Summary
血管内皮严密控制白细胞的招募。不充分的白细胞外渗导致人类炎症性疾病。因此, 寻找新的调节元素内皮活化是必要的设计改进治疗炎症性疾病。在这里, 我们描述了一个全面的方法来表征新的内皮调节剂, 可以改变白细胞贩运在炎症。
Abstract
内皮层是必不可少的, 以维持体内的稳态, 通过控制许多不同的功能。调节炎症反应的内皮层是至关重要的有效打击有害的投入和援助, 恢复受损地区。当内皮细胞暴露在炎症环境中, 如 gram-negative 细菌膜的外成分, 脂多糖 (LPS), 它们表达可溶性炎细胞因子, 如 Ccl5, Cxcl1 和 Cxcl10, 并触发循环白细胞的活化。此外, 黏附分子 e-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1 在内皮表面的表达能使活化白细胞与内皮层相互作用和黏附, 并最终向发炎的组织渗出。在这种情况下, 内皮功能必须受到严格的调节, 因为过量或有缺陷的活化在白细胞的招募可能导致炎症相关的疾病。由于许多这些疾病没有有效的治疗, 新的战略, 重点在血管层必须研究。我们建议全面的化验, 是有用的, 以寻找新的内皮调节剂, 改变白细胞功能。我们通过使用特定的表达靶点 (如细胞因子、趋化因子和黏附分子) 来分析内皮细胞活化作用, 包括: real-time 定量聚合酶链反应 (qPCR), 印迹, 流式细胞仪和粘附化验。这些方法可以确定炎症环境中的内皮功能, 对进行筛选化验以表征新的血管内皮炎症调节剂是非常有用的, 这对于设计治疗策略具有潜在的价值。
Introduction
炎症是对感染性药物的有益的生物学反应, 其主要目的是消除病原体, 修复受损组织。在某些情况下, 如慢性感染或自身免疫性疾病, 炎症无法解决。相反, 有一个异常的反应与持续的白细胞浸润, 导致长期免疫反应, 导致组织损伤, 纤维化, 功能丧失, 和整体, 残疾, 在某些情况下死亡的病人。这些人类疾病, 归类为炎症性疾病, 都涉及血管的控制白细胞外渗1,2。
内皮细胞通过控制白细胞的贩运在调节炎症反应中起着根本性的作用。当内皮层暴露在炎症介质, 如 LPS, 休眠内皮激活和表达炎细胞因子 (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1,等) 和黏附分子 (e-选择素, VCAM-1 和 ICAM-1), 有利于对感染部位进行循环白细胞的招募。由释放的细胞因子引导的白细胞, 然后调解滚动和互动的内皮层通过相应的胶粘剂对应: PSGL-1 的选择, α4β1整合素 VCAM-1, 和αLβ2整合素 ICAM-1。最后, 白细胞在血管中迁移到炎症的焦点3。
内皮细胞在调节炎症反应中所起的重要作用已经在基因修饰的小鼠身上得到证实, 它只在内皮细胞膜上表达 LPS 受体, 即 toll 样受体 4 (TLR4)。这些 endothelial-TLR4 动物能够对 LPS 介导的炎症反应和检测细菌接种后产生的感染, 从而达到与野生型小鼠一样的感染分辨率和生存率4,5。
对于内皮调节炎症反应通路, 已假设, 在某些阶段的白细胞-内皮相互作用的抑制将导致反式内皮细胞的迁移减少, 并有更好的预后炎症相关疾病。事实上, 一些针对内皮细胞活化和白细胞-内皮相互作用的策略被设计成阻碍免疫的外渗作为治疗炎症性疾病的方法6,7。
在本报告中, 我们描述了一个完整的组的体外技术, 以充分表征内皮活性响应炎症刺激 LPS 及其作用的白细胞活化和粘附到血管层。该手稿中使用的内皮细胞模型是小鼠肺内皮细胞系 (MLEC-04), 如 Hortelano et al.所描述的。8. 在文献中验证了 MLEC-04 细胞系是研究内皮细胞活化的适当系统9,10。根据研究兴趣, 这些方法可以很容易地推断出任何内皮或白细胞系统和炎症剖面。一旦确定了所选条件下的内皮参数, 系统就可以对新的药物进行实验, 以评价血管活化。在这种炎症的背景下, 用复利测定的内皮细胞可以与细胞的控制条件相比较, 任何结果的差异都可能使药物的预后与炎症的发展和进展有关。最后, 我们提出了一个相关的系统来表征新的药物靶向内皮细胞, 这可以影响设计的新型血管特异治疗炎症相关疾病。
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Protocol
1. 内皮细胞培养
- 组织培养处理板
- 外套100毫米组织培养板, 2.5 毫升明胶溶液 (蒸压, 蒸馏水中的0.1% 明胶) 30 分钟, #176; C; 此可以推断为所需的井格式。抽出明胶溶液, 在组织培养罩中风干.
