Summary
Vedligeholdelse af blod-hjerne barriere dækning er nøglen til homeostasen i centralnervesystemet. Denne protokol beskriver in vitro teknikker til at afgrænse de grundlæggende og patologiske processer, der modulerer blod-hjerne barriere dækning.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) dækning spiller en central rolle i homeostasen af centralnervesystemet (CNS). BBB holdes dynamisk af astrocytter, pericytter og hjerneendotelceller (BEC'er). Her beskriver vi metoder til vurdering af BBB-dækning ved anvendelse af enkeltkulturer af immortaliserede humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tripelkulturmodel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. For at fremhæve anvendeligheden af analyserne til sygdomstilstande beskriver vi virkningen af oligomer amyloid-β (oAβ), hvilket er en vigtig bidragyder til Alzheimers sygdom (AD) progression på BBB-dækning. Derudover udnytter vi den epidermale vækstfaktor (EGF) for at belyse teknikkens lægemidlets screeningspotentiale. Vores resultater viser, at single og triple cultured BEC'er danner meshwork-lignende strukturer under basale forhold, og at oAβ forstyrrer denne celle meshwork formation og degenererer de præformede mesh strukturer,Men EGF blokerer for denne forstyrrelse. Således er de beskrevne teknikker vigtige for dissektering af grundlæggende og sygdomsrelevante processer, som modulerer BBB-dækning.
Introduction
Blodhjernebarrieren (BBB) af cerebrale kapillærer er den største grænseflade af kontakt mellem blod og hjerne og spiller en central rolle i homeostasen i centralnervesystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiske processer på BBB forhindrer optagelse af uønskede molekyler fra blodet, fjerner affaldsprodukter fra CNS, leverer essentielle næringsstoffer og signalmolekyler til CNS og modulerer neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skade er udbredt under aldring og flere neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom (AD), multipel sklerose og slagtilfælde 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Derfor kan BBB dysfunktion spille en central rolle i neurodegenerative lidelser, herunder som et terapeutisk mål.
Vedligeholdelse af skibsdækning er vigtigt for BBB's homeostatiske funktioner. Imidlertid er in vivo og in vitro datakonflikt om, hvorvidt processerne involveret i neurodegenerative lidelser forårsager højere eller lavere BBB-dækning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , især i AD. Derfor er der en stærk begrundelse for udviklingen af in vitro- modeller ved brug af relevante celletyper til at vurdere og forståelsen af BBB-dækningsdynamikken dynamisk. Cerebral kapillærer er sammensat af astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC) 3 . Cellekultursteknikkerne til vurdering af BBB-funktion er generelt permeabilitetsassays udført på celler dyrket på filterindsatser eller vurdering af niveauer af centrale BEC-proteiner, begge efter tilsætning af stressorer 14 , 15 , 16 . Selv om det er vigtigt, fokuserer disse analyser ikke på cerebrovaskulær dækning.
Her er vores tidligere metoder 17 detaljerede for at vurdere BEC dækning og meshwork-lignende strukturer ved brug af enkeltkulturer af udødeliggjorte humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tredobbelt kulturModel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. Målet var at demonstrere den skadelige virkning af oAβ, som betragtes som en vigtig bidragyder til AD-fremskridt på BEC-dækning. Den beskyttende virkning af den epidermale vækstfaktor (EGF) fremhæver potentialet ved teknikken som et terapeutisk screeningsværktøj. Teknikken har flere brede anvendelser til grundlæggende og anvendt forskning, herunder: 1) afgrænsning af rollen af specifikke veje angiogenese og dækningsdækning, 2) evaluering af virkningerne af sygdomme og aldringsrelevante faktorer ved angiogenese og dækningsdækning og 3) identificering af farmakologisk mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter følger University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care og Use Committee protokoller.
1. Generel forberedelse
BEMÆRK: Hjernens mikrovaskulære endotelcellelinie (hCMEC / D3) er en omfattende karakteriseret immortaliseret human BEC linje 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur hCMEC / D3-cellerne på vævskulturflasker overtrukket med kollagen Type I (kalveskind, 1:20 fortynding af 0,1% opløsning i Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende Ca 2+ og Mg 2+ ) i basalt Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) indeholdende 2-5% føtalt bovint serum (FBS), 10% ascorbinsyre, 10% gentamicinsulfat, 25% hydrocortison og 1/4 af det totale volumen af de tilførte vækstfaktortilskud pr. 500 ml medier [ Vaskulært endothelium grOvf-faktor (VEGF), epidermal vækstfaktor (EGF), insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF-1) og human basisk fibroblastisk vækstfaktor (bFGF), se tabel over materialer ].
