Summary
Vi præsenterer en detaljeret metode til at studere human placenta fysiologi in vivo på sigt. Metoden kombinerer blodprøveudtagning fra de indgående og udgående skibe på moderens og fostrets sider af placenta med ultralydsmålinger af volumenblodstrøm og placentasvævsprøveudtagning.
Abstract
Den menneskelige placenta er meget utilgængelig for forskning, mens den stadig er i utero . Den nuværende forståelse af human placenta fysiologi in vivo er derfor i vid udstrækning baseret på dyreforsøg på trods af den store mangfoldighed blandt arter i placenta anatomi, hæmodynamik og graviditetens varighed. Det store flertal af human placenta-undersøgelser er ex vivo- perfusionsundersøgelser eller in vitro trofoblast-undersøgelser. Selvom in vitro- undersøgelser og dyremodeller er essentielle, er ekstrapolering af resultaterne fra sådanne undersøgelser til den humane placenta in vivo usikker. Vi havde til formål at studere human placenta fysiologi in vivo på sigt, og præsentere en detaljeret protokol af metoden. Udnyttelse af intraabdominal adgang til livmoderven lige før livmoderhalsen under planlagt kejsersnit indsamler vi blodprøver fra de indgående og udgående skibe på moderens og fostrets sider af moderkagen. Når man kombinerer conCentreringsmålinger fra blodprøver med volumenblodstrømsmålinger, er vi i stand til at kvantificere placenta- og føtaloptagelse og frigivelse af en hvilken som helst forbindelse. Endvidere kan placentale vævsprøver fra de samme morfosterpar give målinger af transportørens tæthed og aktivitet og andre aspekter af placentale funktioner in vivo . Gennem denne integrerende anvendelse af 4-fartøjs prøveudtagningsmetode kan vi teste nogle af de nuværende begreber om overførsel og metabolisme af placenta næring i vivo både i normale og patologiske graviditeter. Desuden gør denne metode det muligt at identificere stoffer, der udskilles af moderkagen til moderens cirkulation, hvilket kunne være et vigtigt bidrag til søgen efter biomarkører af placentadysfunktion.
Introduction
Ifølge National Institutes of Health, USA, er placenta det mindst forstås organ i menneskekroppen 1 , 2 , 3 . Det er vanskeligt at få adgang til og studere den menneskelige placenta in vivo uden at påføre uetiske risici på den igangværende graviditet. Undersøgelser af placentafunktionen hos mennesker er derfor i høj grad baseret på in vitro- og ex vivo- modeller. Størstedelen af tidligere in vivo undersøgelser af placenta transport og metabolisme er blevet udført hos dyr 4 , 5 , 6 . Men da placentas struktur og funktioner varierer betydeligt mellem arter, skal ekstrapolering af resultater fra dyr til mennesker ske med forsigtighed. Kun nogle få mindre humane in vivo- undersøgelser har undersøgt placenta og føtal optagelse og transport under normal fysiologiskAl betingelser, og ingen har undersøgt den integrerede overførsel af flere forbindelser 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Disse grundlæggende studier illustrerer, at in vivo undersøgelser af human placenta er mulige, og at de kan tjene flere formål. For det første kan nuværende begreber af placentale funktioner, der hovedsagelig er afledt af in vitro , ex vivo og dyreforsøg, testes i en menneskelig indstilling og således give en ny og mere specifik indsigt i den menneskelige placenta. For det andet kan egenskaber af den dysfunktionelle placenta associeret med afvigende føtalvækst, præeklampsi, moderns diabetes, metabolisk syndrom og andre modermæssige metaboliske forstyrrelser bedre karakteriseres. For det tredje giver menneskelige in vivo- undersøgelser mulighed for at udvikle diagnoserTic og prædiktive værktøjer af placentale funktion.
På denne baggrund har vi til formål at etablere en omfattende samling af fysiologiske data til undersøgelse af human placentafunktion in vivo. Under en planlagt kejsersnit udnytter vi den intraabdominale adgang til livmodervenen for at indsamle blodprøver fra de indgående og udgående skibe på moderens og fostrets sider af moderkagen (4-karprøveudtagningsmetoden). Disse prøver anvendes til at beregne de parrede arteriovenøse koncentrationsforskelle af næringsstoffer og andre stoffer 14 . Derudover måler vi volumenblodstrøm på begge sider af placenta ved hjælp af ultralyd. Følgelig kan placental og føtal optagelse af en hvilken som helst forbindelse kvantificeres. Endvidere er det muligt at bestemme stoffer, der frigives af moderkagen til moder- og føtalomløbet 15 , 16 , 17 . Når kombinereD med kliniske parametre for mor og barn samt analyser af placenta og andre relevante væv, har denne metode det spændende potentiale til at integrere mange aspekter af placentale funktioner in vivo i de samme morfosterpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af databeskyttelsesembedsmændene på Oslo Universitetshospital og Regionaludvalget for Medicinsk og Sundhedsforskningsetik, Sydeuropa 2419/2011. Alle deltagere underskrev skriftligt informeret samtykke ved optagelse.