- 组织培养条件
- 在生物孵化器内培养 MLEC-04 细胞 (37 和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 )。在 Dulbecco 和 #39 的完整培养基中培养细胞; 改良的鹰培养基: 营养混合物 F-12 (DMEM/F-12), 辅以10% 胎牛血清 (FBS) 和100单位/毫升青霉素和100和 #181; 链霉素 (P/毫升).
- 按标准的 Neubauer 室方法计数单元格, 并在10毫升完整介质中将 MLEC-04 细胞添加到100毫米明胶处理的板上, 在低密度 2-11 x 10 4 单元/cm 2 。当细胞到达汇合处时, 拆分1:3 单元格.
注意: 通常这在文化中发生了二到三天. - 通过用10毫升无菌磷酸缓冲盐水 (PBS) 洗涤板来培养细胞, 然后加入2毫升胰蛋白酶-edta 溶液 (0.25% 胰蛋白酶, 5 毫米 edta), 在3和 #176 孵育37分钟;
- 停止胰蛋白酶-EDTA 反应, 并通过添加10毫升完整介质来恢复悬浮细胞。自旋下来的细胞 (300 x g, 5 分钟), 丢弃上清, 重细胞颗粒在完整的媒体和亚文化的适当.
2。LPS 治疗和调解人
- 将完整介质中的 MLEC-04 单元 sub-confluence 成以下井格式: 7 x 10 5 单元格/井在6井板和 2.5 x 10 5 单元格/井在 96-井板上.
- 在细胞孵化器中孵育 6 h 的培养 (37 和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 )。将单元格切换到不完整介质 (DMEM-F12、P/S), 并在夜间 (ON) 离开以同步并减少单元活动.
- 通过在不完整的介质 (30 分钟、37和 #176; C) 中稀释的 (或不含) 药物, 将内皮细胞与 (或不) 有关的物质 (如 DT 10 ) 进行孵化, 从而去除介质和测试新的药理化合物; 添加 1.4 mL/6-井板或0.1496-井板).
- 通过在每种化验中指定的时间内加入 LPS 向孵化培养基 (100 ng/毫升, 最终浓度) 挑战细胞。使用 PBS 作为控件.
3。RT qPCR 对活化内皮细胞转录谱的评价
- 在6井培养皿 (7 x 10 5 单元格/井) 中 MLEC-04 种子 sub-confluence。孵育6小时 (37 和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 ), 然后进行血清饥饿 (孵育).
- 移除介质并治疗 (或不治疗) 不完全介质中稀释的有兴趣的药物的内皮细胞培养物 (孵育30分钟, 37 和 #176; c); 添加1.4 毫升/6 孔板 (30 分钟, 37 和 #176; c).
- 通过向孵育介质添加 100 ng/mL LPS 来挑战细胞 (如步骤2.3 所述), 并孵育 6 h. 停止反应, 用冷 PBS 冲洗两次, 并在-80 和 #176 中保持板, 直到样品处理.
- rna 提取
- 解冻板并添加1毫升/井 RNA 提取缓冲器 (38% 苯酚和0.8 米胍异硫氰酸酯; 见材料表)。在室温 (RT) 下30分钟, 在1.5 毫升的管子内进行搅拌并收集匀浆.
- 添加200和 #181; L 氯仿和温和搅拌十五年代. 在 RT 和离心机上孵育3分钟 (11600 x g、15 min、4和 #176; C).
- 将水相转移到另1.5 毫升管。通过加入500和 #181, 沉淀 RNA, 然后在 RT, 然后离心 (11600 x g, 4 和 #176; C) 后进行10分钟的孵育.
- 用75% 乙醇通过涡流搅拌然后离心 (7500 x g, 4 和 #176; C) 去除上清液和洗涤颗粒.
- 气干颗粒和溶解 RNA 在25和 #181; 纯 H 2 O 通过孵化10分钟, 在55和 #176; c. 将 RNA 保持在-80 和 #176; c 直到样品处理.
