Vi har udviklet en ny protokol til undersøgelse af heterocellulær populationsdynamik som reaktion på forstyrrelser. Dette manuskript beskriver en billedbaseret platform, der producerer kvantitative datasæt til samtidig karakterisering af flere cellulære fænotyper af heterocellulære populationer på en robust måde.
Cellulære processer er komplekse og skyldes samspillet mellem flere celletyper og deres omgivelser. Eksisterende cellebiologiteknikker tillader ofte ikke nøjagtig fortolkning af dette samspil. Ved hjælp af en kvantitativ billeddannelsesbaseret tilgang præsenterer vi en højindholdsprotokol til karakterisering af de dynamiske fænotypiske responser ( dvs. morfologiske forandringer, proliferation, apoptose) af heterogene cellepopulationer for ændringer i miljømæssige stimuli. Vi fremhæver vores evne til at skelne mellem celletyper baseret på enten fluorescensintensitet eller iboende morfologiske funktioner afhængigt af applikationen. Denne platform muliggør en mere omfattende karakterisering af subpopulationsrespons til forstyrrelse, mens der anvendes kortere tid, mindre mængder reagenser og lavere sandsynlighed for fejl end traditionelle cellebiologiske analyser. I nogle tilfælde kan cellepopulationer imidlertid være vanskelige at identificere og kvantificere baseret på kompleks celluLar funktioner og vil kræve yderligere fejlfinding; Vi fremhæver nogle af disse forhold i protokollen. Vi demonstrerer denne ansøgning ved hjælp af respons på stof i en kræftmodel; Det kan dog let anvendes mere bredt til andre fysiologiske processer. Denne protokol gør det muligt for en at identificere subpopulationer inden for et co-kultur system og karakterisere den enkelte respons af hver til eksterne stimuli.
Cellebaserede analyser har været en arbejdshest i grundforskning og stofudviklingsindstillinger. Begrænsningerne af disse standardanalyser er imidlertid blevet mere og mere tydelige med uoverensstemmelsen mellem in vitro og kliniske data og svigtet af de fleste lægemidler for at modtage FDA-godkendelse. Her præsenterer vi en ny metode til udnyttelse af kvantitativ billeddannelse til samtidig analyse af heterocellulære fænotyper som reaktion på relevante, sammenfaldende miljømæssige stimuli.
Traditionelle cellebaserede analyser, der anvendes til at måle celle-levedygtighed, indbefatter: trypanblåtekskluderingsassays, MTT / MTS og Annexin V-FITC-flowcytometrifarvning. Trypan Blue Exclusion analyser, mens de er enkle og billige, kræver et stort antal celler, er tidskrævende og påvirkes ofte af brugerforstyrrelser 1 . MTT- og MTS-analyser måler indirekte celle-levedygtighed gennem målinger af mitokondriens metaboliske hastighed. Det metaboliske aktiviTy for celler kan påvirkes af forskellige kulturbetingelser (såsom medie eller iltkoncentration), hvilket fører til unøjagtige resultater og forhindrer standardisering på tværs af celletyper og betingelser 2 , 3 . En anden stor ulempe ved disse teknikker er deres manglende evne til at skelne mellem flere celletyper – de fleste biologiske systemer er heterocellulære. Selvom flowcytometrimetoder har evnen til at skelne mellem flere cellepopulationer, kræves celleetiketter, dynamisk prøveudtagning er udfordrende, og når der anvendes vedhæftende celler, bliver denne applikation tidskrævende og fejlagtig.
Andre vigtige cellulære fænotyper, herunder morfologiske ændringer, forekommer som reaktion på miljøstimuli, men er ikke fanget af traditionelle cellebaserede assays. Profilering celle tilstande gennem morfologisk karakterisering og kortlægning ligheder over prøver er et kraftfuldt, upartisk værktøj med aEvne til at give en ny indsigt i mange aspekter af grundlæggende og translationel forskning, herunder basisk cellebiologi og stofopdagelse 4 . Desuden er tumorcellemorfologi blevet vist at korrelere med tumorundertyper 5 og aggressivitet 6 . Det er derfor af stor interesse at studere disse cellulære træk og hvordan de vedrører specifikke miljøforstyrrelser. Derudover kan man anvende forskelle i morfologiske egenskaber til at diskriminere mellem subpopulationer i co-kultur systemer. Fluorescensmærkningsceller har nedfald ( dvs. ændring af egencelleegenskaber, tidskrævende), og derfor er yderligere metoder til klassificering af celletyper fordelagtige.
Mikroskopi-baseret billeddannelse er en alternativ metode til profilering af cellulære fænotyper på en multiplekset, kvantitativ og robust måde. I dette manuskript anvender vi vores kvantitative billedbehandlingsrørledning for at fremhæve evolutioNary dynamik af heterogene cellepopulationer inden for en tumor. Vi fokuserer på samspillet mellem ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) celler og cancer-associerede fibroblaster (CAF'er), den mest fremherskende stromalcelletype, der findes i tumorer. CAF'er er blevet impliceret i tumorinitiering, progression og terapeutisk respons; Derfor kan udførelse af fænotypiske analyser på tumorceller i fravær af CAF'er være vildledende 7 , 8 , 9 . Specifikt vurderede vi virkninger af CAF'er på tumorceller som reaktion på erlotinib, et lille molekyle målrettet mod Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), der ofte anvendes til klinisk behandling af NSCLC. Vi udnyttede en højindholds screeningsplatform og den tilhørende billedanalysesoftware til evaluering; Men i et forsøg på at gøre denne metode tilgængelig for andre forskere har vi også udviklet en sammenlignelig downstream-protokol ved hjælp af open source-softwaren:CellProfiler 10 og CellProfiler Analyst 11 . De fleste billedbaserede screeningsanalyser med høj indhold analyseres med kommercialiseret software, der er specifik for en given instrumentmodel. Resultater er vanskelige at replikere i andre laboratorier med forskellige software, fordi de underliggende algoritmer ofte er proprietære. Ved anvendelse af denne billedbaserede pipeline blev celleproliferation, død og morfologi af hver subpopulation af en heterocellulær kultur som svar på lægemiddelbehandling under anvendelse af både fluorescens- og morfologi-baseret klassificering målt. Den følgende protokol giver en robust metode til sondering af komplekse cellulære processer.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 og U54CA143907 for at etablere Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OC'er) hos henholdsvis Dana-Farber Cancer Institute og University of Southern California. SM Mumenthaler modtog en PS-OC transnetwork award, der understøttede nogle af dette arbejde.
Vi vil gerne udtrykke vores dybeste taknemmelighed til vores filantropiske tilhængere, især Stephenson-familien, Emmet, Toni og Tessa, for deres donation af Operetta HCS-platformen. Vi vil også gerne takke J. Foo til vejledning, og Center for Anvendte Molekylærmedicin holdmedlemmer: D. Agus for klinisk vejledning og mentorskap, K. Patsch for meningsfuldt diskussioner med eksperimentelt design, R. Rawat for hjælp i billedanalyseprotokoller , J. Katz for teknisk assistance med Operetta, og P. Macklin og D. Ruderman for nyttige diskussioner og feedback.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |