Summary
Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.
Abstract
Kan-beyin bariyeri (BBB) kapsama merkezi sinir sisteminin (CNS) homeostazında merkezi bir rol oynamaktadır. BBB, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücreleri (BEC'ler) tarafından dinamik olarak muhafaza edilir. Burada, ölümsüzleştirilmiş insan BEC'lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC'lerin tek kültürleri ve BBB'nin bir hümanize üçlü kültür modeli (BEC'ler, astrositler ve perisitler) kullanarak BBB kapsama alanını değerlendirecek yöntemleri ayrıntılı olarak inceliyoruz. Tahlillerin hastalık durumlarına uygulanabilirliğini vurgulamak için, Alzheimer hastalığının (AD) ilerlemesine önemli katkıda bulunan oligomerik amiloid-β'nın (oAβ) BBB kapsamı üzerindeki etkisini tanımlıyoruz. Ayrıca, tekniklerdeki ilaç tarama potansiyelini aydınlatmak için epidermal büyüme faktörünü (EGF) kullanıyoruz. Sonuçlarımız, tek ve üçlü kültürlenmiş BEC'lerin temel koşullar altında ağ gibi yapılar oluşturduğunu ve oAβ'nın bu hücre ağ oluşumunu bozar ve önceden oluşturulmuş örgü yapılarını dejenere ettiğini,Ancak EGF bu aksama engeller. Bundan dolayı, tarif edilen teknikler, BBB kapsama alanını modüle eden temel ve hastalığa bağlı süreçleri ayırmada önemlidir.
Introduction
Serebral kılcal damarların kan-beyin bariyeri (BBB), kan-beyin temasının en büyük arayüzüdür ve merkezi sinir sistemi (SSS) 1 , 2'nin homeostazında merkezi bir rol oynar. BBB'deki dinamik işlemler, istenmeyen moleküllerin kandan alınmasını önler, atık ürünleri MSS'den uzaklaştırır, gerekli besin maddelerini ve CNS'ye sinyal moleküllerini gönderir ve nöroinflamasyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5 modüle eder. Yaşlanma sırasında BBB hasarı ve Alzheimer hastalığı (AD), multipl skleroz ve inme 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ve 6'yı içeren çeşitli nörodejeneratif bozukluklar görülür.Ass = "xref"> 6. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu terapötik bir hedef de dahil nörodejeneratif bozukluklarda önemli bir rol oynayabilir.
Gemi kapsama alanının korunması BBB'nin homeostatik işlevleri için önemlidir. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro veriler, nörodejeneratif bozukluklardaki süreçlerin özellikle AD'de 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 yüksek veya düşük BBB kapsama alanına sahip olup olmadığı konusunda çatışma oluşturmaktadır. Bu nedenle, BBB kapsama alanının dinamiklerini daha kapsamlı olarak anlamak ve değerlendirmek için ilgili hücre tiplerini kullanan in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir gerekçe vardır. Beyin kılcal damarları, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücrelerinden (BEC'ler) oluşur. 14 , 15 , 16 eklenmesinden sonra, filtre ekleri üzerinde büyütülen hücreler üzerinde gerçekleştirilen geçirgenlik testleri veya anahtar BEC proteinlerinin seviyelerini değerlendirmektir. Önemli olmasına rağmen, bu testler serebrovasküler kapsama odaklanmaz.
Burada önceki yöntemlerimiz, ölümsüzleştirilen insan BEC'lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC'lerin tek kültürleri ve bir hümanize üçlü kültür kullanılarak BEC kapsamı ve ağ-yapı benzeri yapıları değerlendirmek için ayrıntılı olarak verilmektedirModel (BEC'ler, astrositler ve perisitler). Amaç, AD progresyonuna önemli katkıda bulunan oAβ'nın zararlı etkisini BEC kapsamı üzerine göstermekti. Epidermal büyüme faktörünün (EGF) koruyucu etkisi, tekniğin terapötik bir tarama aracı olarak potansiyelini vurgular. Teknik, temel ve uygulamalı araştırmalar için çeşitli geniş uygulamalara sahiptir: 1) anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki spesifik yolların rolünün belirlenmesi, 2) hastalık ve yaşlanmayla ilişkili faktörlerin anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki etkilerinin değerlendirilmesi ve 3) farmakolojik hedefler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Illinois Üniversitesi, Chicago Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi protokollerini takip etmektedir.