- 数量和纯度 rna
- 通过测量分光光度计中样品在 260 nm 的吸收度来量化 rna 浓度 (参见 材料表 ).
- 测量在 230 nm 和 280 nm, 以确定 RNA 纯度.
注: 260/280 的比值表示蛋白质或苯酚污染。接近2的比率是可以接受的。260/230 的比值表明 EDTA、碳水化合物或苯酚污染物。2.0-2.2 之间的值是可接受的.
- 检查 RNA 完整性
- 运行2和 #181; g 的总 rna 和一个 rna 阶梯上的1.5% 变性琼脂糖凝胶; 凝胶文档系统的可视化 (参见 材料表 ).
注: 2:1 的清晰和尖锐的28S 和 18S rRNA 波段的比率表示一个完整的 RNA。部分退化的 RNA 作为一个污点的外观解决.
- 运行2和 #181; g 的总 rna 和一个 rna 阶梯上的1.5% 变性琼脂糖凝胶; 凝胶文档系统的可视化 (参见 材料表 ).
- RT-qPCR
- 根据标准协议 (参见 材料目录 ) 11 , 从单个搁浅的 RNA 中合成互补 DNA (cDNA).
- 通过 RT-qPCR
- 为每个样本准备反应混合物: 混合2和 #181; l cDNA, 7 和 #181; l 荧光化合物, 300 nm 前引物, 和 300 nm 反向底漆 ( 表 1 ) 在最终体积为13和 #181; L, 并添加到96井反应板 (请参见 材料表 ).
- 用光学粘合剂盖封板, 离心机 (300 x g, 1 分钟) 并在实时 PCR 系统上运行反应 (热启动95和 #176; c 为二十年代, 其次为40个周期:95 和 #176; c 为 3 s 和60和 #176; c 为三十年代) (请参见 材料表 ).
- 使用比较方法 2 和 #916 对结果进行相对定量分析; #916; Ct 与内务管理基因 glyceraldehyde-3-phosphate 脱氢酶 (GAPDH) 或酸性核糖体磷 P0 (36B4) 12.
4。流式细胞仪评价内皮细胞活化作用
- 按照2节中描述的条件处理 MLEC-04 细胞, 并通过流式细胞仪评估内皮表面蛋白的变化.
- 在步骤1.2.3 中描述的胰蛋白酶-EDTA 法对 6 h LPS 刺激后的细胞进行分离, 用4和 #176 的不完全介质冲洗;
- 使用 Neubauer 室方法计算单元格, 并将 10 x 10 4 单元格放入 u 底 96-井板中。离心机 (300 x g, 5 分钟), 用180和 #176 丢弃上清液; 从上到下的手腕折断, 并迅速恢复到原来的位置.
- 添加50和 #181; 在不完全介质中稀释的选定抗体 (10 和 #181; 最终浓度) 的细胞和孵育 (30 分钟, 4 和 #176; C).
- 将单元格清洗两次 w根据步骤4.3 中所述的程序不完整的介质, 用50和 #181 孵育; L 在10和 #181; 与 FITC 或类似的共轭 (30 min, 4 和 #176; C 在一个黑暗的空间) 的对应的二级抗体的 g/毫升.
- 用不完整的介质冲洗一次, 然后用 PBS 洗涤。用300和 #181 恢复细胞; L PBS 使用1毫升吸管技巧和在细胞仪管中放置.
- 评估流式细胞仪系统中的样本 (请参阅 材料表 )。通过向前和侧面散射参数调整单元格的数量。门的人口利益。根据同种控制的细胞的负控制调节闸门。分析结果为阳性细胞或平均荧光强度的百分比 8 .
5。用免疫印迹法评价内皮细胞活化作用
- 在6井培养皿 (7 x 10 5 细胞/井) 中 sub-confluence 内皮细胞, 并按2节所述处理 LPS。通过下面的印迹协议分析炎症蛋白表达.
- 停止 lps 刺激在不同的时间点, 以阐明不同方面的内皮反应:
- 确定炎症蛋白剖面后 6 h 的 lps 刺激.
- 每15分钟通过60分钟的时间确定单元格信号.
- 在这两种情况下, 通过用冷 PBS 冲洗两次以停止反应, 并将样品存储在-80 和 #176; C 直到样品处理.
- 溶解单元格和蛋白质提取
- 添加200和 #181; 每井溶解缓冲液 (1% 非离子表面活性剂, 10 毫米三盐酸, 1mM EDTA, 150 毫米氯化钠, 30 毫米焦磷酸钠, 50 毫米氟化钠, 2.1 毫米钠钒pH 值 7.6, 辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒) (见材料表).
