El Método de Muestreo de 4 Barcos para Estudios Integrativos de la Fisiología Placentaria Humana Published: August 2, 2017 doi: 10.3791/55847

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Ane M. Holme^1,2, Maia B. Holm^1,2, Marie C. P. Roland^1,3, Hildegunn Horne^1,2, Trond M. Michelsen^1,3, Guttorm Haugen^2,4, Tore Henriksen^1,2

¹Department of Obstetrics, Oslo University Hospital, ²Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, ³Norwegian Advisory Unit on Women's Health, Oslo University Hospital, ⁴Department of Fetal Medicine, Oslo University Hospital

Summary

Presentamos un método detallado para estudiar la fisiología placentaria humana in vivo a término. El método combina el muestreo de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta con medidas de ultrasonido del volumen de flujo sanguíneo y el muestreo de tejido placentario.

Abstract

La placenta humana es altamente inaccesible para la investigación mientras todavía en el útero . Por lo tanto, la comprensión actual de la fisiología placentaria humana in vivo se basa en gran medida en estudios con animales, a pesar de la alta diversidad entre las especies en anatomía placentaria, hemodinámica y duración del embarazo. La gran mayoría de los estudios de placenta humana son estudios de perfusión ex vivo o estudios de trofoblastos in vitro . Aunque los estudios in vitro y los modelos animales son esenciales, la extrapolación de los resultados de tales estudios a la placenta humana in vivo es incierta. Nuestro objetivo es estudiar la fisiología de la placenta humana in vivo a término, y presentar un protocolo detallado del método. Aprovechando el acceso intraabdominal a la vena uterina justo antes de la incisión uterina durante la cesárea planificada, recolectamos muestras de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta. Cuando se combina conCentración de las muestras de sangre con el volumen de las mediciones de flujo sanguíneo, somos capaces de cuantificar la absorción placentaria y fetal y la liberación de cualquier compuesto. Además, las muestras de tejido placentario de los mismos pares madre-feto pueden proporcionar mediciones de la densidad y actividad del transportador y otros aspectos de las funciones placentarias in vivo . A través de este uso integrador del método de muestreo de 4 vasos podemos probar algunos de los conceptos actuales de transferencia de nutrientes placentarios y metabolismo in vivo , tanto en embarazos normales como patológicos. Además, este método permite la identificación de sustancias secretadas por la placenta a la circulación materna, lo que podría ser una importante contribución a la búsqueda de biomarcadores de disfunción placentaria.

Introduction

Según los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos, la placenta es el órgano menos comprendido en el cuerpo humano ^{1 , 2 , 3} . Es difícil acceder y estudiar la placenta humana in vivo sin imponer riesgos no éticos en el embarazo en curso. Los estudios de la función placentaria en humanos se basan en gran medida en modelos in vitro y ex vivo . La mayoría de los estudios previos in vivo del transporte placentario y del metabolismo se han realizado en animales ^{4 , 5 , 6} . Sin embargo, como la estructura y las funciones de la placenta varían considerablemente entre las especies, la extrapolación de los resultados de los animales a los seres humanos debe hacerse con precaución. Sólo unos cuantos estudios humanos in vivo más pequeños han investigado la captación y el transporte fetal y placentario bajo condiciones fisiológicas normalesY ninguno ha explorado la transferencia integrada de varios compuestos ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Estos estudios fundamentales ilustran que los estudios in vivo de la placenta humana son factibles y que pueden servir a varios propósitos. En primer lugar, los conceptos actuales de las funciones placentarias derivadas principalmente de estudios in vitro , ex vivo y en animales pueden ser probados en un entorno humano y, por lo tanto, proporcionar una visión nueva y más específica de la placenta humana. En segundo lugar, se pueden caracterizar mejor las propiedades de la placenta disfuncional asociada con el crecimiento fetal aberrante, la preeclampsia, la diabetes materna, el síndrome metabólico y otras alteraciones metabólicas maternas. En tercer lugar, los estudios humanos in vivo ofrecen la oportunidad deTicas y predictivas de la función placentaria.

En este contexto nos propusimos establecer una colección completa de datos fisiológicos para investigar la función placentaria humana in vivo. Durante una cesárea planificada, explotamos el acceso intraabdominal a la vena uterina para recolectar muestras de sangre de los vasos entrantes y salientes en los lados materno y fetal de la placenta (el método de muestreo de 4 vasos). Estas muestras se utilizan para calcular las diferencias de la concentración arteriovenosa pareada de nutrientes y otras sustancias [ ^14] . Además, medimos el flujo sanguíneo de volumen a ambos lados de la placenta por ultrasonido. En consecuencia, la cuantificación de la absorción placentaria y fetal de cualquier compuesto puede ser cuantificada. Además, es posible determinar las sustancias liberadas por la placenta a las circulaciones materna y fetal ^{15 , 16 , 17} . Cuando combineD con los parámetros clínicos de la madre y el niño, y análisis de placenta y otros tejidos relevantes, este método tiene el potencial emocionante para integrar muchos aspectos de las funciones placentarias in vivo en el mismo par madre-feto.

