Summary
रक्त मस्तिष्क बाधा कवरेज को बनाए रखना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के होमियोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल इन विट्रो तकनीकों में वर्णन करता है कि रक्त और मस्तिष्क बाधा कवरेज को नियंत्रित करने वाले मौलिक और रोग प्रक्रियाओं को चित्रित करने के लिए।
Abstract
रक्त मस्तिष्क की बाधा (बीबीबी) कवरेज केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के होमोस्टेसिस में एक केंद्रीय भूमिका निभाती है। BBB गतिशील रूप से एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसेट्स और मस्तिष्क एन्डोथेलियल सेल (बीईसी) द्वारा बनाए रखा जाता है। यहां, हम बीबीबी के अमर मानव बीईसी, एकमात्र संस्कृतियों और एक मानवीय ट्रिपल कल्चर मॉडल (बीईसी, एस्ट्रोसाइट्स और पेरीसाइट्स) की एकल संस्कृतियों का उपयोग करके बीबीबी कवरेज का आकलन करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। रोग राज्यों के लिए एशेज के प्रयोज्यता को उजागर करने के लिए, हम ऑलिगॉमेरिक अमाइलॉइड-बीओ (ओएएबी) के प्रभाव का वर्णन करते हैं, जो बीबीबी कवरेज पर अल्जाइमर रोग (एडी) की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है। इसके अलावा, हम तकनीकों के ड्रग स्क्रीनिंग क्षमता को रोशन करने के लिए एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) का उपयोग करते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि सिंगल और ट्रिपल कल्चरल बीईसी मूलभूत स्थितियों के तहत मेषवायर की तरह ढांचे का निर्माण करते हैं, और यह oAβ इस सेल मेषवर्क के गठन में बाधित होता है और पूर्वनिर्मित जाल संरचनाओं को बिगड़ता है,लेकिन ईजीएफ इस व्यवधान को रोकता है इस प्रकार, वर्णित तकनीकों को बीबीबी कवरेज को विनियमित करने वाले मौलिक और रोग-संबंधित प्रक्रियाओं को विदारक बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
Introduction
सेरेब्रल केशिलरी के रक्त-मस्तिष्क की बाधा (बीबीबी) रक्त-से-मस्तिष्क के संपर्क का सबसे बड़ा अंतर है और केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 , 2 के होमोस्टेसिस में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। बीबीबी पर गतिशील प्रक्रियाएं रक्त से अवांछित अणुओं को तेज करने से रोकती हैं, सीएनएस से अपशिष्ट उत्पादों को हटा दें, आवश्यक पोषक तत्वों की आपूर्ति करें और सीएनएस को संकेतन करने वाले अणुओं को संवारें, और 1 , 2 , 3 , 4 , 5 के न्यूरोइन्वेल्ममैट्यूट को विनियमित करें। बीबीबी का नुकसान बुढ़ापे और अल्जाइमर रोग (एडी), मल्टीपल स्केलेरोसिस और स्ट्रोक 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , सहित कई न्यूरोडेगरेनेटिव विकारों के दौरान प्रचलित है।Ass = "xref"> 6 इसलिए, बीबीबी रोग एक neurodegenerative विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है, जिसमें चिकित्सीय लक्ष्य भी शामिल है।
BBB के होमोस्टेटिक कार्यों के लिए पोत कवरेज को बनाए रखना महत्वपूर्ण है हालांकि, vivo और इन विट्रो डेटा में संघर्ष में यह है कि क्या neurodegenerative विकारों में शामिल प्रक्रियाएं उच्च या निम्न BBB कवरेज 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , विशेष रूप से एडी में हैं। इसलिए, बीबीबी कवरेज की गतिशीलता का आकलन करने और अधिक व्यापक रूप से समझने के लिए प्रासंगिक सेल प्रकारों का उपयोग कर इन विट्रो मॉडलों के विकास के लिए एक मजबूत तर्क है। सेरेब्रल केशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसेट्स और मस्तिष्क एन्डोथेलियल कोशिका (बीईसी) से बना होती हैं
यहां, हमारे पिछले तरीकों 17 में बीईसी कवरेज और मेषवर्क जैसी संरचनाओं का मूल्यांकन किया गया है जो अमर मानव बीईसी की एकल संस्कृतियों, प्राथमिक माउस बीईसी की एकल संस्कृतियों, और एक मानवकृत ट्रिपल कल्चरबीबीबी के मॉडल (बीईसी, एस्ट्रोसाइट्स और पेरीसाइट्स) लक्ष्य ओएएओ के हानिकारक प्रभाव को प्रदर्शित करना था, जिसे एई विकास के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता माना जाता है, बीईसी कवरेज पर। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) के सुरक्षात्मक प्रभाव एक चिकित्सीय स्क्रीनिंग टूल के रूप में तकनीक की क्षमता पर प्रकाश डाला गया है। तकनीक में बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए कई व्यापक अनुप्रयोग हैं जिनमें शामिल हैं: 1) एंजियोजेनेसिस और पोत कवरेज पर विशिष्ट मार्गों की भूमिका को चित्रित करना, 2) रोग के प्रभावों का मूल्यांकन करना और एंजियोजेनेसिस और पोत कवरेज पर उम्र बढ़ने-संबंधित कारकों का मूल्यांकन करना, और 3) औषधीय लक्षित करता है।