- 孵育15分钟, 在4和 #176; C 在搅拌下, 用吸管尖刮井, 并在1.5 毫升管中收集匀浆.
- 离心管在 11600 x g 在4和 #176; C.
- 在-80 和 #176 中将清液储存在清洁的1.5 毫升管中, 直到处理.
- 按照标准协议 (参见材料表) 13 来测量二辛可宁酸含量的蛋白质浓度.
- 解决30和 #181; 通过标准技术0.1% 十二烷基硫酸钠、10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 14 对每个样品的总蛋白裂解 g。使用10毫米和 #946 的样品, 基 (还原条件) 或无 (还原条件), 取决于用于检测感兴趣的蛋白质的抗体.
- 将分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到聚偏氟 (PVDF) 转移膜, 其0.45 和 #181; m 孔径采用标准程序.
- 在迁移后, 用 pbs 两次冲洗膜, 0.1% polysorbate-20 (pbs t) 和阻断不结合点, 加入20毫升 2% BSA 稀释在 pbs t 中检测磷酸或5% 脱脂奶粉中的总蛋白, 在搅拌下 (90 分钟,RT).
- 将所选抗体稀释在适当的阻塞缓冲液的10毫升中, 在推荐浓度下, 并在搅拌下孵育膜 (上、4和 #176; C)。或者, 将膜放在密封的塑料袋中, 用5毫升稀释的抗体.
- 第二天, 冲洗膜三次 (过量 PBS t, 15 分钟, RT).
- 在适当的阻断缓冲液中, 用10毫升与辣根过氧化物酶 (HRP) 稀释的对应二级抗体, 在搅拌 (30 分钟, RT) 下孵育膜.
- 在搅拌下冲洗三次膜 (过量 PBS-T, 15 分钟, RT).
- 孵育的膜为1分钟, 0.1 毫升/厘米 2 的过氧化物酶基质增强化学发光 (ECL)。将排水膜放在两个透明塑料板之间, 并将其插入到化学发光检测系统中, 其中包括带电耦合的器件摄像机 (CCD).
- 使用 CCD 摄像机检测信号及其软件, 以累计程序记录图像 (在每三十年代曝光时图像显示累计信号, 总时间为15分钟).
- 根据用户指南 15 中所述的协议, 使用 ImageJ 软件量化密度。
- 打开 ImageJ 软件中的示例, 并使用矩形选择工具选择感兴趣的带区.
- 选择作为第一条车道, 并按绘图车道获取剖面图.
- 用 straight-line 选区分隔峰值区域.
- 通过单击每个峰值的内侧来测量每个波段的大小.
- 表示有关加载蛋白质控制 (和 #946;-肌动蛋白, 蛋白, 等的结果 ).
6。粘附测定白细胞活化内皮因子的评价
- 获取内皮条件介质。
- 治疗2节中所示的 MLEC-04 细胞, 并在 24 h 刺激与 LPS (100 ng/毫升) 后收集培养上清液.
- 从处理过的 MLEC-04 细胞和离心机收集被适应的媒介 (600 x g)。将上清液保持在0.5 毫升等分在-80 和 #176; C 直到使用.
- 白细胞粘附检测
- 将96个井板涂上50和 #181; 在 PBS 中稀释的选择的胞外基质蛋白的 L/井 (胶原蛋白, 在0.1 米醋酸中稀释): 纤维粘连蛋白 (1-10 和 #181; g/毫升), 层粘连蛋白 (1-10 和 #181; g/毫升) 和胶原 i 型 (10-40 和 #181; g/毫升)。4和 #176 离开, C.
- 丢弃涂布介质, 并在150和 #181 的水井上阻断不结合位点, 1% BSA 热灭活 (1 分钟, 100 和 #176; C), 在 RT 上为90分钟.
- 用 PBS 冲洗两次井, 并添加100和 #181; L 以前收集的内皮条件介质 (6.1 节).
注: 板已准备好进行附着力测定. - 在生物孵化器中培养小鼠单核-巨噬细胞系 J774 (37 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 ) 与罗斯威尔公园纪念研究所媒体 (RPMI), 10% FBS, 1% P/秒.