1. Forberedelser
BEMÆRK: En tidslinje for procedurerne er skitseret i figur 1 .
Figur 1 : Flowchart, der beskriver timing og personale involveret i 4-fartøjs prøveudtagningsprocedure.
En farve repræsenterer en person. Detaljeret beskrivelse af metoden er angivet i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Personale
- Forbered udstyret, 50 ml iskold 1 M phosphatbufret saltvand (PBS), 25 ml kold RNA stabiliserende opløsning og 5 x 0,5 ml optimal skæringstemperaturforbindelse (OCT). Mærk vacutainers og rør. Se foreløbig liste over udstyr.
2. Moderne egenskaber
- Optag morens kliniske og ikke-kliniske egenskaber ved inkludering og gentag relevante spørgsmål og migAsurements, herunder vægt, på leveringstidspunktet. Optag varigheden af den faste periode forud for kejsersnittet, og eventuelle hypotensive episoder, der opstår under operationen.
Bemærk: Medtag det minimale materniske kliniske datasæt, der er rapporteret i en nylig offentliggørelse fra Global Gravidity CoLaboratory (COLAB). Denne artikel indeholder også nogle meget vigtige aspekter ved valg af studiepopulationer og bør tages op under planlægningen af undersøgelsen 18 . - Overvej optagelse af faderlige karakteristika, herunder etnicitet, alder og body mass index (BMI).
3. Ultralyd
- Udfør Doppler ultralydsundersøgelsen på leveringsdagen, med kvinderne i fastende tilstand. Udfør undersøgelsen i løbet af en periode med føtale quescence, med kvinden i semi-supine position, vippes lidt sideværts modsat til regionen af interesse for at undgå kompression af aorta og vena cava. Overvåg output iTæthed ved hjælp af de mekaniske og termiske indeks på displayet.
- Navlestreng
- Visualiser navlestrengen i en sagittal eller skrå transektion af føtalbukken. Mål den indre kardiameter i den lige del af den intra-abdominale navlestreng inden nogen synlige grene. Brug regelmæssig B-tilstand og visualiser beholderen i en vinkelret indvækningsvinkel for diametermålinger og opbevar flere optimale rammer til senere målinger for at minimere effekten af ændringer i pulserende diameter.
- Gentag målingen fem til ti gange 19 .
- På samme sted skal du bruge Doppler ultralyd og justere sonden for at få en indstillingsvinkel så lav som muligt (altid <30 °) for at måle den gennemsnitlige maksimale hastighed (TAMX). Hent hastigheden over en periode på 3 - 5 s (ikke-pulserende strømning).
- Visualiser navlestrengen i en sagittal eller skrå transektion af føtalbukken. Mål den indre kardiameter i den lige del af den intra-abdominale navlestreng inden nogen synlige grene. Brug regelmæssig B-tilstand og visualiser beholderen i en vinkelret indvækningsvinkel for diametermålinger og opbevar flere optimale rammer til senere målinger for at minimere effekten af ændringer i pulserende diameter.
- Uterinarterie
- Brug DopplerUltralyd for at visualisere livmoderarterien, da den krydser den ydre iliacarterie umiddelbart efter at den forgrener sig fra den indre iliacarterie. Juster sonden på dette websted for at få en lav indstillingsvinkel (altid <30 °) og måle TAMX. Hent hastigheden som gennemsnitshastigheden af tre hjertesykluser.
- Da det ikke er sandsynligt at få en vinkelret vinkel på samme sted som TAMX måles, følg beholderen distalt for at få en korrekt vinkel for diametermålinger så tæt på de steder med diametermålinger som opnåelige. Undgå diametermålinger, hvis nogen synlige fartøjer afgrener sig før dette sted, som vurderet af farvet Doppler-ultralyd.
- Brug regelmæssig B-tilstand og visualiser beholderen i en vinkelret indvækningsvinkel for diametermålinger og opbevar flere optimale rammer til senere målinger for at minimere effekten af ændringer i pulserende diameter.
- Gentag målingen fem til ti gange 19 .
- Bemærk placeringen af placenta.
4. 4-blod blodprøveudtagning
BEMÆRK: Tidslinjen for procedurerne er skitseret i figur 1, og en oversigt over prøverne er illustreret i figur 2 .
Figur 2 : Skematisk illustration af Placental Vasculature og prøveudtagningssites.
I prøveudtagningsmetoden med 4 beholdere trækkes blodprøver ud fra livmodervenen, den radiale arterie (som en proxy for livmoderarterien) og navlestifter og blodårer. Blodstrømning i livmoderen og navlestrengen måles ved hjælp af ultralyd. Vævsprøver fra placenta opsamles. Illustration: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
- Sikkerhedsprocedurer
- Giv alle medarbejdere i operationen teater med handsker, kirurgiske skrubbedragter, masker og hovedbeklædning.
- Giv kirurgerne og forskningspersonalet kontakt med operationsfeltet med kirurgiske skrubbedragter, masker, hovedbeklædning, kjoler og dobbelthandsker. Briller er valgfri.
