Summary
Vi presenterar en detaljerad metod för att studera human placenta fysiologi in vivo vid termen. Metoden kombinerar blodprovtagning från inkommande och utgående kärl på moderns och fostrets sidor av placentan med ultraljudsmätningar av volymblodflöde och placenta vävnadsprovtagning.
Abstract
Den mänskliga placentan är mycket otillgänglig för forskning medan den fortfarande är i utero . Den nuvarande förståelsen av human placenta fysiologi in vivo är därför i stor utsträckning baserad på djurstudier, trots den stora mångfalden bland arten i placenta anatomi, hemodynamik och graviditetens varaktighet. Den stora majoriteten av human placenta studier är ex vivo perfusionsstudier eller in vitro trofoblaststudier. Även om in vitro- studier och djurmodeller är viktiga är extrapolering av resultaten från sådana studier till den mänskliga placenta in vivo osäker. Vi syftade till att studera human placenta fysiologi in vivo vid termen och presentera ett detaljerat protokoll av metoden. Utnyttjande av intraabdominal tillgång till livmodervenen strax innan livmoderns snitt under planerad kejsarsnitt, samlar vi blodprover från inkommande och utgående kärl på moderns och fostrets sidor av placentan. När man kombinerar conCentreringsmätningar från blodprover med volymblodflödesmätningar, kan vi kvantifiera placenta och fetalt upptag och släppa ut någon förening. Vidare kan placenta vävnadsprover från samma morfosterpar ge mätningar av transportörens densitet och aktivitet och andra aspekter av placenta funktioner in vivo . Genom denna integrerade användningen av provtagningsmetoden med 4 kärl kan vi testa några av de nuvarande begreppen överföring och metabolism av placenta näringsämnen in vivo , både vid normala och patologiska graviditeter. Vidare möjliggör denna metod identifiering av substanser som utsöndras av moderkakan mot modercirkulationen, vilket kan vara ett viktigt bidrag till sökandet efter biomarkörer av placenta dysfunktion.
Introduction
Enligt National Institutes of Health, USA, är placentan det minst förstådda organet i människokroppen 1 , 2 , 3 . Det är svårt att komma åt och studera mänsklig placenta in vivo utan att påföra onetiska risker på den pågående graviditeten. Studier av placentafunktionen hos människa baseras därför i stor utsträckning på in vitro- och ex vivo- modeller. Majoriteten av tidigare in vivo studier av placental transport och metabolism har utförts hos djur 4 , 5 , 6 . Men eftersom placenta strukturen och funktionerna varierar väsentligt mellan arter måste extrapolering av resultat från djur till människor ske med försiktighet. Endast några få mindre humana in vivo- studier har undersökt placenta och fosterupptagning och transport under normal fysiologiskAl-betingelser, och ingen har undersökt den integrerade överföringen av flera föreningar 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dessa grundläggande studier illustrerar att in vivo- studier av den mänskliga placentan är möjliga och att de kan tjäna flera syften. För det första kan nuvarande koncept av placentalfunktioner som huvudsakligen härrör från in vitro , ex vivo och djurstudier testas i en mänsklig miljö och därigenom ge en ny och mer specifik inblick i den mänskliga placentan. För det andra kan egenskaper hos den dysfunktionella placentan associerad med avvikande fetaltillväxt, preeklampsi, maternell diabetes, metaboliskt syndrom och andra metaboliska störningar i magen bättre präglas. Tredje, human in vivo- studier ger möjlighet att utveckla diagnosTic och prediktiva verktyg av placenta funktion.