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Protocol
सभी प्रयोग इलिनोइस विश्वविद्यालय, शिकागो की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के प्रोटोकॉल का पालन करते हैं।
1. सामान्य तैयारी
नोट: मस्तिष्क microvascular endothelial सेल लाइन (एचसीएमईसी / डी 3) एक बड़े पैमाने पर विशेषता अमर मानव बीईसी लाइन 14 , 15 , 16 , 18 , 1 9 है । संस्कृति एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं को कोलेजन प्रकार I (बछड़ा त्वचा, 0.1% समाधान के 0.1% समाधान के साथ लेपित टिशू कल्चर फ्लास्क पर सीए 2 + और एमजी 2+ युक्त) हैक बैलेंस्ड नमक समाधान (एचबीएसएस) में बेसल एंडोथेलियल ग्रोथ बेसल मध्यम (ईबीएम -2) प्रति 500 मिलीलीटर प्रति मिनट की आपूर्ति की गई वृद्धि कारक की खुराक की कुल मात्रा का 2-5% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस), 10% एस्कॉर्बिक एसिड, 10% जेजेनेटिसिन सल्फेट, 25% हाइड्रोकार्तिसोन और 1/4 से युक्त [ संवहनी एन्डोथेलियम जीआरओवथ कारक (वीएजीएफ), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक 1 (आईजीएफ -1) और मानव मूल फाइब्रोब्लास्टिक विकास कारक (बीएफजीएफ), सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एफबीएस के साथ ईबीएम -2 माध्यम और वृद्धि कारकों को "ईबीएम -2 पूर्ण" कहा जाता है ईबीएम -2 बिना एफबीएस और सप्लीमेंट्स को "ईबीएम -2 बेसल" कहा जाता है पूर्ण संगम पर, एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं ~ 1 x 10 5 कोशिका / सेमी 2 हैं ।
- 5 मिनट के लिए 5 एमएल ट्रिप्सिन / ईडीटीए (0.25%) के साथ टुकड़ी के बाद सीए 2 + और एमजी 2+ के बिना एचबीएसएस के साथ पहले एचबीएससी के साथ 1 सेमी के अनुपात में एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं को पैसेंजर करें। ईबीएम -2 पूर्ण (1: 1 निष्पक्षीकरण) का उपयोग कर ट्रिप्सिन को बेअसर करना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 290 xg पर अपकेंद्रित्र; सतह पर तैरनेवाला त्यागें 1: 5 अनुपात में ईबीएम -2 पूर्ण और पुनः प्लेट में गोली को फिर से खोलें
- सप्लायर प्रोटोकॉल [ सामग्रियों की सामग्री ] के अनुसार संस्कृति को प्राथमिक मानव स्थायीताएं और एस्ट्रोसाइट्स। संस्कृतियोंईपीबीएस और पेर्सेलेटे ग्रोथ सप्लीमेंट के साथ पेरिसर्टी बेसल माध्यम में पेरिसिट्स।
- Astrocyte वृद्धि कारकों वाले एस्ट्रोसाइट मध्यम में मानव एस्ट्रोकसाइट्स संस्कृति। कोशिका पालन के लिए 3 एमएल पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के साथ लेपित टिशू कल्चर फ्लास्क में पेरर्इसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स दोनों संस्कृति और 2 से 5 के बीच के कक्षों का उपयोग करते हैं।
- 7 चूहों को मारना और संदंश के साथ मस्तिष्क उपजी और सेरेबैला को हटा दें; मेज़ पर मस्तिष्क को ध्यान से रोल करके मैनिंजेस को अलग करें एचआईपीईएस (मस्तिष्क प्रति 5 एमएल) के साथ न्यूनतम बेसिक एजेन्शियल माडियम (एमईएम) में पेट्री डिश में शेष मस्तिष्क के ऊतक को एक बाँझ रेज़र ब्लेड के साथ छिड़कना। संदर्भित प्रोटोकॉल 20 के अनुसार 2-माह-पुराने C57BL / 6J चूहों से प्राथमिक माउस बीईसी अलग करें
- 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कीमा बनाया हुआ मस्तिष्क के ऊतकों को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 290 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक पपैन (मस्तिष्क प्रति 833.33 μL) और डीएनसे (मस्तिष्क प्रति 41.7 μL) में ऊतक सेते हैं।समाधान, ऊतक को पचाने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
- क्रमशः 1 9 और 21 गेज सुई के माध्यम से, एक 22% गोजाइन सीरम अल्ब्युमीन (बीएसए) समाधान के साथ 1: 1 अनुपात पर मिश्रण करें, और 460 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1360 xg पर सेंटीफ्यूज करें।
- परिणामी गोली को 1 एमएल ईबीएम -2 में पूर्ण और अपकेंद्रित्र में 4 0 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 290 xg फिर से 1 एमएल ईबीएम -2 में फिर से फिर से फिर से और कोशिकाओं (1 मिलीलीटर / अच्छी तरह) को कोलेजन (~ 1 मस्तिष्क प्रति अच्छी तरह से) के साथ लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटों पर रखें।
