Summary
שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.
Abstract
מחסום דם מוחי (BBB) מכסה תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS). BBB מתוחזק באופן דינמי על ידי האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs). כאן, אנו מפרטים שיטות להעריך כיסוי BBB באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, ואת מודל התרבות משולש אנושית (BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. כדי להדגיש את הישימות של מבחני למדינות מחלה, אנו מתארים את ההשפעה של olylomeric amyloid-β (oAβ), שהוא תורם חשוב להתפתחות אלצהיימר (AD) התקדמות, על כיסוי BBB. יתר על כן, אנו מנצלים את גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) כדי להאיר את פוטנציאל ההקרנה של התרופה של הטכניקות. התוצאות שלנו מראים כי BECs מתורבת יחיד יחיד משולש ליצור מבנים דמויי רשת כמו בתנאים הבסיסיים, וכי oAβ משבש את זה מבנה התא meshwork ו degenerates מבני רשת preformed,אבל EGF חוסם את ההפרעה הזאת. לכן, הטכניקות המתוארות חשובות לנתח תהליכים בסיסיים וחולי רלוונטיים המווסתים את כיסוי ה- BBB.
Introduction
מחסום דם מוח (BBB) של נימים מוחיים הוא הממשק הגדול ביותר של מגע בין דם למוח וממלא תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 , 2 . תהליכים דינמיים ב- BBB מונעים את ספיגה של מולקולות לא רצויות מהדם, מסירים את מוצרי הפסולת מה- CNS, מספקים חומרים מזינים חיוניים ומולקולות איתות ל- CNS, ומווסתים את הנוירו-דלקתיות 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . נזקי BBB נפוצים במהלך ההזדקנות וכמה הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה ושבץ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,התחת = "xref"> 6. לכן, תפקוד לקוי של BBB עשוי למלא תפקיד מפתח בהפרעות נוירודגנרטיביות, כולל כמטרה טיפולית.
שמירה על כיסוי כלי חשוב עבור פונקציות homeostatic של BBB. עם זאת, in vivo ו במבחנה נתונים הסכסוך על אם התהליכים המעורבים הפרעות נוירודגנרטיב לגרום כיסוי BBB גבוה או נמוך יותר 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , במיוחד לספירה. לכן, יש רציונל חזק לפיתוח של מודלים במבחנה באמצעות סוגי תאים רלוונטיים כדי להעריך באופן מקיף יותר להבין את הדינמיקה של כיסוי BBB. נימים מוחיים מורכבים אסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs) 3 . באופן כללי, טכניקות תא התרבות להערכת פונקציה BBB הן מבחני חדירות המבוצעת על תאים הגדלים על מסננים מוסיף, או הערכת רמות של חלבונים BEC מפתח, הן לאחר תוספת של לחצים 14 , 15 , 16 . למרות חשוב, מבחני אלה אינם מתמקדים כיסוי המוח.
הנה, השיטות הקודמות שלנו 17 מפורטים כדי להעריך כיסוי BEC ומבנים דמויי רשת כמו באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, תרבות משולשת אנושית(BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. המטרה היתה להדגים את ההשפעה המזיקה של OAβ, הנחשב תורם חשוב להתקדמות AD, על כיסוי BEC. האפקט המגן של גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) מדגיש את הפוטנציאל של הטכניקה ככלי סינון טיפולי. טכניקה זו כוללת מספר יישומים נרחבים למחקר בסיסי ויישומי, כולל:) 1 הגדרת תפקידם של מסלולים ספציפיים באנגיוגנזה וכיסוי כלי שיט,) 2 הערכת ההשפעות של מחלות וגורמים רלוונטיים להזדקנות על אנגיוגנזה ועל כיסוי כלי, 3) זיהוי תרופתי מטרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בצע את אוניברסיטת אילינוי, שיקגו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת פרוטוקולים.