- Giv personale håndtering af blodprøverne med handsker.
- Giv personale håndtering af moderkroppens prøver med handsker og kirurgisk maske. Homogenisering kræver brug af hætter.
- Forberedelse i operationsteateret
- Giv en orientering og lever udstyret til alt personale, som vil hjælpe prøveudtagningen inden kirurgi påbegyndes.
- Adresse anæstesiologen og anæstesiologien sygeplejerske, som vil hjælpe med den nødvendige perifere arterielle og venøse adgang, og sikre, atIngen væsker gives intravenøst før prøveudtagning.
- Giver tre sprøjter (10 ml) uden nåle til den person, der hjælper med antecubitalveinprøven og to sprøjter (en 20 ml og en 10 ml) og en blodgassprøjte (med heparin) til den person, der hjælper med den radiale arterie.
- Forbered to sterile sprøjter (20 ml), fem sterile sprøjter (10 ml), tre "sommerfuglnåle" og to blodgassprøjter til operationsfeltet.
- Adgang til blodkar.
- Følg standardproceduren før kejsersnit for at sikre perifer intravenøs (iv) adgang.
BEMÆRK: Antecubitalvenen er at foretrække, fordi det er lettere at tegne prøver fra denne side. - Lokaliser den radiale arterie ved håndleddet ved hjælp af ultralyd eller ved palpation. Efter 0,5 ml subkutan lidokain analgesi placeres en arteriel linje i den radiale arterie. Afgiv prøveudtagningen fra dette websted i tilfælde af tre mislykkede indsætninger, ellerHvis kvinden oplever smerte under indsættelsen.
BEMÆRK: Udfør den kirurgiske procedure af kejsersnit ifølge standardproceduren. Kun de justeringer, der er nødvendige for prøveudtagningen, er understreget nedenfor.
- Følg standardproceduren før kejsersnit for at sikre perifer intravenøs (iv) adgang.
- Moderne blodprøver
BEMÆRK: Hent alle tre moderblodprøver (livmoderveje, radial arterie og antecubital ven) samtidigt før livmoderhalsen.- For livmodervenen, efter åbning af mavemuskulaturen, brug en retraktor til at løfte mavemuren og udsætte hovedafdelingerne på livmoderårene på livmoderens anterolaterale sider. Få blod fra livmoderbladets grene på samme side som moderkagen, når det er muligt, eller brug den mest fremtrædende veneplexus, hvis moderkagen ligger i livmoderlinien.
- Indsæt en sommerfuglnål på en blodgassprøjte i livmoderen i en vinkel på ca. 30 grader, og saml blod gennem forsigtig aspiration for at undgåhæmolyse. Mens du forsigtigt sikrer fuglens nålestilling, skal du udskifte den fyldte blodgassprøjte med en 20 ml og en 10 ml sprøjte efter hinanden.
BEMÆRK: Optimal adgang sikres bedst, når den står på den kontralaterale side af den valgte livmoderveje.
- Indsæt en sommerfuglnål på en blodgassprøjte i livmoderen i en vinkel på ca. 30 grader, og saml blod gennem forsigtig aspiration for at undgåhæmolyse. Mens du forsigtigt sikrer fuglens nålestilling, skal du udskifte den fyldte blodgassprøjte med en 20 ml og en 10 ml sprøjte efter hinanden.
- For den radiale arterie aspirere fra intra-arteriel linjen. Kassér de første 5 ml, og aspirer derefter 3 ml i heparinsprøjte til blodgasanalyser efterfulgt af 3 ml i to sprøjter (20 + 10 ml).
- For antecubitalvenen aspirere forsigtigt fra det intravenøse kateter. Kassér de første 5 ml, og aspirer derefter 30 ml i tre sprøjter (10 ml).
- Udfør en endelig inspektion af prøveudtagningsstedet på livmoderen, før du begynder at lukke maven.
- For livmodervenen, efter åbning af mavemuskulaturen, brug en retraktor til at løfte mavemuren og udsætte hovedafdelingerne på livmoderårene på livmoderens anterolaterale sider. Få blod fra livmoderbladets grene på samme side som moderkagen, når det er muligt, eller brug den mest fremtrædende veneplexus, hvis moderkagen ligger i livmoderlinien.
- Foster blodprøver
- Når barnet er født, straks aspirere blod fra navlestrengen, uden at klemme navlestrengen eller levere placenta. Start hvidH sprøjten til blodgasanalyse, og følg med tre 10 ml sprøjter, hvis det er muligt.
- Når arterieprøverne er fastgjort, skal du klemme ledningen og give barnet til jordemoderne før prøveudtagning fra navlestrengen (blodgas og 20 + 10 ml sprøjter).
BEMÆRK: Hent alle navlestikprøver inden for få sekunder efter fødslen og med placenta in situ, medmindre den er løsrevet spontant. - Følg de norske anbefalinger om late cord clamping. I tilfælde af et ubehageligt barn skal du straks og skære snoren og hånden barnet til jordemoder og neonatolog.