Protocol

El estudio fue aprobado por los funcionarios de protección de datos del Hospital Universitario de Oslo y del Comité Regional de Ética en Investigación Médica y Sanitaria del sur de Noruega 2419/2011. Todos los participantes firmaron un consentimiento informado por escrito en la inclusión.

1. Preparaciones

NOTA: En la Figura 1 se describe un cronograma para los procedimientos.

Figura 1 : Diagrama de flujo que describe el tiempo y el personal involucrado en el procedimiento de muestreo de 4 vasos.
Un color representa a una persona. La descripción detallada del método se da en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Personal
   NOTA: En casos de recolección más avanzada de tejido placentario, se requiere una persona adicional.
2. Equipo
   1. Preparar el equipo, 50 ml de solución salina tamponada con fosfato 1 M (PBS) helada, 25 ml de solución estabilizadora de ARN frío y 5 x 0,5 ml de compuesto óptimo de temperatura de corte (OCT). Etiquete los vacutainers y los tubos. Ver lista tentativa de equipos.

2. Características maternas

1. Registre las características clínicas y no clínicas maternas en la inclusión y repita las preguntas pertinentes y yoPeso, en el momento de la entrega. Anote la duración del período de ayuno antes de la cesárea y cualquier episodio hipotensivo que ocurra durante la cirugía.
   Nota: Incluya el conjunto de datos clínicos maternos mínimos reportados en una publicación reciente de Global Labour Pregnancy CoLaboratory (COLAB). Este artículo también incluye algunos aspectos muy importantes en la elección de las poblaciones de estudio y debe ser abordado durante la planificación del estudio [ ^18] .
2. Considere la posibilidad de registrar características paternales, incluyendo etnicidad, edad e índice de masa corporal (IMC).

3. Ultrasonido

1. Realizar el examen de ultrasonido Doppler el día del parto, con las mujeres en estado de ayuno. Realizar el examen durante un período de reposo fetal, con la mujer en posición semi-supina, inclinada ligeramente lateralmente opuesta a la región de interés para evitar la compresión de la aorta y la vena cava. Supervisar la salida enTensión por los índices mecánicos y térmicos en la pantalla.
2. Vena umbilical
   1. Visualice la vena umbilical en una transección sagital u oblicua del abdomen fetal. Mida el diámetro interno del vaso en la porción recta de la vena umbilical intraabdominal, antes de cualquier rama visible. Utilice el modo B normal y visualice el vaso en un ángulo de insonación perpendicular para las mediciones de diámetro y mantenga varios marcos óptimos para mediciones posteriores para minimizar el efecto de los cambios de diámetro pulsátil.
      1. Repetir las mediciones de cinco a diez veces ¹⁹ .
   2. En el mismo sitio, use ultrasonido Doppler y ajuste la sonda para obtener un ángulo de insonación lo más bajo posible (siempre <30 °) para medir la velocidad máxima programada en el tiempo (TAMX). Obtener la velocidad durante un período de 3 - 5 s (flujo no pulsante).
3. Arteria uterina
   1. Utilizar DopplerUltrasonido para visualizar la arteria uterina al cruzar la arteria ilíaca externa, inmediatamente después de que se ramifica desde la arteria ilíaca interna. Ajuste la sonda en este sitio para obtener un ángulo de insonación bajo (siempre <30 °) y mida el TAMX. Obtener la velocidad como la velocidad media de tres ciclos del corazón.
   2. Como es poco probable que obtenga un ángulo perpendicular en el mismo sitio en que se mide TAMX, siga el vaso distalmente para obtener un ángulo correcto para las mediciones de diámetro tan cerca de los sitios de las mediciones de diámetro como sea posible. Excluya las mediciones de diámetro si algún vaso visible se ramifica antes de este sitio, evaluado por ecografía Doppler color.
      1. Utilice el modo B normal y visualice el vaso en un ángulo de insonación perpendicular para las mediciones de diámetro y mantenga varios marcos óptimos para mediciones posteriores para minimizar el efecto de los cambios de diámetro pulsátil.
      2. Repetir las mediciones de cinco a diez veces ¹⁹ .
      Li
4. Observe la posición de la placenta.

4. Muestreo de sangre de 4 vasos

NOTA: La línea de tiempo para los procedimientos se describe en la Figura 1 y en la Figura 2 se ilustra un resumen de las muestras.

