Summary
Vi presenterer en detaljert metode for å studere human placenta fysiologi in vivo på sikt. Metoden kombinerer blodprøvetaking fra innkommende og utgående fartøy på moderens og fostrets sider av moderkagen med ultralydsmålinger av volumblodstrøm og plasentvevssampling.
Abstract
Den menneskelige placenta er svært utilgjengelig for forskning mens den fortsatt er i utero . Den nåværende forståelsen av human placenta fysiologi in vivo er derfor i stor grad basert på dyreforsøk, til tross for det høye mangfoldet blant arter i anestesi, hemodynamikk og graviditetens varighet. De aller fleste human placenta-studier er ex vivo perfusjonsstudier eller in vitro trofoblast-studier. Selv om in vitro- studier og dyremodeller er essensielle, er ekstrapolering av resultatene fra slike studier til human placenta in vivo usikkert. Vi har som mål å studere human placenta fysiologi in vivo på sikt, og presentere en detaljert protokoll av metoden. Utnyttelse av intraabdominal tilgang til livmorvenen rett før livmorskåret under planlagt keisersnitt, samler vi blodprøver fra de innkommende og utgående skinnene på moderens og føtalets sider av moderkaken. Når du kombinerer conSentreringsmålinger fra blodprøver med volumblodstrømsmålinger, er vi i stand til å kvantifisere placenta og føtale opptak og frigjøring av en hvilken som helst forbindelse. Videre kan plasentalvevsprøver fra de samme morfosterparene gi målinger av transportørens tetthet og aktivitet og andre aspekter av plasentalfunksjonene in vivo . Gjennom denne integrerte bruken av 4-fartøyers prøvetakingsmetode kan vi teste noen av de nåværende konseptene av plasental næringsmiddeloverføring og metabolisme in vivo , både i normale og patologiske graviditeter. Videre muliggjør denne metoden identifisering av substanser utsatt av moderkrekken for moderens sirkulasjon, noe som kan være et viktig bidrag til søket etter biomarkører av moderkreftdysfunksjon.
Introduction
Ifølge National Institutes of Health, USA er placenta det minst forstått organ i menneskekroppen 1 , 2 , 3 . Det er vanskelig å få tilgang til og studere den menneskelige placenta in vivo uten å påføre uetiske farer på den pågående graviditeten. Studier av plasentalfunksjon hos mennesker er derfor i stor grad basert på in vitro- og ex vivo- modeller. De fleste tidligere in vivo- studier av plasentransport og metabolisme har blitt utført hos dyr 4 , 5 , 6 . Men siden placenta strukturer og funksjoner varierer betydelig mellom arter, må ekstrapolering av resultater fra dyr til mennesker gjøres med forsiktighet. Bare noen få mindre humane in vivo- studier har undersøkt plasental- og føtalopptak og transport under normal fysiologiskAl-betingelser, og ingen har utforsket den integrerte overføring av flere forbindelser 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Disse grunnleggende studiene illustrerer at in vivo studier av human placenta er mulige, og at de kan tjene flere formål. For det første kan nåværende konsepter av plasentalfunksjoner som hovedsakelig er avledet fra in vitro , ex vivo og dyreforsøk, bli testet i en human setting og dermed gi ny og mer spesifikk innsikt i den menneskelige placenta. For det andre kan egenskaper av den dysfunksjonelle placenta forbundet med avvigende fostervekst, preeklampsi, maternær diabetes, metabolsk syndrom og andre materielle metabolske forstyrrelser, bli bedre karakterisert. Tredje menneskelige in vivo- studier gir en mulighet til å utvikle diagnoserTic og prediktive verktøy for plasental funksjon.
På denne bakgrunnen hadde vi som mål å etablere en omfattende samling av fysiologiske data for å undersøke human placentafunksjon in vivo. Under en planlagt keisersnitt utnytter vi den intraabdominale tilgangen til livmorvenen for å samle blodprøver fra de innkommende og utgående fartøyene på moderens og fostrets sider av moderkaken (4-kar-prøvetakingsmetoden). Disse prøvene brukes til å beregne de parrede arteriovenøse konsentrasjonsforskjeller av næringsstoffer og andre stoffer 14 . I tillegg måler vi volumblodstrøm på begge sider av morkaken ved ultralyd. Følgelig kan plasentalt og føtal opptak av en hvilken som helst forbindelse kvantifiseres. Videre er det mulig å bestemme substanser frigjort av moderkaken til maternelle og føtal sirkulasjoner 15 , 16 , 17 . Når kombinereD med kliniske parametre av mor og barn, og analyser av placenta og andre relevante vev, har denne metoden det spennende potensialet for å integrere mange aspekter av plasentalfunksjoner in vivo i samme morfosterpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av databeskyttelsesansatte ved Oslo Universitetssykehus og Regionalkomiteen for medisinsk og helseforskningsetikk, Sør-Norge 2419/2011. Alle deltakere signerte skriftlig informert samtykke ved inkludering.