- बाद में 24 घंटे की जगह ईबीएम -2 के साथ पूरी तरह से 4 ग्राम / एमएल पुरिमोसीन हाइड्रोक्लोराइड युक्त बदलें; 2 दिनों के बाद ईबीएम -2 के साथ पूरा करें। प्राथमिक बीईसी एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं के लिए सुसंस्कृत हैं और 1 x 10 5 कोशिकाओं / सेमी 2 पर पूर्ण संगम पर हैं
- ओएएबी के एक 100 सुक्ष्ममापी, परख से पहले 24 घंटे तैयार करें।
नोट: oAβ ए के बीमारी संबंधी रूप माना जाता है। ओएएबी के लिए, डाहलग्रे द्वारा वर्णित अच्छी-विशिष्ट तैयारी का उपयोग करेंएन एट अल 21 - तहखाने झिल्ली स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस और 140 μL तहखाने प्रति ट्यूब प्रति ट्यूब पर बाँझ पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स (8 ट्यूब) में रात भर में पिघलना। प्रत्येक पट्टी को रिफ्रेश करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें 4 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी तरह से एक प्लेट पर एक पट्टी पिघलना, परख से 24 घंटे पहले। दृढ़ता से बचने के लिए विंदुक युक्तियों को प्री-कूल रखें
नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के सभी हैंडलिंग को तेजी से स्थिरता से बचने के लिए बर्फ पर किया जाना चाहिए। जैसा कि बेसमेंट झिल्ली के प्रति 10 μL प्रति उपयोग किया जाता है परख के दिन, प्रत्येक पट्टी एक 96-अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त होती है। - ईबीएम -2 बेसल में पूरी तरह से मिला हुआ बीईसी से छुटकारा पाने से 24 घंटे पहले सेते हैं।
नोट: तर्क यह है कि: ईबीएम -2 पूर्णतया पूरक कारक और एफबीएस शामिल है जो इष्टतम सेल विकास को बढ़ावा देने के उद्देश्य से है; हालांकि, सेल विकास को बढ़ावा देने वाले एक समान आणविक मार्ग मस्तिष्क के एंडोथेलियल सेल कवरेज और गतिशीलता के लिए भी महत्वपूर्ण हैं, दोनों उपस्थिति में और एब्सएक तनाव का निशान इसलिए हम सीरम और अनुपूरक सेल्युलर सिग्नलिंग पथों के अवशिष्ट सक्रियण के भंग प्रभाव को कम करने के लिए बीईसी भूखे हैं। ध्यान देने से, कोशिकाओं को संक्षेप में (5 मिनट) परख से पहले ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के निष्क्रिय होने के दौरान एफबीएस के संपर्क में आया। बीईसी के विपरीत, सीरम भुखमरी (ताई प्रयोगशाला, अप्रकाशित टिप्पणियों) के जवाब में इन कोशिकाओं के प्रकार की वृद्धि और रिश्तेदार अस्थिरता के कारण अलग-अलग कारकों की आवश्यकता के कारण पेरिसट्स और एस्ट्रोसाइट्स भूखे नहीं होते हैं।
नोट: एकल और ट्रिपल कल्चर मेषवर्क फॉर्मेशन और व्यवधान एक्शन के लिए परख के दौरान EBM-2 बेसल का उपयोग किया जाता है। Confounding तनाव या इलाज निर्भर सिग्नल को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
2. मेषवर्क की तरह संरचना और विघटन आश्रय
- एकल बीईसी संस्कृति assays:
नोट: बीईसी की एकल संस्कृतियों के लिए तीन अलग-अलग मानदंडों को चित्र 1 ए में दिखाया गया है - परख के दिन, 10 μL / अच्छी तरह से 9 6-अच्छी तरह प्लेटों के तल में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को विंदित करें और 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें।
- 10 एमएम के स्टॉक समाधान को उत्पन्न करने के लिए 10 μL डीएमएसओ में लैओफिलाइज्ड ग्रीन सेल ट्रैकिंग डाईज (निषिद्ध सामग्री देखें) निलंबित करें, और ईबीएम -2 बेसल में 10 माइक्रोन (1: 1000) को कम करें। पूरी तरह से मिला हुआ फ्लास्क से मीडिया निकालें और ईबीएम -2 बेसल के साथ प्रतिस्थापित करें, जिसमें ग्रीन सेल ट्रैकिंग डाई (75 सेंटीमीटर 2 फ्लास्क के लिए 5 एमएल) है। परख की शुरुआत से 20 मिनट पहले, ग्रीन सेल ट्रैकिंग डाई के साथ प्री-लोड बीईसी।
- कोशिकाओं को 20 से 30 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस से सेते हैं, सेल ट्रैकिंग डाई के माध्यम से मध्यम निकालें और स्टेप 1.1 में वर्णित कोशिकाओं को अलग करें। ईबीएम -2 युक्त 10% एफबीएस और सेंटीफ्यूज के साथ मीडिया को 2 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 240 xg पर बेअसर करना ईबीएम -2 बेसल के 1 एमएल में गोली को फिर से खोलें
- 10,000 कोशिकाओं / ईबीएम -2 बेसल (सभी मानदंडों में 0 घंटे के समय बिंदु) में 96-अच्छी तरह से थाली में बीईसी प्लेटें।