Figura 2 : Ilustración esquemática de la vasculatura placentaria y los sitios de muestreo.
En el método de muestreo de 4 vasos se extraen muestras de sangre de la vena uterina, la arteria radial (como un sustituto de la arteria uterina) y las arterias y venas umbilicales. El flujo sanguíneo en la arteria uterina y la vena umbilical se mide por ultrasonido. Se recogen muestras de tejidos de la placenta. Ilustración: Øystein H. Horgmo, Universidad de Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Procedimientos de seguridad
   1. Proporcionar a todo el personal en el teatro de operaciones con guantes, trajes quirúrgicos, máscaras y sombreros.
   2. Proporcionar a los cirujanos y personal de investigación en contacto con el campo de la operación con trajes quirúrgicos de fregado, máscaras, headwear, batas y guantes dobles. Las gafas son opcionales.
   3. Proporcionar al personal que manipula las muestras de sangre con guantes.
   4. Proporcionar al personal que maneja las muestras de placenta con guantes y máscara quirúrgica. La homogeneización requiere el uso de campanas.
2. Preparación en el teatro de operaciones
   1. Dar un briefing y entregar el equipo a todo el personal que ayudará al muestreo antes del inicio de la cirugía.
   2. Dirigirse al anestesiólogo ya la enfermera de anestesiología que le ayudarán con el necesario acceso arterial y venoso periférico y asegurar queNo se administran líquidos por vía intravenosa antes del muestreo.
   3. Administre tres jeringas (10 ml) sin agujas a la persona que asiste con la muestra de vena antecubital y dos jeringas (una de 20 ml y una de 10 ml) y una jeringa de gas de sangre (con heparina) a la persona que asiste con la arteria radial.
   4. Prepare dos jeringuillas estériles (20 ml), cinco jeringas estériles (10 ml), tres "agujas de mariposa" y dos jeringas de gas en sangre para el campo de operación.
3. Acceso a los vasos sanguíneos.
   1. Siga el procedimiento estándar antes de la cesárea para asegurar el acceso intravenoso periférico (iv).
      NOTA: La vena antecubital es preferible porque es más fácil extraer muestras de este sitio.
   2. Localizar la arteria radial en la muñeca por ultrasonido o por palpación. Después de 0,5 ml de analgesia subcutánea de lidocaína, coloque una línea arterial en la arteria radial. Abandone el muestreo de este sitio en caso de tres inserciones fallidas, oSi la mujer experimenta dolor durante la inserción.
      NOTA: Realizar el procedimiento quirúrgico de la cesárea según el procedimiento estándar. Sólo los ajustes necesarios para el procedimiento de muestreo se subrayan a continuación.
4. Muestras de sangre materna
   NOTA: Obtenga las tres muestras de sangre materna (vena uterina, arteria radial y vena antecubital) simultáneamente antes de la incisión uterina.
   1. Para la vena uterina, después de abrir la cavidad abdominal, use un retractor para levantar la pared abdominal y exponer las ramas principales de las venas uterinas en los lados anterolaterales del útero. Obtenga sangre de las ramas de la vena uterina en el mismo lado que la placenta siempre que sea posible o use el plexo venoso más prominente si la placenta se encuentra en la línea media uterina.
      1. Inserte una aguja de mariposa en una jeringa de gas en la vena uterina en un ángulo de aproximadamente 30 grados y recoger sangre a través de la aspiración suave para evitarHemólisis Mientras asegura cuidadosamente la posición iv de la aguja de mariposa, reemplace la jeringa de gas de sangre llena por una jeringuilla de 20 ml y una de 10 ml consecutivamente.
         NOTA: El mejor acceso se garantiza cuando se está de pie sobre el lado contralateral de la vena uterina elegida.
   2. Para la arteria radial, aspirar desde la línea intraarterial. Deseche los primeros 5 mL, y luego aspirar 3 mL en jeringa de heparina para análisis de gas en sangre, seguido de 3 mL en dos jeringas (20 + 10 mL).
   3. Para la vena antecubital, aspirar suavemente del catéter intravenoso. Deseche los primeros 5 mL, y luego aspirar 30 mL en tres jeringas (10 mL).
   4. Realizar una inspección final del sitio de muestreo en la vena uterina antes de comenzar a cerrar el abdomen.
5. Muestras de sangre fetal
   1. Cuando el niño nace, aspire inmediatamente la sangre de la arteria umbilical, sin apretar el cordón umbilical ni entregar la placenta. Empezar ingenioH la jeringa para el análisis de gas en sangre, y siga con tres jeringas de 10 ml si es posible.
   2. Cuando las muestras arteriales estén aseguradas, sujete el cordón y entregue al niño a la partera antes de tomar muestras de la vena umbilical (gas en sangre y jeringas de 20 + 10 ml).
      NOTA: Obtenga todas las muestras umbilicales dentro de los segundos del parto y con la placenta in situ a menos que se haya separado espontáneamente.
   3. Siga las recomendaciones de Noruega sobre el pinzamiento tardío del cordón umbilical. En caso de un niño en dificultades, abrazadera y cortar el cordón inmediatamente y la mano del niño a la partera y neonatólogo.
6. Manejo de muestras de sangre
   1. Coloque las jeringas de gas en el hielo mientras prepara el resto de las muestras de sangre, y analizarlas en un analizador de gases en 5 minutos.
   2. Transferir las muestras de sangre inmediatamente a vacutainers y colocar los tubos de plasma en un balancín de 1 - 2 min antes de ponerlos en el hielo. Dejar los tubos de suero en la mano de obraAtory banco para resolver durante 30 minutos.
      NOTA: Este es un paso crítico en el procedimiento que necesita atención adicional porque las muestras de los cinco sitios deben prepararse simultáneamente para asegurar una buena calidad.
   3. Centrifugar las muestras de plasma lo antes posible, y en 30 minutos, a 6 ° C, 2.500 xg durante 20 min.
   4. Después de 30 min, centrifugar las muestras de suero a temperatura ambiente durante 10 min a 2.500 x g.
   5. Alícuota de los sobrenadantes cuidadosamente a 2 ml de tubos cryo, dejando 0,5 ml del sobrenadante por encima del pellet para asegurar plasma libre de plaquetas.
   6. Almacenar las muestras a -80 ° C.