1. Genel Hazırlık
NOT: Beyin mikrovasküler endotel hücresi hattı (hCMEC / D3), yoğun şekilde karakterize edilmiş, ölümsüzleştirilmiş insan BEC hattı 14 , 15 , 16 , 18 , 19'dur . Bazal Endotel Büyümesi Bazal Ortamda, kolajen Tip I (buzağı derisi, Ca 2+ ve Mg 2+ içeren Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS)% 0.1 çözeltinin 1:20 seyreltimi) ile kaplanmış doku kültürü şişeleri üzerinde hCMEC / D3 hücrelerini kültürleyin 500 mL medyaya göre% 2-5 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 10 askorbik asit,% 10 gentamisin sülfat,% 25 hidrokortizon ve sağlanan büyüme faktörü takviyelerinin toplam hacminin ¼'ünü içeren bir antikor (EBM-2) Vasküler endotelyum gr(VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ve insan temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF), bakınız Malzeme Listesi].
NOT: EBM-2 orta FBS ve büyüme faktörleri olan "EBM-2 komple" olarak geçmektedir. FBS ve ek içermeyen EBM-2, "EBM-2 bazal" olarak anılır. Tam konfluans durumunda, hCMEC / D3 hücreleri ~ 1 x 105 hücre / cm2 'dir.
- Önce 5 dakika süreyle 5 mL tripsin / EDTA (% 0.25) ile ayrıldıktan sonra Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın 3 dakika boyunca HBSS ile inkübe ederek hCMEC / D3 hücrelerini 1: 5 oranında geçirin. Tripsini EBM-2 komple (1: 1 nötralizasyon) kullanarak nötralize edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 290 xg'de santrifüjleyin; Süpernatanı atın. Peleti EBM-2'de tekrar süspansiyon haline getirin ve 1: 5 oranında plakaya tekrar koyun.
- Birincil insan perisitlerini ve astrositleri tedarikçinin protokolüne göre kültürleyin [ Malzeme Listesi ]. KültürE percyte bazal ortamda perisitler FBS ve perisit büyüme takviyesi ile.
- Astrosit büyüme faktörleri içeren astrosit ortamında insan astrositlerini kültürleyin. Hücre yapışması için 3 mL poli-L-lisin (PLL) ile kaplı doku kültürü şişeleri içindeki perisitleri ve astrositler hem pasajlar 2 ve 5 arasındaki hücreleri kullanır.
- 7 fare euthanize ve beyin sapları ve cerebella forseps ile çıkarın; Beynini dikkatlice gazlı bezle sallayarak çıkarın. Kalan beyin dokusunu, HEPES (beyin başına 5 mL) ile Minimal Esansiyel Ortamdaki (MEM) bir Petri kabında, steril traş bıçağı ile konsantre edin. Birinci fare BEC'lerini, referans ağıdaki protokole göre 2 aylık C57BL / 6J farelerden ayırabilirsiniz 20 .
- Kıyılmış beyin dokusunu 15 mL'lik konik bir tüp içine aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 290 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve dokuyu bir papain (her beyinde 833.33 μL) ve DNaz (beyin başına 41.7 μL) içinde kuluçkaya yatırın.Çözelti, 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca dokuyu sindirmek için.
- Homojenat sırayla 19 ve 21 gauge iğneleri ile triturate,% 22 Bovine Serum Albumin (BSA) çözeltisi ile 1: 1 oranında karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1360 xg'de santrifüjleyin.
- Nihai pelleti 1 mL EBM-2'de tekrar süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 290 xg'de santrifüjleyin. 1 mL EBM-2'de tekrar süspansiyon haline getirin ve kollajen ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda (oyuk başına 1 beyin) hücreleri (1 mL / çukur) yerleştirin.
- Ortamı 24 saat sonra, 4 μg / mL puromisin hidroklorür içeren EBM-2 komple ile değiştirin; 2 gün sonra EBM-2 ile tamamlayın. Birincil BEC'ler hCMEC / D3 hücreleri için olduğu gibi kültürlenirler ve 1 x 105 hücre / cm2'de tam birleşmiş durumdadırlar.
- Testten 24 saat önce 100 uM oAp hazırlayın.
