Summary
혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.
Abstract
내 피 층은 여러 가지 기능을 제어 하 여 신체의 항상성 유지 하기 위한 필수적입니다. 내 피 층에 의해 염증 반응의 규칙은 효율적으로 유해한 입력에 대 한 싸움과 손상 된 지역의 복구에 도움이 중요 합니다. 내 피 세포는 선 동적인 환경, 그람 음성 세균 막, lipopolysaccharide (LPS)의 외부 구성 요소에 노출 되 면 그들은 Ccl5, Cxcl1 등 Cxcl10, 수용 성 프로 염증 성 cytokines를 표현 하 고 방 아 쇠는 순환 하는 백혈구의 활성화입니다. 또한, 내 피 표면에 접착 분자 전자 selectin VCAM-1, ICAM-1의 식 상호 작용 및 접착 내 피 레이어, 그리고 결국 염증된 조직 향해 넘쳐 흐름을 활성화 된 백혈구의 수 있습니다. 이 시나리오에서는 내 피 기능 해야 합니다 엄격 하 게 규제 되어야 백혈구 신규 모집에 과도 한 또는 결함이 활성화 염증 관련 질환으로 이어질 수 있기 때문에. 이후 많은 이러한 장애의 효과적인 치료를 하지 않아도, 혈관 층에 초점을 맞춘 새로운 전략을 조사 해야 합니다. 우리 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 기능을 수정 하는 검색에 유용한 종합적인 분석 제안 합니다. 우리를 포함 한 여러 가지 기술로 특정 식 대상 (예: cytokines, 발산, 및 접착 분자) 백혈구 신규 모집에 참여를 사용 하 여 내 피 활성화 분석: 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 ( RT-qPCR), 서쪽 오 점, cytometry 및 접착 분석 흐름. 이러한 접근 염증 맥락에서 내 피 기능을 결정 하 고 소설 내 피 염증 성 레 귤 레이 터 설계 새로운 치료 전략에 대 한 잠재적으로 가치 있는 특징을 심사 분석을 수행 하는 매우 유용 합니다.
Introduction
염증은 병원 체를 제거 하 고 손상 된 조직을 복구 하는 주요 목적으로 전염 성 요원에 대 한 유익한 생물학 응답 이다. 만성 감염 또는 면역 질환과 같은 특정 조건에서 염증이 해결 되지 않습니다. 대신, 백혈구, 조직 손상, 섬유 증, 기능, 및 전반적인 손실, 장애 및 환자 일부의 경우 죽음에 리드 장기간된 면역 반응의 결과로의 지속적인 침투와 탈 선 반응이입니다. 이러한 인간의 장애, 염증 성 질환으로 카탈로그 모든 백혈구 넘쳐 흐름1,2의 컨트롤에 대 한 혈관 포함.
내 피 세포 백혈구 밀매를 제어 하 여 염증 반응의 규칙에 있는 근본적인 역할을 재생 합니다. 내 피 레이어 LPS 등 염증 성 중재자에 노출은, 휴식 endothelium 활성화 하 고 프로 염증 성 cytokines (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, 등)와 접착 분자 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1)를 표현 하 고 그 은혜 순환 하는 백혈구는 감염의 사이트에 모집 다음 릴리스 cytokines에 의해 액 백혈구 중재 압 연 및 특 파 원 접착제 대응을 통해 내 피 레이어와 상호 작용: selectin, α4β1 integrin VCAM-1 및 αLβ2 integrin ICAM-1 PSGL-1. 마지막으로, 백혈구는 염증3의 초점으로 맥 관 구조에 걸쳐 마이그레이션합니다.
염증 반응 조절에 피 내 막의 필수적인 역할 유전자 LPS 수용 체, 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4), 내 피 세포에만 표현 하기 위해 수정 된 쥐에 증명 되었습니다. 이 내 피 TLR4 동물 LPS 중재 염증 박테리아 접종 후 발생 하는 감염을 감지 하 고 대응 하 고 따라서 감염 확인 및 강포한 유형 쥐4 으로 비슷한 수준에서 생존을 달성할 수 있었다 , 5.
피 규제 염증 반응 통로 대 한 그것은 되었습니다 가정 하는 백혈구 내 피 상호 작용의 어떤 단계에서 저해 트랜스 내 피 마이그레이션에 대 한 더 나은 예 지의 감소 귀 착될 것입니다. 염증 관련 된 질병입니다. 사실, 내 피 활성화 및 백혈구 endothelium 상호 작용을 대상으로 하는 여러 전략 염증 성 장애6,7에 대 한 치료로 면역 세포의 넘쳐 흐름을 방해 하기 위하여 설계 되었습니다.