1. Forberedelser
MERK: En tidslinje for prosedyrene er skissert i figur 1 .
Figur 1 : Flytskjema som beskriver timing og personell involvert i 4-fartøyens prøvetakingsprosedyre.
En farge representerer en person. Detaljert beskrivelse av metoden er gitt i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Personale
- Klargjør utstyret, 50 ml iskall 1 M fosfatbuffert saltvann (PBS), 25 ml kald RNA-stabiliserende oppløsning og 5 x 0,5 ml optimal skjæringstemperaturforbindelse (OCT). Merk de vacutainers og rørene. Se foreløpig liste over utstyr.
2. Maternale egenskaper
- Registrere mors kliniske og ikke-kliniske egenskaper ved inkludering og gjenta relevante spørsmål og megAsurements, inkludert vekt, på leveringstidspunktet. Legg inn varigheten av fasteperioden før keisersnittet, og eventuelle hypotensive episoder som oppstår under operasjonen.
Merk: Inkluder det minimale materniske kliniske datasettet som er rapportert i en nylig publisert fra Global Gravidity CoLaboratory (COLAB). Denne artikkelen inneholder også noen svært viktige aspekter ved valg av studiepopulasjoner og bør tas opp under planlegging av studien 18 . - Vurder å registrere paternale egenskaper, inkludert etnisitet, alder og kroppsmasseindeks (BMI).
3. Ultralyd
- Utfør Doppler-ultralydundersøkelsen på leveringsdagen, med kvinnene i fastende tilstand. Utfør undersøkelsen i løpet av en periode med føtale quescence, med kvinnen i semi-supine stilling, vippet litt lateralt motsatt til regionen av interesse for å unngå komprimering av aorta og vena cava. Overvåk utgangen iTetthet av de mekaniske og termiske indeksene på skjermen.
- Navlestreng
- Visualiser navlestrengen i en sagittal eller skrå transeksjon av føtal buk. Mål den indre beholderdiameteren i den rette delen av den intra abdominale navlestrengen før noen synlige grener. Bruk vanlig B-modus og visualiser fartøyet i en vinkelrett innsynsvinkel for diametermålinger og hold flere optimale rammer for senere målinger for å minimere effekten av endringer i pulserende diameter.
- Gjenta målingene fem til ti ganger 19 .
- På samme sted bruker du Doppler-ultralyd og juster sonden for å få en innsynsvinkel så lav som mulig (alltid <30 °) for å måle den gjennomsnittlige maksimumhastigheten (TAMX). Hent hastigheten over en periode på 3 - 5 s (ikke-pulserende strømning).
- Visualiser navlestrengen i en sagittal eller skrå transeksjon av føtal buk. Mål den indre beholderdiameteren i den rette delen av den intra abdominale navlestrengen før noen synlige grener. Bruk vanlig B-modus og visualiser fartøyet i en vinkelrett innsynsvinkel for diametermålinger og hold flere optimale rammer for senere målinger for å minimere effekten av endringer i pulserende diameter.
- Uterine arterie
- Bruk DopplerUltralyd for å visualisere livmorarterien da den krysser den ytre arterien av ytre arteriet, umiddelbart etter at den grener fra den indre iliacarterien. Juster sonden på dette nettstedet for å få en lav innstillingsvinkel (alltid <30 °) og måle TAMX. Hent hastigheten som gjennomsnittshastigheten til tre hjertesykluser.
- Ettersom det ikke er sannsynlig å få en vinkelrett vinkel på samme sted som TAMX måles, følg fartøyet distalt for å få en riktig vinkel for diametermålinger så nær sidene med diametermålinger som mulig. Ekskluder diametermålingene hvis noen synlige fartøy avgrener seg før dette stedet, som evaluert av fargedoppler-ultralyd.
- Bruk vanlig B-modus og visualiser fartøyet i en vinkelrett innsynsvinkel for diametermålinger og hold flere optimale rammer for senere målinger for å minimere effekten av endringer i pulserende diameter.
- Gjenta målingene fem til ti ganger 19 .
- Legg merke til plasseringen av moderkaken.
4. 4-kar blodprøve
MERK: Tidslinjen for prosedyrene er skissert i figur 1 og en oversikt over prøvene er illustrert i figur 2 .
Figur 2 : Skjematisk illustrasjon av Placental Vasculature og samplingssteder.
I 4-kar-prøvetakingsmetoden er blodprøver trukket fra livmorvenen, den radiale arterien (som en proxy for livmorarterien) og navlestangene og venen. Blodstrømmen i livmorarterien og navlestrengen måles ved hjelp av ultralyd. Vevsprøver fra placenta oppsamles. Illustrasjon: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Sikkerhetsprosedyrer
- Gi alt personell i operasjonsteateret med hansker, kirurgiske skrubbedrag, masker og hodeplagg.
- Gi kirurger og forskningspersonell kontakt med operasjonsfeltet med kirurgiske skrubbefarger, masker, hodeplagg, kappegaver og doble hansker. Briller er valgfrie.
- Gi personell som håndterer blodprøver med hansker.