1. הכנה כללית
הערה: המוח בתאי המוח האנדותל המוחית (hCMEC / D3) הוא קו BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . תרבות hCMEC / D3 תאים על צלוחיות רקמה תרבות מצופה קולגן סוג אני (עגל העור, 1:20 דילול של פתרון 0.1% ב Hank של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) המכיל Ca 2 + ו Mg 2 + ) ב Basal צמיחה האנדותל הבסיס (EBM-2) המכיל 2-5% סרום שור העובר (FBS), חומצה אסקורבית 10%, 10% גנטמיצין גנטמיצין, 25% hydrocortisone ו 1/4 מהנפח הכולל של גורם הגדילה גדל גורם לכל 500 מ"ל של התקשורת [ אנדותל כלי הדם(EGF), גורם גדילה דמוי-אינסולין (EGF), גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) ופקטור הגידול הפיברובלסטי הבסיסי האנושי (bFGF), ראה טבלה של חומרים ].
הערה: מדיום EBM-2 עם FBS וגורמי גדילה נקראים "EBM-2 Complete". EBM-2 ללא FBS ותוספות מכונה "EBM-2 הבסיס". במפגש מלא, תאים hCMEC / D3 הם ~ 1 x 10 5 תאים / ס"מ 2 .
- מעבר תאים HCMEC / D3 ביחס של 1: 5 על ידי הדגירה הראשונה עם HBSS במשך 3 דקות ללא Ca 2 + ו Mg 2 + ואחריו ניתוק עם 5 מ"ל טריפסין / EDTA (0.25%) במשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין באמצעות EBM-2 מלאה (ניטרול 1: 1), ו צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C; להשליך את supernatant. Resuspend גלולה ב EBM-2 להשלים מחדש צלחת ביחס 1: 5.
- תרבות האדם העיקרי pericytes ו astrocytes על פי פרוטוקול הספק [ טבלה של חומרים ]. תרבותיE pericytes במדיום הבסיסי pericyte עם FBS ותוספת גידול pericyte.
- תרבות האסטרוציטים האנושיים במדיום האסטרוציטים המכילים גורמי גדילת האסטרוציטים. התרבות הן pericytes ו astrocytes ב צלוחיות רקמה תרבות מצופה 3 מ"ל של פולי- L- ליזין (PLL) עבור התא דבקות לנצל את התאים בין מעברים 2 ו - 5.
- להרדים 7 עכברים ולהסיר את הגבעולים במוח cerebella עם מלקחיים; לנתק את הקרום על ידי גלגול בזהירות את המוח על גזה. לשרוף את רקמת המוח הנותרת בצלחת פטרי במינימלי Essential בינוני (MEM) עם HEPES (5 מ"ל לכל מוח) עם להב גילוח סטרילי. לבודד את BECs העכבר העיקרי של 2 חודשים בן C57BL / 6J עכברים על פי פרוטוקול הפניה 20 .
- מעבירים את הרקמה המוח טחנת צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו דגירה הרקמה ב papain (833.33 μL לכל מוח) ו DNase (41.7 μL לכל מוח)פתרון, ב 37 מעלות צלזיוס אמבטיה במשך שעה 1, לעכל את הרקמה.
- Triturate homogenate ברצף באמצעות מחטים 19 ו 21 מד, לערבב ביחס 1: 1 עם פתרון Bowine בסרום 22 אלבומין (BSA), ו צנטריפוגות ב XG 1360 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend גלולה שהתקבל ב 1 מ"ל EBM-2 מלאה צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend שוב 1 מ"ל EBM-2 מלא צלחת התאים (1 מ"ל / טוב) על 6 צלחות היטב מצופה קולגן (~ 1 המוח לכל טוב).
- החלף את התקשורת 24 שעות מאוחר יותר עם EBM-2 להשלים המכיל 4 מיקרוגרם / מ"ל puromycin hydrochloride; להחליף עם EBM-2 להשלים לאחר 2 ימים. BECs העיקרי מתורבת כמו לתאי hCMEC / D3 והם במפגש מלא ב 1 x 10 5 תאים / ס"מ 2 .
- הכן מיקרומטר 100 של oAβ, 24 שעות לפני assay.
הערה: oAβ נחשב בצורת המחלה הרלוונטית של A. עבור oAβ, השתמש היטב מאופיין ההכנות שתוארו על ידי DahlgreN et al. 21 . - להפשיר את הפתרון בממברנה במרתף המניה לילה ב 4 ° C ו aliquot לתוך סטרילי סטרילי PCR רצועות (8 צינורות) ב 140 קרום המרתף μL לכל צינור. Refreeze כל רצועה ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר רצועה אחת לכל 96 - גם צלחת על 4 מעלות צלזיוס, 24 שעות לפני assay. טרום מגניב טיפים פיפטה כדי למנוע התמצקות.