이 보고서에서 우리는 생체 외에서 기술 완벽 하 게 특성화 염증 성 자극 LPS에 내 피 활동 및 백혈구 활성화 및 혈관 층에 접착의 역할의 철저 한 그룹을 설명 합니다. 이 원고에 사용 되는 내 피 세포 모델은 마우스 폐 내 피 세포 라인 (MLEC-04), Hortelano 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 8. 내 피 활성화9,10공부 하는 적절 한 시스템 문학에는 MLEC-04 셀 라인 검증 되었습니다. 연구 관심 분야에 따라, 이러한 접근 수 있습니다 쉽게 추정 될 어떤 내 피에 백혈구 시스템 및 염증 성 프로필 또는. 선택한 조건에 내 피 매개 변수를 정의한 후 시스템 혈관 활성화를 평가 하기 위해 제안 된 실험에 대 한 새로운 약물을 테스트할 수 있습니다. 이 염증 성 맥락에서 관심의 화합물과 테스트 내 피 세포는 세포의 제어 조건에 비교 될 수 있다 하 고 결과 차이 약물의 개발 및 염증의 진행에 전조 결과 알릴 수 있습니다. 결론, 우리는 염증 관련 질병에 대 한 소설 관련 혈관 치료의 디자인에 영향을 미칠 수 있는 내 피 세포에 새로운 약물 표적을 특성화 하기 위해 관련 시스템을 제안 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 내 피 세포 배양
- 코트 100 m m 조직 문화 접시 2.5 mL 젤라틴을 조직 배양 플레이트 취급
- 솔루션 (증류수에 압력가 마로 소독, 0.1% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분 동안,이 필요한 잘 형식으로 추정 될 수 있습니다. 발음 젤라틴 솔루션 및 조직 문화 후드에 건조를 접시에 두고.
- 조직 배양 조건
- (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터 안에 MLEC 04 세포 배양. Dulbecco의 완전 한 미디어에 셀 성장 ' s 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 100 단위/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 (P/S)와 보충.
- 표준 Neubauer 챔버 메서드에서 셀의 개수 고 2-11 x 10 4 셀/c m 2의 낮은 밀도에서 완전 한 미디어 10 mL에서에서 100 m m 젤라틴 처리 번호판 MLEC 04 셀을 추가 합니다. 합류를 도달할 때 셀 1: 3을 분할.
참고: 일반적으로이 2 ~ 3 일 후에 문화 발생. - Subculture 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 2 mL 트립 신-EDTA 솔루션 (0.25 %trypsin, 5 mM EDTA)를 추가 하 여 다음와 37에 3 분 동안 품 어 10 mL와 함께 접시를 세척 하 여 셀 ° c.
- 트립 신-EDTA 반응 중지 하 고 10 mL 전체 미디어를 추가 하 여 일시 중단 된 세포를 복구. 스핀 다운 셀 (300 x g, 5 분)는 상쾌한, 적절 하 게 완전 한 미디어와 subculture에 셀룰러 펠 릿 resuspend.
2. LPS 치료 및 중재자
- 접시 완전 한 미디어 다음 잘 형식으로 하위 합류 MLEC-04 셀: 셀/잘에 6-잘 접시와 2.5 10 5 셀/96 잘 접시에 잘 x 7 x 10 5.
- 셀 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에서 6 h에 대 한 문화를 품 어. 셀 불완전 한 미디어 (DMEM F12, P/S)에 전환 하 고 동기화 하 고 세포의 활동을 줄일 (에) 하룻밤 두고.
- 미디어를 제거 하 고 (또는 없이) 내 피 세포를 배양 하 여 새로운 약물 화합물을 테스트 마약 문제 (예: DT 10) 불완전 한 미디어 (30 분, 37 ° C)에 희석; 추가 1.4 mL/6 잘 플레이트 또는 0.14 잘 mL/잘 96 잘 접시).
- 각 분석 결과에 지정 된 시간 동안 LPS 인큐베이션 미디어 (100 ng/mL, 최종 농도)를 추가 하 여 셀을 도전 한다. PBS를 사용 하 여 컨트롤.
3. 실시간 정량 Pcr에 의해 활성화 Endothelium에 Transcriptional 프로필의 평가
- 6 잘 문화에서 하위 합류에 시드 MLEC-04 셀 접시 (7 x 10 5 셀/잘). 6 h (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에 대 한 품 어 고 이후에 혈 청 기아 (에 품 어).
- 미디어를 제거 하 고 치료 (또는) 내 피 세포의 약 문화 (30 분, 37 ° C를 품 어) 불완전 한 미디어에 희석; 1.4 mL을 추가/6 잘 플레이트 (30 분, 37 ° C)에 대 한 잘 취급 하지 않습니다.
- (2.3 단계에서 설명) 하는 대로 100 ng/mL LPS incubated 미디어를 추가 하 여 셀을 도전 6 h. 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지에 품 어 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 번호판을 유지.
- RNA 추출
- 판 해 동 고 1 mL/잘 RNA 추출 버퍼 (38% 페 놀 및 0.8 M guanidinium isothiocyanate; 자료의 표 참조)를 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 동요와 수집 homogenate에서 실 온 (RT)에서 30 분 두고.
- 200 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 부드럽게 RT 및 분리기 (11,600 g, 15 분, 4 ° C)에서 3 분 15 미 품에 대 한 선동.
- 다른 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송. 500 µ L 소 프로 파 놀 RT 한 다음 원심 분리 (11600 x g, 4 ° C)에서 10 분 부 화 뒤를 추가 하 여 RNA를 침전.
- 는 상쾌한 삭제 하 고 소용돌이 동요와 다음 원심 분리 (7500 x g, 4 ° C)에 의해 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.
- 펠 릿 건조 하 고 25 µ L 순수한 H 2 O 샘플 처리까지-80 ° C에 55 ° C. 유지 RNA에서 10 분 동안 배양 하 여 RNA를 solubilize.