BEMÆRK: EBM-2 medium med FBS og vækstfaktorer benævnes "EBM-2 komplet". EBM-2 uden FBS og kosttilskud kaldes "EBM-2 basal". Ved fuld sammenflugt er hCMEC / D3-cellerne ~ 1 x 105 celler / cm2.
- Passere hCMEC / D3-cellerne i et forhold på 1: 5 ved først at inkubere med HBSS i 3 minutter uden Ca 2+ og Mg 2+ efterfulgt af detachment med 5 ml trypsin / EDTA (0,25%) i 5 minutter. Neutraliser trypsinet ved brug af EBM-2 komplet (1: 1 neutralisering) og centrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C; Kassere supernatanten. Resuspender pelleten i EBM-2 komplet og genplacér i forholdet 1: 5.
- Kultur de primære menneskelige pericytter og astrocytter ifølge leverandørens protokol [ Tabel af materialer ]. CulturE pericytes i pericyte basalt medium med FBS og pericyte væksttilskud.
- Kultur de humane astrocytter i astrocytmedium, der indeholder astrocytvækstfaktorer. Kultur både pericytterne og astrocyterne i vævskulturflasker overtrukket med 3 ml poly-L-lysin (PLL) til celleadhærens og udnytte cellerne mellem passager 2 og 5.
- Euthanize 7 mus og fjern hjernestængerne og cerebella med tang Løsne meninges ved omhyggeligt at rulle hjernen på gasbind. Hæld det resterende hjernevæv i en petriskål i minimalt essentielt medium (MEM) med HEPES (5 ml pr. Hjerne) med et sterilt barberblad. Isolér de primære mus-BEC'er fra 2 måneder gamle C57BL / 6J mus i henhold til den refererede protokol 20 .
- Overfør det hakket hjernevæv til et 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og inkubér vævet i en papain (833,33 μL pr. Hjerne) og DNase (41,7 μL pr. Hjerne)Opløsning i et 37 ° C vandbad i 1 time for at fordøje vævet.
- Triturater homogenatet sekventielt gennem 19 og 21 gauge nåle, blandes i et 1: 1 forhold med en 22% Bovine Serum Albumin (BSA) opløsning og centrifugeres ved 1360 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender den resulterende pellet i 1 ml EBM-2 komplet og centrifuge ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspenderes igen i 1 ml EBM-2 komplet og plader cellerne (1 ml / brønd) på 6-brøndsplader belagt med collagen (~ 1 hjerne pr. Brønd).
- Udskift medierne 24 timer senere med EBM-2 komplet indeholdende 4 μg / ml puromycinhydrochlorid; Udskift med EBM-2 komplet efter 2 dage. De primære BEC'er dyrkes som for hCMEC / D3-cellerne og er ved fuld sammenfatning ved 1 x 105 celler / cm2.
- Forbered en 100 μM oAβ, 24 timer før analysen.
BEMÆRK: oAβ betragtes som den sygdomsrelevante form af A. For oAβ, brug de velkarakteriserede præparater beskrevet af DahlgreN et al. 21 . - Tør basalmembran-stamopløsningen natten over ved 4 ° C og alikvot i sterile PCR-rørstrimler (8 rør) ved 140 μl basalmembran pr. Rør. Genfrys hver stribe og opbevar ved -20 ° C. Optøn en strimmel pr. 96-brønds plade ved 4 ° C, 24 timer før analysen. Forkøl pipettespidserne for at undgå størkning.
BEMÆRK: Al håndtering af kældermembranmatrixen skal udføres på is for at undgå hurtig størkning. Da 10 μl pr. Brønd af kældermembran anvendes på analysedagen, er hver strimmel tilstrækkelig til en 96-brønds plade. - Inkubér fuldt konfluente BEC'er i EBM-2 basal, 24 timer før assayet.