NOT: oAβ, A'nın hastalıkla ilişkili formu olarak düşünülür. OAβ için Dahlgre tarafından tanımlanan iyi karakterize edilmiş preparatları kullanınN ve ark. 21 . - Bazal membran stok solüsyonu gece boyunca 4 ° C'de çözülür ve tüp başına 140 uL taban zarında steril PCR tüp şeritlerine (8 tüp) alikuotu yıkayın. Her bir şeridi tekrar -80 ° C'de muhafaza edin. Deneyden 24 saat önce 4 ° C'de 96 oyuklu plaka başına bir şerit çözülür. Katılaşmayı önlemek için pipet uçlarını önceden soğutun.
NOT: Hızlı katılaşmayı önlemek için temel zarı matrisinin tümü buzda olmalıdır. Testin yapıldığı gün bazal zarın her bir kuyucuğunda 10 mcL kullanıldığından, her şerit bir 96 oyuklu plak için yeterlidir. - Tam uyumlu BEC'leri, deneyden 24 saat önce EBM-2 bazalinde kuluçkalayın.
NOT: Gerekçe şöyledir: EBM-2 komple, optimal hücre büyümesini teşvik etmek amacıyla desteklenmiş faktörler ve FBS içerir; Bununla birlikte, hücre büyümesini teşvik eden aynı moleküler yollar, beyin endotel hücre kapsamı ve dinamikleri için gerek var ve gerekse de önemlidirBir stresörün. Dolayısıyla serum ve ek, hücresel sinyal yolaklarının artık aktifleşmesinin karıştırıcı etkisini azaltmak için BEC'leri aç kaldık. Not, hücreler, deneyden önce tripsinize edilmiş hücrelerin nötrleştirilmesi sırasında kısa bir süre (5 dakika) FBS'ye maruz bırakılır. BEC'lerin aksine, perisitler ve astrositler, büyüme için farklı faktörlerin ve serum açlığın- dan yanıt olarak bu hücre tiplerinin göreceli olarak kararsızlığı nedeniyle, serum aç kalmamış değildir (Tai laboratuarı, yayınlanmamış gözlemler).
NOT: EBM-2 bazal, tek ve üçlü kültür ağı oluşumu ve parçalama deneyleri için deneme sırasında kullanılır. Bu, stres faktörünü karıştıran veya tedavi bağımlı sinyal vermeyi önlemek açısından kritik önem taşır.
2. Mesh-benzeri Oluşum ve Parçalanma Testleri
- Tek BEC kültürü tahlilleri:
NOT: BEC'lerin tek kültürleri için üç farklı paradigma Şekil 1A'da gösterilmiştir - Analizin yapıldığı gün, 96-çukurlukların tabanına 10 mcL / çukurdaki bazal membran matrisini pipetleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlanmasına izin verin.
- 10 mM'lik bir stok çözeltisi üretmek için 10 μL DMSO içinde liyofilize yeşil hücre izleme boya ( Malzeme Tablosuna bakın) askıya alın ve EBM-2 bazal 10 uM (1: 1000) için inceltin. Ortamı tamamen bir araya getiren şişeden çıkarın ve yeşil hücre izleme boya içeren EBM-2 bazalıyla değiştirin (75 cm 2 lik bir şişe için 5 mL). Deneyin başlangıcından 20 dakika önce BEC'leri yeşil hücre izleme renklendiricisiyle önceden yükleyin.
- Hücreleri, 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin, hücre izleme boya maddesi ile ortamı alın ve Adım 1.1'de açıklandığı gibi hücreleri ayırın. Ortamı% 10 FBS içeren EBM-2 ile nötralize edin ve 4 ° C'de 5 dakika, 240 xg'de santrifüjleyin. Pellet 1 mL EBM-2 bazal süspansiyon haline getirilir.
- BEC'leri 96 oyuklu plakada EBM-2 bazalında (tüm paradigmalarda 0 saat zaman noktası) 10,000 hücre / oyukla kaplayın.
NOT: Kullanılan paradigmaya bağlı olarak, belirtilen zaman noktalarında tedaviler, stresörler veya araç kontrolleri eklenir. Tüm paradigmalarda, ortam sonraki analizler ( örn., ELISA analizi) için hasat edilir ve hücreler, fosfat tamponlu serumda (PBS) yeni hazırlanmış% 4 paraformaldehitle 24 saat sabitlenir. OAβ'nın meş oluşumu üzerindeki etkilerini belirlemek için alternatif bir yaklaşım olarak, protokol OAp ile konfluent hücre kültürü şişelerini ön inkübe etmek için modifiye edilebilir ve daha sonra ağ örgüsü oluşum paradigmalarını (+/- oAβ) gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir.