- 수량 및 RNA의 순도
- 260에서 샘플의 흡 광도 측정 하 여 RNA 농도 계량 한 분 광 광도 계에 nm (재료의 표 참조).
- 측정 230 nm 및 280 nm RNA의 순도 확인.
참고: 260/280에 비율은 단백질 또는 페 놀 오염을 나타냅니다. 2 가까운 비율 허용 됩니다. 260/230에서 비율 EDTA, 탄수화물 또는 페 놀 오염 물질을 나타냅니다. 2.0-2.2 사이의 값을 사용할 수 있습니다.
- 검사 RNA 무결성
- 총 RNA는 RNA의 실행 2 µ g 1.5 %agarose 젤을 변성 시키기에 사다리, 젤 설명서 시스템에 시각화 (재료의 표 참조).
참고: 명확 하 고 날카로운 28S와 18S rRNA 밴드의 2:1 비율 그대로 RNA를 나타냅니다. 듯한 모양으로 RNA 해결을 부분적으로 저하.
- 총 RNA는 RNA의 실행 2 µ g 1.5 %agarose 젤을 변성 시키기에 사다리, 젤 설명서 시스템에 시각화 (재료의 표 참조).
- 실시간 정량
- 보완 DNA (cDNA) 표준에 따라 단일 좌초 RNA에서 합성 프로토콜 (참조 테이블의 재료) 11.
- 실시간 정량 평가 진 식
- 각 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 믹스 2 µ L cDNA, 7 µ L 형광 화합물, 300 nM 앞으로 뇌관, 및 300 nM 역방향 뇌관 (표 1)는 13 µ L의 최종 볼륨 96-잘 반응 접시에 추가 하 고 (재료의 표 참조).
- 광학 접착제 커버, 원심 분리기 (300 x g, 1 분)와 함께 접시를 봉인 하 고 실시간 PCR 시스템에 반응 실행 (뜨거운 시작 20 95 ° C s 40 주기 다음: 95 ° C 3 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s) (재료의 표 참조).
- 상대적인 정량 비교 방법 2를 사용 하 여 결과 분석 -ΔΔCt 내부 관리 유전자 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 또는 산 성 ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Cytometry 내 피 정품 인증 평가
- 2 절에서 설명한 조건에 따라 MLEC 04 셀 고 cytometry에 의해 내 피 표면 단백질의 변화를 평가.
- 분리 후 트립 신-EDTA 방법에 설명 된 LPS 자극의 6 h 셀 1.2.3, 단계 그리고 4 불완전 한 미디어와 함께 씻어 ° c.
- 는 Neubauer 챔버 메서드를 사용 하 여 셀 고 10 x 10 4의 세포 u-하단 96 잘 접시 합니다. 원래 위치로 빠른 복구에 위에서 손목의 스냅 원심 분리기 (300 x g, 5 분) 및 180 °에 의해 표면에 뜨는 폐기.
- 셀에 불완전 한 미디어 (10 µ g/mL, 최종 농도)에 희석 된 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 (30 분, 4 ° C)를 품 어.
- 씻어 두 번 w 셀ith에 설명 된 절차를 수행 하는 불완전 한 미디어 4.3, 단계 및 해당 이차 항 체의 10 µ g/mL에서 50 µ L로 품 어 결합 FITC 또는 유사한 켤레 (30 분, 어두운 공간에서 4 ° C).
- 씻어 셀 한 번 PBS 세척 뒤 불완전 한 미디어. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 복구 하 고 cytometry 튜브에.
- 흐름 cytometry 시스템에 샘플을 평가 (재료의 표 참조). 앞으로 및 측면 산란 매개 변수 셀 인구를 조정 합니다. 게이트의 인구입니다. 게이츠 세포 isotype 컨트롤과 incubated에서 부정적인 컨트롤에 따라 조정 합니다. 분석 결과 긍정적인 세포의 백분율 또는 형광 강도 8 뜻.
5. 서쪽 오 점 내 피 정품 인증 평가
- 씨앗 6-잘 배양 배지 (7 x 10 5 셀/잘) 하위 합류에 있는 피 고 2에 설명 된 대로 LPS와 치료. 다음 서쪽 오 점 프로토콜에 의해 염증 성 단백질 표정 분석.
- 내 피 응답의 다양 한 측면을 명료 하 게 다른 시간 지점에서 LPS 자극을 중지:
- LPS 자극의 6 h 후 염증 성 단백질 프로필 확인.
- 60 분 기간을 통해 매 15 분을 신호 하는 셀을 결정.
- 두 경우 모두, 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.
- Lyse 세포 및 단백질 추출
- 추가 200 µ L 세포의 용 해 버퍼 각 잘 (1% 비 이온 계면 활성, 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 염화 나트륨 150 m m, 30mm 나트륨 파이 인산, 50mm 나트륨 불 화물에서 2.1 m m 나트륨 orthovanadate를 pH 7.6, 프로 테아 제 억제 물 칵테일 보충) (자료의 표 참조).
- 동요에서 4 ° C에서 15 분 웰 스 피 펫 팁을 긁 고 1.5 mL 튜브에 homogenate 수집을 품 어.
