Summary
אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.
Abstract
שכבת אנדותל חיוני לשמירה על הומאוסטזיס בגוף על ידי שליטה פונקציות שונות. ויסות התגובה דלקתיות על ידי השכבה אנדותל חיוני להילחם ביעילות נגד מזיקים תשומות וסיוע בשחזור של אזורים פגועים. כאשר תאי אנדותל נחשפים סביבה דלקתית, כגון הרכיב החיצוני של הממברנה חיידקים גראם שליליים, ליפופוליסכריד (LPS), הם אקספרס ציטוקינים פרו-דלקתיים מסיסים, כמו Ccl5, Cxcl1 ו- Cxcl10, ויפעיל הפעלה של מחזורי לויקוציטים. בנוסף, הביטוי של מולקולות אדהזיה E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1 על פני אנדותל מאפשר את האינטראקציה והצמדות לויקוציטים מופעל את שכבת אנדותל, בסופו של דבר את extravasation לעבר הרקמה מודלק. בתרחיש זה, הפונקציה אנדותל חייב להיות בחוזקה מוסדר כי הפעלה מוגזמת או פגומה בלשכת הגיוס ליקוציט עלול לגרום הפרעות הקשורות דלקתיות. מאז רבים של הפרעות אלה אין טיפול יעיל, חובה לחקור אסטרטגיות מקוריות עם דגש על שכבת כלי הדם. אנו מציעים מקיף מבחני שימושיות החיפוש של הרומן הרגולטורים אנדותל המשנים ליקוציט פונקציה. אנחנו מנתחים את הפעלת אנדותל באמצעות ביטוי ספציפי מטרות מעורב בגיוס ליקוציט (כגון, ציטוקינים, נוגדנים, מולקולות אדהזיה) עם מספר טכניקות, לרבות: (תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת RT-qPCR), במערב-כתם, flow cytometry והצמדות מבחני. גישות אלה לקבוע פונקציה אנדותל בהקשר דלקתיות, שימושי מאוד לביצוע מבחני המיון כדי לאפיין את הרומן הרגולטורים דלקתיות אנדותל שנמצאים ערך פוטנציאלי עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
Introduction
דלקת היא תגובת ביולוגי מועיל נגד מדבקים, עם המטרה הגדולות כדי לחסל את המחלה ותיקון רקמות שנפגעו. בתנאים מסוימים, כגון דלקות כרוניות או מחלות אוטואימוניות, דלקת לא נפתרת. במקום זאת, יש לתגובה חריגה עם חדירה מתמשכת של לויקוציטים, וכתוצאה מכך לתגובה החיסונית ממושך שמובילה נזק לרקמות, פיברוזיס, אובדן של הפונקציה, כללי, נכות, במוות כמה מקרים של המטופל. הפרעות אלה אנושי, ממוין כמו מחלות דלקתיות, כל לערב את כלי הדם עבור הפקד ליקוציט extravasation1,2.
תאי אנדותל לשחק תפקיד מהותי בוויסות התגובה דלקתיות על ידי שליטה ליקוציט סחר. כאשר שכבת אנדותל חשוף מתווכים דלקתיים כגון LPS, אנדותל מנוחתו מפעיל, מבטא ציטוקינים פרו-דלקתיים (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, וכו '), מולקולות אדהזיה (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1) הטובה. גיוס של מחזורי לויקוציטים לאתר זיהום. לויקוציטים טענתי על ידי ציטוקינים שפורסמו אז לתווך מתגלגל ואינטראקציה עם השכבה אנדותל באמצעות עמיתיהם דבק כתב: PSGL-1 בחירת שמלות, α4β1 אינטגרין VCAM-1 של אינטגרין αLβ2 ICAM-1. לבסוף, לויקוציטים נודדים על פני להערכת לכיוון המוקד של דלקת3.
התפקיד החיוני של אנדותל בוויסות התגובה דלקתיות הוכח על עכברים ששונו גנטית כדי לבטא את קולטן LPS, קולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), רק על תאי אנדותל. בעלי חיים אלה אנדותל-TLR4 הצליחו להגיב כדי דלקת בתיווך LPS וכדי לזהות את הזיהום שנוצר לאחר חיסון חיידקים, וכתוצאה מכך להשיג רזולוציה זיהום והישרדות ברמות דומות כמו עכברים פראי סוג4 , 5.
עבור מסלול מוסדר אנדותל תגובה דלקתית, אותו יש כבר הניחו כי עיכוב בשלבים מסוימים של האינטראקציה ליקוציט-אנדותל כתוצאה צמצום הגירה טראנס-אנדותל, פרוגנוזה טובה יותר עבור מחלות דלקתיות הקשורות. למעשה, מספר אסטרטגיות מיקוד האינטראקציה הפעלה, ליקוציט-אנדותל אנדותל עוצבו כדי לעכב את extravasation של תאים חיסוניים לטיפול הפרעות דלקתיות6,7.