注: J774 细胞在悬浮中生长. - 收集 J774 细胞到15毫升管和离心机 (300 x g, 5 min)。用10毫升无血清培养基丢弃上清和重细胞颗粒。在 Neubauer 室中计数细胞。离心细胞 (300 x g, 5 min), 丢弃上清和重在无血清培养基中的细胞在 15 x 10 4 J774 细胞每50和 #181; L 媒体.
- 将 15 x 10 4 J774 单元格添加到每个井中50和 #181; L 无血清培养基, 在15和 #176 孵育4分钟; c 在1和 #176; c 在 CO 37 细胞孵化器.
- 冲洗两次井, 轻轻地加入温水 PBS; 离心机 (300 x g, 5 分钟), 用180和 #176 丢弃上清液; 手腕从上到下, 快速恢复到原来的位置。修复附加的单元格在 PBS 和孵育中加入100和 #181; 4% 甲醛 (粉煤灰) 的 L/井 (10 分钟, RT).
- 将介质轻轻地丢弃, 并在 PBS 中用2% 甲醇 permeabilize 电池2分钟. 将介质轻轻丢弃, 并通过添加50和 #181 对电池进行着色; 九十年代在 rt 中20% 甲醇中的0.5% 结晶紫的 L/井.
- 用大量的自来水冲洗盘子, 丢弃多余的液体, 使其风干。用数码相机将附着的细胞报告给光显微镜.
- 通过添加100和 #181 稀释细胞染色; 0.1 米柠檬酸钠, 50% 乙醇。测量 545 nm 的吸光度, 并将其结果表示为任意单位的吸光度或附着力百分比, 方法是将100% 作为附着在高配体浓度的井中的细胞黏附力
7。白细胞-内皮细胞共粘法检测内皮细胞活化
- 在2节所述的 96-井板上处理 MLEC-04 单元, 并与 LPS 孵育 (6 h、37和 #176; C).
- 荧光标签 J774 细胞与羧基琥珀酰亚胺酯 (CSFE).
- 按照6.2.5 中的过程清洗 PBS 中的 J774 单元格。通过 Neubauer 室法和重在 PBS 中的 1 x 10 6 单元/mL 计数单元格, 0.1% BSA.
- 用 CFSE (5 #181; M, 最终浓度) 在37和 #176 孵育细胞20分钟; c. 添加5毫升不完全培养基和孵育 (5 分钟, 4 和 #176; c).
- 使用不完整介质清洗一次, 如6.2.5 中所述, 重在 15 x 10 4 cells/100 和 #181; L 并进行 co-adhesion 检测.
- 在内皮治疗后, 用不完整的介质冲洗三次井。将 CFSE-J774 单元格 (15 x 10 4 cells/100 #181; L) 添加到每个内皮涂层井。在4和 #176 中孵育板材10分钟; c 依次为60分钟, 在37和 #176; c.
- 轻轻地清洗水井, 如6.2.7 中所述, 使用加温 PBS, 并报告 J774 粘附到内皮层的方法有以下两种:
- 溶解 0.1 M 中的细胞, 8.8, 1% SDS (100 和 #181; L/井) 并测量CFSE-J774 信号由荧光 (励磁或放射 = 492 nm/517 毫微米)。将结果表示为任意单位的荧光强度或与阳性对照的粘附百分比 (来自每个井的总细胞的信号).
- 修复4% 粉煤灰中的细胞, 通过可视化荧光显微镜 (激发/发射 = 492 nm/517 nm) 将 CFSE-J774 细胞的附着报告给内皮.
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Representative Results
qPCR 对 LPS 诱导的内皮细胞活化作用的评价
在6小时内, 用100毫升 LPS 刺激血清 MLEC-04 细胞, 通过比较活化标记物的表达与静止状态的 qPCR, 对内皮基因表达进行评价。如图 1A所示, LPS 孵育的 MLEC-04 细胞诱导了在炎症反应 (e-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1) 中参与白细胞招募的选择性黏附分子的 mRNA 表达。PECAM-1 被用来作为一个内部控制, 因为表达式是在这个实验治疗的不被修改。图 1B表示由 LPS Ccl5、Cxcl10 和 Cxcl1 的细胞因子的增加 mRNA 表达所测量的内皮细胞活化。这些分子参与了循环白细胞的活化, 包括其对内皮层的贩运, 以及后来的外渗到炎症部位。细胞因子, IL4, 在这种实验治疗下被用作内部控制。
图 1: qPCR 对 LPS 诱导的内皮细胞活化的评价."用 100 ng/毫升 LPS 对 6 h (红条) 与对照条件 (蓝条) 进行了 MLEC-04 细胞的刺激, 用 RT-qPCR 对其基因表达进行了分析。图显示了在炎症反应过程中参与白细胞活化和招募的内皮黏附分子 (A) 和细胞因子 (B) 的控制条件对 mRNA 的折叠诱导作用。在这种情况下, PECAM-1 和 IL4 被用作负控制。结果被表达为平均± SEM 从一个实验, 在三执行了, 执行了三个。请单击此处查看此图的较大版本.