- 11600 x g에서 튜브 4 원심 ° c.
- 처리까지-80 ° C에서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 저장.
- 측정 bicinchoninic 산 분석 결과 표준 다음에 의해 단백질 농도 프로토콜 (재료의 표 참조) 13.
- 는 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염, 10 %polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 14의 표준 기술에 의해 총 단백질 각 샘플에 대 한 lysate의 30 µ g을 해결. 샘플 10 m m β-mercaptoethanol (줄이는 조건)와 함께 또는 없이 실행 (조건 비 감소) 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 항 체에 따라.
- 표준 절차를 사용 하 여 0.45 µ m 기 공 크기와 polyvinylidene difluoride (PVDF) 전송 막 polyacrylamide 젤에서 분리 된 단백질 전송.
- 전이, 후 막 PBS, 0.1% 폴-20 (PBS-T)로 두 번 세척 하 고 추가 20 mL 2% BSA PBS-T 검색된 phosphoproteins 또는 PBS-T 아래 동요 (90 분, 총 단백질에에서 5% 비 지방 건조 우유에에서 희석 하 여 불특정 바인딩 사이트 차단 RT).
- 권장된 농도에서 적절 한 차단 버퍼의 10 mL에 선택 된 항 체를 희석 하 고 동요 (ON, 4 ° C)에서 막 품 어. 또는 막 밀폐 비닐 봉지에 놓고 희석된 항 체의 5 mL을 사용.
- 다음 날 씻어 3 막 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 번.
- 동요 (30 분, RT) 10 mL와 함께 특 파 원 이차 항 체의 아래 막 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)는 적절 한 차단 버퍼에서 1:10,000에 희석에 바인딩된 품.
- 동요 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 아래 세 번 막 세척.
- 과산화 효소 기질 강화 화학 (ECL)의 0.1 mL/c m 2으로 1 분 동안 막 품 어. 두 개의 투명 한 플라스틱 시트, 사이 물기 막 놓고 Charged-Coupled 장치 카메라 (CCD)를 포함 하는 화학 탐지 시스템에 삽입.
- CCD 카메라를 사용 하 여 신호 및 누적 프로그램과 이미지를 기록 하는 소프트웨어 검색 (이미지 표시 누적된 신호 마다 30 s 노출에서 총 15 분 동안).
- Densitometry 15 사용자 가이드 설명 된 프로토콜을 따르고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 밴드 강도 계량.
- ImageJ 소프트웨어에서 샘플을 열고 사각형 선택 도구와 관심의 밴드를 선택 합니다.
- 첫 번째 레인과 언론 플롯 프로필 음모를 차선으로 선택.
- 직선 선택과 봉우리의 영역 구분.
- 각 피크의 내부를 클릭 하 여 각 밴드의 크기를 측정.
- 단백질 제어 (β-말라, tubulin, 등)를 로드 관련 결과 나타냅니다.
6. 내 피 요소 접착 분석 실험에 의해 백혈구 활성화에서 발표 평가
- 내 피 조절된 미디어 얻기.
- 섹션 2에에서 표시 된 대로 MLEC-04 세포를 치료 하 고 LPS 24 시간 자극 후 표면에 뜨는 문화 수집 (100 ng/mL).
- 대우 MLEC-04 세포 분리기 (600 x g)에서 바른된 미디어를 수집합니다. 사용까지-80 ° C에서 0.5 mL aliquots에는 상쾌한 유지.
- 백혈구 접착 분석 결과
- 50 µ L/잘 선택 된 세포 외 기질 단백질 (콜라겐, 0.1 m M 초 산에 희석)를 제외 하 고 PBS에 희석의 96 잘 접시 코트: fibronectin (1-10 µ g/mL ), laminin (1-10 µ g/mL)와 교원 질 유형 I (10-40 µ g/mL). 4 ° c.에 두고 ON
- 코팅된 미디어를 삭제 하 고 150 µ L PBS, 1 %BSA 열 비활성화 (1 분, 100 ° C) 실시간에서 90 분으로 우물에 난다 바인딩 사이트 차단
- PBS로 두 번 우물을 세척 하 고 우물에 100 µ L 이전 수집의 내 피 조절 미디어 (6.1 단원)을 추가.
참고: 판 접착 시험을 수행 하기 위한 준비가. - 문화 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터에서 마우스 monocyte macrophage 셀 라인 J774와 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI), 10 %FBS, 1 %P / s.
참고: J774 세포 성장 정지에서. - 15 mL 튜브 및 원심 분리기 (300 x g, 5 분)로 J774 셀을 수집합니다. 삭제는 상쾌한 고 10 mL 혈 청 자유로운 미디어와 셀룰러 펠 릿 resuspend. Neubauer 챔버에 세포를 계산 합니다. (300 x g, 5 분) 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 50 µ L 미디어 당 15 x 10 4 J774 세포에서 혈 청 자유로운 미디어에 셀 resuspend.
- 추가 15 x 10 4 J774 셀 각 50 µ L 세럼 무료 미디어에서 잘 하 고 CO 2 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 뒤에 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
- 따뜻한 PBS를 추가 하 여 우물을 두 번, 부드럽게 씻어; 원심 (300 x g, 5 분) 하 고 원래 위치로 빠른 복구에 탑에서 손목의 180 ° 스냅 하 여 상쾌한 삭제. 연결 된 셀을 수정PBS에서 100 µ L/4 %paraformaldehyde (PFA)의 음을 추가 하 여 s (10 분, RT)을 품 어와.