- Håndtering af blodprøver
- Sæt blodgassprøjterne på is under forberedelsen af resten af blodprøverne og analyser dem i en blodgasanalysator inden for 5 minutter.
- Overfør blodprøverne øjeblikkeligt til vacutainers og læg plasmaglasserne på en vippe i 1 - 2 minutter, før de sættes på is. Lad serumrørene på arbejdetAtory bænk at bosætte sig i 30 minutter.
BEMÆRK: Dette er et kritisk trin i proceduren, der kræver ekstra opmærksomhed, fordi prøver fra alle fem websteder skal udarbejdes samtidigt for at sikre god kvalitet. - Centrifuger plasmaprøverne hurtigst muligt og inden for 30 minutter ved 6 ° C, 2.500 xg i 20 minutter.
- Efter 30 minutter centrifugeres serumprøverne ved stuetemperatur i 10 minutter ved 2.500 x g.
- Aliquot supernatanterne omhyggeligt til 2 ml cryo rør, hvilket efterlader 0,5 ml af supernatanten over pelleten for at sikre blodpladefri plasma.
- Opbevar prøverne ved -80 ° C.
5. Indsamling af placenta væv
- Placer placenta fladt ned på en iskølet dissektionsbakke så hurtigt som muligt efter at den er blevet leveret. Foto og måle længste diameter og diameter ved 90 grader.
- Væg placenta.
- Optag vægten, de to diametre, hvilken som helst gRosspatologi, antal skibe i ledningen og tidsintervallet fra levering til når placenta blev anbragt på is.
BEMÆRK: Send placenta til patologisk undersøgelse, hvis det er klinisk indikeret. - Placer moderkagen med moderens overflade opad og identificer 4-5 prøveudtagningssteder, der er tilfældigt placeret i hver kvadrant af moderkagen, og undgå områder med frank patologi. Fjern decidua med saks for at skære 3 - 5 mm fra moderens overflade. Saml et 1 - 2 cm 3 stykke villøst væv fra hvert sted.
- Vask det opsamlede væv forsigtigt i 50 ml koldt 1M PBS. Opdel i flere stykker fra hvert prøveudtagningssted og alikvot.
Bemærk: Placentastykkernes størrelse afhænger af de planlagte analyser. - Tilsæt alikvoter af 0,1 - 0,5 cm 3 vævsprøver til 5 cryo rør og snapfrys i flydende nitrogen.
- Tilsæt små stykker af 0,1 - 0,2 cm 3 til røret med 25 ml RNA stabiliseringsopløsning. Opbevares ved 46, C i 24 timer, kassere RNA stabiliseringsopløsningen og erstatte den. Fryse.
- Tilsæt stykker på 0,5 cm 3 til 5 cryo rør med 0,5 ml OCT, fyld op med OCT, bland og frys.
- Opbevar prøverne ved -80 ° C indtil analyse.
BEMÆRK: Burton et al. Giver et glimrende overblik over praktiske aspekter af placentaudtagning afhængigt af de planlagte analyser. 20 Overvej at forberede det resterende væv til isolering af de mikrovilløse og basale membraner, og at samle deciduelt væv ved vakuumsugningsteknik. 21 , 22
6. Neonatale egenskaber
- Optag de neonatale egenskaber, herunder Apgar-score (1, 5 og 10 min), køn, vægt, længde, svangerskabsalder og adgang til nyfødt intensivvagt (længde og udfald af opholdet).
- Overvej at måle neonatal kropssammensætning ved antropometriske målinger, luftforskydningMentplethysmograf eller dobbelt røntgenabsorptiometri. 23 , 24
7. Beregninger
- Antag en lignende blodsammensætning i den radiale og uterine arterie og beregne den uteroplacente arteriovenøse koncentrationsdifferens.
Uteroplacental arteriovenøs koncentrationsforskel = C A - C V
Umbilical venøs - arteriel koncentrationsforskel = C v - C a
Hvor C er koncentreret med abonnementer: A, den radiale arterie; V, livmodervenen V navlestreg og a, navlestiften. - Beregn volumen blodgennemstrømning, ml / min (Q):
Hvor D er fartøjets diameter (cm), er TAMX den gennemsnitlige maksimale hastighed, og h er koefficienten for den rumlige blodhastighedsprofil. Brug 0,5 som koefficient for navlestrengen og0,6 for livmoderarterien 25 , 26 . - Beregn placentaoptagelsen og slip efter Ficks princip:
Uteroplacental optagelse = ( C A - C V ) x Qm
Fosteroptagelse = ( C v - C a ) x Q f
Abonnementer: m, mor og f, foster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøvetagningsmetoden med 4 beholdere kan anvendes i klinisk praksis, og vi har opnået blodprøver fra 209 mor / spædbarnspar. I 128 af disse opnåede vi også for at måle volumen blodgennemstrømning. Komplet 4-fartøjsudtagning og god kvalitetsmåling af både moder- og fosterskibe blev opnået hos 70 moderfosterpar ( figur 3 ). Derudover har vi hidtil indsamlet blod- og placentaprøver fra 30 præeklamptiske patienter. Vi har tidligere offentliggjort artikler om human placentaoverførsel af næringsstoffer samt placentaudgivelse af vasoaktive faktorer, der demonstrerer to anvendelser af metode 14 , 15 , 16 .
