в контексте воспалительных и строго регулировать поведение лейкоцитов. Про воспалительных элементов, например Ccl5, Cxcl10 и Cxcl1, связывать их специфическими рецепторами на поверхности тромбоцитов и сигнал побудить лейкоцита взаимодействия с молекулами недавно выраженной адгезии сосудистого слое (E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1), и миграции лейкоцитов к патологической области (рис. 1, Рисунок 2, рис. 3)8,10,18. Другие члены одной семьи белков участвует в урегулировании воспаление и, следовательно, восстановления тканей. Выражение этих противовоспалительных цитокинов относится к хронических воспалительных заболеваний, потому что они препятствуют лейкоцита вербовки и пользу иммунитет Распродажа10,19,20. Чтобы выбрать возможно эндотелиальной воспалительных регуляторы, рекомендуется выполнять этот assay выражение cytokine и вычислить выражение молекул эндотелиальной адгезии в присутствии соединений интереса. В самом деле, анализ уровня между противовоспалительным против провоспалительных цитокинов может использоваться как прогностическую ценность для прогрессирования заболевания и раскрывает препарата терапевтический интерес21.
LPS, привязка к ее клеток поверхности рецептор триггеры комплекс внутриклеточных сигнальных каскадов, возглавляемая киназы карты Эрк 1/2, JNK и p38 и signalosome NF-kB, побудить воспалительных транскрипционный анализ программы. Многие из этих путей являются общими для других воспалительных раздражители, такие как ФНО α или IL-110,22. Эндотелиальные активации определяется обнаружения фосфорилированных форму членов киназы карты как показано для партии "Эрк" 1/2 на рисунке 4. Кроме того, эндотелиальные активации LPS индуцирует Ферментативная активность IKKβ комплекса, которая фосфорилирует и ухудшает NF-kB ингибитор комплекс IκB, таким образом позволяя NF-kB эффекторных членов ядерного транслокации выполнять корреспондент транскрипционный анализ активности (рис. 4). Характеризующие механизмов, которыми наркотиков соединения влияет на эндотелиальных воспалительный процесс является весьма полезной, не только в описании препарата, но и в разработке Роман воспалительных лечения в сочетании с совместимыми обычных терапии 23.
Соединений из эндотелия скрининга воспалительных анализов, необходимо далее изучить для подтверждения их функциональной актуальность в критических шагов лейкоцита поведение анализов, как в конечном счете, клетки отвечают за воспалительных заболеваний. Эти анализы анализ активности лейкоцитов в двух различных экспериментальных условиях. Во-первых, в оценке роли эндотелиальной выпустила цитокинов на активации лейкоцитов, при посредничестве Интегрин адгезии анализов. Лейкоцитарные интегринов активируются эндотелиальной выпустила цитокинов. Таким образом лейкоцитарные клей способность Интегрин лигандов является представитель измерения для лейкоцитов функция8,10,18. Вторая заключается в изучении роли молекул недавно выраженной эндотелиальной адгезии лейкоцитов взаимодействия в сосудистой слой, Сопредседатель адгезии анализов. Молекулы эндотелиальной адгезии, выраженные в контексте воспалительных имеет важное значение для набора лейкоцитов на окружающие ткани. Таким образом анализируя лейкоцитов, взаимодействующих с эндотелиальной лечение монослое клеток представляет прогностическое значение для прогрессирования воспалительных (рис. 5)8,10,18. Результаты, полученные от этих подходов предполагает, что выбранные соединения являются серьезными кандидатами в разработке будущих стратегий для лечения воспалительных заболеваний
Экспериментально определены здесь предлагается универсальный инструмент для будущих приложений из-за его способности экстраполировать для различных систем сотовой или стимулирующее. Процедура может быть изменен в эндотелия из различного происхождения или видов и проверить его функциональность на нескольких иммунных клеток, а также различных воспалительных агентов таких ПЛАСТИНОК, ФНО α, бактерий, вирусов и т.д. Как описано в тексте, исследователи должны сначала характеризуют эндотелиальной активации в собственной системе позже охарактеризовать роль выбранного соединения на воспалительную реакцию. Ограничения протокола являются выбор соответствующей отрицательный контроль и определение точно эндотелиальной деятельности параметров, которые различить отдыхает от стимулировали государству. В том случае, в условиях, описанных в настоящем документе не работают для другой системы исследователи должны устранить экспериментальные параметры, выполняя дополнительные зависящие от времени анализов и с помощью градиента концентрации воспалительных стимула чтобы определить стимулирующее окно, которое позволяет для тестирования новых препаратов для регуляции воспалительной реакции.
В заключение, этот эндотелиальной воспалительных протокол рекомендуется для поиска nEW эндотелиальной регуляторы ориентации воспалительной реакции. Для выполнения этой процедуры будет предоставлять роман, интересные соединения, которые могут применяться для изучения будущих приложений и разработке инновационной терапии сосудистых конкретных против воспалительных заболеваний, и которые потенциально могли бы быть интерес для фармацевтического рынка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию (МИНЕКО) и Институту Salud Карлоса III (ISCIII) (Грант номер IERPY 1149/16 а.л.; МРУ 1410/09 для S. Hortelano); по МИНЕКО через Fondo de Investigación en Salud (FIS) (предоставляет номера PI11.0036 и PI14.0055 S. Hortelano). Эрранс Касадо S. было поддержано IERPY 1149/16 от ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z.
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