- 부드럽게 미디어를 삭제 하 고 부드럽게 실시간 삭제 미디어에서 2 분에 대 한 PBS에 2% 메탄올을 가진 세포를 permeabilize 90에 대 한 20% 메탄올에서 50 µ L / 0.5% 크리스탈 바이올렛의 우물을 추가 하 여 셀을 얼룩 실시간에 s
- 풍부한 실행 물과 함께 접시를 세척, 초과 액체를 삭제 하 고 건조를 두고. 디지털 카메라는 가벼운 현미경에 결합에 의해 연결 된 셀을 보고.
- 셀 100 µ L/0.1 M 나트륨 구 연산 염, 50% 에탄올의 우물을 추가 하 여 얼룩을 희석. 더 높은 리간드 농도와 코팅 545 nm 및 흡 광도 또는 세포 접착으로 100% 고려 하 여 접착의 비율의 임의의 단위로 결과 도달 우물에서 흡 광도 측정
7. 백혈구 Endothelium 공동 접착 분석 결과 내 피 정품 인증 테스트
- 96 잘 접시에 MLEC-04 셀 섹션 2에에서 설명 된 대로 고 LPS (6, 37 ° C)와 품 어.
- J774 셀 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CSFE)와 라벨을 붙일.
6.2.5에서 절차를 수행 하는 PBS에
- 워시는 J774 셀. 수는 Neubauer에 의해 셀 방법 챔버 1 x 10 6 셀/mL PBS, 0.1 %BSA resuspend.
- 37 ° C. 추가 5 mL 불완전 한 미디어에서 20 분 (5 µ M, 최종 농도) CFSE와 셀을 품 어 고 (5 분, 4 ° C)를 품 어.
- 6.2.5에 설명 된 대로 불완전 한 미디어로 한 번 씻어. 15 x 10 4 셀/100 µ L에서 resuspend, 공동 접착 시험 진행.
- Endothelium 치료 후 씻어 3 배 불완전 한 미디어와 우물. 내 피-코팅 잘 각 CFSE J774 셀 (15 x 10 4 셀/100 µ L)를 추가 합니다. 37에서 60 분 다음 4 ° C에서 10 분 동안 접시를 품 어 ° c.
- 우물 6.2.7에 설명 된 대로, 부드럽게 세척., 따뜻하게 PBS를 사용 하 여 및 다음 두 가지 방법으로 내 피 레이어 J774 접착을 보고:
- 0.1 M Tris HCl pH 8.8, 1 %SDS에서 세포를 Lyse (100 µ L/잘) 측정 하 고는 CFSE J774 신호 fluorometry (여기/방출 = 492 nm/517 nm). 형광 강렬의 임의 단위 또는 긍정적인 통제에 관하여 접착의 비율 결과 나타냅니다 (추가 총 세포에서 신호에 각 잘).
- 형광 현미경 시각화 하 여 4 %PFA 및 보고서에 셀 endothelium CFSE J774 셀의 첨부 파일을 수정 (여기/방출 = 492 nm/517 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
실시간 정량 Pcr에 의해 LPS 유발 내 피 세포 활성화의 평가
굶 어 혈 청 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 6 h에 의해 자극 되었다 그리고 내 피 유전자 발현 비교 활성화 마커 휴식 상태를 표현 하 여 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다. 그림 1A같이 LPS incubated MLEC-04 세포 염증 반응 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1) 동안 백혈구 신규 모집에 관련 된 선택 된 접착 분자의 mRNA 표현 유도. PECAM-1 식이 실험적인 치료에서 수정 되지 않은 때문에 내부 제어로 사용 되었다. 그림 1B LPS cytokines Ccl5, Cxcl10, 및 Cxcl1의 증가 mRNA 식으로 측정 하 여 내 피 활성화를 나타냅니다. 이 분자는 백혈구 내 피 레이어 및 염증의 사이트에 최신 넘쳐 흐름을 그들의 매매를 포함 한 순환의 활성화에서 포함 된다. Cytokine, IL4,이 실험적인 치료에서 내부 통제로 사용 되었다.
그림 1: 평가 LPS 유발의 내 피 세포를 실시간 정량 Pcr에 의해 활성화. 는 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 제어 상태 (파란색 막대)에 비해 6 h (빨간색 막대)으로 자극 했다 그리고 실시간 정량 Pcr에 의해 유전자 발현 분석. 그래프 표시 선택한 내 피 접착 분자 (A)의 제어 상태에 관하여 mRNA의 배 유도 및 cytokines (B) 백혈구 활성화 및 염증 반응 동안 채용에 관련 된. PECAM-1와 IL4이이 조건 하에서 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 결과 3 중에서 실시 한 실험 수행, 3 중에서 ± SEM 의미 표현 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
LPS 처리 내 피 세포에 접착 분자의 단백질 표정
염증 성 자극은 이전 섹션에서 설명한 대로 MLEC-04 셀에 실행 되 고 단백질 식이 서쪽 오 점 기술에 의해 조사 되었다. 휴식 내 피 선물 접착 분자 VCAM-1 및 ICAM-1 (로-로 표시)의 거의 발견할 수 없는 수준. LPS (+), 앞 내 피 활성화 형 설명 표식 (그림 2) 식의 upregulation에 의해 분명 하다. 세포 막 densitometry 분석 후 상대 밴드 밀도 계산 하기 위해 로드 제어로 사용 된 β-걸 감지에 의해 정상화 되었다.