नोट: प्रतिमान का उपयोग किया जा रहा है, उपचार, तनाव, या वाहन नियंत्रण निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर जोड़ा जाता है। सभी मानदण्डों में, बाद के विश्लेषण ( उदाहरण के लिए, एलिसा विश्लेषण) के लिए माध्यम काटा जाता है और कोशिकाओं को 24 घंटे में फॉस्फेट बफररड सीरम (पीबीएस) में ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड के साथ तय किया जाता है। जाल के गठन पर ओएएबी के शब्द के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, प्रोटोकॉल को ओएएओ के साथ मिला हुआ सेल संस्कृति फ्लास्क को पूर्व-सेवन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और फिर मेषवर्क संरचना मानदंड (+/- oAβ) का प्रदर्शन करता है।
नोट: सभी नमूनों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम मात्रा 70 μL है। सभी उपचार (ओएएओ, ईजीएफ, आदि ) अपने संबंधित कुओं में एक 1:20 कमजोर पड़ने यानी प्रति उपचार 3.5 μL में जोड़ दिए जाते हैं। प्रतिमान 1 के लिए, कोशिकाओं को सेल निलंबन समाधान में 63 μL / w पर जोड़ा जाता हैell। तत्काल oAβ, वांछित उपचार, और नियंत्रण 3.5 μL / अच्छी तरह से प्रत्येक में जोड़ा जाता है, कुल 70 μL देते हैं। प्रतिमान 2 के लिए, सेल निलंबन के 63 μL और उपचार के 3.5 μL ( जैसे 100 एनजी / एमएल ईजीएफ) 0 घंटे के समय में जोड़ा जाता है। 4 एच ऊष्मायन के बाद, एक ओएबी स्टॉक के 3.5 μL जोड़ा जाता है ( उदाहरण के लिए 100 एनएम फाइनल ओएए बी एकाग्रता, 2 माइक्रोग्राम ओएएबी स्टॉक के 3.5 μL)। पैरामाइम 3 के लिए, सेल निलंबन के 63 μL 0 घंटे के समय में जोड़ा जाता है और 4 घंटे, ओएएबी पर और वांछित उपचार 3.5 μL / अच्छी तरह से प्रत्येक में जोड़ा जाता है, जिससे कुल 70 μL इन खंडों को उपचार के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि केवल एक उपचार की आवश्यकता होती है, तो सेल निलंबन मात्रा को 66.5 μL (10,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से बनाए रखने) में समायोजित किया जा सकता है और उपचार मात्रा 3.5 μL पर रह सकती है।
नोट: बीईसी के एकल संस्कृति के एश्ले के अतिरिक्त, हमने विकास किया हैप्रासंगिक तनावों ( जैसे ओएए बीओ) के लिए preformed नेटवर्क के भीतर बीईसी, पीरीसाइट्स, और एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए ट्रिपल कल्चर परख प्रतिमान ( चित्रा 1 बी ) एड। बीईसी 0 घंटे में वांछित उपचार की उपस्थिति में चढ़ाया जाता है। 4 घंटे में, प्लेटिलाईट को धीरे से प्लेट में जोड़ा जाता है। 7 घंटे में, एस्ट्रोसाइट्स को प्लेट में जोड़ दिया जाता है, इसके बाद 11 घंटे में एक तनाव का जोड़ा जाता है। तब कोशिकाओं को 24 घंटे का समय बिताया जाता है।
नोट: ट्रिपल कल्चर एसेल्स के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी कोशिकाओं को एक ही समय में मिला हुआ हो। परख की एक हफ्ता पहले मानव एस्ट्रोसाइट्स और पीरीसाइट्स सुसंस्कृत होना चाहिए, जबकि एचएसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं को परख की तारीख से 4-5 दिन पहले चढ़ाया जाना चाहिए या पास होना चाहिए। इसके अलावा, फेनोोटाइपिक ड्र्रिफ्ट से बचने के लिए कम मार्ग (2-5) प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
- एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं के लिए ग्रीन सेल ट्रैकिंग डाई वर्किंग सोल्यूशन को 20 मिनट पहले परख शुरू करने के लिए जोड़ें। 10 में एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं पर प्लेट लगाएं, 000 कोशिकाओं / ईबीएम -2 बेसल (0 घंटे समय बिंदु) में अच्छी तरह से। उपयोग की जाने वाली मात्रा 45 μL की सेल निलंबन और 3.5 μL उपचार ( अर्थात 50 मिलीग्राम / एमएल, 100 एनजी / एमएल या 1000 एनजी / एमएल के स्टॉक जो कि 20 गुना अधिक केंद्रित होते हैं) की अंतिम ईजीएफ सांद्रता में इस्तेमाल होता है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 एच के ऊष्मायन के बाद, मानव प्राथमिक पेरिसलाईट्स के लिए ब्लू सेल ट्रैकिंग डाई वर्किंग सोल्यूशन (ईबीएम -2 बेसल में 10 माइक्रोन सेल ट्रैकर नीला) जोड़ें। 4 घंटे के समय बिंदु पर (सेल ट्रैकिंग डाई के साथ ~ 30 मिनट ऊष्मायन), धीरे-धीरे 2 र्इपीआरटीइट्स / एचसीएमईसी / डी 3 युक्त 6 एलएलएल / वेल के वॉल्यूम में अच्छी तरह से जोड़ें।