BEMÆRK: Begrundelsen er: EBM-2 komplet indeholder supplerende faktorer og FBS med det formål at fremme optimal cellevækst; Imidlertid er de samme molekylære veje, der fremmer cellevækst, også vigtige for hjerneendotelcelledækning og -dynamik, både i nærvær og abseNce af en stressor. Vi sverker derfor serum og tillæg til BEC'erne for at reducere den konfronterende virkning af resterende aktivering af cellulære signalveje. Bemærk, at cellerne kort (5 min) udsættes for FBS under neutraliseringen af trypsiniserede celler forud for analysen. I modsætning til BEC'er er pericytterne og astrocytterne ikke sultede på grund af kravet om forskellige faktorer for vækst og den relative ustabilitet af disse celletyper som reaktion på serumsultation (Tai-laboratorium, upublicerede observationer).
BEMÆRK: EBM-2 basal anvendes under assayet for enkelt- og tredobbelt kultur meshwork dannelse og afbrydelsesanalyser. Dette er afgørende for at forhindre konfronterende stressor eller behandlingsafhængig signalering.
2. Meshwork-lignende formations- og afbrydelsesassays
- Enkelt BEC-kulturanalyser:
BEMÆRK: Tre forskellige paradigmer for de enkelte kulturer af BEC er vist i figur 1A - På analysedagen pipetteres kældermembranmatrixen ved 10 μl / brønd ind i bunden af 96 brøndsplader og tillades at sætte i 1 time ved 37 ° C.
- Suspender den lyofiliserede grøncelle sporing farve (se Tabel af materialer ) i 10 μL DMSO for at danne en 10 mM stockopløsning og fortyndes til 10 μM (1: 1000) i EBM-2 basal. Fjern mediet fra den fuldt konfluente kolbe og erstatt med EBM-2 basal indeholdende det grønne celle sporingsfarvestof (5 ml for en 75 cm 2 kolbe). Preload BECs med den grønne cellesporingsfarve, 20 min før assayens start.
- Inkuber cellerne i 20-30 minutter ved 37 ° C, fjern mediet med celleopsparingsfarvestof, og fjern cellerne som beskrevet i trin 1.1. Neutraliser media med EBM-2 indeholdende 10% FBS og centrifuge ved 240 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender pelleten i 1 ml EBM-2 basal.
- Plad BEC'erne i 96-brøndspladen ved 10.000 celler / brønd i EBM-2 basal (0 timepunkt i alle paradigmer).
BEMÆRK: Afhængigt af det paradigme, der benyttes, tilføjes behandlinger, stressorer eller vehikelkontrol på de angivne tidspunkter. I alle paradigmer høstes mediet til efterfølgende analyse ( f.eks. ELISA-analyse), og celler fastgøres efter 24 timer med frisk fremstillet 4% paraformaldehyd i phosphatbufferet serum (PBS). Som en alternativ tilgang til at bestemme termen virkninger af oAβ på meshdannelse kan protokollen modificeres for at inkuberere konfluente cellekulturkolber med oAβ og derefter udføre meshwork-dannelsesparadigmerne (+/- oAβ).
BEMÆRK: Det endelige volumen i hver brønd for alle paradigmer er 70 μL. Alle behandlinger (oAβ, EGF osv. ) Tilsættes til deres respektive brønde ved en 1:20 fortynding, dvs. 3,5 μl pr. Behandling. Til Paradigm 1 sættes cellerne i en celle-suspensionsopløsning ved 63 μl / well. Umiddelbart oAβ, ønskede behandlinger og kontroller tilsættes ved 3,5 μl / brønd hver, hvilket giver i alt 70 μl. Til Paradigm 2 tilsættes 63 μl cellesuspension og 3,5 μl behandling ( fx 100 ng / ml EGF) ved 0 timepunktet. Efter 4 h inkubation tilsættes 3,5 μl af en oAβ stamme ( fx til 100 nM endelig oAβ koncentration, 3,5 μl 2 μM oAβ stamme). Til Paradigm 3 tilsættes 63 μl cellesuspension ved 0 timepunktet og ved 4 timer tilsættes oAβ og ønskede behandlinger ved 3,5 μl / brønd hver, hvilket giver i alt 70 μl. Disse mængder kan justeres efter behandling. For eksempel, hvis kun én behandling er påkrævet, kan cellesuspensionsvolumenet justeres til 66,5 μL (vedligeholdelse af 10.000 celler / brønd), og behandlingsvolumenet kan forblive på 3,5 μl.