בדו ח זה, אנו מתארים קבוצה יסודית של שיטות in vitro לקשרי לאפיין באופן מלא את הפעילות אנדותל בתגובה התקליטים גירוי דלקתי ותפקידו ליקוציט הפעלה והצמדות על שכבת כלי הדם. המודל תא אנדותל בשימוש כתב יד זה היה הקו תא אנדותל הריאות העכבר (MLEC-04), כפי שתואר על ידי. Hortelano et al. 8. שורת התאים MLEC ה-04 אומתה בספרות להיות מערכת המתאים ללמוד הפעלה אנדותל9,10. בהתבסס על תחומי המחקר, גישות אלה יכול להיות בקלות אקסטרפולציה בכל אנדותל או מערכות ליקוציט ופרופיל דלקתיות. לאחר הגדרת הפרמטרים אנדותל בתנאים שנבחר, המערכת באפשרותך לבדוק תרופות חדישות על הניסויים המוצע כדי להעריך את הפעלת כלי הדם. בהקשר זה דלקתיות, תאי אנדותל נבדק עם המתחם עניין ניתן להשוות את תנאי הבקרה של התאים, כל ההבדלים וכתוצאה מכך יכול לעדכן את התוצאה prognostic של התרופה על התפתחות והתקדמות של דלקת. לסיכום, אנו מציעים מערכת הרלוונטיים לאפיון מטרות חדשות סמים לתאי אנדותל, אשר יכולים להשפיע על העיצוב של טיפולים ספציפיים וסקולרית נגד מחלות דלקתיות הקשורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים אנדותל
- תרביות רקמה מטופלים צלחות
- מעיל 100 מ מ תרביות רקמה צלחות עם ג'לטין 2.5 מ ל פתרון (בלוק, 0.1% ג'לטין במים מזוקקים) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; זה יכול להיות אומדן לתבנית טוב נדרש. האחות הפתרון ג'לטין ולהשאיר צלחות מילה נהדרת בשכונה תרביות רקמה.
- תנאים תרביות רקמה
- לטפח את התאים MLEC-04 בפנים החממה הביולוגית (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2). לגדל את התאים בתקשורת מלאה של Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני: תערובת מזין F-12 (DMEM/F-12) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg 100/mL (P/S).
- לספור את התאים בשיטה קאמרית סטנדרטי נויבאואר, ולהוסיף את התאים MLEC-04 הלוחות שטופלו ג'לטין 100 מ מ בתקשורת מלאה 10 מ"ל, על צפיפות נמוכה של 2-11 x 4 10 תאים/ס מ 2. לפצל את התאים 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש.
הערה: הדבר מתרחש בדרך כלל אחרי שלושה ימים בתרבות. - תת-תרבות התאים ע י שטיפת הצלחות עם 10 מ"ל סטרילי פוספט Buffered מלוחים (PBS) ולאחר מכן על-ידי הוספת 2 מ"ל טריפסין-EDTA פתרון (0.25% טריפסין, 5 מ מ EDTA) ואת תקופת דגירה של 3 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לעצור את התגובה טריפסין-EDTA ולשחזר את התאים על תנאי על-ידי הוספת מדיה מלאה 10 מ"ל. ספין למטה התאים (x 300 גרם, 5 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר הסלולר מדיה מלאה ו תת-תרבות כראוי.
2. טיפול LPS וכן
- צלחת התאים MLEC-04 בתקשורת מלאה-זרימה תת לתוך התבנית טוב הבאה: 7 x 10 5 תאים/טוב על לוחות 6-ובכן, 2.5 x 10 5 תאים/טוב על צלחות 96-ובכן.
- דגירה תרבות ש ח 6 בחודש חממה תא (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2). להחליף את התאים למדיה לא שלם (DMEM-F12, P/S) ולהשאיר לילה (ב) כדי לסנכרן וכדי להקטין את פעילות התא.
- מסיר את המדיה ולבדוק תרכובות הרומן תרופתי על ידי המקננת תאי אנדותל עם (או בלי) התרופה המדובר (למשל DT 10) מדולל בתקשורת לא שלם (30 דקות, 37 ° C); להוסיף 1.4 mL/במשך 6-ובכן צלחת או 0.14 mL/טוב עבור לוחות 96-ובכן).
- אתגר בתאים על-ידי הוספת LPS התקשורת דגירה (100 ננוגרם למ"ל, הריכוז הסופי) עבור תקופת הזמן שצוין בכל וזמינותו. השתמש PBS כפקד.
3. הערכה של פרופיל תעתיק על אנדותל מופעל על ידי RT-qPCR
- זרע MLEC-04 תאים על זרימה תת בתרבות 6-ובכן צלחות (7 x 10 5 תאים/טוב). תקופת דגירה של 6-אייץ ' (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2) ולהמשיך לאחר מכן לרעב סרום (דגירה ON).
- מסיר את המדיה ועל לטיפול (או לא להתייחס) תא אנדותל תרבויות עם התרופה עניין מדולל בתקשורת לא שלם (דגירה 30 דקות, 37 ° C); להוסיף 1.4 mL/במשך 6-ובכן צלחת (30 דקות, 37 ° C).
- אתגר בתאים על-ידי הוספת 100 ננוגרם למ"ל LPS התקשורת incubated (כפי שמתואר בשלב 2.3), דגירה עבור 6-אייץ לעצור את התגובה על ידי שטיפת פעמיים עם PBS קר ולשמור צלחות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה.
- החילוץ-RNA
- להפשיר את הצלחות ולהוסיף 1 מאגר החילוץ mL/טוב RNA (38% פנול ו- 0.8 מ' guanidinium isothiocyanate; ראה טבלה של חומרים). להשאיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) תחת homogenate עצבנות ולאסוף צינורות 1.5 mL-
- להוסיף 200 µL כלורופורם, להתסיס בעדינות במשך 15 ס' Incubate למשך 3 דקות ב RT ו צנטריפוגה (11,600 x g, 15 דקות, 4 ° C).
- להעביר פאזה מימית עוד צינור 1.5 מ. לזרז RNA על-ידי הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 500 ואחריו דגירה 10 דקות ב RT ולאחר מכן צנטריפוגה (11,600 x g, 4 ° C).
- למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה עם 75% אתנול על-ידי מערבולת עצבנות ולאחר מכן צנטריפוגה (7,500 x g, 4 ° C).
- מילה נהדרת בגדר ו solubilize RNA 25 µL טהור H 2 O על ידי המקננת 10 דקות-55 מעלות צלזיוס RNA שמור ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה.