- अतिरिक्त 2.5 एच ऊष्मायन (0 घंटे समय बिंदु से कुल 6.5 घंटे) के बाद, मानव प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स में नारंगी सेल ट्रैकिंग डाई काम करने वाले समाधान (ईबीएम -2 बेसल में 10 माइक्रोन सेल ट्रैकर नारंगी) जोड़ें। 7 घंटे के समय में, धीरे-धीरे 12 μL मात्रा में प्लेट में 10,000 एस्ट्रोसाइट्स / अच्छी तरह से जोड़ें। इसलिए, एंडोथिलियल कोशिकाओं के लिए समग्र सेलुलर अनुपात: पेरिसिट: एस्ट्रोसाइट्स iएस 5: 1: 5 इसके अलावा, इस बिंदु पर प्राप्त मात्रा 66.5 μL है।
- ओएए बीओ (3.5 माइक्रोन का 100 माइक्रोन स्टॉक) 4 एच बाद में (कुल 11 घंटे से 0 घंटे का समय)।
- कोशिकाओं को 13 घंटे बाद पीबीएस में ताजे तैयार 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड में ठीक करें।
सावधानी: पैराफार्मैडीहाइड को संभालने के दौरान सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने और चश्मा पहनें
3. मात्रा
- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके 50% अधिकतम शक्ति पर 2 एस एक्सपोज़र समय के साथ 1.6 एक्स बढ़ाई पर 96-अच्छी तरह से थाली की पूरी तरह से प्रतिदीप्ति छवियों को कैप्चर करें।
नोट: समतुल्य माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, व्यापक विश्लेषण के लिए संपूर्ण अच्छी तरह से कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है। - मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, ImageJ एंजियोजेनेसिस एनालाइज़र प्लगइन 22 का उपयोग करके शाखाओं की संख्या, मैश की संख्या और कुल सेल लंबाई (इन पाठों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवा द्वारा नियंत्रित किया जाता हैफिर से) नीचे वर्णित है। इस चरण के विस्तृत दृश्य प्रोटोकॉल को चित्र 2 में प्रदान किया गया है।
- सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करके फिजी इमेजजे खोलें।
- टूलबार के अंत में स्थित डबल रेड फॉरवर्ड बायाँ पर क्लिक करें, फिर "एंजियोजेनेस एनालाइज़र" पर क्लिक करें
- छवि फ़ाइलों के साथ फ़ोल्डर का चयन करें, "ओपन" पर क्लिक करें
- जब "विश्लेषण के लिए सेटिंग्स" बॉक्स दिखाई देता है, तो "ओके" पर क्लिक करें
- जब "प्रसंस्करण छवियाँ" बॉक्स दिखाई देता है, जो संसाधित होने वाली छवियों की संख्या को इंगित करता है, "ओके" पर क्लिक करें
- जब "बैच प्रगति विंडो" बॉक्स दिखाई देता है, जो अनुमानित प्रसंस्करण समय को इंगित करता है। इस समय के दौरान प्रोग्राम शाखाओं की संख्या, मूस की संख्या, और कुल सेल लंबाई सहित आउटपुट को मात्रा देता है।
नोट: एक बार सभी छवियों की मात्रा निर्धारित हो जाने पर, परिणाम फ़ाइल मूल छवि फ़ोल्डर में एक स्प्रेडशीट दस्तावेज़ के रूप में दिखाई देगी। - चुनते हैंस्प्रैडशीट फ़ाइल जिसमें परिणाम होते हैं और शाखाओं की संख्या, मेस और समूहों के बीच कुल सेल लंबाई की तुलना करते हैं।
नोट: ट्रिपल कल्चर परख में इमेजजे का उपयोग पर्सिलीटे / एस्ट्रोसाइट कवरेज और संख्या का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। छवियां एक अंधे हुए प्रयोगकर्ता द्वारा थ्रेसहोल्ड होती हैं और "कणों का विश्लेषण" रीडआउट बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ़ंक्शन हैं। एओ 17 या अन्य मार्करों के लिए फिक्स्ड कोशिकाओं और ट्यूब की तरह ढांचे को भी इम्यूनोस्टाईड किया जा सकता है।
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Representative Results
एकल संस्कृतियों में, दोनों एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं ( चित्रा 3 ए ) और प्राथमिक माउस बीईसी ( चित्रा 3 बी ) दोनों अच्छी तरह से मशहूर जैसी संरचनाएं बनाती हैं। संरचनाओं को एक दूसरे से जुड़े नोड्स ( चित्रा 3 ) के एक मशोज़ द्वारा चिह्नित किया जाता है। वर्णित सभी मानदण्डों में ( चित्रा 1 ), मस्तक की तरह संरचनाएं नियंत्रण समूहों में 24 घंटे के बाद समान होती हैं, ~ 20 मेषवक्र जैसी संरचनाएं जिनमें कुल सेल्यूलर लंबाई ~ 10,000 पिक्सल होती है