BEMÆRK: Ud over de enkeltkulturanalyser af BEC'er har vi udvikletUdgav et triple kulturanalyseparadigm ( figur 1B ) for at bestemme responsen af BEC'er, pericytter og astrocytter inden for præformerede netværk til relevante stressorer ( fx oAβ). BEC'er udplades i nærværelse af ønskede behandlinger efter 0 timer. Om 4 timer tilsættes pericytter forsigtigt til pladen. Om 7 timer tilsættes astrocytter til pladen efterfulgt af tilsætningen af en stressor ved 11 timer. Celler inkuberes derefter indtil 24 timers tidspunkt.
BEMÆRK: For triple-kulturanalyserne er det vigtigt at overveje timing for at sikre, at alle celler er sammenflydende på samme tid. Humane astrocytter og pericytter bør dyrkes 1 uge før analysen, mens hCMEC / D3-cellerne skal pletteres eller passeres 4-5 dage før analysedato. Endvidere er det vigtigt at anvende lav passage (2-5) primære celler for at undgå fænotypisk drift.
- Tilføj den grønne celleopsparingsfarvestof-arbejdsløsning til hCMEC / D3-cellerne 20 minutter inden begyndelsen af analysen. Plad hCMEC / D3 cellerne ved 10, 000 celler / brønd i EBM-2 basal (0 h tidspunkt). De anvendte volumener er 45 μl cellesuspension og 3,5 μl behandling ( dvs. endelige EGF koncentrationer på 50 ng / mL, 100 ng / mL eller 1000 ng / mL fra lagre, der er 20 gange mere koncentreret).
- Efter 3,5 timers inkubation ved 37 ° C tilsættes den blå celle sporingsfarvestof-arbejdsløsning (10 μM cellesporeblå i EBM-2 basal) til de humane primære pericytter. På 4 h tidspunktet (~ 30 min inkubation med celleopsparingsfarvestof) tilsættes forsigtigt 2000 pericyt / brønd til pladen indeholdende hCMEC / D3 i et volumen på 6 μl / brønd.
- Efter en ekstra 2,5 timers inkubation (i alt 6,5 timer fra 0 timers tidspunkt), tilsættes den orange celleopsparingsfarvestof-opløsning (10 μM cellesporingsorange i EBM-2 basal) til de humane primære astrocytter. På 7 h tidspunktet tilsættes forsigtigt 10.000 astrocytter / brønd til pladen i 12 μl volumen. Derfor er det samlede cellulære forhold for endotelceller: pericytter: astrocytter iS 5: 1: 5. Endvidere er volumenet opnået til dette punkt 66,5 μL.
- Tilsæt oAβ (3,5 μL 100 μM lager) 4 timer senere (i alt 11 timer fra 0 timer).
- Fastgør cellerne 13 timer senere i frisklavet 4% paraformaldehyd i PBS.
Forsigtig: Brug beskyttelses tøj, handsker og briller, mens du behandler paraformaldehyd.
3. Kvantificering
- Fange fluorescensbilleder af hele brønden i 96-brøndspladen ved 1,6x forstørrelse med en 2 s eksponeringstid ved 50% maksimal effekt ved hjælp af et dissekeringsmikroskop.
BEMÆRK: Ækvivalente mikroskoper kan udnyttes; Det er imidlertid afgørende at fange hele brønden for omfattende analyse. - For kvantitativ analyse, behandle billederne ved hjælp af ImageJ angiogenese analysator plugin 22 for at kvantificere antallet af grene, antal masker og total cellelængde (disse aflæsninger bliver automatisk tabuleret af softwaRe) som beskrevet nedenfor. En detaljeret visuel protokol for dette trin er tilvejebragt i figur 2 .
- Åbn fiji ImageJ ved at klikke på softwareikonet.
- Klik på de dobbeltrøde fremadspil, der findes i slutningen af værktøjslinjen, og klik derefter på "Angiogenesis Analyzer".
- Vælg mappen med billedfiler, klik på "Åbn".
- Når feltet "Indstillinger for analyse" vises, skal du klikke på "OK".
- Når feltet "Behandlingsbilleder" vises, hvilket angiver antallet af billeder, der skal behandles, skal du klikke på "OK".
- Når "Batch Progress Window" boksen vises, hvilket angiver den forventede behandlingstid. I løbet af denne tid kvantificerer programmet udgangene, herunder antallet af grene, antal masker og total cellelængde.