Eksempel på hvordan 4-fartøjsmetoden bruges til at studere placental overførsel
Der er signifikant arteriOvnige glukoseforskelle på begge sider af placenta, der demonstrerer en in vivo uteroplacental og føtal optagelse af glucose ( tabel 1 ). Placental overførsel af glucose er afhængig af moder-føtal glucose gradient og dermed på moderens glukoseniveauer. Vi har dog tidligere vist, at denne gradient og dermed glucoseoverførslen er signifikant påvirket af fetalinsulinniveauer og glukoseforbrug. Dette er et eksempel på, hvordan denne metode illustrerer vigtige maternal-føtale samspil 14 .
| Beholder | Glucose mmol / L | p-værdi * |
| Radialarterie | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Urinveje | 4,23 [3,94, 4,53] | |
| Navlestreng | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Umbilical arterie | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Parrede forskelle | ||
| Radialarterie - livmoderveje | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Umbilical arterie - navlestang | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Radial arterie - navlestifinder | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tabel 1: Median [Q1, Q3] Koncentrationer og Arteriovenøse Forskelle af Glucose
* Wilcoxon Signed-Rank test
Fostal glukose optagelse fra (placenta frigivelse til) navlestrengscirkulationen antages at være afhængig ikke kun oN den moder-føtal gradient, men på blodplade i blodet 5 . På samme måde kan det være relevant at studere føtal glukoseoptagelse som en funktion af moderkropsvægt eller fødselsvægt. I n = 128 fandt vi en gennemsnitlig [Q1, Q3] total navlestrengeventilstrøm på 196,2 [158,3, 232,2] ml / min og beregnet en median [Q1, Q3] føtal glukoseoptagelse fra (placental frigivelse til) navlestrengscirkulationen af 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normaliseret for fødselsvægt er dette lig med 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. Placenta frigiver 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) pr. Kg placenta.
Eksempel på hvordan 4-kar-metoden bruges til at studere placentaoptagelse
Dyrestudier tyder på, at glutaminsyre er vigtig både i interkonversion af aminosyrer i moderkagen og føtaleleveren og som et oxidativt brændstof i andre metaboliske veje 27 . Ved hjælp af placenta 4-beholder prøvetagningsmetode vi studerede uTeroplacental og navlestrengs arteriovenøse forskelle i glutaminsyre hos mennesker ( tabel 2 ). Vi fandt en placentaoptagelse (således en føtal frigivelse) af glutaminsyre fra navlestrengscirkulationen. Yderligere fandt vi en placental optagelse af glutaminsyre fra moderens kredsløb. Denne placentaoptagelse fra begge kredsløb er et eksempel på, hvordan 4-kar-metoden kan anvendes til at demonstrere in vivo hos mennesker, at placenta metabolisme af næringsstoffer er en del af reguleringen af transplacental overførsel.
| Beholder | Glutaminsyre μmol / L | p-værdi * |
| Radialarterie | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Urinveje | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Navlestreng | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Umbilical arterie | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Parrede forskelle | ||
| Radial arterie-uterine venen | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Umbilical arterie -umbilær ven | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tabel 2: Median [Q1, Q3] Koncentrationer og Arteriovenøse Forskelle af Glutaminsyre
* Wilcoxon Signed-Rank test
Eksempel på hvordan 4-karmetoden bruges til at studere frigivelse af placenta
Det er etableret, at placenta udskiller progesteron og for at validere vores 4-kar-metode på moderkanten af moderkagen, måler vi in vivo- frigivelsen af progesteron ved teRm 28 . Vi fandt en signifikant placentaudgivelse af progesteron til modercirkulationen ( tabel 3 ). Den observerede arteriovenøse forskel viser, hvordan prøvetagningsmetoden med placenta 4-kar kan bruges til at detektere stoffer, der frigives af placenta, og er meget relevant, når man studerer patologiske graviditeter.
| Beholder | Progesteron nmol / L | p-værdi * |
| Radialarterie | 678 [514, 971] | |
| Urinveje | 1852 [1059, 2786] | |
| Parrede forskelle | ||
| Radial arterie-uterine venen | -1187 [-1855, -404] | p <0,001 |
Tabel 3: Median [Q1, Q3] koncentrationer og uteroplacental arteriovenøs forskel på progesteron
* Wilcoxon Signed-Rank test
Figur 3 : Flowcharts og illustration af inkluderede og tabte deltagere.