रोग संबंधी तनाव के तरीकों के प्रयोज्यता को उजागर करने के लिए, ओएएबी एचसीएमईसी / डी 3 में जोड़ा गया था और दो पैराग्ज में प्राथमिक माउस बीईसी सेल मेशवर्क गठन (पैराडाइम 1) के विघटन में, ओएएबी और कोशिकाओं को उसी समय चढ़ाया जाता है। प्रीफोर्मेड मेषवर्क (पैराडाइम 2) के बाधा में, ओएए बीओ जोड़ रहा हैकोशिकाओं चढ़ाना के बाद एड 4 घंटे ( चित्र 1 ए देखें)। 100 एनएम पर ओए बी ने मेशैचर जैसी संरचना और पूर्वनिर्धारित मेषवर्क के अवशोषण ( चित्रा 3 ए , 3 बी ) के विघटन को प्रेरित किया। उदाहरण के लिए, दोनों मानदण्डों में एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, कुल सेल कवरेज / लंबाई की मात्रा का ठहराव 16-20% कम है, जो 100 एनएम ओएए 17 है । इसके अलावा, दोनों मानदण्ड 17 में 100 एनएम ओएएबी के साथ मैश की संख्या 40% कम हो जाती है। इस प्रकार, एक रोग संबंधित तनाव से मानव और चूहों बीईसी कवरेज पर एक समान हानिकारक प्रभाव पैदा करता है।
सेल कल्चर सिस्टम का एक मुख्य लाभ यह है कि रोगों से संबंधित क्षति को रोकने वाले कारकों या उपचारों की पहचान करने की क्षमता है, जो फिर से vivo परीक्षण में आगे बढ़ सकते हैं। सिद्धांत प्रयोग के एक प्रमाण के रूप में, ओएएओ प्रेरित चा को रोकने के लिए मुख्य एंजियोजेनिक वृद्धि कारकों के प्रभावपोत कवरेज के लिए nges 17 मूल्यांकन किया गया ईजीएफ ने एचएसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं को ओएएबी प्रेरित नुकसान रोका। उन आंकड़ों के आधार पर, ईजीएफ को एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग करके एक निवारण प्रतिमान में परीक्षण किया गया था जो कि AD- जैसे विकृति विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं का recapitulates। ईजीएफ उपचार ने संज्ञानात्मक और बीबीबी घाटे को रोक दिया, जिसमें पोत अध: पतन 23 भी शामिल है । इन आंकड़ों में विवोरो प्रणाली के लिए इन विट्रो प्रणाली की अनुमानित क्षमता का समर्थन किया गया है। वर्तमान में, हम स्क्रीनिंग के लिए सभी तीन विकसित मानदंडों का उपयोग करते हैं: 1) जाल गठन, 2) सेल मैशॉवक व्यवधान की रोकथाम, और 3) मेशविक व्यवधान का एक साथ उपचार जैसा कि चित्रा 3 में उजागर किया गया है, ईजीएफ अमर और प्राथमिक माउस बीईसी संस्कृतियों में ओएए-प्रेरित क्षति से बचा सकता है।
बीबीबी में बीईसी, पेरिसेट्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल होते हैं जो संपूर्ण मरीब्रोवास्क में एकत्रित रूप से योगदान करते हैंUlar कवरेज इसलिए, इन इन विट्रो सिस्टम के एक अनुकूलन में सभी तीन BBB सेल प्रकारों का समावेश है। हमारी ट्रिपल कल्चर परख प्रतिमान एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं, प्राथमिक मानव पार्सेसाइट्स और प्राइमरी मानव एस्ट्रोकैट्स को शामिल करता है, जो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( चित्रा 1 बी ) में क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है। ट्रिपल कल्चर परख प्रतिमान में, एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाएं एकल संस्कृतियों के समान एक समान मेशैचर पैटर्न बनाती हैं, लेकिन नोड्स और कनेक्ट करने वाली शाखाओं ( चित्रा 4 ) से जुड़ी टर्इसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स के साथ। 100 एनएम ओएएबी के अतिरिक्त मेषवक्र व्यवधान (~ 10-15%) लाती है और बीईसी 17 से संपर्क करने वाले पेरीसाइट्स की संख्या में कमी। एकल संस्कृति परख मानदंडों से प्राप्त आंकड़ों के संबंध में, ईएजी-प्रेरित क्षति ईजीएफ उपचार से रोका जा रहा है। इस प्रकार, ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल एस्ट्रोसाइट्स के इंटरैक्टिव प्रभावों पर ध्यान केंद्रित अध्ययनों के लिए अनुकूल है, पेरिकजहाज़ की गतिशीलता पर ytes और बीईसी
चित्रा 1: मेष के निर्माण और व्यवधान के विश्लेषण के अवलोकन ( ए ) एकल संस्कृति परख मानदंड। पैराग्डम 1, मेशैचर फॉर्मेशन। सेल, तनाव और उपचार सभी प्लेट में 0 घंटे के समय में जोड़ा जाता है। पैराग्डम 2, मेशविक व्यवधान की रोकथाम। कोशिकाओं को वांछित उपचार की उपस्थिति में चढ़ाया जाता है, 4 घंटे के लिए सेवन किया जाता है, और 4 घंटे के समय में एक तनाव ज्वार किया जाता है। पैराग्डम 3, मेषवर्क व्यवधान का एक साथ उपचार कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है और उपचार के लिए 4 घंटे के लिए मश्शे-समान संरचनाएं तैयार करने की अनुमति दी जाती है और / या तनाव को 4 घंटे के समय में एक साथ जोड़ दिया जाता है। सभी मानदंडों को 24 घंटे के समय में समाप्त होता है, और कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मालाइहाइड के साथ तय किया जाता है। ( बी ) ट्रिपल कल्चर परख प्रतिमान बीईसी (10,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) पूर्व में चढ़ाया जाता हैवांछित उपचार के 0 घंटे 4 घंटे