På denna bakgrund syftade vi till att upprätta en omfattande samling fysiologiska data för att undersöka den mänskliga placenta funktionen in vivo. Under en planerad kejsarsnitt utnyttjar vi den intraabdominala tillgången till livmodervenen för att samla blodprover från inkommande och utgående kärl på moderkroppen och fostrets sidor (4-kärls provtagningsmetod). Dessa prover används för att beräkna de parade arteriovenösa koncentrationsskillnaderna mellan näringsämnen och andra ämnen 14 . Dessutom mäter vi volymen blodflöde på båda sidor av placentan genom ultraljud. Följaktligen kan placenta och fosterupptagning av vilken som helst förening kvantifieras. Vidare är det möjligt att bestämma substanser som frigörs av moderkakan till moder- och fostercirkulationerna 15 , 16 , 17 . När kombineraD med kliniska parametrar för mor och barn samt analyser av placenta och andra relevanta vävnader, har denna metod en spännande potential att integrera många aspekter av placenta funktioner in vivo i samma morfosterpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av dataskyddspersonal vid Oslo Universitetssjukhus och Regionkommittén för medicinsk och hälsovetenskaplig etik, Södra Norge 2419/2011. Alla deltagare undertecknade ett skriftligt informerat samtycke vid införandet.
1. Förberedelser
OBS! En tidslinje för procedurerna beskrivs i Figur 1 .
Figur 1 : Flödesschema som beskriver timing och personal involverad i provtagningsproceduren med 4 kärl.
En färg representerar en person. Detaljerad beskrivning av metoden ges i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Personal
- Förbered utrustningen, 50 ml iskallt 1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 25 ml kall RNA-stabiliserande lösning och 5 x 0,5 ml optimal skärtemperaturförening (OCT). Märk de vacutainers och rören. Se preliminär lista över utrustning.
2. Maternal Egenskaper
- Registrera moderns kliniska och icke-kliniska egenskaper vid inkludering och upprepa relevanta frågor och jagAsurements, inklusive vikt, vid tidpunkten för leveransen. Anteckna varaktigheten för den fasta perioden före kejsarsnittet och eventuella hypotensiva episoder som inträffar under operationen.
Anm .: Inkludera den minsta maternella kliniska databasen som rapporterats i en nyligen publicerad publikation från Global Gravidity CoLaboratory (COLAB). Denna artikel innehåller också några mycket viktiga aspekter vid val av studiepopulationer och bör tas upp under planeringen av studien 18 . - Överväga att registrera faderliga egenskaper, inklusive etnicitet, ålder och kroppsmassindex (BMI).
3. Ultraljud
- Utför Doppler ultraljudsundersökning på leveransdagen, med kvinnorna i fastande tillstånd. Utför undersökningen under en period av fosterskapning, med kvinnan i semi-supine position, lutad något i sidled motsatt regionen av intresse för att undvika komprimering av aorta och vena cava. Övervaka utmatningen iTäthet av de mekaniska och termiska indexerna på displayen.
- Navelsträcka
- Visualisera navelstrinnet i en sagittal eller snett transektion av fetma buken. Mäta den inre kärldiametern i den raka delen av intra-abdominal navelvenen före några synliga grenar. Använd regelbundet B-läge och visualisera kärlet i en vinkelrätt insonationsvinkel för diametermätningar och behåll flera optimala ramar för senare mätningar för att minimera effekten av förändringar av pulsatil diameter.
- Upprepa mätningarna fem till tio gånger 19 .
- På samma plats använder du Doppler ultraljud och justerar sonden för att få en insoneringsvinkel så låg som möjligt (alltid <30 °) för att mäta den genomsnittliga maximala hastigheten (TAMX). Hämta hastigheten över en period på 3 - 5 s (icke-pulserande flöde).
- Visualisera navelstrinnet i en sagittal eller snett transektion av fetma buken. Mäta den inre kärldiametern i den raka delen av intra-abdominal navelvenen före några synliga grenar. Använd regelbundet B-läge och visualisera kärlet i en vinkelrätt insonationsvinkel för diametermätningar och behåll flera optimala ramar för senare mätningar för att minimera effekten av förändringar av pulsatil diameter.