BEMÆRK: Når alle billeder er kvantificeret, vises resultatfilen i den oprindelige billedmappe som et regnearkdokument. - VælgRegnearkfilen indeholder resultater og sammenligner antallet af grene, masker og total cellelængde mellem grupper.
BEMÆRK: I triple-kulturanalysen anvendes ImageJ yderligere til analyse af percyt / astrocyt-dækning og antal. Billeder tærskes af en blindet eksperimentator og funktionen "analysere partikler" bruges til at generere aflæsninger. Faste celler og rørlignende strukturer kan også immunostaines for Ap 17 eller andre markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enkeltkulturer danner både hCMEC / D3-cellerne ( Figur 3A ) og de primære mus-BEC'er ( Figur 3B ) meshworklignende strukturer i hele brønden. Strukturerne er kendetegnet ved et netværk af indbyrdes forbundne knuder ( figur 3 ). I alle de beskrevne paradigmer ( figur 1 ) er de meshwork-lignende strukturer ens efter 24 timer i kontrolgrupperne, der danner ~ 20 meshwork-lignende strukturer med en total cellulær længde på ~ 10.000 pixel.
For at fremhæve anvendeligheden af metoderne til sygdomsrelevante stressorer blev oAβ tilsat til hCMEC / D3 og de primære mus-BEC'er i to paradigmer. I forstyrrelsen af celle meshwork dannelse (Paradigm 1) plades oAβ og celler på samme tid. I forstyrrelsen af præformeret meshwork (Paradigm 2) tilføjes oAβUdført 4 timer efter plating af cellerne (se figur 1A ). OAβ ved 100 nM inducerer forstyrrelse af den meshworklignende dannelse og degenerering af præformeret netværk ( figur 3A , 3B ). Ved anvendelse af hCMEC / D3-cellerne i begge paradigmer er kvantificering af den totale celledækning / længde f.eks. 16-20% lavere med 100 nM oAβ 17 . Yderligere reduceres antallet af masker med 40% med 100 nM oAβ i begge paradigmer 17 . Således inducerer en sygdomsrelevant stressor en lignende skadelig virkning på humant og mus BEC dækning.
En nøglefordel ved celledyrkningssystemet er evnen til at identificere faktorer eller behandlinger, som forhindrer sygdomsrelevant skade, som derefter kan gå videre til in vivo test. Som et bevis på princippet eksperiment, virkningerne af de vigtigste angiogene vækstfaktorer på forebyggelse af oAβ-induceret chaNges at fartøjsdækningen blev vurderet 17 . EGF forhindrede oAβ-induceret skade på hCMEC / D3-cellerne. Baseret på disse data blev EGF testet i et forebyggelsesparadigme ved brug af en transgen musemodel, der recapitulerer kritiske aspekter af AD-lignende patologi. EGF-behandling forhindrede de kognitive og BBB-underskud, herunder skibsdegenerering 23 . Disse data understøtter det in vitro- prædiktive potentiale for in vivo- aktivitet. I øjeblikket udnytter vi alle tre udviklede paradigmer til screening: 1) mesh formation, 2) forebyggelse af celle meshwork afbrydelse, og 3) samtidig behandling af meshwork forstyrrelse. Som fremhævet i figur 3 kan EGF beskytte mod oAβ-induceret skade i immortaliserede og primære mus-BEC-kulturer.
BBB består af BEC'er, pericytter og astrocytter, som samlet bidrager til overordnet cerebrovascUlar dækning. Derfor er en tilpasning af in vitro- systemet inkorporering af alle tre BBB-celletyper. Vores triple kulturanalyseparadigm inkorporerer hCMEC / D3-cellerne, primære humane pericytter og primære humane astrocytter, som tilsættes sekventielt til kældermembranmatricen ( Figur 1B ). I triple culture assay paradigmet danner hCMEC / D3 cellerne et lignende meshwork mønster som i de enkelte kulturer, men med pericytterne og astrocyterne fastgjort til knuderne og forbindende grene ( Figur 4 ). Tilsætningen af 100 nM oAβ inducerer maskinsvigt (~ 10-15%) og en reduktion i antallet af pericytter, der berører BEC'erne 17 . I korrelation med data afledt af enkeltkulturanalyseparadigmerne forhindres oAβ-induceret skade ved EGF-behandling. Således er triple culture BBB-modellen velegnet til studier med fokus på de interaktive effekter af astrocytter, pericYtes og BEC'er på fartøjets dynamik.