黏附分子在 LPS 治疗的内皮细胞中的表达
对 MLEC-04 细胞进行了炎症刺激, 并在前段进行了详细研究, 并采用了免疫印迹技术对蛋白质表达进行了研究。静息内皮呈现几乎无法察觉的粘附分子 VCAM-1 和 ICAM-1 (标记为-)。在 LPS (+) 的存在, 内皮活化表型是明显的上调表达的标记 (图 2)。用β-肌动蛋白检测法对膜进行归一化, 作为负荷控制, 计算密度分析后的相对带密度。
图 2: 黏附分子在 LPS 治疗的内皮细胞上的表达.有代表性的西方印迹评价 VCAM-1 和 ICAM-1 蛋白表达在休息 (-) 与 LPS 处理 (+) MLEC-04 细胞。β-肌动蛋白被用作加载控制。每个蛋白质的分子量在括号内。这些值表示相对频带密度的 semi-quantification。请单击此处查看此图的较大版本.
LPS 介导炎症的内皮表面标记
在6小时刺激的 LPS (100 ng/毫升) 后, 流式细胞术对炎症环境中的内皮活化进行了评价。在这种情况下, 检测与粘附分子参与白细胞相互作用进行了评估。图 3A的左面板表示与同种负控制 (黑色虚线直方图) 相比, 静止 MLEC-04 单元 (红色-实心直方图) 中指定标记的基本表达式。图 3A的右面板显示从受激 MLEC-04 导出的结果。与静止状态 (黑点直方图) 相比, LPS 治疗能显著上调粘附分子 e-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1 在细胞膜 (红-固柱状图) 中的表达。如在细胞仪图谱中所示, 在这种实验条件下, PECAM-1 的表达不变。图 3B显示了用于评估内皮炎症反应的可能介质的量化值。%: 阳性细胞百分比;平均荧光强度。
图 3: LPS 介导的炎症中的内皮表面标记.细胞黏附分子的流式细胞仪在静止和 LPS 刺激的 MLEC-04 细胞上的分布。左面板显示在休眠细胞 (抗原标记-红色直方图) 上的蛋白质表达与同种匹配的控制 (Ctrl-黑色直方图)。右面板将控制细胞表面蛋白表达 (黑色直方图) 与 LPS 治疗的内皮细胞 (红色直方图) 进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.
内皮细胞内毒素刺激诱发的信号传导通路
通过对关键信号分子的评价, 研究了炎症过程中血管室激活的机制。对不同时期 LPS 刺激的 MLEC-04 细胞进行蛋白质提取, 并利用免疫印迹技术对其活化程度进行分析。图 4显示 NF-nf-信号的 IκB α阻遏在15分钟 LPS 孵育后磷酸化, 并在1小时后返回到基底水平。另一方面, LPS 在15分钟后激活了 ERK 1/2 信号, 这在炎症反应中建立了一个重要的血管内皮细胞激活通路。用β-肌动蛋白或 ERK 1/2 检测方法对膜进行了归一化, 作为负荷控制, 计算密度分析后的相对带密度。
图 4: 由 LPS 在内皮细胞上触发的信号通路.MLEC-04 细胞刺激与 100 ng/毫升 LPS 的时间表明, 在图和信令通路 erk 1/2 (p-erk 1/2) 和 NF kB (通过 p-IκBα) 评价的印迹。ERK 1/2 总和β-肌动蛋白被用作加载控制在每个条件。每个蛋白质的分子量在括号内。这些值表示相对频带密度的 semi-quantification。请单击此处查看更大版本的这个数字。
LPS 刺激内皮细胞行为的调节
内皮激活调节的生物学相关性是由白细胞性能的功能分析决定的。如协议部分所述, 包括两种不同的方法来检测内皮细胞调节的白细胞功能。虽然化验结果询问不同方面的炎症反应 (RT qPCR 的内皮细胞因子释放的白细胞活化, 和西方印迹的内皮黏附分子在白细胞相互作用), 获得的数据是两种评价白细胞附着的微观细节。白细胞活化的内皮可溶性因子是必不可少的发展有效的炎症反应, 因为它有利于细胞粘附到几个基底。图 5A显示 J774 细胞粘附到0.5 µg/毫升纤维连接蛋白涂敷井, 以响应先前收集的条件介质从控制或 LPS 治疗的内皮细胞。明亮的现场图像和分光光度测量表明, 在条件介质中释放的由 LPS 处理的内皮细胞的因素足以有效地诱导 J774 活化, 如诱导细胞附着蛋白.图 5B代表一种 co-adhesion 的检测方法, 用于评估血管层支持白细胞粘附分子的新表达的能力。简要地, MLEC-04 细胞的血清饥饿的 subconfluent 培养 6 h 被洗涤了多次和 co-incubated 与白细胞线 J774 以前标记用荧光探针, CFSE。如显微和荧光测量中所示, LPS-血管刺激有利于 CFSE-J774 细胞与内皮单分子膜的相互作用。