הערה: כל הטיפול במטריצת הממברנה במרתף חייב להתבצע על הקרח כדי למנוע הידוק מהיר. כמו 10 μL לכל טוב של קרום במרתף משמש ביום assay, כל רצועה מספיקה עבור צלחת 96-היטב. - דגירה BECs ומחוברות במלואה בבסיס EBM-2, 24 שעות לפני assay.
הערה: הרציונל הוא: EBM-2 להשלים מכיל גורמים נוספו FBS במטרה לקדם את הצמיחה התא אופטימלית; אולם, אותם מסלולים מולקולריים המקדמים את צמיחת התאים חשובים גם לכיסוי תאי האנדותל של המוח ולדינמיקה, הן בנוכחות והן בשכיחותלא של לחץ. לכן, אנו מוסיפים את הרעל והורדים את BEC על מנת להפחית את האפקט המבלבל של הפעלה שיורית של מסלולי איתות סלולריים. שים לב, התאים הם בקצרה (5 דקות) חשופים FBS במהלך ניטרול של תאים trypsinized לפני assay. בניגוד BECs, pericytes ו astrocytes אינם מורעבים בסרום, בשל הדרישה של גורמים שונים לצמיחה וחוסר היציבות היחסית של סוגי תאים אלה בתגובה רעב בסרום (מעבדה טאי, תצפיות שלא פורסמו).
הערה: הבסיס EBM-2 מנוצלת במהלך assay עבור יחיד ושלוש תרבות meshwork ו מבחני הפרעה. זה קריטי כדי למנוע בלבול confounding או טיפול תלוי איתות.
2. Meshwork- כמו גיבוש ו הפרעה Assays
- בודד BEC תרבות מבחני:
הערה: שלוש פרדיגמות שונות עבור תרבויות יחיד של BECs מוצגים בתרשים 1A - ביום assay, פיפטה המטריצה במרתף במרתף 10 μL / גם לתוך החלק התחתון של צלחות 96-היטב ולאפשר להגדיר עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
- להשעות את lyophilized תא ירוק מעקב צבע (ראה טבלה של חומרים ) ב 10 DMSO μL כדי ליצור פתרון מלאי 10 מ"מ, ו לדלל ל 10 מיקרומטר (1: 1000) בבסיס EBM-2. הסר את התקשורת מן הבקבוק ומחוברות לחלוטין ולהחליף EBM-2 הבסיס המכיל את התא ירוק צבע מעקב (5 מ"ל על בקבוק 75 ס"מ 2 ). Preload BECs עם צבע ירוק מעקב התא, 20 דקות לפני תחילת assay.
- דגירה התאים 20-30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, להסיר את המדיום עם צבע התא מעקב, לנתק את התאים כמתואר בשלב 1.1. לנטרל את התקשורת עם EBM-2 המכיל 10% FBS ו צנטריפוגה ב XG 240 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של EBM-2 הבסיס.
- צלחת BECs בצלחת 96-היטב ב 10,000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת הזמן בכל הפרדיגמות).
הערה: בהתאם לפרדיגמה בשימוש, טיפולים, לחצים, או פקדי הרכב מתווספים בנקודות הזמן שצוין. בכל הפרדיגמות, המדיום נקצר לניתוח שלאחר מכן ( למשל ניתוח ELISA) ותאים קבועים ב 24 שעות עם paraformaldehyde 4% מוכן טרי ב פוספט שנאגרו בסרום (PBS). כגישה חלופית כדי לקבוע את ההשפעות טווח של oAβ על היווצרות רשת, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי מראש דגירה צלוחיות תרבות תאים confluent עם oAβ, ולאחר מכן לבצע את פרדיגמות היווצרות meshwork (+/- oAβ).