के समय में पेरिसलेट्स (2,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह) को धीरे से प्लेट में जोड़ा जाता है 7 घंटे में एस्ट्रोसाइट्स (10,000 कोशिकाएं / अच्छी तरह से) प्लेट में जोड़ दी जाती हैं, इसके बाद 11 घंटे में प्रासंगिक तनाव के अलावा। कोशिकाओं को तब 24 घंटे तक बिछाया जाता है और 4% पैराफॉर्मालाइहाइड के साथ तय किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: मात्रात्मक विश्लेषण सभी छवियां फिजी इमेजजे पर खुलती हैं और बैंग-संसाधित एंजियोजेनेसिस एनालाइज़र 22 का उपयोग कर रही हैं। कुल लंबाई और मैश की संख्या का उपयोग किया जाता है। कृपया टी के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा
चित्रा 3: मेषवर्क व्यवधान एसेज: प्रतिनिधि चित्र सभी छवियों पैरामाइम 2, मेषवर्क व्यवधान का उपयोग करने वाले प्रयोगों से प्राप्त होती हैं ( ए ) एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां जो वाहन नियंत्रण (वीसी), ईजीएफ (100 एनएम), ओए बीओ (100 एनएम), या ओएओओ (100 एनएम) + ईजीएफ (100 एनएम) के साथ चढ़ाया और इलाज की जाती हैं। 10 एक्स बढ़ाई हुई छवि, स्केल बार = 100 माइक्रोन। ( बी ) प्राइमरी माउस बीईसी की प्रतिनिधि छवियां जो वीसी, ईजीएफ (100 एनएम), ओएओओ (100 एनएम) या ओए बीओ (100 एनएम) + ईजीएफ (100 एनएम) के साथ चढ़ाया और इलाज किया गया है। 10x बढ़ाई में चित्र, हरा = बीईसी, स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4. ट्रिपल कल्चर परख: प्रतिनिधि चित्र ( ए ) एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं, प्राइमरी मानव पेरीसाइट्स, और प्राइमरी मानव एस्ट्रोसाइट्स के विधायक, ईजीएफ (100 एनएम), ओएओओ (100 एनएम), या ओएओओ (100 एनएम) + ईजीएफ (100 एनएम) चित्रा -1 बी में वर्णित प्रतिमान के अनुसार 10x बढ़ाई, हरा = बीईसी, नीले = परिरक्षकों और लाल (पीयूडोकोलोर) = एस्ट्रोसाइट्स पर छवियाँ स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
वर्णित विधियों का उपयोग मस्तिष्कशोधक कवरेज 24 के आस-पास के कई मौलिक जैविक सवालों के समाधान के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, वे यह पहचान कर सकते हैं कि कौन से रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग पथ एंजियोजेनेसिस, कैंसर के ऊतकों में पोत कवरेज, और मस्तिष्क से संबंधित परिधीय एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक भूमिका निभाते हैं। उदाहरणों में एंजियोजेनिक वृद्धि कारक रिसेप्टर्स, नाइट्रिक ऑक्साइड, एमटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज सिग्नलिंग और कैल्शियम सिग्नलिंग 25 , 26 , 27 शामिल हैं । इस प्रयास को सुविधाजनक बनाने के लिए एचसीएमईसी / डी 3 और प्राथमिक बीईसी आनुवंशिक पछाड़ना दृष्टिकोणों के अनुकूल हैं 18 । तंत्रज्ञानात्मक अंतर्दृष्टि, कृत्रिम बीईसी से प्राप्त की जा सकती है जो चूहों से पृथक या एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट पछाड़ना के साथ महत्वपूर्ण प्रोटीनों के वर्णित हैं। इसके अलावा, ट्रिपल कल्चर एसेज एस्ट्रोसाइट और पेरिसिल इन्फ्लूएंक का गहराई से विश्लेषण करती हैंई मस्तिष्क एंडोथिलियल सेल फ़ंक्शन पर। उदाहरण के लिए, पेर्सेराइट्स और एस्ट्रोसाइट्स घुलनशील मध्यस्थों ( जैसे एंजियोपोइटिन, साइटोकिन्स) के निर्माण के माध्यम से और स्ट्रक्चरल समर्थन 24 के माध्यम से मेषवर्क्स जैसी पोत निर्माण को प्रभावित कर सकते हैं।
मॉडल प्रणाली को बीमारी अनुसंधान के लिए भी लागू किया जा सकता है उदाहरण के लिए, सिस्टम यह बता सकता है कि क्या बीमारी और बुढ़ापे-संबंधित तनावों ने एक्सगोनेसिस और / या मेषवॉक विघटन को बढ़ावा दिया है या नहीं। स्ट्रेसर्स एक विशिष्ट विकार के लिए प्रासंगिक हो सकते हैं, जैसे ओएएओ, या अधिक सामान्यीकृत, जैसे हाइड्रोजन पेरोक्साइड, साइटोकिन्स। ट्रिपल कल्चर प्रतिमान जटिलता की एक अतिरिक्त परत जोड़ता है जो बीबीबी डायनेमिक्स को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण, रोग-संबंधित तंत्र की समझ में सुधार कर सकता है: यह बताएगा कि क्या बीमारी संबंधित तनाव से बीईसी फंक्शन को बाधित करने के लिए एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसेट सक्रिय होते हैं। एकल और ट्रिपल कल्चर एलेसेस दोनों के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं को अलग से अलग किया जा सकता हैमी माउस मॉडल जो कार्यात्मक प्रभाव को चित्रित करने के लिए ब्याज की विकारों की नकल करते हैं।