- Uterinartären
- Använd DopplerUltraljud för att visualisera livmodern när den passerar den yttre iliacartären, omedelbart efter att den grenar från den inre iliacartären. Justera sonden på den här platsen för att få en låg insoneringsvinkel (alltid <30 °) och mäta TAMX. Hämta hastigheten som medelhastigheten för tre hjärtcykler.
- Eftersom det inte är sannolikt att få en vinkelrät vinkel på samma plats som TAMX mäts, följ kärlet distalt för att få en korrekt vinkel för diametermätningar så nära sidorna med diametermätningar som möjligt. Uteslut diametermätningarna om några synliga fartyg avgrenas före denna plats, vilket utvärderas av färgdoppler-ultraljud.
- Använd regelbundet B-läge och visualisera kärlet i en vinkelrätt insonationsvinkel för diametermätningar och behåll flera optimala ramar för senare mätningar för att minimera effekten av förändringar av pulsatil diameter.
- Upprepa mätningarna fem till tio gånger 19 .
- Observera placentans position.
4. Blodprovtagning med 4 blodkärl
OBS! Tidslinjen för procedurerna beskrivs i Figur 1 och en översikt över proverna illustreras i Figur 2 .
Figur 2 : Schematisk illustration av Placental Vasculature och samplingsplatser.
I provtagningsmetoden med 4 kärl dras blodprover från livmodervenen, den radiella artären (som en proxy för livmoderns artär) och navelartärerna och venen. Blodflöde i livmodern och navelvenen mäts med ultraljud. Vävnadsprover från placentan uppsamlas. Illustration: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Säkerhetsförfaranden
- Skaffa all personal i operationssteatern med handskar, kirurgiska skrubbdragor, masker och huvudbonader.
- Ge kirurgerna och forskarpersonalen kontakt med operationsfältet med kirurgiska skrubbdragor, masker, huvudbonader, klänningar och dubbla handskar. Glasögon är valfria.
- Ge personalen hantering av blodproverna med handskar.
- Ge personal som hanterar placentaproverna med handskar och kirurgisk mask. Homogenisering kräver användning av huvar.
- Förberedelse i operationsteatern
- Ge en sammanfattning och ge utrustningen till all personal som hjälper provtagningen före operationens början.
- Adressera anestesiologen och anestesiologiska sjuksköterskan som kommer att bistå med den nödvändiga perifera arteriella och venösa tillgången och se till attInga vätskor ges intravenöst före provtagning.
- Ge tre sprutor (10 ml) utan nålar till den person som hjälper till med antecubital venprovet och två sprutor (en 20 ml och en 10 ml) och en blodgasspruta (med heparin) till personen som hjälper till med den radiella artären.
- Förbered två sterila sprutor (20 ml), fem sterila sprutor (10 ml), tre "fjärilnålar" och två blodgasssprutor för operationsfältet.
- Tillgång till blodkärl.
- Följ standardproceduren före kejsarsnittet för att säkerställa perifer intravenös (iv) tillgång.
OBS: Antecubitalvenen är att föredra eftersom det är lättare att rita prover från den här webbplatsen. - Lokalisera den radiella artären vid handleden genom ultraljud eller genom palpation. Efter 0,5 ml subkutan lidokain analgesi, placera en arteriell linje i den radiella artären. Överge provtagningen från den här webbplatsen om tre misslyckade inlägg, ellerOm kvinnan upplever smärta under införandet.
OBS: Utför kirurgiskt ingrepp i kejsarsnitt enligt standardproceduren. Endast de justeringar som behövs för urvalsproceduren understrykas nedan.
- Följ standardproceduren före kejsarsnittet för att säkerställa perifer intravenös (iv) tillgång.
- Maternal blodprover
OBS: Hämta alla tre blodprövningar från moderen (livmodern, radialartären och antecubitalvenen) samtidigt före livmoderns snitt.- För livmoderven, efter att ha öppnat bukhålan, använd en retraktor för att lyfta bukväggen och exponera huvudgrenarna på livmodervenerna på livmoderns anterolaterala sidor. Skaffa blod från livmoderns åkgrenar på samma sida som placentan när det är möjligt eller använd den mest framträdande venen plexus om placentan ligger i livmoderns mittlinje.