A. Viser deltagernes deltagelse, hvilket viser, at deltagerne var tabt hovedsageligt på grund af start af arbejde inden kejsersnitt eller mangel på tilstrækkeligt personale til at gennemføre undersøgelsen. B. Af de 179 kvinder med normale graviditeter (blå) blev der opnået fuldstændige 4 blodkarprøver i 162 (91%) (ufuldstændige føtalblodprøver: sorte, ufuldstændige moderblodprøver: grå). En halvtreds (28%) deltagere blev ikke medtaget til ultralydsmålinger på grund af logistiske begrænsninger. Af de 128 deltagere (72%) udsat for ultralyd blev blodflowmålinger ved fostrets side af placenta opnået hos alle deltagere (lysegrøn), mens fuldstændige blodmålinger i både moder- og fostrets side blev opnået i 77 (60%) (mørkegrøn). Illustration: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Placenta 4-beholder prøveudtagningsmetode er relevant for tre hovedformål. For det første kan det bruges til at studere, hvordan specifikke stoffer optages af moderkagen på moderens side og eventuelt overføres til navlens cirkulation og fosteret, som det fremgår af vores glukose- og aminosyreundersøgelser. For det andet er metoden yderst relevant til at studere stoffer, der produceres af moderkagen og frigives til moder- eller fostercirkulationen, som det fremgår af progesteronresultaterne. For det tredje kan det være nyttigt at studere, hvordan fosteret in vivo eliminerer affaldsprodukter under hurtig vækst og vævsmodellering.
Kritiske trin og logistikproblemer af 4-fartøjsmetoden
Placenta 4-karprøveudtagning er tidligere blevet anvendt til at bestemme placental overførsel af makronæringsstoffer in vivo ved normale fysiologiske graviditeter 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, men med et begrænset antal undersøgelser. Den begrænsede anvendelse af 4-karprøveudtagningen skyldes sandsynligvis den krævende logistik af proceduren. En vellykket koordinering mellem patienten, forskerne og personalet hos fakultet, obstetrik og anæstesiologi er afgørende for at kunne anvende denne metode. Vi mener, at det har været en stor fordel, at flere af de vigtigste efterforskere er fødselslæger, kende kliniske rutiner og nøglepersonale. Derved er undersøgelsesprocedurerne blevet implementeret sammen med den daglige kliniske praksis. Ved at koordinere og sikre hvert trin i proceduren har vi fået prøver fra over 200 mor / nyfødte par. Desuden har vores strategi været at holde prøveudtagningen på få hænder, fordi der er tekniske udfordringer i den procedure, der er afgørende for det vellykkede resultat af stikprøven, og for mange samplere kan introducere unødvendige kilder til variation af dataene. ConsequVi anbefaler, at alle sonografiske undersøgelser udføres af samme eksaminator ved brug af samme ultralydsmaskine. Udstyret skal vælges omhyggeligt, da skibsvæggen er afgørende. Uterinarterierne i tredje trimester er særlig teknisk udfordrende at måle, fordi livmoderstørrelsen og indholdet gør det vanskeligt at opnå både den vinkelret indvækningsvinkel, der anvendes til diametermålingerne og den lave indstillingsvinkel for flowhastighedsmålinger på det nøjagtig samme sted. Desuden kræver vellykket blodprøveudtagelse identifikation af passende prøveudtagningssted i livmoderen og mild forsigtighed. På navlestrækningen kræver følsomheden af føtal erythrocytter særlig opmærksomhed mod aspirationskraften. Det er vores erfaring, at forsinket levering eller mindre stress til spædbarnet var forbundet med tidlig indsnævring af navlestrengen, hvilket resulterede i reduceret arteriel prøvevolumen.
Metodologiske / Analytiske problemstillinger af 4-fartøjsmetoden
Det er vigtigt at behandle flere metodologiske problemer i fortolkningen af resultaterne fra en placenta 4-kar studie. For det første, hvis målet er at beregne massen af et stof optaget eller frigivet af moderkagen, er det vigtigt at overveje mængden af blodgennemstrømning. Man bør huske på, at livmodervenen ikke blot dræber moderkagen, men også udleder livmodermusklen, og at livmodervaskulaturen i forskellige grader anastomiserer med æggestokkene og vaginalvaskulaturen. Dernæst er det vigtigt at overveje, at udveksling af vand over placenta kan påvirke koncentrationenRationer målt, og derved påvirke de beregnede arteriovenøse koncentrationsforskelle. Ideelt set behandles dette bedst ved at justere koncentrationsforskellene for det tabte vand eller opnået i hvert moderfosterpar. Dette kan opnås ved at måle et stof, der ikke optages eller frigives af moderkagen eller livmoderen. Hæmoglobinkoncentrationerne eller beregnede procentdele af erytrocytter (hæmatokrit) kan tjene som korrektionsfaktorer for vandudveksling. Ved fortolkning af optagelse eller frigivelse af forbindelser på moderens side af placenta kan det desuden være interessant at opnå arteriovenøse forskelle i andre væv til sammenligning. Vi har derfor inkluderet en blodprøve fra antecubitalvenen for at karakterisere specifikke træk ved placenta ved at sammenligne arteriovenøse forskelle over placenta med dem i kapillærlejet i underarmen. Vi fandt denne sammenligning særligt interessant, da vi testede placentaudgivelse af sFlt-1 og placenta vækst faCtor fordi systemiske endotelceller kunne være en potentiel kilde for disse forbindelser 14 . Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan det være vigtigt at relatere arteriovenøse forskelle til vægten af placenta for at beregne placentaffektiviteten, dvs. med hensyn til (mmol / L) / kg eller (mmol / min) / kg placenta.