- Gi personell som håndterer mageprøver med hansker og kirurgisk maske. Homogenisering krever bruk av hetter.
- Forberedelse i operasjonsteateret
- Gi en orientering og lever utstyret til alle personellene som vil bistå med prøvetaking før kirurgi.
- Adresse anestesiologen og anestesiologi sykepleier som vil bistå med nødvendig perifer arteriell og venøs tilgang, og sørge for atIngen væsker gis intravenøst før prøvetaking.
- Gi tre sprøyter (10 mL) uten nåler til personen som bistår med antecubitalveinprøven og to sprøyter (en 20 mL og en 10 mL) og en blodgassprøyte (med heparin) til personen som bistår med den radiale arterien.
- Forbered to sterile sprøyter (20 mL), fem sterile sprøyter (10 mL), tre "butterfly nåles" og to blodgass sprøyter for operasjonsfeltet.
- Tilgang til blodkar.
- Følg standard prosedyren før keisersnittet for å sikre perifer intravenøs (iv) tilgang.
MERK: Antecubitalvenen er å foretrekke fordi det er lettere å tegne prøver fra dette nettstedet. - Lokaliser radialarterien ved håndleddet ved ultralyd eller ved palpasjon. Etter 0,5 ml subkutan lidokain analgesi, plasser en arteriell linje inn i den radiale arterien. Oppgi prøvetaking fra dette nettstedet i tilfelle tre mislykkede innføringer, ellerHvis kvinnen opplever smerte under innsetting.
MERK: Utfør den kirurgiske prosedyren av keisersnitt i henhold til standardprosedyren. Bare justeringene som trengs for prøvetakingsprosedyren er understreket nedenfor.
- Følg standard prosedyren før keisersnittet for å sikre perifer intravenøs (iv) tilgang.
- Maternal blodprøver
MERK: Skaff alle tre blodprøver fra moderen (livmorvev, radial arterie og antecubitalvein) samtidig før livmorskåret.- For livmorvenen, etter å ha åpnet bukhulen, bruk en retractor for å løfte bukveggen og avsløre hovedgrenene til livmorårene på livmorens anterolaterale sider. Få blod fra livmoravnets grener på samme side som moderkaken når det er mulig, eller bruk den mest fremtredende venet plexus hvis moderkaken ligger i livmorhalskretsen.
- Sett en butterfly nål på en blodgass sprøyte i livmorveven i en vinkel på ca 30 grader og samle blod gjennom forsiktig aspirasjon for å unngåhemolyse. Mens du nøye sikrer fuglens nålstilling, erstattes den fylte blodgassprøyten med en 20 ml og en 10 ml sprøyte etter hverandre.
MERK: Optimal tilgang sikres best når du står på den kontralaterale siden av den valgte livmorvenen.
- Sett en butterfly nål på en blodgass sprøyte i livmorveven i en vinkel på ca 30 grader og samle blod gjennom forsiktig aspirasjon for å unngåhemolyse. Mens du nøye sikrer fuglens nålstilling, erstattes den fylte blodgassprøyten med en 20 ml og en 10 ml sprøyte etter hverandre.
- For den radielle arterien, aspirere fra intra-arterial linjen. Kast de første 5 ml, og aspirer deretter 3 ml i heparinsprøyte for blodgassanalyser, etterfulgt av 3 ml i to sprøyter (20 + 10 ml).
- For antecubitalvenen, aspirere forsiktig fra det intravenøse kateteret. Kast de første 5 ml, og aspirer deretter 30 ml i tre sprøyter (10 ml).
- Utfør en endelig inspeksjon av prøveplasseringsstedet på livmorveven før du begynner å lukke magen.
- For livmorvenen, etter å ha åpnet bukhulen, bruk en retractor for å løfte bukveggen og avsløre hovedgrenene til livmorårene på livmorens anterolaterale sider. Få blod fra livmoravnets grener på samme side som moderkaken når det er mulig, eller bruk den mest fremtredende venet plexus hvis moderkaken ligger i livmorhalskretsen.
- Fosterblodprøver
- Når barnet er født, aspirer straks blod fra navlestrengen, uten å klemme navlestrengen eller levere morkaken. Begynn medH sprøyten for blodgassanalyse, og følg med tre 10 ml sprøyter hvis mulig.
- Når arterieprøver er sikret, klemme ledningen og hånd barnet til jordemor før prøvetaking fra navlestrengen (blodgass og 20 + 10 ml sprøyter).
MERK: Hent alle navlestrømmer i løpet av få sekunder etter levering og med morkaken på stedet, med mindre det er løsrevet spontant. - Følg norske anbefalinger om senklemmer. Ved et nødt barn må du klemme og kutte ledningen umiddelbart og hånd barnet til jordemor og neonatolog.
- Håndtering av blodprøver
- Sett blodgasssprøyter på is mens du forbereder resten av blodprøver, og analyser dem i en blodgassanalysator innen 5 min.