הערה: נפח הסופי בכל טוב עבור כל הפרדיגמות הוא 70 μL. כל הטיפולים (oAβ, EGF, וכו ' ) מתווספים בארות בהתאמה שלהם בדילול 1:20 כלומר 3.5 μL לכל טיפול. עבור פרדיגמה 1, התאים מתווספים פתרון ההשעיה התא ב 63 μL / wEll. OAβ מיד, טיפולים הרצוי, ובקרות מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. עבור פרדיגמה 2, 63 μL ההשעיה התא 3.5 μL של הטיפול ( למשל 100 ng / מ"ל EGF) מתווספים בנקודת זמן 0 h. לאחר הדגירה 4 שעות, 3.5 μL של מלאי oAβ נוסף ( למשל עבור 100 nM ריכוז oAβ הסופי, 3.5 μL של 2 מיקרומטר oAβ המניות). עבור פרדיגמה 3, 63 μL ההשעיה התא מתווסף בנקודת זמן 0 שעה ב 4 שעות, oAβ וטיפולים הרצוי מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. כרכים אלה יכולים להיות מותאמים בהתאם לטיפולים. לדוגמה, אם רק טיפול אחד נדרש, נפח ההשעיה התא יכול להיות מותאם 66.5 μL (שמירה על 10,000 תאים / טוב) ואת נפח הטיפול יכול להישאר 3.5 μL.
הערה: בנוסף מבחני תרבות אחת של BECs, יש לנו לפתחאד פרדיגמה assay תרבות משולשת ( איור 1 ב ) כדי לקבוע את התגובה של BECs, pericytes, ו astrocytes בתוך רשתות preformed כדי רלוונטיים stressors ( למשל oAβ). BECs מצופה בנוכחות טיפולים הרצוי ב 0 h. ב 4 שעות, pericytes מתווספים בעדינות לצלחת. בשעה 7 שעות, אסטרוציטים מתווספים לצלחת, ואחריו תוספת של מתח ב 11 שעות. תאים מודגרת אז עד נקודת זמן 24 שעות.
הערה: עבור מבחני תרבות משולשת, חשוב לשקול עיתוי כדי להבטיח שכל התאים מחוברים בו זמנית. אסטרוציטים אנושיים pericytes צריך להיות מתורבת 1 שבוע לפני assay, ואילו hCMEC / D3 תאים צריך להיות מצופה או passaged 4-5 ימים לפני תאריך assay. יתר על כן, חשוב להשתמש במעבר נמוך (2-5) תאים ראשוניים, כדי למנוע סחיפה פנוטיפי.
- הוסף את התא הירוק מעקב צבע עובד פתרון לתאי hCMEC / D3 20 דקות לפני תחילת assay. פלייט את hCMEC / D3 תאים בשעה 10, 000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת זמן). הכרכים המשמשים 45 μL ההשעיה התא 3.5 μL של טיפול ( כלומר ריכוז EGF הסופי של 50 ng / mL, 100 ng / mL, או 1000 ng / mL ממניות כי הם 20 פעמים מרוכז יותר).
- לאחר הדגירה 3.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס, מוסיפים את התא הכחול מעקב צבע עובד פתרון (10 מיקרומטר תא גשש כחול EBM-2 הבסיס) כדי pericytes העיקרי האדם. בנקודת זמן 4 שעות (~ 30 דקות הדגירה עם צבע מעקב התא), בעדינות להוסיף 2000 pericytes / גם על הצלחת המכילה את hCMEC / D3 בנפח של 6 μL / טוב.
- לאחר הדגירה 2.5 שעות נוספות (סה"כ 6.5 שעות מ 0 נקודת זמן שעה), להוסיף את התא כתום מעקב צבע פתרון עובד (10 מיקרומטר תא גשש כתום EBM-2 הבסיס) כדי האסטרוציטים העיקרי האדם. בנקודת זמן 7 שעות, בעדינות להוסיף 10,000 astrocytes / גם את הצלחת נפח 12 μL. לכן, היחס הסלולרי הכולל לתאי האנדותל: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. יתר על כן, נפח שהושג לנקודה זו הוא 66.5 μL.
- הוסף oAβ (3.5 μL של 100 מיקרומטר המניה) 4 שעות מאוחר יותר (סה"כ 11 שעות מ 0 נקודת זמן שעה).
- תקן את התאים 13 שעות מאוחר יותר paraformaldehyde 4% מוכן טרי PBS.
זהירות: ללבוש ביגוד מגן, כפפות, משקפיים תוך טיפול paraformaldehyde.