- כמות והטוהר של RNA
- לכמת את ריכוז ה-RNA על ידי מדידת ספיגת את המדגם-260 ננומטר בספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים).
- מידה ב- 230 nm ו 280 ננומטר כדי לקבוע את הטוהר רנ א.
הערה: היחס ב 260/280 מציינת זיהום חלבון או פנול. יחס קרוב 2 מקובל. היחס במלון 260/230 מציין EDTA, פחמימות או פנול מזהמים. ערכים בין 2.0-2.2 מקובלים.
- RNA בדיקת תקינות
- לרוץ 2 µg של RNA הכולל ו- RNA סולם % 1.5 denaturing agarose ג'ל; להמחיש על מערכת תיעוד ג'ל (ראה טבלה של חומרים).
הערה: יחס של 2:1 ברורה וחדה 28S ו- 18S rRNA להקות מציינת של RNA ללא פגע. חלקית השפיל RNA פותר כמו מראה מרוח.
- לרוץ 2 µg של RNA הכולל ו- RNA סולם % 1.5 denaturing agarose ג'ל; להמחיש על מערכת תיעוד ג'ל (ראה טבלה של חומרים).
- RT-qPCR
- לסנתז DNA משלימים (cDNA) מ- RNA נטושים יחיד בעקבות התקן פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) 11-
- הערך ביטוי גנים מאת RT-qPCR
- להכין לתערובת תגובה עבור כל דגימה: לערבב 2 µL cDNA, 7 µL מתחם פלורסנט, 300 פריימר לפנים nM ו 300 ננומטר הפוכה פריימר (טבלה 1) ב הנפח הסופי של 13 µL, ולהוסיף הצלחת תגובה 96-ובכן (ראה טבלה של חומרים).
- לאטום את הצלחת עם מכסה אופטי דבק, צנטריפוגה (x 300 גרם, 1 דקות) ולהפעיל את התגובה על מערכת ה-PCR בזמן אמת (התחלה לוהטת 95 ° C עבור 20 s ואחריו 40 מחזורי: 95 ° C עבור 3 s ו- 60 ° C ל 30 s) (ראה טבלה של חומרים).
- לנתח את התוצאות על ידי כימות יחסית באמצעות השיטה השוואתי 2 -ΔΔCt עם חדרנית גנים גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) או phosphoprotein חומצי ribosomal P0 (36B4) 12 .
4. להעריך אנדותל להפעלה באמצעות Cytometry זרימה
- לטיפול תאי MLEC-04 בעקבות התנאים המתוארים בסעיף 2, להעריך את השינויים את החלבונים פני אנדותל מאת cytometry זרימה.
- ניתוק התאים לאחר 6 שעות של LPS גירוי עם השיטה טריפסין-EDTA המתוארים שלב 1.2.3, לשטוף עם התקשורת לא הושלמה ב-4 מעלות צלזיוס
- לספור את התאים בשיטה קאמרית נויבאואר, למקם תאים 10x10 4 u-96-ובכן לוחות. צנטריפוגה (x 300 גרם, 5 דקות), supernatant על ידי סיבוב 180 מעלות ביטול הצמדה של כף היד מלמעלה למטה, התאוששות מהירה למיקום המקורי.
- להוסיף 50 µL של הנוגדן שנבחר מדולל בתקשורת לא שלמה (10 µg/mL, הריכוז הסופי) לתאים, דגירה (30 דקות, 4 ° C).
- לרחוץ את התאים w פעמייםith התקשורת לא שלם בעקבות ההליך המתואר צעד 4.3, דגירה עם µL 50-µg/mL 10 של הנוגדן המשני המתאים בשילוב FITC או דומה המספר המשלים (30 דקות, 4 ° C בחלל האפל).
- לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת לא שלם ולאחריה שטיפה PBS. לשחזר את התאים עם PBS 300 µL באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל ומניחים cytometry צינורות.
- להעריך את הדגימות במערכת cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים). התאם את האוכלוסייה התא על ידי העבר לצד פיזור פרמטרים. שער האוכלוסייה של ריבית. להתאים את השערים בהתבסס על הפקד שלילי מתאי מודגרות עם שליטה isotype. לנתח את התוצאות כאחוז של תאים חיוביים או מתכוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית 8.
5. להעריך אנדותל להפעלה באמצעות ווסטרן כתם
- זרע של אנדותל-זרימה תת ב 6-ובכן תרבות צלחות (7 x 10 5 תאים/טוב), להתייחס עם LPS כמתואר בסעיף 2. לנתח את הביטוי דלקתי חלבון באמצעות פרוטוקול תספיג הבאה.
- מפסיק את הגירוי LPS בנקודות זמן שונות התירי היבטים שונים של התגובה אנדותל:
- לברר את הפרופיל דלקתיות חלבונים אחרי 6 שעות של גירוי LPS.
- לקבוע את התא איתות כל 15 דקות תקופת 60 דקות.
- בשני המקרים, התגובה כביסה פעמיים עם PBS קר ולקבל לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה. מאגר
- תאים Lyse והפקת חלבונים
- להוסיף 200 µL פירוק כדי מכל קידוח (1% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, 150 מ מ נתרן כלורי, רב-תכליתי נתרן 30 מ מ, 50 מ מ נתרן פלואוריד, מ מ 2.1 orthovanadate נתרן ב pH 7.6, בתוספת מעכב פרוטאז קוקטייל) (ראה טבלה של חומרים).
- דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, לגרד וולס עם טיפ פיפטה ולאסוף את homogenate צינורות 1.5 mL-
- Centrifuge הצינורות ב 11,600 x g ב-4 מעלות צלזיוס
- לאחסן את תגובת שיקוע צינורות mL 1.5 נקי ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.