Figur 1: Oversigt over meshwork dannelse og afbrydelsesanalyser. ( A ) Enkeltkulturanalyseparadigmer. Paradigm 1, meshwork formation. Celler, stressorer og behandlinger er alle tilføjet til pladen på 0 timers tidspunkt. Paradigm 2, forebyggelse af meshwork forstyrrelse. Celler udplades i nærvær af ønskede behandlinger, inkuberes i 4 timer, og en stressor tilsættes ved 4 h tidspunktet. Paradigm 3, samtidig behandling af meshwork forstyrrelse. Celler er udpladet og får lov til at danne meshworklignende strukturer i 4 timer før behandlinger og / eller stressorer tilsættes samtidigt på 4 h tidspunktet. Alle paradigmer slutter ved 24 h tidspunktet, og cellerne er fikseret med 4% paraformaldehyd. ( B ) Triple-kulturanalyseparadigm. BEC'er (10.000 celler / brønd) er pletteret i presEnce af ønskede behandlinger efter 0 timer. Ved 4 timers tidspunkt tilsættes pericytter (2.000 celler / brønd) forsigtigt til pladen. Ved 7 timer tilsættes astrocytter (10.000 celler / brønd) til pladen efterfulgt af tilsætning af relevante stressorer ved 11 timer. Celler inkuberes derefter indtil 24 h tidspunktet og fikseres med 4% paraformaldehyd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvantitativ analyse. Alle billeder åbnes på Fiji ImageJ og batch-behandles ved hjælp af Angiogenesis Analyzer 22 . Kvantificering af total længde og antal masker anvendes. Klik her for at se en større version af tHans figur.
Figur 3: Meshwork-afbrydelsesassays: repræsentative billeder. Alle billeder er afledt af eksperimenter under anvendelse af Paradigm 2, meshwork forstyrrelse. ( A ) Repræsentative billeder af hCMEC / D3-cellerne pletteret og behandlet med vehikelkontrol (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Billeder ved 10X forstørrelse, Skala bar = 100 μm. ( B ) Repræsentative billeder af de primære mus-BEC'er pletteret og behandlet med VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Billeder ved 10X forstørrelse, grøn = BEC, Skalestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Triple-kulturanalyse: repræsentative billeder. ( A ) Repræsentative billeder af hCMEC / D3-cellerne, primære humane pericytter og primære humane astrocytter udpladet og behandlet med VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) eller oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Ifølge det paradigme, der er beskrevet i figur 1B . Billeder ved 10X forstørrelse, grøn = BEC, blå = pericytes og rød (pseudocolor) = astrocytter. Skalestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at adressere flere grundlæggende biologiske spørgsmål omkring cerebrovaskulær dækning 24 . Specifikt kan de identificere hvilke receptorer og signalveje der spiller en rolle i angiogenese, fartøjsdækning i cancervæv og perifere endotelceller, der er relevante for hjernen. Eksempler indbefatter angiogene vækstfaktorreceptorer, nitrogenoxid, mitogenaktiveret proteinkinase-signalering og calciumsignalering 25 , 26 , 27 . HCMEC / D3 og primære BEC'er kan ændres til genetiske nedbrydningsmetoder for at lette denne indsats 18 . Mekanisk indsigt kan opnås ved at dyrke BEC'er isoleret fra mus med fuldstændig eller endotelcellespecifik knockdown af nøgleproteiner med de beskrevne fremgangsmåder. Endvidere muliggør triple-kulturanalyserne en dybtgående analyse af astrocyt- og pericyte-influencenE på hjerne endotelcellefunktionen. For eksempel kan pericytter og astrocytter påvirke meshwork-lignende fartøjsdannelse gennem produktion af opløselige mediatorer ( fx angiopoietin, cytokiner) og også via strukturel støtte 24 .