विभिन्न कोशिकाओं के प्रकारों के लिए मेषवेव जैसी रचना और व्यवधान के एशेज के अनुकूल होने के लिए कई महत्वपूर्ण विचार हैं। सबसे पहले बोने का घनत्व है प्रत्येक नई सेल लाइन के लिए, एक महत्वपूर्ण पहला कदम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सिंगल और ट्रिपल कल्चर एसेस दोनों के लिए बोने वाले घनत्व को अनुकूलित करना है। जाल गठन सेल संख्या निर्भर है, दोनों बहुत अधिक है और बहुत कम सेल घनत्व के परिणाम के रूप में मेष के निर्माण की कमी में। इसके अलावा, यहाँ वर्णित विधियों और कोशिकाओं के लिए, बड़े पैमाने पर प्रयोग करने से पहले सेल प्रसंस्करण में किसी भी प्रयोगशाला के विविधताओं के लिए खाते में सेल घनत्व तुलना करने के लिए विवेकपूर्ण है। दूसरा विचार मेशवर्क्स गठन का अस्थायी अनुक्रम है। समय-समय पर प्रयोगों का पता लगाने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए, जब मेष-कार्य संरचनाएं बनती हैं और नीचा दिखती हैं। आमतौर पर, एक मजबूत मेषवर्क-एलIke गठन ~ 4 घंटे में मनाया जाता है तीसरा विचार बीजिंग के पहले और प्रयोग के दौरान माध्यम का विकल्प होता है। बीईसी, पेरिसिट्स और एस्ट्रोसाइट्स मध्यम में सुसंस्कृत होते हैं जिनमें एफबीएस शामिल होता है और सेल विकास के लिए अनुकूलित वृद्धि कारकों में बहुत अधिक होता है। यद्यपि इसे सीरम पसंद किया जाता है और विकास कारक प्रयोग के पूर्व 24 घंटे बीईसी को भूखा लेता है, कुछ सेल प्रकारों के लिए यह संभव नहीं है। उदाहरण के लिए, विशिष्ट रिसेप्टर नॉकडाउन के साथ प्राथमिक कोशिकाओं को विकास की सुविधा के लिए अतिरिक्त कारकों की आवश्यकता हो सकती है। प्रयोग के दौरान ये विचार भी लागू होते हैं, और माध्यम की पसंद जांच के तहत विशिष्ट प्रश्न पर निर्भर होती है। हालांकि, exogenously जोड़ा तनाव और संभावित उपचार, विशेष रूप से वृद्धि कारकों या संबंधित यौगिकों की भूमिका की जांच करते समय, प्रयोग के दौरान सीरम और विकास कारक के माध्यम से मुक्त माध्यम का उपयोग आदर्श है। इसके अलावा, बीईसी की सीरम की भुखमरी को कम करने में संभव है, लेकिन यह सिग पर निर्भर हैजांच के तहत नैलिंग मार्ग एक चौथे विचार तनाव या उपचार जोड़ने का समय है मध्यम उपचार की पसंद के लिए, समय वैज्ञानिक प्रश्न पर आधारित है। मेषवायर संरचना परख angiogenesis के समान है, जबकि एक परिपक्व बीबीबी के लिए मेषवर्क विघटन परख अधिक प्रासंगिक हो सकता है। हमारे अनुभव में, एक बार स्थापित होने पर, एशेज प्रयोगों के बीच लगातार डेटा तैयार करते हैं। संगतता मुद्दे अक्सर कर्मियों के बीच घनत्व विसंगतियों को बोने के कारण होते हैं, और महत्वपूर्ण, यदि मध्यम या प्रासंगिक अभिकर्मकों के घटकों को अनजाने में बदल दिया जाता है
वर्णित विधियों के आगे के विकास की सीमाएं और क्षेत्र हैं इस प्रक्रिया की ताकत यह है कि तनाव की कमी सांद्रता ( यानी ओएएबी) का उपयोग मस्तिष्क की विघटन को लागू करने के लिए किया जा सकता है, जो कि माइक्रोन के मुकाबले एनएम है, जो अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। हालांकि, यह ताकत एक सीमा भी हो सकती है। वास्तव में, उच्च, बीअब भी गैर-विषाक्त, ओएएओ की सांद्रता दवा की जांच करने के उद्देश्य से संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकती है, जो अन्य रोग संबंधी तनावों पर लागू होगी। इस पद्धति की एक सीमा है कि वर्णित प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के मेषकाब 24 घंटे से अधिक स्थिर है। दरअसल, 24 घंटे के बाद, सेल के मशरूम खराब होने लगते हैं। इसलिए, हम 18 घंटे के कुल ओएबी ऊष्मायन समय को सक्षम करने के लिए, मेशवर्क गठन के बाद एक अपेक्षाकृत कम समय (4 घंटे) के बाद ओएएबी को जोड़ते हैं। शायद कम सेल बीन्सिंग घनत्व लंबे समय तक उपचार प्रोटोकॉल सक्षम हो सकें। एक और संभावित सीमा यह है कि इन विट्रो सिस्टम में कोशिकाओं के एक स्थिर मेष की नकल की नकल नहीं की जा सकती है, जैसे कि vivo में देखा जाएगा। वृद्ध चूहों से कोशिकाओं को अलग करने से विवो परिदृश्य में नकल की जा सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लियोन ताई को इलिनोइस विश्वविद्यालय के शिकागो स्टार्ट-अप फंड्स द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
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