3. כימות
- ללכוד תמונות הקרינה של כל טוב של צלחת 96-היטב בהגדלה 1.6X עם זמן חשיפה של 2 ב 50% כוח מקסימלי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
הערה: מיקרוסקופים שווה יכול להיות מנוצל; עם זאת, זה קריטי כדי ללכוד את הבאר כולו לניתוח מקיף. - לשם ניתוח כמותי, לעבד את התמונות באמצעות ImageJ angiogenesis תוסף plugin 22 לכמת את מספר הענפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל (אלה readouts הם tabulated באופן אוטומטי על ידי softwaRe) כמתואר להלן. פרוטוקול חזותי מפורט של שלב זה מסופק באיור 2 .
- פתח את fiji ImageJ על-ידי לחיצה על סמל התוכנה.
- לחץ על חצים קדימה אדום אדום הממוקם בסוף סרגל הכלים, ולאחר מכן לחץ על "אנגיוגנזה Analyzer".
- בחר את התיקיה עם קבצי תמונה, לחץ על "פתח".
- כאשר מופיעה תיבת "הגדרות לניתוח", לחץ על "אישור".
- כאשר מופיעה תיבת "עיבוד תמונות", המציינת את מספר התמונות שיש לעבד, לחץ על "אישור".
- כאשר מופיעה תיבת "חלון התקדמות אצווה", המציינת את זמן העיבוד המשוער. במהלך תקופה זו התוכנית לכמת את התפוקות, כולל מספר סניפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל.
הערה: לאחר הכנת כל התמונות, קובץ התוצאות יופיע בתיקיית התמונה המקורית כמסמך גיליון אלקטרוני. - בחרקובץ הגיליון המכיל תוצאות ולהשוות את מספר הענפים, הרשתות ואורך התא הכולל בין הקבוצות.
הערה: בתרשים assay תרבות משולש ImageJ מנוצל עוד יותר כדי לנתח כיסוי pericyte / astrocyte ומספר. תמונות הם thresholded על ידי נסיין עיוור ואת "לנתח חלקיקים" פונקציה מנוצל כדי ליצור readouts. תאים קבועים כמו מבנים דמויי צינור יכול גם להיות immunostained עבור Aβ 17 או סמנים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתרבויות בודדות, הן hCMEC / D3 תאים ( איור 3 א ) ואת BECs העכבר הראשי ( איור 3 ב ) טופס מבנים דמויי רשת כמו בכל רחבי הבאר. המבנים מאופיינים על ידי רשת של צמתים interlinked ( איור 3 ). בכל הפרדיגמות המתוארות ( איור 1 ), המבנים דמויי רשת דמויי רשת דומים לאחר 24 שעות בקבוצות הבקרה, ויוצרים 20 מבנים דמויי רשת, עם אורך תאגידי כולל של 10,000 פיקסלים.
כדי להדגיש את הישימות של שיטות למחלות רלוונטיות המחלה, oAβ נוספה hCMEC / D3 ואת BECs העכבר הראשי בשני פרדיגמות. בשנת הפרעה של היווצרות רשת התא (פרדיגמה 1), oAβ ותאים מצופים בו זמנית. בשנת הפרעה של preformed meshwork (פרדיגמה 2), oAβ הוא להוסיףEd 4 שעות לאחר ציפוי התאים (ראה איור 1 א ). OAβ ב 100 ננומטר גורם הפרעה של מבנה דמוי רשת כמו ניוון של רשת preformed ( איור 3 א , 3B ). לדוגמה, באמצעות תאים hCMEC / D3 בשני פרדיגמות, כימות של כיסוי התא הכולל / אורך הוא 16-20% נמוך עם 100 nM oAβ 17 . יתר על כן, מספר meshes מופחת על ידי 40% עם 100 ננומטר oAβ בשני פרדיגמות 17 . לכן, מתח גורם רלוונטי גורם להשפעה מזיקה דומה על כיסוי BEC האדם ועכברים.