- Sätt in en fjärilsnål på en blodgasspruta i livmodervenen i en vinkel på ungefär 30 grader och samla blod genom försiktig aspiration för att undvikahemolys. När du försiktigt säkrar fjärilnålens iv-position, byt ut den fyllda blodgassprutan med en 20 ml och en 10 ml spruta i följd.
OBS: Optimal åtkomst säkerställs bäst när den står på den kontralaterala sidan av den utvalda venén.
- Sätt in en fjärilsnål på en blodgasspruta i livmodervenen i en vinkel på ungefär 30 grader och samla blod genom försiktig aspiration för att undvikahemolys. När du försiktigt säkrar fjärilnålens iv-position, byt ut den fyllda blodgassprutan med en 20 ml och en 10 ml spruta i följd.
- För den radiella artären, aspirera från intra-arteriella linjen. Kassera de första 5 ml, och sedan aspirera 3 ml i heparinsprutan för blodgasanalyser följt av 3 ml i två sprutor (20 + 10 ml).
- För antecubitalvenen, aspirera försiktigt från den intravenösa kateteren. Kassera de första 5 ml, och sedan aspirera 30 ml i tre sprutor (10 ml).
- Utför en slutlig inspektion av provtagningsstället på livmodern innan du börjar stänga buken.
- För livmoderven, efter att ha öppnat bukhålan, använd en retraktor för att lyfta bukväggen och exponera huvudgrenarna på livmodervenerna på livmoderns anterolaterala sidor. Skaffa blod från livmoderns åkgrenar på samma sida som placentan när det är möjligt eller använd den mest framträdande venen plexus om placentan ligger i livmoderns mittlinje.
- Fosterblodprover
- När barnet är födt, aspirera omedelbart blod från navelsträngen, utan att klämma navelsträngen eller leverera placentan. Börja witH sprutan för blodgasanalys och följ om möjligt med tre 10 ml sprutor.
- När artärproverna är fastsatta, kläm kabeln och ge barnet till barnmorska före provtagning från navelvenen (blodgas och 20 + 10 ml sprutor).
ANMÄRKNING: Hämta alla navelprover inom några sekunder efter leverans och med placentan in situ om den inte har lossnat spontant. - Följ de norska rekommendationerna om sen sladdklämning. Vid ett obehagligt barn, kläm och snitt sladden omedelbart och hand barnet till barnmorska och neonatolog.
- Hantering av blodprover
- Sätt blodgasens sprutor på is medan du förbereder resten av blodproverna och analysera dem i en blodgasanalysator inom 5 minuter.
- Överför blodproverna omedelbart till vacutainers och placera plasmörerna på en vippare i 1 - 2 min innan de läggs på is. Lämna serumrören på arbetetAtory bänk att bosätta sig i 30 minuter.
OBS! Detta är ett kritiskt steg i förfarandet som behöver extra uppmärksamhet, eftersom prover från alla fem sidor måste förberedas samtidigt för att säkerställa god kvalitet. - Centrifugera plasmaproverna så snart som möjligt och inom 30 minuter vid 6 ° C, 2.500 xg under 20 minuter.
- Efter 30 min centrifugera serumproverna vid rumstemperatur i 10 minuter vid 2500 x g.
- Aliquot supernatanterna försiktigt till 2 ml cryo-rör, vilket lämnar 0,5 ml av supernatanten ovanför pelleten för att säkerställa blodplättfri plasma.
- Förvara provet vid -80 ° C.
5. Insamling av placenta vävnad
- Placera placentan platta på ett iskyldt dissektionsbricka så snart som möjligt efter det att det har levererats. Fotografera och mäta längsta diameter och diameter vid 90 grader.