- Overfør blodprøver umiddelbart til vakuumbehandlere og plasser plasmaglassene på en rocker i 1 - 2 minutter før du legger dem på is. La serumrørene stå på arbeidetAtory benk å bosette seg i 30 minutter.
MERK: Dette er et kritisk skritt i prosedyren som trenger ekstra oppmerksomhet fordi prøver fra alle fem sidene må tilberedes samtidig for å sikre god kvalitet. - Sentrifuger plasmaprøvene så snart som mulig, og innen 30 minutter ved 6 ° C, 2500 xg i 20 minutter.
- Etter 30 min, sentrifuger serumprøver ved romtemperatur i 10 minutter ved 2500 x g.
- Aliquot supernatantene forsiktig til 2 mL cryo rør, etterlater 0,5 mL av supernatanten over pellet for å sikre blodplas-fritt plasma.
- Oppbevar prøvene ved -80 ° C.
5. Samling av placental væv
- Plasser moderkaken flatt ned på en iskjølt disseksjonsbrett så snart som mulig etter at den er levert. Fotografer og måler lengste diameter og diameter ved 90 grader.
- Veie morkaken.
- Legg inn vekten, de to diameterene, hvilken som helst gRosspatologi, antall fartøy i ledningen og tidsintervallet fra levering til når placenta ble plassert på is.
MERK: Send morkaken til patologisk undersøkelse dersom det er klinisk indikert. - Plasser morkaken med mødreflaten vendt opp og identifiser 4 - 5 utvalgssteder som er tilfeldig plassert i hver kvadrant av moderkaken, og unngå områder med frankpatologi. Fjern deciduaen med saks for å kutte bort 3 - 5 mm fra maternets overflate. Samle et 1 - 2 cm 3 stykke villøst vev fra hvert sted.
- Vask oppsamlet vev forsiktig i 50 ml kald 1M PBS. Del i flere deler fra hvert prøvetrykksted og alikvot.
Merk: Størrelsen på morkaken vil avhenge av de planlagte analysene. - Legg til alikvoter på 0,1 - 0,5 cm 3 vevsprøver til 5 cryo rør og snapfrys i flytende nitrogen.
- Legg små stykker av 0,1 - 0,2 cm 3 til røret med 25 ml RNA stabiliseringsoppløsning. Oppbevar ved 46, C i 24 timer, kasserer RNA stabiliseringsløsningen og erstatt den. Fryse.
- Legg stykker på 0,5 cm 3 til 5 kryo rørene med 0,5 ml OCT, fyll opp med OCT, bland og frys.
- Oppbevar prøvene ved -80 ° C til analyse.
MERK: Burton et al. Gir en utmerket oversikt over de praktiske aspektene ved pladeprøvetaking, avhengig av de planlagte analysene. 20 Vurder å forberede det gjenværende vevet for isolering av de mikrovilløse og basale membranene, og å samle det enkelte vev ved vakuumsugingsteknikk. 21 , 22
6. Neonatale egenskaper
- Ta opp de neonatale egenskapene, inkludert Apgar-poeng (1, 5 og 10 min), kjønn, vekt, lengde, svangerskapsalder og opptak til nyfødt intensivavdeling (lengde og utfall av oppholdet).
- Vurder å måle neonatal kroppssammensetning ved antropometriske målinger, luftforskyvningMent plethysmograph eller dual røntgen absorptiometri. 23 , 24
7. Beregninger
- Anta lignende blodsammensetning i den radiale og uterine arterien og beregne uteroplacental arteriovenøs konsentrasjonsforskjell.
Uteroplacental arteriovenøs konsentrasjonsforskjell = C A - C V
Umbilikal venøs - arteriell konsentrasjonsforskjell = C v - C a
Hvor C er konsentrasjon med abonnement: A, den radiale arterien; V, livmorvenen; V navlestrengen og a, navlestrengen. - Beregn volumet blodstrøm, ml / min (Q):
Hvor D er fartøyets diameter (cm), er TAMX en gjennomsnittlig maksimal hastighet og h er koeffisienten for den romlige blodhastighetsprofilen. Bruk 0,5 som koeffisient for navlestrengen og0,6 for livmorarterien 25 , 26 . - Beregn placentaopptaket og slipp ut i henhold til Ficks prinsipp:
Uteroplacental opptak = ( C A - C V ) x Qm
Fosteropptak = ( C v - C a ) X Qf
Abonnementer: m, mor og f, foster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøvetakingsmetoden med 4 beholdere er anvendelig i klinisk praksis, og vi har vellykket blodprøver fra 209 mor / spedbarnspar. I 128 av disse oppnådde vi også å måle volumblodstrømmen. Komplett 4-fartøy prøvetaking og god kvalitet flyt målinger av både mor og foster fartøy ble oppnådd i 70 morfoster par ( figur 3 ). I tillegg har vi hittil samlet blod- og placenta-prøver fra 30 preeklamptiske pasienter. Vi har tidligere publisert artikler om human placenta-overføring av næringsstoffer, samt utgivelse av vasoaktive faktorer, som demonstrerer to anvendelser av metode 14 , 15 , 16 .