图 5: 通过 co-adhesion 检测, 白细胞与 LPS-孵育内皮单层的相互作用.(A) 光镜图像显示 J774 细胞的结晶紫染色, 附着在0.5 µg/毫升纤维连接蛋白涂敷井中, 以响应控制或 LPS 治疗的内皮细胞的条件介质。刻度条, 50 µm。分光光度分析表明, 以任意单位 (a.u) ± SEM 表示的吸光度测量是代表实验运行的三倍。(B) 荧光显微显示附 CFSE-J774 细胞的控制或 LPS 治疗的 MLEC-04 细胞评价 co-adhesion 测定。缩放条 = 50 µm。以下荧光分析表明, 荧光强度表示为任意单位 (a.u) ± SEM 为代表的实验运行三个。请单击此处查看此图的较大版本.
| 目标 | NCBI RefSeq ID | 正向序列 (5´-3´) | 反转序列 (5´-3´) |
| gapdh | NM_001289726。1 | 行动 GTG GGC CCC GG3 | TGA cct TGC |
| 36B4 | NM_007475。5 | TGC AGC | GTT 铁通海合会猫 CAG C |
| Cxcl10 | NM_021274。2 | CCG TTT | CCC 铁通 GGT 堵嘴 GAA |
| Ccl5 | NM_013653。3 | ctg | 高温 TGA |
| Cxcl1 | NM_008176。3 | GGG AAG AAA TGC AAG | AGG |
| IL1R2 | NM_010555。4 | AGT TGG TAC CTA | AGT TGC |
| IL10 | NM_010548。2 | ctg。 | GGG 猫 CAC |
| PECAM-1 | NM_008816。3 | TGC GGT TAA CG | TTT 委员会 |
| e-选择素 | NM_011345。2 | GGA ATG | AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693。3 | GGC TGA | CCG GTT |
| ICAM-1 | NM_010493。3 | CCG CTA CCG | GGC GGC |
表 1: 本研究中使用的引物清单。
| 休息 | lps | |||
| % | 基金会 | % | 基金会 | |
| ctrl | 1.79 | 3。5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| e-选择素 | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
表 2: LPS 介导的炎症的内皮表面标记物流式细胞仪分析细胞黏附分子在静息和 LPS 刺激 MLEC-04 细胞中的表达。在静止和 LPS 刺激的内皮细胞中, 对应于阳性细胞 (%) 和平均荧光强度百分比的每个标记的代表值。在这些实验条件下, PECAM-1 被用作负控制。
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Discussion
这种内皮细胞的协议描述了一种逐步的技术, 建立了探索新的机制参与调节炎症反应的基础。这些方法是基于对 LPS 刺激的内皮活性的研究, 并评估在炎症反应过程中所涉及的白细胞招募的关键步骤, 特别是: 内皮细胞因子释放, 内皮黏附分子表达和白细胞粘附到血管层。一旦血管内皮细胞的参数建立, 系统可以寻找新的化合物参与调节内皮功能, 从而, 炎症进展。这些监管药物可能对医药市场有潜在的利益。这一顺序协议的主要投射是建立一个基础, 以扩大这些研究, 以不同的内皮类型和刺激条件, 通过调整其相对血管活动参数。
这种筛选所选择的药物将成为设计治疗炎症性疾病新疗法的有趣候选者。一方面, 有利于内皮细胞反应的化合物, 并有助于白血球的招募将有希望的免疫缺陷的情况16,17。另一方面, 内皮抑制剂将构成治疗慢性炎症性疾病的优良疗法10。