그림 2: LPS 처리 내 피 세포에 접착 분자의 단백질 표정. 대표 서쪽 오 점 평가 VCAM-1 및 ICAM-1 단백질 식은 휴식 (-) MLEC-04 셀 LPS 처리 (+)에 비해. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. 각 단백질의 분자량은 괄호 안에. 값은 상대 밴드 밀도의 반 정량화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
LPS 중재 염증에 내 피 표면 마커
염증 성 맥락에서 내 피 활성화 LPS에 의해 6 시간 자극 후 cytometry에 의해 평가 되었다 (100 ng/mL). 이 상태에서 백혈구 상호 작용에 관련 된 접착제 관련 분자의 탐지 평가 했다. 그림 3A 의 왼쪽된 패널 기저 표현의 휴식 MLEC 04 셀 (레드 솔리드 히스토그램)에 지정 된 마커 isotype 부정적인 제어 (히스토그램 블랙 점선)에 비해 나타냅니다. 그림 3A 의 오른쪽 패널 자극된 MLEC-04에서 파생 된 결과 보여줍니다. LPS 치료 크게 upregulated 전자 selectin 접착 분자의 표현 VCAM-1과 ICAM-1 원형질 막 (레드 솔리드 히스토그램) 휴식 상태 (히스토그램 블랙 점선)에 비해. 같이 cytometry 프로필 하 고 전에, PECAM-1의 표현이 실험 조건에서 그대로 인용. 그림 3B 참조로 내 피 염증 반응의 가능한 중재자를 평가 하는 데 사용 하는 정량화 값을 보여 줍니다. %: 백분율의 긍정적인 세포; MFI: 형광 강도 의미 한다.
그림 3: 내 피 표면 표식 LPS 중재 염증에. Cytometry 프로필 휴식에 세포 접착 분자의 흐름 및 LPS 자극 MLEC-04 셀. 왼쪽된 패널 isotype 일치 컨트롤 (Ctrl-블랙 히스토그램)을 기준 (항 원 표시 빨간색 막대 그래프) 휴식 세포에 단백질 표정을 보여줍니다. 오른쪽 패널 제어 세포 표면 단백질 식 (검은 히스토그램) LPS 처리 내 피 세포 (빨간 막대 그래프)를 비교합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
내 피 세포에 LPS 자극에 의해 발생 하는 신호 통로
염증 중 혈관 칸막이 활성화에 관여 하는 메커니즘은 키 신호 분자를 평가 하 여 조사. MLEC-04 셀 다른 기간에서 LPS로 자극된 단백질 추출, 처리 그리고 활성화의 정도 서쪽 오 점 기술에 의해 분석 되었다. 그림 4 는 NF-κB 신호 IκB α 진압 LPS-보육, 15 분 후 phosphorylated 고 1 시간 후 기초 수준을 반환 합니다. LPS에서 ERK 1/2를 활성화 하는 다른 한편으로, 15 분 후 신호는 필수적인 통로 염증 반응 중 내 피 활성화에 관련 된 설정. 세포 막 했다 정규화 β-말라 또는 ERK 1/2 감지는 densitometry 분석 후 상대 밴드 밀도 계산 하기 위해 로드 컨트롤으로 사용 되었다.
그림 4: 내 피 세포에 LPS에 의해 발생 하는 통로 신호. 그림에 표시 된 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 시간으로 자극된 하 고 신호 경로 ERK 1/2 (P-ERK 1/2) 및 (P-IκBα)를 통해 NF kB 서쪽 오 점으로 평가 했다. ERK 1/2 총 및 β-말라 각 조건에서 컨트롤 로드로 사용 되었다. 각 단백질의 분자량은 괄호 안에. 값은 상대 밴드 밀도의 반 정량화를 나타냅니다. 제발 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.이 그림.
Endothelium LPS로 자극된 하 여 백혈구 동작의 규정
염증 반응의 진행에 내 피 활성화의 규칙의 생물학 관련성 백혈구 성능 기능 분석 실험에 의해 결정 됩니다. 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 두 가지 다른 방법을 내 피 세포에 의해 규제 백혈구 기능을 테스트 하기 위해 포함 되어 있습니다. 분석 실험 심문 (내 피 cytokines 백혈구 활성화, 및 서쪽 오 점 내 피 접착 분자 백혈구 상호 작용에 대 한 발표에 대 한 실시간 정량) 염증 반응의 다른 측면, 가져온 데이터는 둘 다 백혈구 첨부의 미세한 세부 사항을 평가합니다. 내 피 성 요인에 의해 백혈구 활성화로 여러 가지 기판에 세포 접착 호의 효율적인 염증 반응을 개발 위해 필수적 이다. 그림 5A µ g/mL fibronectin 코팅 컨트롤에서 이전에 수집한 바른 미디어 응답에서 우물 또는 LPS 처리 내 피 세포를 0.5 J774 세포 접착을 보여줍니다. 밝은 필드 이미지 및 spectrophotometric 측정 나타냅니다 LPS 처리 endothelium에서 바른된 언론에 발표 하는 요소는 효율적으로 J774 활성화를 유도 하기에 충분 한 셀 첨부의 유도 의해와 같이 fibronectin입니다. 그림 5B 는 내 피 접착 분자의 소설 식으로 백혈구 회사 접착을 지원 하기 위해 혈관 층의 기능을 평가 하는 공동 접착 분석 결과를 나타냅니다. 간단히, MLEC-04 셀 6 h에 대 한 LPS로 자극된의 굶 어 혈 청 subconfluent 문화 씻어 여러 번 있었고 공동 인 큐베이 팅 J774 이전 형광 프로브, CFSE 라는 백혈구 라인. 현미경 및 spectrofluorometric 측정에서와 같이, LPS 혈관 자극 내 피 단층 CFSE J774 세포의 상호 작용을 하시 더군요.