Eksempel på hvordan 4-fartøymetoden brukes til å studere plasentransfer
Det er betydelig arteriUjevn glukoseforskjell på begge sider av moderkroppen som demonstrerer en in vivo uteroplacental og føtal opptak av glukose ( tabell 1 ). Placental overføring av glukose er avhengig av moder-føtal glukosegradient, og dermed på moderens glukosenivå. Vi har imidlertid tidligere vist at denne gradienten, og dermed glukoseoverføringen, er signifikant påvirket av føtale insulinnivåer og glukoseforbruk. Dette er et eksempel på hvordan denne metoden illustrerer viktig maternal-føtale samspill 14 .
| Vessel | Glukosemol / L | p-verdi * |
| Radial arterie | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Uterine venen | 4,23 [3,94, 4,53] | |
| Navlestreng | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Umbilical arterie | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Parrede forskjeller | ||
| Radial arterie - livmoderveine | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Umbilical artery - navlestreng | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Radial arterie - navlestreng | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tabell 1: Median [Q1, Q3] Konsentrasjoner og Arteriovenøse Forskjeller av Glukose
* Wilcoxon Signed-Rank test
Fostal glukoseopptaket fra (placentautgivelse til) navlestrømssirkulasjonen antas å være avhengig ikke bare oN fødselsgradienten, men på blodprosessen i blodet 5 . På samme måte kan det være aktuelt å studere føtale glukoseopptaket som en funksjon av moderkreft eller fødselsvekt. I n = 128 fant vi en median [Q1, Q3] total navlestrengsvene på 196,2 [158,3, 232,2] ml / min og beregnet en median [Q1, Q3] føtal glukoseopptak fra (placentautslipp til) navlestrømssirkulasjonen av 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normalisert for fødselsvekt er dette lik 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. Morkaken frigir 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) per kg placenta.
Eksempel på hvordan 4-fartøymetoden brukes til å studere opptak av placenta
Dyrestudier antyder at glutaminsyre er viktig både i interkonversjon av aminosyrer i moderkagen og føtale leveren, og som et oksidativt brensel i andre metabolske veier 27 . Ved hjelp av placenta 4-fartøy prøvetaking metoden vi studerte uTeroplacental og navlestikk arteriovenøse forskjeller i glutaminsyre hos mennesker ( tabell 2 ). Vi fant en placentaopptak (dermed en føtal frigjøring) av glutaminsyre fra navlestrømssirkulasjonen. Videre fant vi en placental opptak av glutaminsyre fra moderens sirkulasjon. Denne plasentale opptaket fra begge sirkulasjonene er et eksempel på hvordan 4-karmetoden kan brukes til å demonstrere in vivo hos mennesket at placenta metabolisme av næringsstoffer er en del av reguleringen av transplacental overføring.
| Vessel | Glutaminsyre μmol / L | p-verdi * |
| Radial arterie | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Uterine venen | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Navlestreng | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Umbilical arterie | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Parrede forskjeller | ||
| Radial arterie-uterinvein | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Umbilical artery -umbilisk vene | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tabell 2: Median [Q1, Q3] Konsentrasjoner og Arteriovenøse Forskjeller av Glutaminsyre
* Wilcoxon Signed-Rank test
Eksempel på hvordan 4-fartøymetoden brukes til å studere utgivelse av placenta
Det er fastslått at morkaken avdriver progesteron og for å validere vår 4-kar-metode på moderens side av moderkaken, måler vi in vivo- frigjøring av progesteron ved teRm 28 . Vi fant en signifikant placentautgivelse av progesteron i morsomgangssirkulasjonen ( tabell 3 ). Den observerte arteriovenøse forskjellen demonstrerer hvordan prøvetakingsmetoden for placenta 4-kar kan brukes til å oppdage stoffer som frigjøres av moderkaken, og er svært relevant når man studerer patologiske graviditeter.
| Vessel | Progesteron nmol / L | p-verdi * |
| Radial arterie | 678 [514, 971] | |
| Uterine venen | 1852 [1059, 2786] | |
| Parrede forskjeller | ||
| Radial arterie-uterinvein | -1187 [-1855, -404] | p <0,001 |
Tabell 3: Median [Q1, Q3] konsentrasjoner og uteroplacental arteriovenøs forskjell av progesteron
* Wilcoxon Signed-Rank test
Figur 3 : Flytediagrammer og illustrasjon av inkluderte og tapte deltakere.