Begrænsninger og styrker af 4-fartøjsmetoden
Selvom placentas fysiologi er mindre påvirket af kejsersnitt end ved stress af vaginal afgivelse, er der flere begrænsninger for denne metode. Vaginal levering anbefales i de fleste tilfælde af almindelige graviditetskomplikationer (som præeklampsi, diabetes, fedme og moderat føtale makrosomi), som kan begrænse og fordreje ansættelsen. Selv når optimering af hvert trin i metoden er det svært at opnå komplette målinger og prøver i hver patient på grund af de tekniske vanskeligheder i blodprøveproceduren og ultralyd volumenUme flow målinger ( figur 3 ). Hertil kommer, at selvom ultralydsmålingene udføres så tæt på operationen som muligt, udføres de selvfølgelig før spinalanæstesi og blodprøveudtagning. Herved følger, at moderens hjerteproduktion (CO) kan ændre sig og muligvis påvirke blodudstrømningen i uteroplacenter (og endda feto-placenta). Den mulige ændring i CO forårsaget af spinalanæstesiacan kompenseres af phenylephrin, som blev anvendt i den nuværende undersøgelse. Foreløbige data fra en delmængde af vores deltagere (n = 23) viser ingen signifikant ændring i CO før spinalanæstesi og på tidspunktet for prøveudtagning (upublicerede data). Ved anvendelse af 4-beholderprøveudtagningsmetoden hos mennesker begrænser både muligheden for at indføre en tidsvariabel og manipulere blodindholdet 5 , 29 , 30 , i modsætning til hos dyr. Af disse overvejelser følger det heraf, at 4-fartøjet Prøveudtagningsmetode er tværsnit og stort set observatorisk af natur, og de opnåede data skal analyseres i overensstemmelse hermed. På den anden side giver 4-fartøjs prøveudtagningsmetoden en unik mulighed for at studere human placenta fysiologi og patofysiologi in vivo med alle de interaktive faktorer i spil, en situation, der aldrig kan reproduceres in vitro . Det giver en glimrende mulighed for at teste hypoteser, der er opstået fra dyreforsøg eller andre eksperimentelle undersøgelser. Ligeledes kan det generere nye hypoteser, som skal testes mekanisk in vitro og i dyreforsøg.
Potentielle anvendelser af 4-fartøjsmetoden
I patologiske graviditeter har moder- og føtal arteriovenøse koncentrationsforskelle hidtil været undersøgt særskilt og tilladt til afprøvning af nogle af de eksisterende hypoteser in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. 4-fartøjs prøveudtagningsmetode giver den tiltalende mulighed for at studere maternal-, placenta- og føtaleenheden sammen i stedet for som separate enheder i patologiske graviditeter og kan kaste nyt lys på både gamle og nye spørgsmål inden for rammerne af maternal-føtal interaktion. 4-fartøjs prøveudtagningsmetode kan anvendes på en bred vifte af forskningsspørgsmål i både normale og patologiske graviditeter afhængigt af de yderligere analyser af prøverne. Valget af vacutainers, mængden af blod, placentaområdet og andre vævsprøver bør afgøres i henhold til forskningsspørgsmålet. Burton et al. Har for nylig offentliggjort et fremragende papirbeskrivelsesprocedure for at sikre eksempler på placentasvæv af god kvalitet og tillade sammenlægning af forskellige biobanker for at løse bestemte puslespil, der kræver en stor mængde prøver, der skal løses 20 . 4-karprøverne kan analyseres for at studere den specifikke frigivelse af exosomer til moderAl cirkulation, overførsel af medicin, metabolitter og toksiner. Analyser med stor skala omics (metabolomics, proteomics and lipidomics) har potentiale til at identificere stoffer og metabolitter i moderplasma, som udskilles af moderkagen. Derved kan etableringen af 4-fartøjs prøveudtagningsmetode identificere placentaafledte faktorer i modercirkulationen og mulige udtømning af biomarkører af placentafunktionen. Kombineret med teknikker til at adskille de moderselskabsvendte mikrofle og fostervendte basale plasmamembraner af syncytiotrophoblast kan overførsel af et stof undersøges sammen med aktiviteten og placeringen af relevante transportproteiner 21 . Endvidere kan mekanismer til regulering af næringsoverførsel in vivo belyses ved at analysere niveauerne af næringsstoffer og mikronæringsstoffer i de fire beholdere og relaterer overførslen af næringsstoffer til målinger af næringsstof- og energimålesystemet i placenta 32 33 . Glukosinfusion før levering er en anden mulig tilgang. Placental overførsel kan relateres til moderens metaboliske variabler som BMI-, glukose- og plasma lipidprofiler og føtale resultater som fødselsvægt og kropssammensætning 18 . Sammen vil disse tilgange muligvis belyse placentas integrerende rolle, idet de ligger i centrum af samspillet mellem maternelle og føtale forhold og behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Først og fremmest takker vi oprigtigt de mødre, der deltog i dette projekt. Dernæst anerkender vi alt personale, der hjalp og lette prøveudtagningen, anæstesiologen, sygeplejerskeanæstesiologen og de kirurgiske sygeplejersker. Projektet ville ikke have været muligt uden finansiering fra den regionale sundhedsmyndighed i Sydøstasien og den norske rådgivende enhed for kvinders sundhed, Oslo Universitet og lokal finansiering fra Oslo Universitetshospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
- Jansson, T., Powell, T. L. Role of the placenta in fetal programming: underlying mechanisms and potential interventional approaches. Clin Sci (Lond). 113 (1), 1-13 (2007).