由受激内皮细胞表达的因子的表征预示着炎症的演化。细胞因子是在炎症环境中内皮层释放的小蛋白质, 强烈调节白细胞的行为。亲炎症成员, 如 Ccl5, Cxcl10 和 Cxcl1, 绑定到他们的白细胞表面的特定受体和信号诱导白细胞相互作用与新表达的黏附分子的血管层 (e-选择素, VCAM-1 和 ICAM-1), 并白细胞迁移到病理区域 (图 1, 图 2, 图 3)8,10,18。同样的蛋白质家族的其他成员参与了炎症的解决, 因此组织修复。这些抗炎细胞因子的表达与慢性炎症性疾病有关, 因为它们阻碍了白细胞的招募和支持免疫清除10,19,20。为了选择可能的内皮炎症调节剂, 建议执行这种细胞因子表达测定, 并评价内皮黏附分子在存在的兴趣化合物的表达。事实上, 分析抗炎与炎细胞因子之间的水平可以作为疾病进展的预测价值, 并揭示了药物的治疗兴趣21。
LPS 结合其细胞表面受体触发复杂的细胞内信号转导由 MAP 激酶 ERK 1/2, JNK, 和 p38 和 NF-kB signalosome 诱导的炎症转录程序。许多这些途径是共同的其他炎症刺激, 如 TNF-α或 IL-110,22。在图 4中, 通过检测 MAP 激酶成员的磷酸化形式来确定内皮细胞活化作用, 如 ERK 1/2 所示。此外, LPS 的内皮激活诱导 IKKβ复合体的酶活性, 对和降解 nf-kb 抑制剂复合 IκB, 从而允许核易位的 nf-kb 效应成员执行通讯员转录活性 (图 4)。对药物化合物影响内皮炎症反应的机制进行表征是非常有用的, 不仅在描述药物, 而且在设计新的炎症治疗与相容的常规疗法结合在一起23。
从内皮细胞炎症筛检中选择的化合物, 必须进一步研究, 以确认其功能相关性的关键步骤的白细胞行为的检测, 最终, 该单元是负责的炎症性疾病。这些化验分析了两种不同实验环境中的白细胞活性。第一种是评估内皮细胞因子在整合素介导的黏附力测定中对白细胞活化的作用。白细胞整合被激活的内皮细胞因子释放。因此, 白细胞黏附能力对整合素配体是一个代表性的测量白细胞功能8,10,18。二是研究新表达的内皮黏附分子在白细胞与血管层的相互作用上的作用, co-adhesion 测定。内皮黏附分子表达的炎症环境是必不可少的白细胞招募到周围的组织。因此, 分析白细胞与内皮治疗单分子膜的相互作用构成了炎症进展的预后价值 (图 5)8,10,18。从这些方法得出的结果表明, 选定的化合物是设计未来治疗炎症性疾病的策略的重要候选者
这里定义的实验方案是一个通用的工具, 用于未来的应用, 因为它能够推断不同的细胞或刺激系统。该过程可以修改为不同的来源或物种的内皮, 并测试其功能的几个免疫细胞, 以及不同的炎症因子, 如 LPS, TNF-α, 细菌, 病毒,等。正如本文中所描述的, 研究人员必须首先在他们自己的系统中描述内皮细胞的活化作用, 然后再描述一个选择的化合物在炎症反应中所扮演的角色。协议的限制是选择一个适当的负控制和精确定义的内皮活性参数, 辨别休息的受激状态。在本文所描述的条件不适用于不同的系统时, 研究人员必须通过执行额外的时间依赖性检测来诊断实验参数, 并使用炎症刺激的浓度梯度定义一个刺激窗口, 允许测试新的药物来调节炎症反应。
最后, 建议使用这种内皮炎性的协议来寻找 n针对炎症反应的血管内皮调节剂。执行这个过程将提供新奇, 有趣的化合物, 可以应用于研究其未来的应用和设计创新的血管特异性治疗炎症相关疾病, 这可能是对医药市场的兴趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) 和干杯卡洛斯 III (ISCIII) 的支持 (赠款编号 IERPY 1149/16 至 a.1;MPY 1410/09 到 s Hortelano);由 MINECO 通过基金 de 研究 en 干杯 () (授予数字 PI11.0036 和 PI14.0055 对 s Hortelano)。Herranz 由 ISCIII IERPY 1149/16 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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