- Väga placentan.
- Anteckna vikten, de två diametrarna, vilken som helst gRosspatologi, antal kärl i sladden och tidsintervallet från leverans till när placentan placerades på is.
OBS: Skicka placentan till patologisk undersökning om det kliniskt indikeras. - Placera placentan med mäldens yta uppåt och identifiera 4 - 5 provtagningssites som är slumpmässigt placerade i varje kvadrant av moderkakan och undviker områden med frankpatologi. Ta bort decidua med sax för att skära bort 3 - 5 mm från moderns yta. Samla 1 - 2 cm 3 bitar av villös vävnad från varje plats.
- Tvätta den uppsamlade vävnaden försiktigt i 50 ml kall 1 M PBS. Dela upp i flera bitar från varje provplats och alikvot.
Anm .: Storleken på placenta bitarna beror på de planerade analyserna. - Lägg till alikvoter av 0,1 - 0,5 cm 3 vävnadsprover till 5 kryo-rör och snäppfrys i flytande kväve.
- Tillsätt små bitar av 0,1 - 0,2 cm 3 till röret med 25 ml RNA-stabiliseringslösning. Förvara vid 46, C i 24 h, kassera RNA-stabiliseringslösningen och ersätt den. Frysa.
- Tillsätt bitar av 0,5 cm 3 till 5 kryo-rör med 0,5 ml OCT, fyll upp med OCT, blanda och frysa.
- Förvara proven vid -80 ° C tills analysen är klar.
OBS: Burton et al. Ger en utmärkt översikt över praktiska aspekter av placentalprovtagning beroende på de planerade analyserna. 20 Överväga att förbereda den återstående vävnaden för isolering av de mikrovillösa och basala membranerna och för att samla envis vävnad genom vakuumsugningsteknik. 21 , 22
6. Neonatala egenskaper
- Anteckna de neonatala egenskaperna, inklusive Apgar-poäng (1, 5 och 10 min), kön, vikt, längd, graviditetsalder och inträde till nyfödd intensivvårdsenhet (längd och utfall av vistelsen).
- Överväg mätning av neonatal kroppssammansättning genom antropometriska mätningar, luftförskjutningMentplethysmograf eller dubbel röntgenabsorptiometri. 23 , 24
7. Beräkningar
- Antag en liknande blodkomposition i den radiella och uterina artären och beräkna den uteroplacentala arteriovenösa koncentrationsskillnaden.
Uteroplacental arteriovenös koncentrationsskillnad = C A - C V
Navel venös - arteriell koncentrationsskillnaden = C v - C en
Där C är koncentration med abonnemang: A, den radiella artären; V, livmodern V navelsträngen och a, navelarterien. - Beräkna volymen blodflöde, ml / min (Q):
När D är kärldiametern (cm) är TAMX en genomsnittlig maxhastighet och h är koefficienten för den rumsliga blodhastighetsprofilen. Använd 0,5 som koefficienten för navelvenen och0,6 för uterusartären 25 , 26 . - Beräkna placentaupptaget och släpp ut enligt Ficks princip:
Uteroplacental upptag = ( C A - C V ) x Qm
Fosterupptagning = ( C v - C a ) x Q f
Prenumerationer: m, mamma och f, foster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Provtagningsmetoden med 4 kärl är tillämplig i klinisk praxis och vi har framgångsrikt erhållit blodprover från 209 mor / spädbarnspar. I 128 av dessa uppnådde vi också att mäta volymen blodflöde. Komplett 4-kärlprovtagning och mätningar av god kvalitet hos både moder- och fosterskärl erhölls i 70 moderfosterpar ( figur 3 ). Dessutom har vi hittills samlat blod och placenta prover från 30 preeklamptiska patienter. Vi har tidigare publicerat artiklar om mänsklig placentaöverföring av näringsämnen, liksom placentautsläpp av vasoaktiva faktorer, vilket visar två tillämpningar av metoden 14 , 15 , 16 .