יתרון מרכזי של מערכת התרבות התא הוא היכולת לזהות גורמים או טיפולים המונעים נזק רלוונטי למחלה, אשר לאחר מכן יכול להתקדם לבדיקה vivo . כהוכחה לניסוי עקרוני, ההשפעות של גורמי הצמיחה האנגיוגניים העיקריים על מניעת צ'ה המושרה ב- oAβNges כדי כיסוי כלי הוערכו 17 . EGF מנע OAβ הנגרמת נזק לתאי hCMEC / D3. בהתבסס על נתונים אלה, EGF נבדק בפרדיגמה מניעה באמצעות מודל עכבר מהונדס כי recapitulates היבטים קריטיים של AD- כמו הפתולוגיה. טיפול ב- EGF מנע את הגירעונות הקוגניטיביים וה- BBB, כולל ניוון כלי הדם. נתונים אלה תומכים בפוטנציאל החיזוי של מערכת המבחנה בפעילות in vivo . כיום, אנו מנצלים את כל שלוש הפרדיגמות המפותחות להקרנה: 1) היווצרות רשת, 2) מניעת הפרעה של רשת התא, 3) טיפול סימולטני של שיבוש רשת. כפי שמודגם באיור 3 , EGF יכול להגן מפני הנזק שנגרם oAβ בתרבויות BEC העכבר הנציח העיקרי.
BBB מורכב BECs, pericytes ו astrocytes כי באופן קולקטיבי לתרום cerebrovasc הכוללכיסוי סודי. לכן, אחד הסתגלות של מערכת חוץ גופית היא שילוב של כל שלושת סוגי תאים BBB. הפרדיגמה התרבותית שלנו assay משולש משלבת את hCMEC / D3 תאים, pericytes האדם העיקרי והאסטרוציטים האנושיים העיקריים, אשר מתווספים ברצף למטריצה בממברנה במרתף ( איור 1 ב ). בפרדיגמה assay תרבות משולשת, תאים hCMEC / D3 יוצרים דפוס דומה רשת כמו בתרבויות יחיד, אבל עם pericytes ו astrocytes המצורפת הצמתים וחיבור סניפים ( איור 4 ). תוספת של oAβ 100 ננומטר גורם לשיבוש רשת (~ 10-15%) וכן ירידה במספר pericytes יצירת קשר BECs 17 . בקורלציה עם הנתונים הנגזרים הפרדיגמות assay תרבות אחת, הנזק שנגרם oAβ נמנע על ידי טיפול EGF. לפיכך, מודל BBB תרבות משולשת מתאים היטב מחקרים התמקדו אפקטים אינטראקטיביים של האסטרוציטים, pericYtes ו BECs על הדינמיקה כלי.
איור 1: סקירה של היווצרות רשת ו מבחני הפרעה. ( א ) פרדיגמות assay תרבות אחת. פרדיגמה 1, מבנה רשת. תאים, לחצים וטיפולים כל נוסף על צלחת בנקודת זמן 0 h. פרדיגמה 2, מניעת שיבוש רשת. תאים מצופים בנוכחות טיפולים הרצוי, מודגרות במשך 4 שעות, ואת הלחץ הוא הוסיף בנקודת זמן 4 שעות. פרדיגמה 3, טיפול סימולטני בהפרעות רשת. תאים מצופים מותר ליצור מבנים דמויי רשת כמו 4 שעות לפני טיפולים ו / או stressors מתווספים בו זמנית בנקודת זמן 4 שעות. כל הפרדיגמות בסוף בנקודת זמן 24 שעות, ותאים קבועים עם paraformaldehyde 4%. ( ב ) משולש תרבות assay פרדיגמה. BECs (10,000 תאים / טוב) הם מצופה הנשיאשל טיפולים הרצוי ב 0 h. בשעה 4 שעה נקודת pericytes (2,000 תאים / טוב) מתווספים בעדינות לצלחת. בשעה 7 שעות האסטרוציטים (10,000 תאים / טוב) מתווספים לצלחת, ואחריו תוספת של לחצים רלוונטיים ב 11 שעות. תאים מודגרת אז עד 24 שעות נקודת זמן קבוע עם paraformaldehyde 4%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח כמותי. כל התמונות נפתחות על פיג 'י ImageJ ו אצווה מעובד באמצעות Analiogenesis Analyzer 22 . כימות האורך הכולל ומספר רשתות משתלבים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של t את דמותו.