NOT: Bütün paradigmalar için her kuyunun son hacmi 70 mcL'dir. Tüm tedaviler (oAβ, EGF, vb. ) Ilgili oyuklara 1:20 seyreltme, yani her muamele başına 3.5 mcL ilave edilir. Paradigma 1 için, hücreler 63 μL / w'de bir hücre süspansiyonu çözeltisine eklenirell. Hemen oAp, arzu edilen tedaviler ve kontroller toplam 3.5 mcL / oyuk eklenerek toplam 70 mcL verilir. Paradigma 2 için, 0 saat zaman noktasında 63 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL tedavi ( örn., 100 ng / mL EGF) eklenir. 4 saat inkübasyondan sonra 3.5 μL bir oAβ stoğu eklenir ( örn. , 100 nM son oAp konsantrasyonu, 3.5 uL 2 uM oAβ stoğu için). Paradigma 3 için 63 μL hücre süspansiyonu, 0 saat zaman noktasında eklenir ve 4 saat sonra, oAp ve istenen tedaviler, her biri 3.5 mcL / çukurda eklenir ve toplam 70 mcL verilir. Bu ciltler tedavilere göre ayarlanabilir. Örneğin, tek bir tedavi gerekiyorsa, hücre süspansiyonu hacmi 66.5 uL'ye ayarlanıp (10,000 hücre / kuyuyu muhafaza eder) tedavi hacmi 3.5 uL'de kalabilir.
NOT: BEC'lerin tek kültür deneylerine ek olarak,Önceden oluşturulmuş şebekelerdeki BEC'lerin, perisitlerin ve astrositlerin ilgili stresörlere ( örn., OAβ) yanıtını belirlemek için üçlü bir kültür analizi paradigması hazırladılar ( Şekil 1B ). BEC'ler istenen tedavilerin varlığında 0 saat boyunca kaplanır. 4 saat sonra, perisitler nazikçe plakaya eklenir. 7 saat sonra, astrositler plakaya ilave edilir ve onu takiben 11 saate bir stres verici katılır. Hücreler daha sonra 24 saat zaman noktasına kadar inkübe edilir.
NOT: Üçlü kültür deneyleri için, tüm hücrelerin aynı anda birleşeceğinden emin olmak için zamanlamanın değerlendirilmesi önemlidir. İnsanlardaki astrositler ve perisitler deneyden 1 hafta önce kültüre alınırken, hCMEC / D3 hücrelerinin deney tarihinden 4-5 gün önce plakalanması veya pasajlanması gerekir. Ayrıca, fenotipik sürüklenmeyi önlemek için düşük geçit (2-5) primer hücrelerin kullanılması önemlidir.
- Deney başlamadan 20 dakika önce hCMEC / D3 hücrelerine yeşil hücre izleme solüsyonu çözeltisi ekleyin. HCMEC / D3 hücrelerini 10, 000 hücre / çukur EBM-2 bazal (0 saat zaman noktası). Kullanılan hacimler 45 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL muamele ( yani 20 kat daha yoğun olan stoklardan 50 ng / mL, 100 ng / mL veya 1000 ng / mL son EGF konsantrasyonları) şeklindedir.
- 37 ° C'de 3.5 saat inkübasyondan sonra insan primer perisitlerine mavi hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci mavisi) ekleyin. 4 saatlik zaman noktasında (hücre izleme boya ile 30 dakika inkübasyon), hCMEC / D3'ü içeren plakaya 6 mcL / çukur hacminde nazikçe 2.000 perissit / kuyu ekleyin.
- İnsan primer astrositlerine ek 2.5 saat inkübasyon (0 saat zaman noktasından toplam 6.5 saat) takiben turuncu hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci turuncu) ekleyin. 7 saatlik zaman noktasında, 12 mcL hacimdeki plakaya hafifçe 10.000 astrosit / kuyu ekleyin. Bu nedenle, endotel hücreleri için genel hücre oranı: perişitler: astrositler iS 5: 1: 5. Dahası, bu noktaya ulaşan hacim 66.5 uL'dir.