- למדוד ריכוז החלבון על ידי וזמינותו חומצה bicinchoninic בעקבות התקן פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) 13.
- לפתור את µg 30 lysate עבור כל דגימה הכוללת חלבון בטכניקה סטנדרטית של 0.1% נתרן גופרתי dodecyl, 10% לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) 14. הפעל דגימות עם 10 מ מ β-mercaptoethanol (הפחתת תנאי) או בלי (תנאי שאינו בהפחתת) בהתאם הנוגדן המשמשים לזיהוי החלבון עניין.
- להעביר את החלבונים מופרדים הג'ל לזיהוי polyvinylidene difluoride (PVDF) העברת קרום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.45, באמצעות הליך סטנדרטי.
- לאחר העברה, לשטוף את הקרום פעמיים עם PBS, 0.1% ציטוזאן (PBS-T), לחסום אתרי קישור לא ספציפי על-ידי הוספת 20 מ ל 2% BSA מדולל ב- PBS-T phosphoproteins שאותרו או 5% שומן חלב יבש ב- PBS-T הכולל חלבונים, תחת עצבנות (90 דקות, RT).
- לדלל הנוגדן שנבחרו ב- 10 מ"ל המאגר חסימה המתאים-הריכוז המומלץ, דגירה הקרום מתחת עצבנות (ON, 4 ° C). לחלופין, למקם את הקרום שקיות אטומות ומשמש 5 מ של הנוגדן מדולל.
- ביום למחרת, לשטוף את הקרום שלוש פעמים (עודף PBS-T, 15 דקות, RT).
- Incubate הקרום מתחת עצבנות (30 דקות, RT) עם 10 מ"ל של הנוגדן משני כתב מאוגדים חזרת peroxidase (HRP) מדולל ב 1:10,000 במאגר חסימה המתאים.
- לרחוץ את הקרום שלוש פעמים תחת עצבנות (עודף PBS-T, 15 דקות, RT).
- דגירה הקרום עבור 1 דקות עם 0.1 מ"ל/cm 2 של chemiluminescence המצע משופרת peroxidase (ECL). מקם את הקרום סחוט בין שתי יריעות פלסטיק שקוף ולאחר להכניס אותו לתוך מערכת זיהוי chemiluminescence הכולל מצלמה Charged-Coupled התקן (CCD).
- להשתמש במצלמה של מצלמות כדי לזהות את האות והתוכנה שלה לתמונות רשומה עם התוכנית המצטברת (תמונות להציג אות שהצטברו אצל כל חשיפה של 30 לתקופה סה כ 15 דקות).
- לכמת את עוצמת הלהקה מאת densitometry באמצעות שימוש בתוכנה ImageJ הפרוטוקול המתואר במדריך למשתמש 15.
- פתח את הדגימה בתוכנה ImageJ ובחר את הלהקה עניין בכלי בחירה מלבנית.
- בחר כמו ליין הראשון, הקש על העלילה נתיבים כדי להשיג את החלקות פרופיל.
- מפריד את האזור של הפסגות עם הבחירה בקו ישר.
- למדוד את הגודל של כל הלהקה על ידי לחיצה על החלק הפנימי של כל שיא.
- מייצגים את התוצאות לגבי טעינת פקד חלבון (β-אקטין, טובולין, וכו ').
6. הערכת גורם אנדותל שוחרר מן ליקוציט להפעלה באמצעות מבחני אדהזיה
- להשיג את המדיה ממוזגים אנדותל.
- לטיפול תאי MLEC-04 כמצוין בסעיף 2, לאסוף את התרבות supernatant לאחר גירוי 24 שעות עם LPS (100 ng/mL).
- לאסוף את המדיה ממוזגים תאים שטופלו MLEC-04, צנטריפוגה (600 x g). לשמור את תגובת שיקוע ב- 0.5 מ ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש.
- Assay אדהזיה ליקוציט
- מעיל צלחות 96-ובכן עם µL 50/טוב של חלבונים מטריצה חוץ-תאית שנבחר מדולל ב- PBS (למעט קולגן, אשר הוא מדולל ב 0.1 M חומצה אצטית): fibronectin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL), קולגן מסוג I (10-40 µg/mL). על חופשה ב 4 º C
- למחוק את המדיה מצופה, לחסום אתרי קישור לא ספציפי על וולס עם 150 µL הציבורית, 1% BSA להשבית-חום (1 דקות, 100 ° C) במשך 90 דקות ב- RT.
- לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS ולהוסיף µL של שנאספו בעבר אנדותל ממוזגים 100 מדיה (סעיף 6.1) הבארות.
הערה: לוחות מוכנים עבור ביצוע וזמינותו אדהזיה. - תרבות העכבר מונוציט-macrophage התא בשורה J774 חממה ביולוגי (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2) עם רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
הערה: התאים J774 גדלים ההשעיה. - לאסוף את התאים J774 לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה (x 300 גרם, 5 דקות). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר הסלולר עם 10 מ"ל סרום ללא מדיה. לספור את התאים בתוך תא Neubauer. Centrifuge התאים (x 300 גרם, 5 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים בתקשורת ללא סרום-15 x 10 4 J774 תאים לכל מדיה µL 50-
- הוסף 15 x 10 תאים 4 J774 לכל אחד טוב בתקשורת ללא סרום µL 50, תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C ואחריו 1 h ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תא 2 CO.
- לרחוץ הבארות פעמיים, בעדינות על-ידי הוספת PBS חמים; צנטריפוגה (300 x גרם, 5 דקות) ולמחוק את תגובת שיקוע על ידי הצמד 180° של כף היד מן העליון התחתון, התאוששות מהירה למיקום המקורי. לתקן את התא מצורףs על-ידי הוספת µL 100/טוב של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS דגירה (10 דקות, RT).