Modulsystemet kan også anvendes til sygdomsforskning. For eksempel kan systemet adressere, om sygdoms- og ældningsrelevante stressorer tilføjes eksogent fremme angiogenese og / eller meshwork forstyrrelse. Stressorer kan være relevante for en specifik lidelse, fx oAβ eller mere generaliseret, fx hydrogenperoxid, cytokiner. Trippelkulturparadigmet tilføjer et ekstra lag af kompleksitet, som kan forbedre forståelsen af kritiske, sygdomsrelevante mekanismer, der påvirker BBB-dynamikken: afgrænsning af, om sygdomsrelevante stressorer aktiverer astrocytter og pericytter for at forstyrre BEC-funktionen. For både enkle og tredobbelte kulturanalyser kan de primære celler isoleres fraM musemodeller, der efterligner forstyrrelser af interesse for yderligere at afgrænse funktionelle effekter.
Der er en række vigtige overvejelser for at tilpasse de meshwork-lignende dannelse og afbrydelsesanalyser til forskellige celletyper. Den første er såddensiteten. For hver ny cellelinie optimerer et kritisk første trin optimering af seedensiteterne i kældermembranmatrixen for både enkelt- og triple-kulturanalyserne. Netdannelsen er afhængig af celletal, da både for høj og for lav celletæthed resulterer i mangel på meshworkdannelse. Endnu, selv for de heri beskrevne fremgangsmåder og celler er det forsigtigt at udføre celledensitetssammenligninger for at tage højde for eventuelle laboratorievariationer i cellebehandling før udførelse af større skalaforsøg. Den anden overvejelse er den tidsmæssige rækkefølge af meshwork-dannelsen. Tidskursforsøg skal udføres for at identificere, hvornår meshwork-lignende strukturer danner og nedbrydes. Typisk er et robust meshwork-lIke formation observeres ved ~ 4 timer. Den tredje overvejelse er valget af medium forud for såning og under forsøget. BEC'er, pericytter og astrocytter dyrkes i medium, der indeholder FBS og en overflod af vækstfaktorer optimeret til cellevækst. Selv om det foretrækkes, at serum og vækstfaktor sulter BEC'erne 24 timer forud for eksperimentet, kan det for visse celletyper ikke være muligt. For eksempel kan primære celler med specifikke receptor knockdowns kræve yderligere faktorer for at lette væksten. Disse overvejelser gælder også under forsøget, og valg af medium er afhængig af det specifikke spørgsmål, der er under undersøgelse. Når man imidlertid undersøger rollen som eksogent tilsatte stressorer og potentielle behandlinger, især vækstfaktorer eller beslægtede forbindelser, er anvendelsen af serum og vækstfaktor frit medium under eksperimentet ideelt. Derudover kan det være muligt at reducere længden af serumstærkning af BEC'erne, men dette afhænger af sigetNaling pathway under undersøgelse. En fjerde overvejelse er timingen for at tilføje stressorer eller behandlinger. Med hensyn til valg af mellembehandling er timingen baseret på det videnskabelige spørgsmål. Netværksdannelsesassayet er mere analogt med angiogenese, mens meshwork-afbrydelsesassayet kan være mere relevant for en moden BBB. I vores erfaring, når de er etableret, producerer analyserne konsistente data mellem eksperimenter. Konsistensproblemer skyldes ofte afvigelser mellem sejdethed mellem personale og vigtigere, hvis komponenter i mediet eller relevante reagenser ubevidst ændres.
Der er begrænsninger og områder med yderligere udvikling af de beskrevne metoder. En styrke af denne procedure er, at lave koncentrationer af stressor ( dvs. oAβ) kan anvendes til at inducere maskestørrelse, dvs. nM sammenlignet med μM, som er mere fysiologisk relevante. Denne styrke kan dog også være en begrænsning. Faktisk højere, bUd stadig ikke-toksiske, kan koncentrationer af oAβ være påkrævet til lægemiddel screening formål at øge følsomheden, som vil gælde for andre sygdomsrelevante stressorer. En begrænsning af metoden er, at meshwork af celler kun er stabile i løbet af 24 timer i de beskrevne protokoller. Faktisk begynder cellenetværkene efter 24 timer at degenerere. Derfor tilføjer vi oAβ efter en relativt kort tid (4 timer) efter meshwork-dannelsen for at muliggøre en total oAβ inkubationstid på 18 timer. Måske kan lavere celledæthedstætheder muliggøre længere behandlingsprotokoller. En yderligere potentiel begrænsning er, at in vitro- systemet muligvis ikke efterligner et stabilt netværk af celler, som det ville observeres i in vivo . Isolering af celler fra gamle mus kan efterligne in vivo scenariet mere nøje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Leon Tai er finansieret af University of Illinois Chicago startfonde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