A. Viser inkludering av deltakerne, og viser at deltakerne mistet seg hovedsakelig på grunn av arbeidstidsarbeid før keisersnitt eller mangel på tilstrekkelig personell til å gjennomføre studien. B. Av de 179 kvinnene med normale graviditeter (blå) ble det oppnådd fullstendig 4-kar blodprøver i 162 (91%) (ufullstendige føtale blodprøver: svarte, ufullstendige morsprøveprøver: grå). Femtiett (28%) deltakere ble ikke inkludert i ultralydsmålinger på grunn av logistiske begrensninger. Av 128 deltakere (72%) utsatt for ultralyd, ble blodstrømsmålinger ved fostrets side av moderkroppen oppnådd hos alle deltakere (lysegrønn), mens det ble oppnådd fullstendige blodmålinger i både mors- og fostersiden i 77 (60%) (mørk grønn). Illustrasjon: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mønsteret med moderkreft 4-fartøy er relevant for tre hovedformål. For det første kan det brukes til å studere hvordan bestemte stoffer tas opp av moderkrekken på morssiden og muligens overføres til navlestrømssirkulasjonen og fosteret, som demonstrert av våre glukose- og aminosyreundersøkelser. For det andre er metoden svært relevant for å studere substanser produsert av moderkagen og frigjort til moder- eller føtal sirkulasjon, som demonstrert av progesteron-resultatene. For det tredje kan det være nyttig å studere hvordan fosteret in vivo eliminerer avfallsprodukter under den raske veksten og vevsmodelleringen.
Kritiske skritt og logistiske problemer av 4-fartøymetoden
Placenta 4-fartøy prøvetaking har tidligere blitt brukt til å bestemme plasental overføring av makronæringsstoffer in vivo i normale fysiologiske graviditeter 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, men med et begrenset antall studiefag. Den begrensede bruken av 4-fartøyet prøvetaking skyldes trolig den krevende logistikken til prosedyren. En vellykket samordning mellom pasienten, forskerne og personell ved instituttene for fostermedisin, obstetrik og anestesiologi er viktig for å kunne benytte denne metoden. Vi tror det har vært en stor fordel at flere av de viktigste etterforskerne er obstetrikere, kjenne til kliniske rutiner og nøkkelpersonell. Dermed har studieprosedyrene blitt implementert ved siden av den daglige kliniske praksisen. Ved å koordinere og sikre hvert trinn i prosedyren, har vi fått prøver fra over 200 mor / nyfødte par. Videre har vår strategi vært å holde prøvetakingsprosedyren på få hender fordi det er tekniske utfordringer i prosedyren som er avgjørende for det vellykkede resultatet av prøvetaking, og for mange samplere kan introdusere unødvendige kilder til variasjon av dataene. ConsequVi anbefaler at alle sonografiske undersøkelser utføres av samme eksaminator ved bruk av samme ultralydsmaskin. Utstyret bør velges med forsiktighet, da oppløsningen av fartøyets vegg er avgjørende. Uterinarteriene i tredje trimester er spesielt teknisk utfordrende å måle fordi livmorstørrelsen og innholdet gjør det vanskelig å oppnå både den vinkelrette innfellingsvinkelen som brukes til diametermålingene og den lave innstillingsvinkelen for flythastighetsmålinger på nøyaktig samme sted. Videre krever vellykket blodprøve identifisering av passende prøvetakingssted i livmorvenen og mild aspirasjon. På navlestrengs side krever følsomhetens erythrocytters sårhet særlig oppmerksomhet mot aspirasjonskraften. Det er vår erfaring at forsinket levering eller mindre stress til spedbarnet var forbundet med tidlig innsnevring av navlestrengen, noe som resulterte i redusert arteriell prøvevolum.
Metodisk / Analytisk utgave av 4-fartøymetoden
Det er viktig å ta opp flere metodologiske problemer i tolkningen av resultatene fra en placenta 4-kar studie. For det første, hvis målet er å beregne massen av et stoff som tas opp, eller frigjort, av moderkagen, er det viktig å vurdere volumet av blodpassering. Det bør holdes oppmerksom på at livmorvenen ikke bare tømmer morkaken, men også drenerer livmormuskelene, og at livmorvaskulaturen i ulike grad anastomiserer med eggstokken og vaginalvaskulaturen. Deretter er det viktig å vurdere at utveksling av vann over morkaken kan påvirke konsentrasjonenRangeringene målt, og derved påvirker de beregnede arteriovenøse konsentrasjonsforskjeller. Ideelt sett behandles dette best ved å justere konsentrasjonsforskjellene for vannet som er tapt eller oppnådd i hvert morfosterpar. Dette kan oppnås ved å måle et stoff som ikke tas opp eller frigjøres av morkaken eller livmoren. Hemoglobinkonsentrasjonen eller beregnede prosentandeler av erytrocytter (hematokrit) kan fungere som korreksjonsfaktorer for vannutveksling. Videre kan det ved interpreting opptak eller frigjøring av forbindelser på moderens side av moderkagen være interessant å oppnå arteriovenøse forskjeller i andre vev for sammenligning. Vi har derfor tatt med en blodprøve fra antecubitalvenen for å karakterisere spesifikke trekk ved moderkaken ved å sammenligne arteriovenøse forskjeller over moderkaken med de av kapillærbunnen av underarmen. Vi fant denne sammenligningen spesielt interessant da vi testet utløsning av sFlt-1 og placenta vekst faCtor fordi systemiske endotelceller kunne være en potensiell kilde til disse forbindelsene 14 . Avhengig av forskningsspørsmålet kan det være av betydning å knytte arteriovenøse forskjeller til vekten av morkaken for å beregne placentaffektiviteten, dvs. når det gjelder (mmol / L) / kg eller (mmol / min) / kg placenta.