- למחוק את המדיה בעדינות, permeabilize בעדינות את התאים עם מתנול 2% ב- PBS למשך 2 דקות ב RT. להשליך המדיה ואת כתם בתאים על-ידי הוספת µL 50/טוב של 0.5% קריסטל ויולט ב 20% מתנול עבור 90 s-RT.
- לשטוף את הצלחת עם שפע מים זורמים, למחוק את הנוזל העודף, אנו נותנים מילה נהדרת... הדו ח המצורף התאים על ידי מצלמה דיגיטלית מצמידים מיקרוסקופ אור-
- לדלל את התא צביעת על-ידי הוספת µL 100/טוב של 0.1 M סודיום ציטרט, 50% אתנול. למדוד ספיגת 545 ננומטר, מייצגים תוצאות כמו יחידות שרירותי של ספיגת או אחוז הדבקה על ידי שוקל 100% כמו תא אדהזיה הגיעו עד בארות מצופה עם ריכוז גבוה יותר של ליגנד
7. מבחן אנדותל להפעלה באמצעות ליקוציט-אנדותל אדהזיה שיתוף Assay
- לטיפול תאי MLEC-04 על 96-ובכן לוחות כמתואר בסעיף 2, דגירה עם LPS (6 שעות, 37 ° C).
- Fluorescently תווית J774 תאים עם אסתר Succinimidyl Carboxyfluorescein (CSFE).
- לשטוף J774 תאים ב- PBS בעקבות ההליך ב 6.2.5. ספירת התאים על ידי נויבאואר הקאמרית שיטה ו resuspend-עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל ב- PBS, BSA 0.1%-
- דגירה את התאים עם CFSE (5 מיקרומטר, הריכוז הסופי) עבור 20 דקות 37 ° C. הוסף 5 מ ל מדיה לא שלם, דגירה (5 דקות, 4 ° C).
- לשטוף פעם עם מדיה לא שלם, כמוסבר 6.2.5., resuspend ב- 15 x 10 4 תאים/100 µL והמשך שיתוף אדהזיה וזמינותו.
- לאחר הטיפול אנדותל, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם מדיה לא שלם. הוסף תאים CFSE-J774 (15 x 10 4 תאים/100 µL) לכל אנדותל מצופים היטב. דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות ב 4 ° C ולאחריו 60 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף בעדינות, כפי שמתואר 6.2.7 הבארות. באמצעות PBS ומחוממת, ולדווח את הידבקות J774 על שכבת אנדותל משתי השיטות הבאות:
- Lyse התאים 0.1 M טריס-HCl pH 8.8, 1% מרחביות (100 µL טוב) ולמדוד אות CFSE-J774 על ידי fluorometry (עירור/פליטה = nm nm/517 492). מייצגים את התוצאות בתור יחידות שרירותי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית או אחוז אדהזיה ביחס בקרה חיובית (אות מתאי סה כ הוסיף כדי מכל קידוח).
- לתקן את התאים 4% PFA ודוח את הקובץ המצורף של תאי CFSE-J774 אנדותל דמיין תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור/פליטה = nm nm/517 492).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של LPS-induced תא אנדותל הפעלת מאת RT-qPCR
התאים MLEC-04 סרום מורעבים היו מגורה על ידי 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור 6-אייץ ', בביטוי הגן אנדותל הוערכה באמצעות RT-qPCR על-ידי השוואת הביטוי של הפעלת סמנים למצב מנוחה. כפי שמוצג באיור 1A, התאים MLEC-04 מודגרות-LPS המושרה הביטוי mRNA של מולקולות אדהזיה שנבחר מעורב ליקוציט הגיוס במהלך התגובה דלקתיות (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1). PECAM-1 שימש בקרה פנימית כי הביטוי יבוצעו בהם שינויים תחת טיפול ניסיוני. איור 1B מייצג את ההפעלה אנדותל מאת LPS נמדד על-ידי הביטוי mRNA מוגבר של ציטוקינים Ccl5, Cxcl10 ו- Cxcl1. מולקולות אלה מעורבים ההפעלה של מחזורי לויקוציטים, כולל שלהם סחר שכבת אנדותל, extravasation מאוחר יותר לאתר דלקת. ציטוקינים, IL4, שימש פקד פנימי תחת טיפול ניסיוני.
איור 1: הערכה של LPS-induced אנדותל תאים הפעלה מאת RT-qPCR. את תאים MLEC-04 היו מגורה עם 100 ננוגרם למ"ל של LPS במשך 6 שעות (ברים אדומה) לעומת מצב שליטה (סרגל כחול) ולאחר בביטוי הגן נותחה על ידי RT-qPCR. הגרפים מראים קיפול אינדוקציה של mRNA לגבי התנאי שליטה של מולקולות אדהזיה אנדותל שנבחר (A) וציטוקינים (B) מעורב ליקוציט הפעלה והגיוס במהלך התגובה דלקתיות. PECAM-1 ו- IL4 שימשו כפקדי שלילי בתנאים האלה. תוצאות באים לידי ביטוי אומר ± SEM של ניסוי אחד, מתוך שלוש שבוצעה, ביצעו דולר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
חלבון הביטוי של מולקולות אדהזיה בתאי אנדותל שטופלו LPS
גירוי דלקתי בוצעה על תאים MLEC-04 כמפורט בסעיף הקודם, הביטוי חלבון נחקר על ידי שיטת תספיג חלבון. מנוחתו אנדותל מציג רמות כמעט בלתי מורגשת של מולקולות אדהזיה VCAM-1 ו- ICAM-1 (כאנטי-). בנוכחות LPS (+), פנוטיפ מופעל אנדותל מתבטא על ידי קולטנים upregulation של הביטוי סמני המתואר (איור 2). הממברנות היו מנורמל על ידי זיהוי β-אקטין, אשר שימש את הפקד טעינה כדי לחשב את צפיפויות הלהקה יחסית לאחר ניתוח densitometry.