- 4 saat sonra oAβ (3.5 uL, 100 uM stok) ekleyin (0 saat zaman noktasından toplam 11 saat).
- Hücreleri 13 saat sonra taze hazırlanmış% 4 paraformaldehid PBS içinde sabitleyin.
Dikkat: paraformaldehidi tutarken koruyucu giysi, eldiven ve gözlük takın.
3. Nicelleştirme
- Bir diseksiyon mikroskopu kullanarak% 50 maksimum güçle 2 saniyelik pozlama süresiyle 1.6 kat büyütmede 96 oyuklu plakanın tüm kuyusunun floresans görüntülerini yakalayın.
NOT: Eşdeğer mikroskoplar kullanılabilir; Ancak, kapsamlı analiz için bütün kuyuyu yakalamak kritik önem taşır. - Kantitatif analiz için, şube sayısını, kafeslerin sayısını ve toplam hücre uzunluğunu ölçmek için ImageJ anjiyojenez analizörü eklentisi 22'yi kullanarak görüntüleri işleyin (bu okumalar otomatik olarak softwa ile tablolaştırılırYeniden) aşağıda tarif edildiği gibi. Bu adımın ayrıntılı bir görsel protokolü Şekil 2'de verilmektedir .
- Fiji ImageJ'yi yazılım simgesini tıklayarak açın.
- Araç çubuğunun ucundaki çift kırmızı öne oklara tıklayın, ardından "Anjiyogenez Analiz Cihazı" na tıklayın.
- Resim dosyalarıyla klasörü seçin, "Aç" ı tıklayın.
- "Analiz için ayarlar" kutusu göründüğünde, "Tamam" ı tıklayın.
- İşlenecek görüntü sayısını belirten "görüntüleri işleme" kutusu göründüğünde, "Tamam" düğmesine tıklayın.
- Tahmini işleme süresini gösteren "toplu ilerleme penceresi" kutusu göründüğünde. Bu süre zarfında program, dal sayısı, kafes sayısı ve toplam hücre uzunluğu gibi çıktıları nicelleştirir.
NOT: Tüm görüntüler niceleyildikten sonra, sonuçlar dosyası orijinal resim klasöründe e-tablo belgesi olarak görünür. - seçmekSonuçları içeren elektronik tablo dosyası ve gruplar arasındaki dal sayısı, kafesler ve toplam hücre uzunluğu karşılaştırılır.
NOT: Üçlü kültür deneyinde ImageJ, perisit / astrosit kapsamını ve sayısını analiz etmek için ayrıca kullanılmaktadır. Görüntüler körü kör bir deneyci tarafından sınırlanmış ve okunmaları oluşturmak için "parçacıkları analiz" işlevi kullanılmıştır. Sabit hücreler ve tüp benzeri yapılar ayrıca Aβ 17 veya diğer markerler için immüno-lekelendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek kültürlerde hem hCMEC / D3 hücreleri ( Şekil 3A ) hem de birincil fare BEC'ler ( Şekil 3B ), kuyu boyunca ağ örgüsü benzeri yapılar oluşturmaktadır. Yapılar, birbirine bağlı düğümlerin ağ tarafından karakterize edilmiştir ( Şekil 3 ). Açıklanan tüm paradigmalarda ( Şekil 1 ), ağ örgüsü benzeri yapılar kontrol gruplarında 24 saat sonra benzer şekilde ~ 10.000 piksel toplam hücresel uzunluğa sahip ~ 20 ağ-yapıya benzer yapılar oluşturmuştur.
Yöntemlerin hastalıkla ilgili stres etkenlerine uygulanabilirliğini vurgulamak için oAβ hCMEC / D3'e eklendi ve birincil fare BEC'leri iki paradigmada eklendi. Hücrenin ağ oluşumunun bozulmasında (Paradigm 1) oAβ ve hücreler aynı anda kaplanır. Önceden oluşturulmuş ağların bozulmasında (Paradigma 2), oAβ,Hücrelerin kaplanmasından 4 saat sonra (bakınız Şekil 1A ). 100 nM'de oAβ, ağ-yapılı formasyonun bozulmasına ve önceden oluşturulmuş ağın dejenerasyonuna neden olur ( Şekil 3A , 3B ). Örneğin, her iki paradigmada hCMEC / D3 hücrelerini kullanarak toplam hücre kapsama / uzunluğunun nicelendirilmesi, 100 nM oAβ 17 ile% 16-20 daha düşüktür. Ayrıca, her iki paradigmada da 100 nM oAβ ile mesh sayısı% 40 oranında azaltılır 17 . Dolayısıyla, hastalıkla ilgili bir stres faktörü, insan ve fareler BEC kapsamı üzerinde benzer zararlı bir etkiye neden olur.