Exempel på hur 4-kärlmetoden används för att studera placentaöverföring
Det finns signifikanta arterierOlika glukosskillnader på båda sidor av placentan som visar en in vivo uteroplacental och fetalt upptag av glukos ( Tabell 1 ). Placentaöverföringen av glukos är beroende av moder-fetalt glukosgradienten och därmed på moderns glukosnivåer. Vi har emellertid tidigare visat att denna gradient, och därmed glukosöverföringen, också påverkas signifikant av fetalt insulinnivåer och glukosförbrukning. Detta är ett exempel på hur denna metod illustrerar viktiga maternal-fetala samspel 14 .
| Fartyg | Glukosmolol / L | p-värde * |
| Radialartären | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Livmoderven | 4,23 [3,94, 4,53] | |
| Navelsträcka | 3,78 [3,52, 4,06] | |
| Umbilical arterie | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Parade skillnader | ||
| Radialartär - livmoderven | 0,29 [0,13, 0,41] | <0,001 |
| Umbilical artery - navelsträng | 0,54 [0,29, 0,76] | <0,001 |
| Radialartär - navelarterie | 1,25 [1,03, 1,51] | <0,001 |
Tabell 1: Median [Q1, Q3] Koncentrationer och arteriovenösa skillnader i glukos
* Wilcoxon Signed-Rank test
Förekomsten av fetalt glukos från (placenta frisättning till) navelströmscirkulationen antas vara beroende inte bara oN den maternal-fosterliga gradienten, men på blodflödet i blodet 5 . På samma sätt kan det vara relevant att studera fetalt glukosupptagning som en funktion av moderkroppsvikt eller födelsevikt. I n = 128 fann vi ett median [Q1, Q3] totalt navelsträngsflöde av 196,2 [158,3, 232,2] ml / min och beräknade en median [Q1, Q3] fetalt glukosupptagning från (placenta frisättning till) navelströmscirkulationen av 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normaliserad för födelsevikt är detta lika med 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. Placenta släpper ut 0,16 [0,10, 0,26] (mmol / min) per kg placenta.
Exempel på hur 4-kärlmetoden används för att studera upptag av placenta
Djurstudier tyder på att glutaminsyra är viktig både vid omvandling av aminosyror i moderkakan och fostrets lever och som ett oxidativt bränsle i andra metaboliska vägar 27 . Med hjälp av placenta 4-kärls provtagningsmetod studerade vi uTeroplacentala och navlera arteriovenösa skillnader i glutaminsyra hos människor ( tabell 2 ). Vi hittade en placentaupptagning (sålunda en fet frisättning) av glutaminsyra från navelströmscirkulationen. Vidare fann vi en placentaupptag av glutaminsyra från moderns cirkulation. Denna placentaupptagning från båda cirkulationerna är ett exempel på hur 4-kärlmetoden kan användas för att demonstrera in vivo hos människa att placenta metabolism av näringsämnen är en del av reglering av transplacental överföring.
| Fartyg | Glutaminsyra μmol / L | p-värde * |
| Radialartären | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Livmoderven | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Navelsträcka | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Umbilical arterie | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Parade skillnader | ||
| Radiell artär-uterinven | 10,4 [1,6, 21,2] | <0,001 |
| Umbilical artery -umbilisk ven | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0,001 |
Tabell 2: Median [Q1, Q3] Koncentrationer och arteriovenösa skillnader i glutaminsyra
* Wilcoxon Signed-Rank test
Exempel på hur 4-kärlmetoden används för att studera utsläpp av placenta
Det är uppenbart att placentan utsöndrar progesteron och för att validera vår 4-kärlmetod på moderkanten av placentan mättes in vivo- frisättningen av progesteron vid teRm 28 . Vi hittade en signifikant placenta frisättning av progesteron till modercirkulationen ( tabell 3 ). Den observerade arteriovenösa skillnaden visar hur proventationsmetoden för placenta 4-kärl kan användas för att detektera substanser som frigörs av placentan och är mycket relevant när man studerar patologiska graviditeter.