5. Recolección de tejido placentario

1. Coloque la placenta plana sobre una bandeja de disección enfriada con hielo lo más pronto posible después de haber sido entregada. Fotografíe y mida el diámetro más largo y el diámetro a 90 grados.
2. Pesar la placenta.
3. Registre el peso, los dos diámetros, cualquier gRoss patología, el número de vasos en el cordón y el intervalo de tiempo desde la entrega a la placenta se colocó en hielo.
   NOTA: Envíe la placenta al examen patológico si está clínicamente indicado.
4. Colocar la placenta con la superficie materna hacia arriba e identificar 4 - 5 sitios de muestreo situados aleatoriamente en cada cuadrante de la placenta, evitando áreas de patología franca. Retire la decidua con unas tijeras para cortar a 3 - 5 mm de la superficie materna. Recoger un pedazo de 1 - 2 cm ³ de tejido villoso de cada sitio.
5. Lave el tejido recolectado suavemente en 50 mL de PBS 1M frío. Divida en varias piezas de cada sitio de muestreo y alícuota.
   Nota: El tamaño de las piezas de placenta dependerá de los análisis planificados.
6. Añadir alícuotas de 0,1 - 0,5 cm ³ muestras de tejido a 5 tubos cryo y congelación rápida en nitrógeno líquido.
7. Añadir pequeños trozos de 0,1 - 0,2 cm ³ al tubo con 25 ml de solución de estabilización de ARN. Tienda a las 46; C durante 24 h, desechar la solución de estabilización de ARN y reemplazarla. Congelar.
8. Añadir trozos de 0,5 cm ³ a los 5 tubos cryo con 0,5 mL de OCT, rellenar con OCT, mezclar y congelar.
9. Almacene las muestras a -80 ° C hasta su análisis.
   NOTA: Burton et al. Proporciona una excelente visión general de los aspectos prácticos del muestreo placentario en función de los análisis previstos. ²⁰ considerar para preparar el tejido restante para el aislamiento de las membranas de microvellosidades y basal, y para recoger el tejido decidual por la técnica de succión de vacío. ^{21 , 22}

6. Características Neonatales

1. Anote las características neonatales, incluyendo Apgar-score (1, 5 y 10 min), sexo, peso, longitud, edad gestacional y admisión a la Unidad de Cuidados Intensivos de Recién Nacidos (duración y resultado de la estancia).
2. Considere la posibilidad de medir la composición corporal neonatal mediante medidas antropométricas, desplazamiento de airePletismógrafo o doble absorciometría de rayos X. ^{23 , 24}

7. Cálculos

1. Suponga una composición sanguínea similar en la arteria radial y uterina y calcule la diferencia de concentración arteriovenosa uteroplacentaria.
   Diferencia de la concentración arteriovenosa uteroplacentaria = C _A - C _V
   Diferencia de la diferencia venoso - arterial umbilical = C _v - C _a
   
   Donde C es concentración con subíndices: A, la arteria radial; V, la vena uterina; V la vena umbilical y a, la arteria umbilical.
2. Calcular el volumen de flujo sanguíneo, ml / min (Q):
   
   Donde D es el diámetro del recipiente (cm), TAMX es la velocidad máxima promediada en el tiempo y h es el coeficiente para el perfil espacial de la velocidad de la sangre. Utilizar 0,5 como coeficiente para la vena umbilical y0,6 para la arteria uterina ^{25 , 26} .
3. Calcular la captación y liberación placentaria según el principio de Fick:
   
   Captación uteroplacentaria = ( C _A - C _V ) x Qm
   Captación fetal = ( C _v - C _a ) X Q _f
   
   Subíndices: m, materna y f, fetal.