Begrensninger og styrker i 4-fartøymetoden
Selv om placenta fysiologi er mindre påvirket av keisersnitt enn ved stress av vaginal levering, er det flere begrensninger på denne metoden. Vaginal levering anbefales i de fleste tilfeller av vanlige graviditetskomplikasjoner (som preeklampsi, diabetes, fedme og moderat føtale makrosomi), noe som kan begrense og forstyrre rekruttering. Selv når man optimaliserer hvert trinn i metoden, er det vanskelig å oppnå fullstendige målinger og prøver på hver pasient på grunn av de tekniske vanskeligheter i blodprøveprosedyren og ultralyd volumUme flow målinger ( figur 3 ). I tillegg, selv om ultralydsmålinger blir gjennomført så nær tid til operasjonen som mulig, blir de iboende utført før spinalbedøvelsen og blodprøven. Fra dette følger at moderens kardiale utgang (CO) kan endres og muligens påvirke uteroplacental (og til og med feto-placental) blodstrøm. Den mulige endringen i CO forårsaket av spinalanestesiacan kompenseres av fenylefrin som ble brukt i den nåværende studien. Foreløpige data fra en delmengde av deltakerne (n = 23) viser ingen signifikant endring i CO før spinalbedøvelse og ved prøvetaking (upubliserte data). Ved å bruke 4-kar-prøvetakingsmetoden hos mennesker, begrenser både muligheten til å innføre en tidsvariabel og manipulere blodinnholdet 5 , 29 , 30 , i motsetning til hos dyr. Fra disse hensynene følger det at 4-fartøyet Prøvetakingsmetode er tverrsnitt og i stor grad observasjonsmessig av natur, og de innhentede dataene må analyseres tilsvarende. På den annen side gir 4-fartøy-prøvetakingsmetoden en unik mulighet til å studere human placenta fysiologi og patofysiologi in vivo , med alle de interaksjonsfaktorene som er på spill, en situasjon som aldri kan reproduseres in vitro . Det gir en utmerket mulighet til å teste hypoteser som har oppstått fra dyr eller andre eksperimentelle studier. På samme måte kan det generere nye hypoteser som må testes mekanisk in vitro og i dyreforsøk.
Potensielle anvendelser av 4-fartøymetoden
I patologiske graviditeter har maternelle og føtal arteriovenøse konsentrasjonsforskjeller hittil blitt studert separat og tillatt for testing av noen av de eksisterende hypotesene in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. 4-fartøyers prøvetakingsmetode gir den tiltalende muligheten til å studere maternal-, plasental- og føtaleenheten i stedet for som separate enheter i patologiske graviditeter, og kan kaste nytt lys på både gamle og nye spørsmål innenfor omfanget av maternal-føtale samhandling. 4-fartøys prøvetakingsmetode kan brukes på et bredt spekter av forskningsspørsmål i både normale og patologiske graviditeter, avhengig av videre analyser av prøvene. Valget av vacutainers, volumet av blod, spenningsområdet og andre vevsprøver bør avgjøres i henhold til forskningsspørsmålet. Burton et al. Har nylig publisert en utmerket dokumentbeskrivelse for å sikre god kvalitet på prøver av placentavev, og å tillate sammenslåing av forskjellige biobanker for å ta opp bestemte puslespill som trenger en stor mengde prøver som skal løses 20 . 4-karprøver kan analyseres for å studere den spesifikke frigivelsen av eksosomer til maternAl sirkulasjon, overføring av medisiner, metabolitter og toksiner. Analyser med stor skala omics (metabolomics, proteomics and lipidomics) har potensial til å identifisere stoffer og metabolitter i mors plasma som utskilles av moderkaken. Dermed kan etableringen av 4-fartøyers prøvetakingsmetode identifisere moderkreft-avledede faktorer i moderens sirkulasjon og mulige tease out biomarkører av placenta funksjon. Kombinert med teknikker for å skille de materielle motstående mikrofle og fostervendte basale plasmamembranene i syncytiotrofoblastet, kan overføring av et stoff studeres sammen med aktiviteten og plasseringen av relevante transportproteiner 21 . Videre kan mekanismer som regulerer næringsoverføring in vivo , bli belyst ved å analysere nivåene av næringsstoffer og mikronæringsstoffer i de fire karene og relaterer overføringen av næringsstoffer til målinger av nærings- og energimålesystemet i moderkaken 32 33 . Glukosinfusjon før levering er en annen mulig tilnærming. Placental overføring kan være relatert til mors metabolske variabler som BMI, glukose og plasma lipidprofiler og føtale utfall som fødselsvekt og kroppssammensetning 18 . Sammen vil disse tilnærmingene muligens belyse den integrative rollen som moderkaken, som ligger i sentrum av samspillet mellom maternale og føtale forhold og behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Først og fremst takker vi hjertelig mødrene som deltok i dette prosjektet. Deretter anerkjenner vi alt personell som assisterte og lette prøvetakingsprosedyren, anestesiologen, sykepleieren anestesiolog og kirurgisk sykepleiere. Prosjektet ville ikke vært mulig uten finansiering fra Helse Sør-Øst-Norge og Norsk Rådgivende enhet for kvinners helse, Oslo Universitet og lokal finansiering fra Oslo Universitetssykehus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
- Jansson, T., Powell, T. L. Role of the placenta in fetal programming: underlying mechanisms and potential interventional approaches. Clin Sci (Lond). 113 (1), 1-13 (2007).