| Fartyg | Progesteron nmol / L | p-värde * |
| Radialartären | 678 [514, 971] | |
| Livmoderven | 1852 [1059, 2786] | |
| Parade skillnader | ||
| Radiell artär-uterinven | -1187 [-1855, -404] | p <0,001 |
Tabell 3: Median [Q1, Q3] koncentrationer och uteroplacental arteriovenös skillnad av progesteron
* Wilcoxon Signed-Rank test
Figur 3 : Flödesschema och illustration av inkluderade och förlorade deltagare.
A. Visar deltagarnas deltagande, vilket visar att deltagarna förlorades huvudsakligen på grund av arbetets start före kejsarsnitt eller brist på tillräcklig personal för att genomföra studien. B. Av de 179 kvinnor med normala graviditeter (blåa) erhölls fullständiga 4-blods blodprövningar i 162 (91%) (ofullständiga blodprover i blodet: svarta, ofullständiga moderblodprover: grå). Femtio (28%) deltagare ingick inte i ultraljudsmätningar på grund av logistiska begränsningar. Av den 128 deltagare (72%) utsatta för ultraljud, blodflödesmätningar vid fostrets sida av placentan erhölls hos alla deltagare (ljusgröna), medan fullständiga blodflödesmätningar hos både moder- och fetalsidan erhölls i 77 (60%) (mörkgrön). Illustration: Øystein H. Horgmo, Universitetet i Oslo. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Provtagningsmetoden för placenta 4-kärl är relevant för tre huvudändamål. För det första kan det användas för att studera hur specifika ämnen tas upp av moderkakan på moderns sida och eventuellt överförs till navelströmscirkulationen och fostret, vilket framgår av våra glukos- och aminosyrastudier. För det andra är metoden mycket relevant för att studera substanser som produceras av placentan och släpptes till moder- eller fostercirkulationen, vilket demonstreras av progesteronresultaten. För det tredje kan det vara användbart att studera hur fostret in vivo eliminerar avfallsprodukter under snabb tillväxt och vävnadsmodellering.
Kritiska steg och logistikproblem av 4-kärlmetoden
Placenta 4-kärlprovtagning har tidigare använts för att bestämma placental överföring av makronäringsämnen in vivo vid normala fysiologiska graviditeter 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, men med ett begränsat antal studieämnen. Den begränsade användningen av 4-kärlprovtagningen beror troligen på processens krävande logistik. En framgångsrik samordning mellan patienten, forskarna och personalen vid fakultetens, obstetriska och anestesiologiska institutioner är avgörande för att kunna använda denna metod. Vi tror att det har varit en stor fördel att flera av de främsta utredarna är obstetrikare, känner till kliniska rutiner och nyckelpersoner. Därmed har studierna genomförts utöver den dagliga kliniska praxisen. Genom att samordna och säkra varje steg i proceduren har vi fått prov från över 200 mor / nyfödda par. Vidare har vår strategi varit att hålla provtagningsproceduren på få händer eftersom det finns tekniska utmaningar i det förfarande som är avgörande för det framgångsrika resultatet av provtagningen och för många sampler kan introducera onödiga källor till variation av data. ConsequVi rekommenderar att alla sonografiska undersökningar ska utföras av samma granskare med samma ultraljudsmaskin. Utrustningen bör väljas med försiktighet, eftersom upplösningen av kärlväggen är avgörande. Uterinartärerna i tredje trimestern är särskilt tekniskt utmanande att mäta eftersom livmoderns storlek och innehåll gör det svårt att erhålla både den vinkelräta insoneringsvinkeln som används för diametermätningarna och den låga insoneringsvinkeln för flödeshastighetsmätningar på exakt samma plats. Vidare kräver framgångsrikt blodprovtagning identifiering av lämplig provtagningsplats i livmodern och mild aspiration. På navelsidan kräver fragiliteten hos de fetala erytrocyterna särskild uppmärksamhet åt aspirationskraften. Det är vår erfarenhet att fördröjd leverans eller mindre stress hos barnet var förknippad med tidig förträngning av navelartären vilket resulterade i minskad arteriell provvolym.