Representative Results

El método de muestreo de 4 vasos es aplicable en la práctica clínica y hemos obtenido con éxito muestras de sangre de 209 pares madre / bebé. En 128 de estos también se logró medir el volumen de flujo sanguíneo. Se obtuvieron muestreos completos de 4 recipientes y mediciones de flujo de buena calidad de ambos vasos maternos y fetales en 70 pares madre-feto ( Figura 3 ). Además, hasta ahora hemos recogido sangre y muestras de placenta de 30 pacientes preeclámticos. Recientemente hemos publicado artículos sobre la transferencia placentaria humana de nutrientes, así como la liberación placentaria de factores vasoactivos, demostrando dos aplicaciones del método ^{14 , 15 , 16} .

Ejemplo de cómo se usa el método de 4 vasos para estudiar la transferencia placentaria
Hay arterias significativasHígado en ambos lados de la placenta, lo que demuestra una in vivo uteroplacental y la absorción fetal de la glucosa ( Tabla 1 ]. La transferencia placentaria de glucosa depende del gradiente materno-fetal de glucosa y, por lo tanto, de los niveles de glucosa materna. Sin embargo, hemos demostrado previamente que este gradiente, y por lo tanto la transferencia de glucosa, está significativamente influenciado también por los niveles de insulina fetal y el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de cómo este método ilustra una importante interacción materno-fetal ¹⁴ .

Buque	Glucosa mmol / L	Valor de p *
Arteria radial	4,49 [4,22, 4,84]
Vena uterina	4,23 [3,94, 4,53]
Vena umbilical	3,78 [3,52, 4,06]
Arteria umbilical	3,24 [2,95, 3,56]
Diferencias pareadas
Arteria radial - vena uterina	0,29 [0,13, 0,41]	<0,001
Arteria umbilical - vena umbilical	0,54 [0,29, 0,76]	<0,001
Arteria radial - arteria umbilical	1,25 [1,03, 1,51]	<0,001

Tabla 1: Concentraciones Medias [Q1, Q3] y Diferencias Arteriovenosas de Glucosa
* Prueba Wilcoxon Signed-Rank

Se cree que la absorción de glucosa fetal desde (la liberación placentaria a) la circulación umbilical depende no sólo deN el gradiente materno-fetal, pero en el flujo sanguíneo placentario ⁵ . Asimismo, puede ser relevante estudiar la captación fetal de glucosa en función del peso de la placenta o del peso al nacer. En n = 128 se encontró un flujo venoso umbilical mediano [Q1, Q3] de 196.2 [158.3, 232.2] mL / min y se calculó una absorción de glucosa fetal mediana [Q1, Q3] de (liberación placentaria a) la circulación umbilical de 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normalizado para el peso al nacer esto es igual a 0,03 [0,02, 0,04] ​​(mmol / min) / kg. La placenta libera 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) por kg de placenta.

Ejemplo de cómo se usa el método de 4 vasos para estudiar la absorción placentaria
Estudios en animales sugieren que el ácido glutámico es importante tanto en la interconversión de los aminoácidos en la placenta y el hígado fetal, como como combustible oxidativo en otras vías metabólicas ²⁷ . Usando el método de muestreo de 4 vasos de placenta estudiamos la uTeroplacentarias y umbilicales del ácido glutámico en humanos ( Tabla 2 ). Se encontró una absorción placentaria (por lo tanto una liberación fetal) de ácido glutámico de la circulación umbilical. Además, encontramos una absorción placentaria de ácido glutámico de la circulación materna. Esta absorción placentaria de ambas circulaciones es un ejemplo de cómo el método de 4 vasos puede utilizarse para demostrar in vivo en humanos que el metabolismo placentario de nutrientes es una parte de la regulación de la transferencia transplacentaria.

Buque	Ácido glutámico μmol / L	Valor de p *
Arteria radial	61,5 [51,0, 77,7]
Vena uterina	51,0 [36,3, 65,0]
Vena umbilical	39,3 [24,7, 52,8]
Arteria umbilical	44,7 [33,1, 59,3]
Diferencias pareadas
Vena arterial-uterina radial	10,4 [1,6, 21,2]	<0,001
Vena umbilical de la arteria umbilical	-8,7 [-16,0, 0,2]	<0,001

Tabla 2: Concentraciones medias [Q1, Q3] y diferencias arteriovenosas del ácido glutámico
* Prueba Wilcoxon Signed-Rank

Ejemplo de cómo se usa el método de 4 vasos para estudiar la liberación placentaria
Se establece que la placenta secreta progesterona y con el fin de validar nuestro método de 4 vasos en el lado materno de la placenta, se midió la liberación in vivo de progesterona en teRm ²⁸ . Encontramos una importante liberación placentaria de progesterona a la circulación materna ( Tabla 3 ). La diferencia arteriovenosa observada demuestra cómo el método de muestreo placentario de 4 vasos puede utilizarse para detectar sustancias liberadas por la placenta y es muy relevante cuando se estudian embarazos patológicos.