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Guttmacher, A. E., Spong, C. Y. The human placenta project: it's time for real time. Am J Obstet Gynecol. 213, 4 Suppl 3-5 (2015).
- Battaglia, F. C., Regnault, T. R. Placental transport and metabolism of amino acids. Placenta. 22 (2-3), 145-161 (2001).
- Hay, W. W. Placental-fetal glucose exchange and fetal glucose metabolism. Trans Am Clin Climatol Assoc. 117, 321-339 (2006).
- Woollett, L. A. Review: Transport of maternal cholesterol to the fetal circulation. Placenta. 32, Suppl 2 218-221 (2011).
- Prenton, M. A., Young, M. Umbilical vein-artery and uterine arterio-venous plasma amino acid differences (in the human subject). J Obstet Gynaecol Br Commonw. 76 (5), 404-411 (1969).
- Cetin, I., et al. Plasma and erythrocyte amino acids in mother and fetus. Biol Neonate. 60 (2), 83-91 (1991).
- Filshie, G. M., Anstey, M. D. The distribution of arachidonic acid in plasma and tissues of patients near term undergoing elective or emergency Caesarean section. Br J Obstet Gynaecol. 85 (2), 119-123 (1978).
- Haberey, P. P., Schaefer, A., Nisand, I., Dellenbach, P. The fate and importance of fetal lactate in the human placenta -a new hypothesis. J Perinat Med. 10 (2), 127-129 (1982).
- Prendergast, C. H., et al. Glucose production by the human placenta in vivo. Placenta. 20 (7), 591-598 (1999).
- Metzger, B. E., Rodeck, C., Freinkel, N., Price, J., Young, M. Transplacental arteriovenous gradients for glucose, insulin, glucagon and placental lactogen during normoglycaemia in human pregnancy at term. Placenta. 6 (4), 347-354 (1985).
- Zamudio, S., et al. Hypoglycemia and the origin of hypoxia-induced reduction in human fetal growth. PLoS One. 5 (1), 8551 (2010).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Lorentzen, B., Michelsen, T. M., Henriksen, T. Placental glucose transfer: a human in vivo study. PLoS One. 10 (2), 0117084 (2015).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Henriksen, T., Michelsen, T. M. In vivo uteroplacental release of placental growth factor and soluble Fms-like tyrosine kinase-1 in normal and preeclamptic pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 781-782 (2016).
- Paasche Roland, M. C., Lorentzen, B., Godang, K., Henriksen, T. Uteroplacental arterio-venous difference in soluble VEGFR-1 (sFlt-1), but not in soluble endoglin concentrations in preeclampsia. Placenta. 33 (3), 224-226 (2012).
- Brar, H. S., et al. Uteroplacental unit as a source of elevated circulating prorenin levels in normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 155 (6), 1223-1226 (1986).
- Myatt, L., et al. Strategy for standardization of preeclampsia research study design. Hypertension. 63 (6), 1293-1301 (2014).
- Kiserud, T., Rasmussen, S. How repeat measurements affect the mean diameter of the umbilical vein and the ductus venosus. Ultrasound Obstet Gynecol. 11 (6), 419-425 (1998).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Illsley, N. P., Wang, Z. Q., Gray, A., Sellers, M. C., Jacobs, M. M. Simultaneous preparation of paired, syncytial, microvillous and basal membranes from human placenta. Biochim Biophys Acta. 1029 (2), 218-226 (1990).
- Staff, A. C., Ranheim, T., Khoury, J., Henriksen, T. Increased contents of phospholipids, cholesterol, and lipid peroxides in decidua basalis in women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 180 (3), Pt 1 587-592 (1999).
- Catalano, P. M., Thomas, A. J., Avallone, D. A., Amini, S. B. Anthropometric estimation of neonatal body composition. Am J Obstet Gynecol. 173 (4), 1176-1181 (1995).
- Ellis, K. J., et al. Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model. Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).
- Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term. Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).
- Acharya, G., et al. Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep. Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).
- Wu, X., et al. Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy. Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).
- Tuckey, R. C. Progesterone synthesis by the human placenta. Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).
- Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. Fetal metabolic response to maternal starvation. Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).
- Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. Insulin effect on fetal glucose utilization. Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).
- Bujold, E., et al. Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin. J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).
- Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing. Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).
- Cetin, I. Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).