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Guttmacher, A. E., Spong, C. Y. The human placenta project: it's time for real time. Am J Obstet Gynecol. 213, 4 Suppl 3-5 (2015).
- Battaglia, F. C., Regnault, T. R. Placental transport and metabolism of amino acids. Placenta. 22 (2-3), 145-161 (2001).
- Hay, W. W. Placental-fetal glucose exchange and fetal glucose metabolism. Trans Am Clin Climatol Assoc. 117, 321-339 (2006).
- Woollett, L. A. Review: Transport of maternal cholesterol to the fetal circulation. Placenta. 32, Suppl 2 218-221 (2011).
- Prenton, M. A., Young, M. Umbilical vein-artery and uterine arterio-venous plasma amino acid differences (in the human subject). J Obstet Gynaecol Br Commonw. 76 (5), 404-411 (1969).
- Cetin, I., et al. Plasma and erythrocyte amino acids in mother and fetus. Biol Neonate. 60 (2), 83-91 (1991).
- Filshie, G. M., Anstey, M. D. The distribution of arachidonic acid in plasma and tissues of patients near term undergoing elective or emergency Caesarean section. Br J Obstet Gynaecol. 85 (2), 119-123 (1978).
- Haberey, P. P., Schaefer, A., Nisand, I., Dellenbach, P. The fate and importance of fetal lactate in the human placenta -a new hypothesis. J Perinat Med. 10 (2), 127-129 (1982).
- Prendergast, C. H., et al. Glucose production by the human placenta in vivo. Placenta. 20 (7), 591-598 (1999).
- Metzger, B. E., Rodeck, C., Freinkel, N., Price, J., Young, M. Transplacental arteriovenous gradients for glucose, insulin, glucagon and placental lactogen during normoglycaemia in human pregnancy at term. Placenta. 6 (4), 347-354 (1985).
- Zamudio, S., et al. Hypoglycemia and the origin of hypoxia-induced reduction in human fetal growth. PLoS One. 5 (1), 8551 (2010).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Lorentzen, B., Michelsen, T. M., Henriksen, T. Placental glucose transfer: a human in vivo study. PLoS One. 10 (2), 0117084 (2015).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Henriksen, T., Michelsen, T. M. In vivo uteroplacental release of placental growth factor and soluble Fms-like tyrosine kinase-1 in normal and preeclamptic pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 781-782 (2016).
- Paasche Roland, M. C., Lorentzen, B., Godang, K., Henriksen, T. Uteroplacental arterio-venous difference in soluble VEGFR-1 (sFlt-1), but not in soluble endoglin concentrations in preeclampsia. Placenta. 33 (3), 224-226 (2012).
- Brar, H. S., et al. Uteroplacental unit as a source of elevated circulating prorenin levels in normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 155 (6), 1223-1226 (1986).
- Myatt, L., et al. Strategy for standardization of preeclampsia research study design. Hypertension. 63 (6), 1293-1301 (2014).
- Kiserud, T., Rasmussen, S. How repeat measurements affect the mean diameter of the umbilical vein and the ductus venosus. Ultrasound Obstet Gynecol. 11 (6), 419-425 (1998).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Illsley, N. P., Wang, Z. Q., Gray, A., Sellers, M. C., Jacobs, M. M. Simultaneous preparation of paired, syncytial, microvillous and basal membranes from human placenta. Biochim Biophys Acta. 1029 (2), 218-226 (1990).
- Staff, A. C., Ranheim, T., Khoury, J., Henriksen, T. Increased contents of phospholipids, cholesterol, and lipid peroxides in decidua basalis in women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 180 (3), Pt 1 587-592 (1999).
- Catalano, P. M., Thomas, A. J., Avallone, D. A., Amini, S. B. Anthropometric estimation of neonatal body composition. Am J Obstet Gynecol. 173 (4), 1176-1181 (1995).
- Ellis, K. J., et al. Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model. Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).
- Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term. Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).
- Acharya, G., et al. Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep. Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).
- Wu, X., et al. Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy. Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).
- Tuckey, R. C. Progesterone synthesis by the human placenta. Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).
- Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. Fetal metabolic response to maternal starvation. Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).
- Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. Insulin effect on fetal glucose utilization. Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).
- Bujold, E., et al. Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin. J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).
- Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing. Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).
- Cetin, I. Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).