Buque	Progesterona nmol / L	Valor de p *
Arteria radial	678 [514, 971]
Vena uterina	1852 [1059, 2786]
Diferencias pareadas
Vena arterial-uterina radial	-1187 [-1855, -404]	P <0,001

Tabla 3: Concentraciones medias [Q1, Q3] y diferencia arteriovenosa uteroplacentaria de progesterona
* Prueba Wilcoxon Signed-Rank

Figura 3 : Diagramas de flujo e ilustración de participantes incluidos y perdidos.
A. Muestra la inclusión de los participantes, demostrando que los participantes se perdieron principalmente debido al inicio del parto antes de la cesárea o la falta de personal suficiente para llevar a cabo el estudio. B. De las 179 mujeres con embarazos normales (azules) se obtuvieron muestras completas de sangre de 4 vasos en 162 (91%) (muestras incompletas de sangre fetal: negro, muestras de sangre materna incompleta: gris). Cincuenta y uno (28%) participantes no fueron incluidos para las mediciones de ultrasonido debido a limitaciones logísticas. De los 12En todos los participantes (verde claro) se obtuvieron 8 participantes (72%) sometidos a ecografía, se obtuvieron mediciones del flujo sanguíneo en el lado fetal de la placenta, mientras que en 77 (60%) se obtuvieron mediciones completas del flujo sanguíneo tanto en el lado materno como en el fetal, (verde oscuro). Ilustración: Øystein H. Horgmo, Universidad de Oslo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El método de muestreo de 4 vasos de placenta es relevante para tres propósitos principales. En primer lugar, puede utilizarse para estudiar cómo las sustancias específicas son absorbidas por la placenta en el lado materno y posiblemente transferidas a la circulación umbilical y al feto, como lo demuestran nuestros estudios sobre glucosa y aminoácidos. En segundo lugar, el método es altamente relevante para estudiar las sustancias producidas por la placenta y liberadas a las circulaciones materna o fetal, como lo demuestran los resultados de la progesterona. En tercer lugar, puede ser útil estudiar cómo el feto in vivo elimina los productos de desecho durante el crecimiento rápido y la remodelación tisular.

Pasos críticos y problemas logísticos del método de 4 vasos
Placenta 4-vaso de muestreo se ha utilizado previamente para determinar la transferencia placentaria de macronutrientes in vivo en embarazos fisiológicos normales ^{8 , 10 ,}Ss = "xref"> 12, pero con un número limitado de sujetos de estudio. El uso limitado del muestreo de 4 recipientes es probablemente debido a la logística exigente del procedimiento. Una coordinación exitosa entre el paciente, los investigadores y el personal de los departamentos de medicina fetal, obstetricia y anestesiología es esencial para emplear este método. Creemos que ha sido una gran ventaja que varios de los principales investigadores son obstétricos, conociendo rutinas clínicas y personal clave. Por lo tanto, los procedimientos del estudio se han implementado junto con la práctica clínica diaria. Al coordinar y asegurar cada paso del procedimiento, hemos obtenido muestras de más de 200 pares madre / recién nacidos. Además, nuestra estrategia ha sido mantener el procedimiento de muestreo en pocas manos porque hay retos técnicos en el procedimiento que son decisivos para el éxito del muestreo y demasiados muestreadores pueden introducir fuentes innecesarias de variación de los datos. ConsequRecomendamos que todos los exámenes sonográficos sean realizados por el mismo examinador utilizando la misma máquina de ultrasonido. El equipo debe ser elegido con cuidado, ya que la resolución de la pared del vaso es crucial. Las arterias uterinas en el tercer trimestre son especialmente difíciles de medir técnicamente debido a que el tamaño y el contenido uterinos hace difícil obtener tanto el ángulo de insonación perpendicular usado para las mediciones de diámetro como el ángulo de insonación bajo para las mediciones de velocidad de flujo en el mismo sitio. Además, el muestreo sanguíneo exitoso requiere la identificación del sitio de muestreo apropiado de la vena uterina y la aspiración suave. En el lado umbilical la fragilidad de los eritrocitos fetales requiere una atención especial a la fuerza de aspiración. Es nuestra experiencia que el retraso en la entrega o menor estrés para el bebé se asoció con la constricción temprana de la arteria umbilical, lo que resulta en la reducción del volumen de la muestra arterial.