איור 3: מבחני meshwork הפרעה: תמונות נציג. כל התמונות נגזרות ניסויים ניצול פרדיגמה 2, הפרעה meshwork. ( א ) תמונות נציג של hCMEC / D3 תאים מצופה ומטופלים עם בקרת הרכב (VC), EGF (100 ננומטר), oAβ (100 ננומטר), או oAβ (100 ננומטר) + EGF (100 ננומטר). תמונות בהגדלה 10X, קנה מידה בר = 100 מיקרומטר. ( B ) תמונות נציג של BECs העכבר הראשי מצופה ומטופלים עם VC, EGF (100 ננומטר), oAβ (100 ננומטר) או oAβ (100 ננומטר) + EGF (100 ננומטר). תמונות בהגדלה 10X, ירוק = BECs, קנה מידה בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Keep-together.within-page = "1"> 
איור 4. assay תרבות משולש: תמונות נציג. ( א ) תמונות נציג של hCMEC / D3 תאים, pericytes האדם העיקרי, האסטרוציטים האנושיים הראשי מצופה ומטופלים עם VC, EGF (100 ננומטר), oAβ (100 ננומטר), או oAβ (100 ננומטר) + EGF (100 ננומטר) על פי הפרדיגמה המתוארת באיור 1 ב . תמונות בהגדלה של 10X, ירוק = BECs, כחול = pericytes, ואדום (pseudocolor) = אסטרוציטים. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות המתוארות ניתן להשתמש כדי לענות על כמה שאלות ביולוגיות היסוד סביב כיסוי המוחי 24 . באופן ספציפי, הם יכולים לזהות אילו קולטנים מסלולי איתות לשחק תפקיד אנגיוגנזה, כיסוי כלי הדם ברקמת סרטן, ותאי האנדותל היקפיים הרלוונטיים למוח. הדוגמאות כוללות קולטני גורמי גדילה אנגיוגניים, תחמוצת חנקן, סיגנל מיטוגן המופעל על-ידי קיטאז של מיטוגן וסגירת סידן 25 , 26 , 27 . HCMEC / D3 ו BECs העיקרי ניתנים לשינוי גישות מציאה גנטית כדי להקל על מאמץ זה 18 . תובנה מכנית ניתן להשיג מ BECs culturing מבודדים עכברים עם מציאה מלאה תא אנדותל ספציפי של חלבונים מפתח עם השיטות המתוארות. יתר על כן, מבחני התרבות משולשת לאפשר ניתוח מעמיק של האסטרוציט ואת ההשפעה pericyteעל תפקוד תאי האנדותל במוח. לדוגמה, pericytes ו astrocytes יכול להשפיע על הקמת רשת כמו meshwork דרך ייצור של מתווכים מסיסים ( למשל אנגיופויטין, ציטוקינים) וגם באמצעות תמיכה מבנית 24 .
מערכת המודל יכול להיות מיושם גם על מחקר המחלה. לדוגמה, המערכת יכולה לתת מענה לשאלה האם לחצים מדאיגים על-רקע מחלות והזדקנות מוסיפים אקסוגניים לעידוד אנגיוגנזה ו / או הפרעה ברשת. מדחסים יכולים להיות רלוונטיים להפרעה ספציפית, כגון oAβ, או הכללה כללית יותר, למשל מי חמצן, ציטוקינים. פרדיגמת התרבות המשולשת מוסיפה נדבך נוסף במורכבות, אשר עשוי לשפר את ההבנה של מנגנונים קריטיים למחלות הרלוונטיים המשפיעים על הדינמיקה של BBB: הגדרת אם לחצים רלוונטיים למחלה מפעילים אסטרוציטים ופריציטים כדי לשבש את תפקוד ה- BEC. עבור מבחני תרבות אחת בודדת ושלוש, תאים ראשוניים יכולים להיות מבודדים הלוך ושובמ 'מודלים לחקות הפרעות של עניין כדי לתכנן עוד אפקטים פונקציונליים.