Hücre kültür sisteminin en önemli avantajı, hastalıkla ilgili hasarı önleyen faktörleri veya tedavileri tanımlama yeteneğidir; bu da, daha sonra in vivo teste geçebilir. Prensiplerin bir kanıtı olarak, ana anjiyojenik büyüme faktörlerinin oAβ kaynaklı cha'nın önlenmesindeki etkileriGemi kapsama alanlarına kıyasla 17 . EGF, hCMEC / D3 hücrelerine oAβ'nın yol açtığı hasarı önledi. Bu verilere dayanarak, EGF, AD benzeri patolojinin kritik yönlerini tekrarlayan transgenik bir fare modeli kullanarak bir önleme paradigmasında test edildi. EGF tedavisi, damar dejenerasyonu da dahil olmak üzere bilişsel ve BBB defisitlerini önledi 23 . Bu veriler in vivo aktivite için in vitro sistemin prediktif potansiyelini desteklemektedir. Şu anda tarama için üç gelişmiş paradigmayı kullanıyoruz: 1) örgü oluşumu, 2) hücre ağının bozulmasının önlenmesi ve 3) ağların bozulmasının eşzamanlı olarak muamele edilmesi. Şekil 3'te vurgulandığı gibi, EGF, ölümsüzleştirilen ve birincil fare BEC kültürlerinde OAβ kaynaklı zararlara karşı koruyabilir.
BBB, toplu olarak genel serebrovaska katkıda bulunan BECler, perisitler ve astrositlerden oluşurUların kapsama alanı. Bu nedenle, in vitro sistemin bir uyarlaması, üç BBB hücresi türünün hepsinin bir araya getirilmesidir. Üçlü kültür analizi paradigmamız, sırasıyla bazal membran matrisine eklenen hCMEC / D3 hücreleri, primer insan perisitleri ve primer insan astrositlerini içerir ( Şekil 1B ). Üçlü kültür analizi paradigmasında, hCMEC / D3 hücreleri tek kültürlerde olduğu gibi benzer bir ağ örüntüsü oluşturur, ancak perisitler ve astrositler düğümlere bağlanır ve dalları birbirine bağlar ( Şekil 4 ). 100 nM oAb ilavesi, ağ işi bozulmasına (~% 10-15) ve BEC'ler ile temas eden perisit sayısının azalmasına neden olur17. Tek kültür takımı paradigmalarından elde edilen verilerle ilişkili olarak, OAβ kaynaklı hasar EGF tedavisi ile engellenir. Bu nedenle, üçlü kültür BBB modeli astrositlerin interaktif etkileri, perikYtes ve GEM dinamikleri üzerine BEC'ler.
Şekil 1: Ağ örgüsü oluşumu ve parçalanma tahlillerine genel bakış. ( A ) Tek kültür analizi paradigmaları. Paradigma 1, ağ oluşumu. Hücreler, stresörler ve tedaviler plakaya 0 saat zaman noktasına eklenir. Paradigma 2, ağ kirliliğinin önlenmesi. Hücreler, arzu edilen tedavilerin varlığında kaplanır, 4 saat inkübe edilir ve bir stresör, 4 saatlik zaman noktasına eklenir. Paradigma 3, ağda parçalanmanın eşzamanlı muamelesi. Hücreler kaplanır ve tedaviden önce 4 saat boyunca ağ-yapı benzeri yapılar oluşturulmasına izin verilir ve / veya stresörler aynı anda 4 saat zaman noktasına eklenir. Bütün paradigmalar 24 saat zaman noktasında sona erer ve hücreler% 4 paraformaldehitle sabitlenir. ( B ) Üçlü kültür analizi paradigması. BEC'ler (10,000 hücre / çukur) preslenmiş0 saat içinde istenen tedavilerin uygulanması. 4 saatlik perikside (2,000 hücre / kuyu) plakaya hafifçe ilave edilir. 7 saat sonra, plakaya astrositler (10.000 hücre / çukur) eklenir, ardından 11 st'de ilgili stresörlerin ilavesi yapılır. Hücreler daha sonra 24 saat zaman noktasına kadar inkübe edilir ve% 4 paraformaldehitle sabitlenir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Niceliksel analiz. Tüm resimler Fiji ImageJ üzerinde açılır ve Angiogenesis Analyzer 22 kullanılarak toplu işlenir. Toplam uzunluk ve kafes sayısının tayini yapılır. T daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınızOnun şekli.