El método de "muestreo de 4 vasos de placenta" es un procedimiento invasivo y exigente. Por lo tanto, los criterios de inclusión y exclusión deben estar bien definidos de acuerdo con la pregunta de investigación para evitar procedimientos de muestreo innecesarios. Los pacientes sólo deben ser abordados para su inclusión después de la decisión sobre el modo de parto, para asegurar que las indicaciones para la cesárea no se vean influidas por la participación en el proyecto de investigación. Aunque el procedimiento requiere poco tiempo extra en el quirófano, requiere la presencia de más personal que obligue a limitar los inconvenientes y perturbaciones causados ​​por el muestreo. Hemos utilizado la arteria radial como un proxy para la arteria uterina, ya que la inserción de una línea arterial es menos invasiva y asegura el muestreo simultáneo de la arteria y la vena. Algunos grupos usan sangre arterializada que es un procedimiento aún menos invasivo ¹³ . Sin embargo, apaRt de una incidencia de un hematoma local en relación a la línea arterial que resulta en parestesia temporal de la mano, no hemos experimentado efectos adversos durante el muestreo de cualquiera de los 4 sitios. En particular, no hemos observado ningún sangrado de la vena uterina perforada.

Aspectos metodológicos y analíticos del método de 4 vasos
Es importante abordar varias cuestiones metodológicas en la interpretación de los resultados de un estudio de 4 vasos de placenta. En primer lugar, si el objetivo es calcular la masa de una sustancia absorbida o liberada por la placenta, es importante considerar el volumen de sangre que pasa. Debe tenerse en cuenta que la vena uterina no sólo drena la placenta, sino que también drena el músculo uterino, y que la vasculatura uterina en varios grados se anastomosa con la vasculatura ovárica y vaginal. A continuación, es importante considerar que el intercambio de agua a través de la placenta puede influir en la concentraciónRaciones medidas, y por lo tanto afectan las diferencias de la concentración arteriovenosa calculadas. Idealmente, esto se resuelve mejor ajustando las diferencias de concentración para el agua perdida o ganada en cada par madre-feto. Esto puede lograrse midiendo una sustancia que no es absorbida ni liberada por la placenta o el útero. Las concentraciones de hemoglobina o los porcentajes calculados de eritrocitos (hematocrito) pueden servir como factores de corrección para el intercambio de agua. Además, al interpretar la captación o liberación de compuestos en el lado materno de la placenta puede ser de interés obtener diferencias arteriovenosas en otros tejidos para comparación. Por lo tanto, hemos incluido una muestra de sangre de la vena antecubital para caracterizar las características específicas de la placenta mediante la comparación de las diferencias arteriovenosas sobre la placenta con los de la capa capilar del antebrazo. Encontramos esta comparación particularmente interesante cuando probamos la liberación placentaria de sFlt-1 y el crecimiento placentario faYa que las células endoteliales sistémicas podrían ser una fuente potencial de estos compuestos [ ^14] . Dependiendo de la pregunta de investigación, podría ser importante relacionar las diferencias arteriovenosas con el peso de la placenta para calcular la eficiencia placentaria, es decir , en términos de (mmol / L) / kg o (mmol / min) / kg de placenta.

Limitaciones y fortalezas del método de 4 recipientes
Aunque la fisiología placentaria es menos afectada por la cesárea que por el estrés del parto vaginal, existen varias limitaciones a este método. El parto vaginal se recomienda en la mayoría de los casos de complicaciones comunes del embarazo (como preeclampsia, diabetes, obesidad y macrosomía fetal moderada), lo que puede limitar y sesgar el reclutamiento. Incluso al optimizar cada paso del método es difícil obtener mediciones completas y muestras en cada paciente debido a las dificultades técnicas en el procedimiento de muestreo de sangre y el ultrasonido volUme ( Figura 3 ). Además, aunque las mediciones de ultrasonido se realizan lo más cerca posible de la cirugía, se realizan de forma inherente antes de la anestesia espinal y el muestreo de sangre. De esto se deduce que el gasto cardíaco materno (CO) puede cambiar y posiblemente afectar el flujo sanguíneo uteroplacentario (e incluso fetoplacentario). El posible cambio en el CO causado por la anestesia espinal puede ser compensado por la fenilefrina que se utilizó en el presente estudio. Los datos preliminares de un subconjunto de nuestros participantes (n = 23) no muestran alteración significativa en CO antes de la anestesia espinal y en el momento del muestreo (datos no publicados). El uso del método de muestreo de 4 vasos en seres humanos, en oposición a los animales, limita tanto la posibilidad de introducir una variable de tiempo como de manipular el contenido de sangre ^{5 , 29 , 30} . A partir de estas consideraciones, se deduce que el vaso de 4 vasos El método de muestreo es transversal y en gran medida observacional por naturaleza, y los datos obtenidos deben ser analizados en consecuencia. Por otra parte, el método de muestreo de 4 vasos proporciona una posibilidad única de estudiar fisiología placentaria humana y fisiopatología in vivo , con todos los factores interactivos en juego, una situación que nunca puede reproducirse in vitro . Ofrece una excelente oportunidad para probar hipótesis que han surgido de animales u otros estudios experimentales. Asimismo, puede generar nuevas hipótesis que necesitan ser probadas mecánicamente in vitro y en estudios con animales.