איור 2: חלבון הביטוי של מולקולות אדהזיה בתאי אנדותל שטופלו LPS. נציג תספיג בהערכת VCAM-1 ו- ICAM-1 חלבון ביטוי המנוחה (-) לעומת שטופלו LPS (+) MLEC-04 תאים. Β-אקטין שימש פקד הטעינה. המשקל המולקולרי של כל חלבון הוא בסוגריים מרובעים. הערכים מייצגים כימות למחצה של צפיפויות הלהקה היחסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סמני פני אנדותל בדלקת בתיווך LPS
הפעלת אנדותל בהקשר דלקתיות היה מוערך על ידי cytometry זרימה לאחר 6 שעות-גירוי על ידי LPS (100 ng/mL). במצב זה, הגילוי של מולקולות הקשורות דבק המעורבים באינטראקציה ליקוציט הוערך. החלונית השמאלית של איור 3A מייצג ביטוי הבזליים סמני שצוין בתאים MLEC-04 המנוחה (היסטוגרמה מוצק אדום) לעומת הפקד שלילי isotype (היסטוגרמה מנוקד-שחור). הלוח נכון של איור 3A מראה את התוצאות נגזר MLEC מגורה-04. הטיפול LPS באופן משמעותי upregulated הביטוי של מולקולות אדהזיה E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1 קרום הפלזמה (היסטוגרמה מוצק אדום) בהשוואה למצב מנוחה (היסטוגרמה מנוקד-שחור). כפי שמוצג cytometry פרופילי והגדיר לפני, הביטוי של PECAM-1 הוא ללא שינוי במצב ניסיוני זה. איור 3B מציגה את הערכים כימות המשמשים גם הפניות להערכת מגשרים אפשריים של התגובה דלקתיות אנדותל. %: אחוז תאים חיוביים; MFI: כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
איור 3: סמני פני אנדותל בדלקת בתיווך LPS. Flow cytometry פרופילים של מולקולות אדהזיה תא על נח ותאים מגורה-LPS MLEC-04. החלונית השמאלית מציגה ביטוי חלבונים בתאי resting (אנטיגן אדום עם התווית היסטוגרמה) ביחס הפקד isotype מתאימים (Ctrl-שחור היסטוגרמה). החלונית ' נכון ' משווה את הביטוי תא-פני חלבון שליטה (שחור היסטוגרמות) בתאי אנדותל שטופלו LPS (היסטוגרמה אדומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איתות המסלולים מופעלות על ידי גירוי LPS בתאי האנדותל
המנגנונים המעורבים הפעלת תא כלי הדם בעת דלקת נחקרות על-ידי הערכת מפתח מולקולות איתות. התאים MLEC-04 מגורה עם LPS בתקופות שונות עובדו לחילוץ חלבון, מידת ההפעלה נותחה על ידי שיטת תספיג חלבון. איור 4 מראה מדכא. שבולם IκB-α של NF-κB איתות זה phosphorylated לאחר 15 דקות LPS-דגירה, חוזר אל רמות הבסיס לאחר 1 שעה. מצד שני, התקליטים מפעילה טיפשה 1/2 איתות לאחר 15 דקות, אשר מבססת מסלול חיוני של המעורבים הפעלה אנדותל במהלך התגובה דלקתיות. הממברנות היו מנורמל β-אקטין או טיפשה זיהוי 1/2, אשר שימשו את הפקדים טעינה כדי לחשב את צפיפויות הלהקה יחסית לאחר ניתוח densitometry.
איור 4: מסלולי המופעלות על-ידי LPS על תאי אנדותל איתות. התאים MLEC-04 מגורה עם 100 ננוגרם למ"ל ובידקו את התנאים של הפעמים המצוין הדמות, המסלולים איתות טיפשה 1/2 (P-טיפשה 1/2) ו- NF-kB (דרך P-IκBα) הוערכו על ידי תספיג חלבון. טיפשה 1/2 סה כ וβ-אקטין שימשו טעינת הפקדים כל תנאי. המשקל המולקולרי של כל חלבון הוא בסוגריים מרובעים. הערכים מייצגים כימות למחצה של צפיפויות הלהקה היחסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של. הדמות הזאת
ויסות ההתנהגות ליקוציט מאת אנדותל מגורה עם LPS
הרלוונטיות הביולוגי של התקנון של הפעלת אנדותל על ההתקדמות של תגובה דלקתית נקבעת לפי מבחני פונקציונליות של ביצועים ליקוציט. כמתואר בסעיף פרוטוקול, שתי גישות שונות נכללות לבדיקת תפקוד ליקוציט מוסדר על ידי תאי אנדותל. למרות מבחני לחקור היבטים שונים של התגובה דלקתיות (RT-qPCR עבור ציטוקינים אנדותל משוחרר על ידי הפעלת ליקוציט תספיג עבור מולקולות אדהזיה אנדותל באינטראקציה ליקוציט), נמצאים הנתונים שהושגו שניהם להעריך פרטים מיקרוסקופיים ליקוציט המצורף. הפעלת ליקוציט על ידי גורמים מסיסים אנדותל חיוני לפיתוח מענה יעיל דלקתיות, כמו מיטיבה תא הדבקה על מצעים מספר. איור 5A מראה הדבקה תא J774 על 0.5 µg/mL fibronectin מצופה בארות בתגובה שנאספו בעבר מדיה ממוזגים של הפקד או LPS התייחסו תאי אנדותל. שדה בהיר תמונות ומדידות spectrophotometric להצביע על הגורמים שפורסמו בתקשורת ממוזגים של אנדותל שטופלו LPS מספיקים לגרום ביעילות J774 ההפעלה, כפי שהראה את תנאי הגיוס מהתופעה תא fibronectin. איור 5B מייצג של assay אדהזיה שיתוף כדי להעריך את היכולת של שכבת כלי הדם כדי לתמוך ליקוציט אדהזיה המשרד על-ידי הביטוי הרומן של מולקולות אדהזיה אנדותל. בקצרה, התרבויות subconfluent סרום רעב של התאים MLEC-04 מגורה עם LPS עבור 6-אייץ ' היו נשטפים מספר פעמים, מודגרות במשותף עם הקו ליקוציט ש-j774 בעבר עם החללית פלורסנט, CFSE תוויות. כפי שמוצג micrographs ומדידות spectrofluorometric, גירוי LPS-וסקולרית מיטיבה את האינטראקציה של תאים CFSE-J774 טפט אנדותל.