Şekil 3: Mesh Parçalanma Denemeleri: Temsili görüntüler. Tüm görüntüler, Paradigm 2, ağ işi bozulması kullanan deneylerden türetilir. ( A ) araç kontrolü (VC), EGF (100 nM), oAp (100 nM) veya oAp (100 nM) + EGF (100 nM) ile kaplanmış ve işlenmiş hCMEC / D3 hücrelerinin temsili görüntüleri. 10X büyütmede görüntüler, Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) veya oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) ile kaplanmış ve işlenmiş birincil fare BEC'lerin temsili görüntüleri. 10X büyütmede görüntüler, yeşil = BEC'ler, Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Üçlü kültür tahlili: temsili imgeler. ( A ) VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) veya oAp (100 nM) + EGF (100 nM) ile kaplanmış ve işlenmiş hCMEC / D3 hücreleri, birincil insan perisitleri ve birincil insan astrositlerinin temsili görüntüleri, Şekil 1B'de anlatılan paradigmaya göre. 10X büyütmede görüntüler, yeşil = BEC'ler, mavi = perişitler ve kırmızı (sahte renk) = astrositler. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarif edilen yöntemler, serebrovasküler kapsama alanı ile ilgili çeşitli temel biyolojik soruları çözmek için kullanılabilir 24 . Spesifik olarak hangi reseptörlerin ve sinyal yollarının anjiyogenez, kanser dokusunda gemi kapsama alanı ve beynin ilgili olduğu periferik endotel hücrelerinde rol oynadığını tespit edebilirler. Örnekler, anjiyojenik büyüme faktörü reseptörleri, nitrik oksit, mitojen aktive protein kinaz sinyali ve kalsiyum sinyali 25 , 26 , 27'yi içerir . HCMEC / D3 ve birincil BEC'ler, bu çabayı kolaylaştıracak genetik devir yaklaşımları için değiştirilebilir 18 . Mekanik içgörü, anlatılan yöntemlerle anahtar proteinlerin tam veya endotel hücreye özgü nakavtları ile farelerden izole edilmiş BEC'lerin kültürlenmesinden elde edilebilir. Ayrıca, üçlü kültür deneyleri, astrositin ve perisit etkisinin derinlemesine analizini mümkün kılarBeyin endotel hücre fonksiyonu üzerinde. Örneğin, perisitler ve astrositler çözünebilir mediyatörlerin ( örn., Anjiyopoietin, sitokinler) üretimi ve aynı zamanda yapısal destek 24 vasıtasıyla ağ-yapımı benzeri damar oluşumunu etkileyebilir.
Model sistemi ayrıca hastalık araştırmalarına da uygulanabilir. Örneğin, sistem eksojen olarak eklenen hastalıklara ve yaşlanmaya bağlı stresörlerin anjiyojenez ve / veya ağ oluşumunun bozulmasını teşvik edip etmediğini ele alabilir. Stresörler spesifik bir bozukluk, örneğin oAβ veya daha yaygın, örneğin hidrojen peroksit, sitokinler ile ilgili olabilir. Üçlü kültür paradigması, BBB dinamiklerini etkileyen kritik, hastalıkla ilgili mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilecek ek bir karmaşıklık katmanı ekler: BET işlevini bozmak için hastalıkla ilgili stresörlerin astrositleri ve perisitleri etkinleştirip etkinleştirmediğini belirleme. Hem tekli hem de üçlü kültür deneyleri için birincil hücreler froM fare modelleri, işlevsel etkileri daha ayrıntılı tanımlamak için ilgi bozukluklarını taklit eder.