그림 5: 공동 접착 분석 결과 의해 내 피 단층 LPS incubated 상호 작용 백혈구. (A) 가벼운 현미경 이미지 컨트롤이 나 LPS 처리 내 피 세포에서 바른된 미디어에 대응에서 0.5 µ g/mL fibronectin 코팅 우물에 연결 된 J774 셀의 크리스탈 바이올렛 얼룩 보여주는. 스케일 바, 50 µ m입니다. 아래 spectrophotometric 분석 3 중에 실행 하는 대표적인 실험에 대 한 임의의 단위 (거리) ± SEM으로 흡 광도 측정을 나타냅니다. (B) 형광 현미경 CFSE J774 셀 컨트롤 또는 공동 접착 분석 결과 의해 평가 하는 LPS 처리 MLEC-04 셀에 연결 된 표시. 눈금 막대 = 50 µ m. 아래 fluorometric 분석 3 중에 실행 하는 대표적인 실험에 대 한 임의의 단위 (거리) ± SEM으로 형광 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 대상 | NCBI RefSeq ID | 전달 시퀀스 (5´-3´) | 역방향 시퀀스 (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | 법 GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT 안내 |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC 고양이 CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT 개 그 GAA 따 |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG 아 그 AAA TGC 아 그 CTG AA | CTG 전술 AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG 전술 CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG 고양이 CAC TTC 전술 CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E selectin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG 아가 | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA가 | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
표 1:이 연구에 사용 된 뇌관의 목록입니다.
| 휴식 | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Ctrl 키 | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| E selectin | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
표 2: 내 피 표면 표식 LPS 중재 염증에. 교류 cytometry 분석 및 LPS 자극 휴식 MLEC-04 세포에 세포 접착 분자 식 부 량이 고 긍정적인 세포 (%)와 평균 형광 강도 (MFI) 휴식 및 LPS 자극 내 피 세포의 백분율에 해당 하는 각 표식에 대 한 대표적인 값입니다. PECAM-1이 실험 조건 하에서 부정적인 제어로 사용 되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 내 피 프로토콜 탐험 소설 메커니즘 염증 반응의 조절에 관여에 대 한 기초를 설정 하는 단계적 기술을 설명 합니다. 이러한 방식을 내 피 활동 LPS에 의해 자극된의 연구에 기초 하 고 특히 백혈구 신규 모집 선 동적인 응답 동안에 관련 된 중요 한 단계를 평가: cytokines 내 피, 내 피 접착 분자 표정 및 백혈구 접착 혈관 층에. 내 피 매개 변수가 설정 되 면 시스템 내 피 기능의 규정에 관련 된 소설 화합물에 대 한 검색할 수 있습니다 따라서, 염증 진행. 그 규제 약물 제약 시장에 대 한 관심의 수 있습니다. 이 순차 프로토콜의 주요 투영 물질로 조건 내 피 종류에 그들의 상대 혈관 활동 매개 변수를 조정 하 여 이러한 연구를 확장 하기 위한 기초입니다.
이 심사에 의해 선정 하는 마약 염증 성 질환에 대 한 새로운 치료 전략을 설계에 대 한 재미 있는 후보자를 창설할 것 이다. 한편으로, 내 피 응답을 선호 하 고 백혈구 신규 모집을 하는 화합물 면역 결핍 상태16,17약속 될 것입니다. 다른 한편으로, 내 피 억제제10만성 염증 성 질환 대 한 우수한 치료를 창설할 것입니다.
자극된 endothelium에 의해 표현 하는 cytokines의 염증의 진화를 예측 합니다. Cytokines 염증 맥락에서 내 피 층으로 발표 하는 작은 단백질 그리고 백혈구 행동을 강력 하 게 규제. 프로-염증 성, Cxcl10, Ccl5, Cxcl1, 등 백혈구 표면에 그들의 특정 한 수용 체에 바인딩 회원과 신호 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1), 혈관 층에 새로 표현된 접착 분자와 백혈구 상호 작용을 유도 하 고 병 적인 영역 (그림 1, , 그림 2 그림 3)8,,1018백혈구 마이그레이션. 단백질의 동일한 가족의 다른 일원 염증과 결과적으로 조직 복구의 해상도에서 포함 된다. 그들은 백혈구 신규 모집을 방해 하 고 면역 정리10,,1920부탁 하기 때문에 이러한 항 염증 성 cytokines의 식은 만성 염증 성 질환에 대 한 관련입니다. 선택 가능한 내 피 염증 성 레 귤 레이 터,이 사이토카인 식 분석 결과 수행 하 고 관심의 화합물의 존재 내 피 접착 분자 식을 평가 하는 것이 좋습니다. 사실, 질병의 진행에 대 한 예측 값으로 사용할 수 있습니다 프로 염증 성 cytokines 대 염증 사이의 수준을 분석 하 고 치료 관심21의 마약을 보여준다.