Aplicaciones potenciales del método de 4 recipientes
En los embarazos patológicos, las diferencias en la concentración arteriovenosa materna y fetal se han estudiado por separado hasta ahora y se han permitido ensayar algunas de las hipótesis existentes in vivo ^{15 , 16 ,}Ass = "xref"> 31. El método de muestreo de 4 vasos ofrece la oportunidad atractiva de estudiar la unidad materna, placentaria y fetal juntos en vez de como entidades separadas en embarazos patológicos y puede arrojar nueva luz sobre preguntas viejas y nuevas dentro del alcance de la interacción materno-fetal. El método de muestreo de 4 vasos puede aplicarse a una amplia gama de preguntas de investigación en embarazos normales y patológicos dependiendo del análisis posterior de las muestras. La elección de vacutainers, el volumen de sangre, el rango de placenta y otras muestras de tejido debe decidirse de acuerdo con la pregunta de investigación. Burton et al. Han publicado recientemente un excelente documento describiendo los procedimientos para asegurar muestras de buena calidad de tejido placentario y permitir la fusión de diferentes biobancos con el fin de abordar ciertos rompecabezas que necesitan una gran cantidad de muestras a resolver ²⁰ . Las muestras de 4 vasos pueden analizarse para estudiar la liberación específica de exosomas a la madreLa circulación sanguínea, la transferencia de medicamentos, metabolitos y toxinas. Los análisis de los ómicos a gran escala (metabolómica, proteómica y lipidómica) tienen el potencial de identificar sustancias y metabolitos en el plasma materno que son secretados por la placenta. Por lo tanto, el establecimiento del método de muestreo de 4 vasos puede identificar factores derivados de la placenta en la circulación materna y posiblemente eliminar los biomarcadores de la función placentaria. Combinado con técnicas para separar las membranas plasmáticas basales frente a microvilla y fetal frente al síntiotrofoblasto materno, la transferencia de una sustancia puede ser estudiada junto con la actividad y localización de proteínas transportadoras relevantes ²¹ . Además, los mecanismos que regulan la transferencia de nutrientes in vivo pueden ser elucidados mediante el análisis de los niveles de nutrientes y micronutrientes en los cuatro vasos y relacionar la transferencia de nutrientes a las mediciones de los nutrientes y sistema de detección de energía en la placenta ³² 33] . La infusión de glucosa antes del parto es otro enfoque posible. La transferencia placentaria podría estar relacionada con las variables metabólicas maternas como el IMC, la glucosa y los perfiles lipídicos plasmáticos y los resultados fetales como el peso al nacer y la composición corporal [ ^18] . En conjunto, estos enfoques posiblemente iluminarán el papel integrador de la placenta, estando situados en el centro de la interacción entre las condiciones y necesidades maternas y fetales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Maternal body composition
Impedance scale	Tanita		or similar
Ultrasound measurements
Sequoia 512 ultrasound machine	Acuson		equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)
Blood samples
Arerial cannula	BD Medical	682245	or similar
20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle	Termo	SS-20ES	or similar. 3 needed.
10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle	Termo	SS-10ES	or similar. 9 needed.
5 cc 6% Luer Syringe without Needle	Termo	SS-05S1	or similar. 2 needed.
Arterial blood gas syringe	Radiometer Medical		or similar. 4 needed.
Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge	Greiner Bio-One	450081	(intended for single use).3 needed.
Vacutainer tube 6 mL EDTA	Greiner Bio-One	456043	or similar. Label with sample site. 10 needed.
Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator	Greiner Bio-One	456305	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator	Greiner Bio-One	456089	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Vacutainer tube 3 mL  9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio-One	454334	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Cryogenic vials, 2.0 mL	Corning	430488	or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.
Marked trays to transport the syringes			to transport the blood samples in the operation theatre
Rocker			for gentle mixing of the samples
Ice			in styrofoam box
Liquid nitrogen			in appropriate container
Placenta samples
Metal tray
Ice			in styrofoam box
Calibrated scale
Metal ruler
1 M Phosphate buffered saline	Sigma	D1408	or similar. Dilute 10 M to  1 M before use
RNA stabilization solution	Sigma	R0901-500ML	or similar
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound	vwr	361603E	or similar
Cryogenic vials, 2.0 mL	Corning	430488	or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.
Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL	Greiner Bio-One	227,285	or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed.
Liquid nitrogen			in appropriate container
Fetal body composition
Calibrated scale
Measuring tape