Ağ yapısı benzeri oluşumu ve parçalanma tahlillerini farklı hücre tiplerine uydurmak için bazı önemli hususlar vardır. Birincisi ekim yoğunluğu. Her yeni hücre hattı için, kritik bir ilk adım, hem tek hem de üçlü kültür deneyleri için temel membran matrisindeki ekim yoğunluklarını optimize etmektir. Örgü oluşumu hücre sayısına bağlıdır, çünkü çok yüksek ve çok düşük hücre yoğunluğu, ağ oluşumu eksikliği ile sonuçlanır. Dahası, burada açıklanan yöntemler ve hücreler için bile, daha büyük ölçekli deneyler yapmadan önce hücre işlemedeki laboratuar değişikliklerinin hesaba katılması için hücre yoğunluk karşılaştırmalarını yapmak akıllıca olacaktır. İkinci düşünme, ağ oluşumunun zamansal sırasıdır. Ağ yapısı benzeri yapıların oluştuğunu ve bozulduğunu belirlemek için zaman dersi deneyleri yapılmalıdır. Tipik olarak, sağlam bir ağ-lİKE oluşumu ~ 4 saatte gözlenir. Üçüncü düşünme, tohumlamadan önce ve deney sırasında ortamın seçilmesidir. BECler, perisitler ve astrositler, FBS ve hücre çoğalması için optimize edilmiş bir büyüme faktörü içeren ortamda kültürlenir. Serum ve büyüme faktörünün BEC'leri deneyden 24 saat önce aç bırakması tercih edilmesine rağmen, bazı hücre türleri için bu mümkün olmayabilir. Örneğin, spesifik reseptör knockdown'larına sahip primer hücreler büyümeyi kolaylaştırmak için ek faktörler gerektirebilir. Bu hususlar deney sırasında da geçerlidir ve ara maddenin seçimi soruşturma altındaki spesifik soruna bağlıdır. Bununla birlikte, eksojen olarak eklenen stresörlerin ve potansiyel tedavilerin, özellikle de büyüme faktörlerinin veya ilgili bileşiklerin rolünü araştırırken, deney sırasında serum ve büyüme faktörü içermeyen ortamın kullanılması idealdir. Ek olarak, BEC'lerin serum açlığı uzunluğunu azaltmak mümkün olabilir, ancak bu, sigortaya bağlıdırSoruşturma altındaki yol. Dördüncü bir husus, stresörlerin veya tedavilerin eklenme zamanlamasıdır. Orta dereceli tedavinin seçimi konusunda, zamanlamalar bilimsel soruna dayanır. Ağ örgüsü oluşum testi anjiogenezide daha fazla bulunurken ağ örgüsü bozulması testi olgun bir BBB ile daha alakalı olabilir. Deneyimlerimizde, kurulduktan sonra, deneyler deneyler arasında tutarlı veriler üretir. Tutarlılık sorunları genellikle personel arasındaki yoğunluk uyuşmazlıklarının ekilmesinden ve önemlisi, orta veya ilgili reaktiflerin bileşenleri bilmeden değiştirildiğinden kaynaklanmaktadır.
Açıklanan yöntemlerin daha da geliştirilmesi için sınırlamalar ve alanlar vardır. Bu prosedürün bir gücü, daha düşük fizyolojik olarak alakalı olan μM'ye kıyasla, ağrı kesintisini yani nM'yi indüklemek için düşük stresör konsantrasyonlarının ( yani oAβ) kullanılabilmesidir. Bununla birlikte, bu güç bir sınırlama da olabilir. Gerçekten, daha yüksek, bHala toksik olmayan konsantrasyonlarda oAβ, ilaç tarama amaçları için duyarlılığın arttırılması için gerekebilir ve bu da diğer hastalıkla ilgili stres faktörlerine uygulanır. Metodun bir sınırlaması, hücrelerin ağ örgüsünün açıklanan protokollerde yalnızca 24 saat boyunca sabit olmasıdır. Nitekim, 24 saat sonra, hücre ağları dejenere olmaya başlar. Bu nedenle, ağ oluşumundan sonra nispeten kısa bir süre sonra (4 saat) oAβ ekleyerek, 18 saatlik bir toplam oAβ inkübasyon süresi sağlanır. Belki de düşük hücre tohumlama yoğunlukları daha uzun tedavi protokollerini mümkün kılabilir. Bir başka potansiyel sınırlama, in vitro sistemin in vivo gözlemlendiği gibi kararlı bir hücre ağını taklit etmemesi olabilir. Yaşlı farelerden hücrelerin izole edilmesi, in vivo senaryoyu daha yakından taklit edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Leon Tai Illinois Üniversitesi Chicago başlangıç fonlarıyla finanse edilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