ישנם מספר שיקולים חשובים עבור התאמת meshwork כמו היווצרות הבדיקות הפרעה סוגי תאים שונים. הראשון הוא צפיפות זריעת. עבור כל קו תאים חדש, צעד ראשון קריטי הוא אופטימיזציה של צפיפות זריעת במטריצה קרום במרתף עבור מבחני התרבות יחיד ושלוש. מבנה הרשת הוא מספר התאים תלויים, כמו גם גבוה מדי נמוך מדי צפיפות התא התוצאה חוסר מבנה meshwork. יתר על כן, גם עבור שיטות ותאים המתואר כאן, זה נבון לנהל השוואות צפיפות תאים כדי להסביר את כל השינויים במעבדה עיבוד התא לפני ביצוע ניסויים בקנה מידה גדול. השיקול השני הוא רצף הזמני של היווצרות רשת. הניסויים קורס זמן צריך להתבצע כדי לזהות מתי meshwork כמו מבנים טופס לשפל. בדרך כלל, רשת קשוחה-lהיווצרות ike הוא ציין ב ~ 4 שעות. השיקול השלישי הוא בחירת המדיום לפני הזריעה ובמהלך הניסוי. BECs, pericytes ו astrocytes הם מתורבת בינוני המכיל FBS ו שפע של גורמי גדילה אופטימיזציה של צמיחת תאים. למרות זאת הוא העדיף גורם מגורמי צמיחה לרעוב את BECs 24 שעות לפני הניסוי, עבור סוגי תאים מסוימים זה לא יכול להיות ריאלי. לדוגמה, תאים ראשוניים עם נקישות קולטן ספציפיים עשויים לדרוש גורמים נוספים כדי להקל על הצמיחה. שיקולים אלה חלים גם במהלך הניסוי, ובחירת המדיום תלויה בשאלה הספציפית הנחקרת. עם זאת, כאשר חוקרים את התפקיד של addorsously הוסיף stressors וטיפולים פוטנציאליים, במיוחד גורמי גדילה או תרכובות קשורות, השימוש בסרום גורם הצמיחה גורם חופשי במהלך הניסוי הוא אידיאלי. בנוסף, זה עשוי להיות אפשרי לצמצם את אורך הרעב בסרום של BECs, אבל זה תלוי sigנתיב naling תחת חקירה. שיקול רביעי הוא העיתוי של הוספת לחצים או טיפולים. באשר לבחירה של טיפול בינוני, תזמוני מבוססים על השאלה המדעית. Assay ההשתלבות meshwork מקביל יותר אנגיוגנזה, בעוד assay הפרעה רשת עשוי להיות רלוונטי יותר עבור BBB בוגרת. מניסיוננו, פעם הוקמה, מבחני לייצר נתונים עקביים בין ניסויים. בעיות עקביות הם לעתים קרובות עקב פערים צפיפות זריעת בין אנשי, וחשוב, אם רכיבים של ריאגנטים בינוניים או רלוונטיים הם ביודעין השתנה.
ישנן מגבלות ותחומים של פיתוח נוסף של השיטות המתוארות. כוח של הליך זה הוא ריכוזים נמוכים של לחץ ( כלומר oAβ) יכול להיות מנוצל כדי לגרום הפרעה meshwork כלומר nM לעומת מיקרומטר, אשר רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, כוח זה עשוי גם להיות מגבלה. ואכן, גבוה יותר, בעדיין לא רעיל, ריכוזי oAβ עשוי להידרש למטרות סריקה תרופה כדי להגביר את הרגישות, אשר יחולו על מחלות אחרות רלוונטיים stressors. מגבלה של השיטה היא כי meshwork של תאים יציבה רק מעל 24 שעות בפרוטוקולים המתוארים. ואכן, לאחר 24 שעות, רשת התא מתחילה להתנוון. לכן, אנו מוסיפים oAβ לאחר זמן קצר יחסית (4 שעות) לאחר היווצרות meshwork, כדי לאפשר זמן הדגירה הכולל של oAβ של 18 שעות. אולי צפיפות זריעת תאים נמוכה יותר עשויה לאפשר פרוטוקולי טיפול ארוכים יותר. מגבלה פוטנציאלית נוספת היא כי מערכת במבחנה לא יכול לחקות רשת meshwork יציבה כפי שנצפה in vivo . בידוד התאים מעכברים בגילאי עשוי לחקות מקרוב את התסריט vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ליאון טאי ממומן על ידי אוניברסיטת אילינוי שיקגו start-up קרנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