איור 5: אינטראקציה ליקוציט כדי מודגרות-LPS טפט אנדותל על ידי שיתוף אדהזיה assay. (א) מיקרוסקופ אור תמונות מראה קריסטל ויולט מכתים של התאים J774 מחובר 0.5 בארות fibronectin מצופה µg/mL בתגובה מדיה ממוזגים של הפקד או שטופלו LPS תאי אנדותל. סולם בר, 50 מיקרומטר. הניתוח spectrophotometric המוצג להלן מציינת את המדידה ספיגת לבטא יחידות שרירותי (א"א) ± SEM עבור ניסוי נציג לרוץ שהפקידים. קרינה פלואורסצנטית (B) micrographs הצג מחובר CFSE-J774 תאים הפקד או תאים שטופלו LPS MLEC-04 מוערכת על-ידי שיתוף אדהזיה וזמינותו. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הניתוח fluorometric המוצג להלן מציינת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לבטא יחידות שרירותי (א"א) ± SEM עבור ניסוי נציג לרוץ שהפקידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| היעד | מזהה RefSeq NCBI | להעביר את רצף (5´-3´) | רצף הפוכה (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | חברתנו מעשה גת GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC המרכז לאמנות עכשווית חטיבתי CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | אגא TGC AGC אגא TCC GCA T | GTT CTT GCC החתול חטיבתי CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | אילנה לפנות לסוכנות ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT איסור פרסום גה ת א |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG חטיבתי CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG טק AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | של AGT GCA GCA אגא CTC TGG טק CTA | של AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC אתא CTG CTA ACC G | GGG החתול CAC TTC טק חטיבתי GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC גת GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC חטיבתי |
| בחירת שמלות E | NM_011345.2 | GCA TGT לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה ATG ACG אגא GA | GTC AGG חברתנו TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC המרכז לאמנות עכשווית GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA המרכז לאמנות עכשווית TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
טבלה 1: רשימת תחל השתמשו במחקר זה.
| נח | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Ctrl | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| בחירת שמלות E | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
בטבלה 2: סמני פני אנדותל בדלקת בתיווך LPS. כימות של התא מולקולות אדהזיה הבעת התאים MLEC-04 מנוחה ו LPS מגורה על ידי ניתוח cytometry זרימה. הערכים נציג עבור כל סמן התואם אחוז תאים חיוביים (%) ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) בתאי האנדותל מנוחתו של גירוי-LPS. PECAM-1 שימש פקד שלילי בתנאים אלה ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול אנדותל זה מתאר טכנולוגיה stepwise היוצרת את היסודות לחקר מנגנוני הרומן מעורב בוויסות התגובה דלקתיות. גישות אלה מבוססים על המחקר של הפעילות אנדותל מגורה על ידי LPS ולהעריך את השלבים הקריטיים מעורב ליקוציט הגיוס במהלך לתגובה דלקתית, במיוחד: שחרור ציטוקינים אנדותל, אדהזיה אנדותל מולקולות אדהזיה הביטוי ולבנות על שכבת כלי הדם. ברגע הפרמטרים אנדותל מבוססים, המערכת באפשרותך לחפש תרכובות הרומן מעורב ברגולציה של הפונקציה אנדותל וכתוצאה מכך התקדמות דלקתיות. הסמים רגולטורית עלולה להיות עניין לשוק התרופות. התחזית העיקריים של הפרוטוקול סדרתית היא ליצור בסיס עבור הרחבת מחקרים אלה בפני סוגים אנדותל ותנאים מופחתים על-ידי כוונון. לפרמטרים פעילות כלי הדם היחסי שלהם.
סמים שנבחרו על ידי הקרנה זו תהווה מועמדים מעניינים עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות מקוריות נגד מחלות דלקתיות. מצד אחד, תרכובות בעד התגובה אנדותל ולתרום ליקוציט הגיוס יהיה מבטיח כשל חיסוני התנאים16,17. מצד שני, מעכבי אנדותל תהווה טיפולים מצוינים עבור מחלות דלקתיות כרוניות10.
אפיון ציטוקינים לידי אנדותל מגורה מנבאת את האבולוציה של הדלקת. ציטוקינים הם חלבונים קטנים שפרסם את שכבת אנדותל בהקשר דלקתיות ולווסת חריפה ליקוציט התנהגות. חברי הפרו דלקתיים, כמו Ccl5, Cxcl10, Cxcl1, לאגד קולטנים ספציפיים שלהם על פני ליקוציט ו אות לזירוז ליקוציט אינטראקציה עם מולקולות אדהזיה ביטוי לאחרונה על שכבת כלי הדם (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1), ו ליקוציט ההעברה ל-10,8,18אזור פתולוגי (איור 1, איור 2, איור 3). שאר חברי אותה משפחה של חלבונים מעורבים בהחלטה דלקת וכתוצאה מכך רקמות תיקון. הביטוי של ציטוקינים אנטי דלקתיות אלה רלוונטי עבור מחלות דלקתיות כרוניות כי הם לעכב ליקוציט גיוס טובה חסינות סיווג10,19,20. כדי לבחור אפשרי הרגולטורים דלקתיות אנדותל, מומלץ לבצע assay הביטוי הזה ציטוקין ולהעריך את הביטוי מולקולות אדהזיה אנדותל בנוכחות תרכובות של עניין. למעשה, ניתוח הרמות בין אנטי דלקתיות לעומת ציטוקינים פרו-דלקתיים יכול לשמש ערך ניבוי על התקדמות המחלה, מגלה את התרופה של עניין טיפולית21.
את התקליטים איגוד שלה מפעילים קולטן משטח תאים מורכבים cascades איתות תאיים בראשות מפה kinases טיפשה 1/2, JNK, p38 ו signalosome את NF-kB לזירוז התוכנית תעתיק דלקתיות. רבים מן המסלולים הללו נפוצים לגירויים דלקתיות אחרות כגון TNF-α או IL-110,22. הפעלת אנדותל נקבעת על ידי גילוי הצורה phosphorylated של חברי קינאז מפה כמתואר עבור טיפשה 1/2 באיור4. יתר על כן, הפעלת אנדותל מאת LPS מעוררת פעילות אנזימטי של IKKβ מורכבות, אשר phosphorylates ופוגם המדכא NF-kB IκB מורכבים, ובכך מאפשר NF-kB אפקטור חברי הגרעין רוברטסונית לבצע את הכתב פעילות גנים ברמת השעתוק (איור 4). אפיון המנגנון שבאמצעותו המתחם סמים משפיע על התגובה דלקתיות אנדותל הוא מאוד שימושי, לא רק לתאר את התרופה, אבל גם באופן בעיצוב הרומן דלקתיות טיפולים בשילוב עם טיפולים קונבנציונליים תואם 23.
תרכובות לבחירתכם אנדותל דלקתיות מבחני המיון, בטח עוד יותר להילמד לאשר שלהם רלוונטיות פונקציונלי בשלבים קריטיים של מבחני התנהגות ליקוציט, כפי בסופו של דבר, התאים אחראים על הפרעות דלקתיות. אלה מבחני לנתח את הפעילות ליקוציט שתי הגדרות שונות ניסיוני. הראשון הוא בהערכת את התפקיד של ציטוקינים אנדותל שפורסמו על ליקוציט ההפעלה על ידי מבחני אדהזיה בתיווך אינטגרין. אינטגרינים ליקוציט מופעלים על ידי ציטוקינים שפורסמו אנדותל. לכן, היכולת אינטגרין ליגנדים דבק ליקוציט הוא מידה נציג ליקוציט פונקציה8,10,18. השני הוא לומד את התפקיד של מולקולות אדהזיה אנדותל ביטוי לאחרונה האינטראקציה ליקוציט על שכבת כלי הדם על ידי מבחני אדהזיה משותף. מולקולות אדהזיה אנדותל בא לידי ביטוי בהקשר דלקתיות חיוני לגיוס ליקוציט הרקמה שמסביב. לפיכך, ניתוח של לויקוציטים אינטראקציה עם טפט אנדותל שטופלו של תאים, מהווה ערך prognostic עבור התקדמות דלקתיות (איור 5)8,10,18. התוצאות נגזר מן הגישות האלה הייתי מציע כי תרכובות שנבחרו הם מועמדים רציניים בעיצוב אסטרטגיות לעתיד לטיפול בהפרעות דלקתיות
ההצעה ניסיוני יוגדרו כאן הוא כלי רב-תכליתי עבור יישומים עתידיים בשל היכולת לנחש את מערכות שונות הסלולר או מופחתים. ניתן לשנות את ההליך כדי אנדותל מקורות שונים או מינים, כדי לבדוק את הפונקציונליות שלה על מספר תאי המערכת החיסונית, כמו גם סוכנים דלקתיים שונים כגון LPS, TNF-α, חיידקים, וירוסים, וכו '. כפי שמתואר בטקסט, בטח חוקרים קודם לאפיין את ההפעלה אנדותל במערכת שלהם מאוחר יותר לאפיין את התפקיד של מתחם שנבחרו על התגובה דלקתיות. מגבלות של הפרוטוקול הם הבחירה של פקד שלילי המתאים והגדרת בדיוק הפרמטרים פעילות אנדותל להבחין המנוחה מהמדינה מגורה. במקרה זה בתנאים המתוארים במאמר זה לא יפעלו עבור מערכת אחרת, חוקרים עליך לפתור את הפרמטרים ניסיוני על ידי ביצוע מבחני תלויי-זמן נוסף באמצעות שיפוע ריכוז של הגירוי דלקתיות להגדרת חלון מופחתים המאפשר לבדיקת תרופות חדשות על ויסות התגובה דלקתיות.
לסיכום, פרוטוקול דלקתיות אנדותל זו מומלצת עבור החיפוש של nאיכס הרגולטורים אנדותל מיקוד את התגובה דלקתית. ביצוע הליך זה יספק את הרומן, תרכובות מעניינות שניתן ליישם כדי ללמוד שלה יישומים עתידיים, ועיצוב טיפולים חדשניים וסקולרית ספציפי נגד מחלות דלקתיות הקשורות, פוטנציאל שיכול להיות של ריבית בשוק התרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad (MINECO) ודה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (מענק מספר IERPY 1149/16 א. ל; MPY 1410/09 ל S. Hortelano); על ידי MINECO דרך en Fondo Investigación דה סאלוד (FIS) (מעניקה מספרים PI11.0036 ו- PI14.0055 S. Hortelano). ס Herranz נתמכה על-ידי IERPY 1149/16 מ ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