복잡 한 세포내 신호 폭포 지도 kinases ERK 1/2를 이끄는 그것의 세포 표면 수용 체에서 바인딩 LPS, 설립, p38 그리고 NF-kB signalosome 염증 transcriptional 프로그램을 유도 하. 이 통로의 대부분은 TNF-α 등 일리노이-110,22다른 염증 성 자극에 일반적 이다. 내 피 활성화는 그림 4에서 ERK 1/2에 대 한 같이 지도 키 니 아 제 회원의 phosphorylated 형태를 감지 하 여 결정 됩니다. LPS에 의해 내 피 활성화 phosphorylates 및 NF kB 억제제 저하는 복잡 한, IKKβ의 효소 활동을 유도 하는 또한, 복잡 한 IκB, NF-kB 이펙터 회원 핵 전 좌의 특 파 원 수행 되므로 transcriptional 활동 (그림 4)입니다. 마약 화합물 내 피 염증 반응에 영향을 미치는 메커니즘을 특성화 하는 것은 매우 유용 하 고, 마약, 설명 하지만 호환 기존의 치료와 함께에서 새로운 염증 치료에도 디자인에 23.
화합물 내 피 염증 성 심사 분석 실험에서 선택, 더 공부를 해야 합니다 백혈구 행동 분석의 중요 한 단계에 그들의 기능적인 관련성 확인을 궁극적으로, 세포는 염증 성 질환에 대 한 책임. 이 분석 실험 두 개의 서로 다른 실험 설정에서 백혈구 활동 분석. Integrin 중재 접착 분석 실험에 의해 백혈구 활성화에 내 피 출시 cytokines의 역할 평가입니다. 백혈구 integrins 내 피 출시 cytokines에 의해 활성화 됩니다. 따라서, 백혈구 접착 수 integrin ligands 백혈구 기능8,10,18에 대 한 대표적인 측정 이다. 두 번째 공동 접착 분석 실험에 의해 혈관 층에 백혈구 상호 작용에 새로 표현된 내 피 접착 분자의 역할을 공부입니다. 염증 성 맥락에서 표현 하는 내 피 접착 분자 주변 조직에 백혈구 신규 모집을 위해 필수적 이다. 따라서, 염증 진행 (그림 5)8,10,18에 대 한 전조 값을 구성 백혈구 내 피 처리 단층 세포의 상호 작용을 분석 합니다. 이 방법에서 파생 된 결과 선택 된 화합물은 염증 성 질환 치료를 위한 미래 전략 설계에 심각한 후보자는 건의 할 것입니다.
여기에 정의 된 실험 제안 다른 세포 또는 stimulatory 시스템을 추정 하는 기능 때문에 미래의 어플리케이션을 위해 다양 한 도구입니다. 다른 근원 또는 종, 그리고 여러 가지 면역 세포에 LPS, TNF-α, 박테리아, 바이러스, 등다른 염증 성 에이전트의 기능을 테스트 하는 절차 endothelium에 수정할 수 있습니다. 텍스트에 설명 된 대로 연구원은 나중에 염증 반응 선택 된 화합물의 역할의 특성 그들의 자신의 시스템에 내 피 활성화를 특징 먼저 해야 합니다. 프로토콜의 한계는 적절 한 부정적인 제어 및 자극된 상태에서 쉬고 분별 내 피 활동 매개 변수 정확 하 게 정의의 선택. 이 문서에 설명 된 조건 다른 시스템에 대 한 작동 하지 않는 경우, 연구원은 문제를 해결 해야 실험적인 매개 변수 추가 시간에 따라 분석 실험을 수행 하 고 염증 성 자극의 농도 기온 변화도 사용 하 여 에 선 동적인 응답의 규칙에 대 한 새로운 약물 테스트에 대 한 수 있는 물질로 창을 정의 합니다.
결론,이 내 피 염증 성 프로토콜은 n의 검색에 대 한 권장으 내 피 레 귤 레이 터는 선 동적인 응답을 대상으로. 재미 있는 화합물의 미래 응용 프로그램을 공부 하 고 염증 관련 질병에 대 한 혁신적인 혈관 관련 치료 설계에 적용 될 수 있는 그리고 잠재적으로의 될 수 있는 소설, 제공할 것입니다이 절차를 수행 제약 시장에 관심입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO) 및 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (보조금 번호 IERPY 1149/16 앨 러 배 마; MPY 1410/09 S. Hortelano에); 의해 Fondo 드 Investigación en 건배 (FIS) (S. Hortelano PI11.0036-PI14.0055 번호 부여)을 통해 MINECO. S. Herranz IERPY 1149/16 ISCIII에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