Metodiska / Analytiska problem med 4-kärlmetoden
Det är viktigt att ta upp flera metodologiska problem i tolkningen av resultaten från en placenta 4-kärlstudie. För det första, om syftet är att beräkna massan av ett ämne som tas upp eller frigörs av moderkakan är det viktigt att överväga volymen av blod som passerar. Det bör hållas i åtanke att livmodern inte bara avtar placentan utan också dränerar livmodermuskeln, och att livmoderkarbonaturen i olika grad anastomoserar med äggstocks-och vaginalvaskulaturen. Därefter är det viktigt att överväga att utbytet av vatten över moderkakan kan påverka koncentrationenRationer mätta och därmed påverka de beräknade arteriovenösa koncentrationsskillnaderna. Idealt sett behandlas detta bäst genom att justera koncentrationsskillnaderna för det förlorade eller vunna vattnet i varje moderfosterpar. Detta kan uppnås genom att mäta ett ämne som inte tas upp eller frigörs av placentan eller livmodern. Hemoglobinkoncentrationerna eller beräknade procenttal av erytrocyter (hematokrit) kan fungera som korrigeringsfaktorer för vattenbyte. Vid tolkning av upptagning eller frisättning av föreningar på moderns sida av placentan kan det vidare vara intressant att erhålla arteriovenösa skillnader i andra vävnader för jämförelse. Vi har därför inkluderat ett blodprov från antecubitalvenen för att karakterisera specifika särdrag hos placentan genom att jämföra de arteriovenösa skillnaderna över placentan med de hos kapillärbädden i underarmen. Vi hittade denna jämförelse särskilt intressant när vi testade placenta frisättning av sFlt-1 och placenta tillväxt faCtor eftersom systemiska endotelceller skulle kunna vara en potentiell källa till dessa föreningar 14 . Beroende på forskningsfrågan kan det vara viktigt att relatera arteriovenösa skillnader till placentans vikt för att beräkna placentaffektiviteten, dvs när det gäller (mmol / L) / kg eller (mmol / min) / kg placenta.
Begränsningar och styrkor i 4-kärlmetoden
Även om placenta fysiologi är mindre påverkad av kejsarsnitt än vid stress av vaginal leverans, finns det flera begränsningar för denna metod. Vaginal leverans rekommenderas i de flesta fall av vanliga graviditetskomplikationer (som preeklampsi, diabetes, fetma och måttlig fostermakrosomi), vilket kan begränsa och förspänna rekryteringen. Även när man optimerar varje steg i metoden är det svårt att få fullständiga mätningar och prov i varje patient på grund av de tekniska svårigheterna i blodprovet och ultraljudsvolymenUme-flödesmätningar ( figur 3 ). Dessutom, även om ultraljudsmätningarna utförs så nära tid som möjligt för operationen, är de i själva verket utfört före ryggmärgsanestesi och blodprovtagning. Härav följer att materiell hjärtproduktion (CO) kan förändras och eventuellt påverka blodtrycket av uteroplacentalt (och till och med feto-placental). Den möjliga förändringen i CO som orsakas av ryggmärgsanestesiacan kompenseras av fenylefrin som användes i den aktuella studien. Preliminära data från en delmängd av våra deltagare (n = 23) visar ingen signifikant förändring av CO före spinalanestesi och vid provtagningstidpunkten (ej offentliggjorda data). Med hjälp av 4-kärlsprovtagningsmetoden hos människor, begränsar både möjligheten att introducera en tidsvariabel och manipulera blodhalten 5 , 29 , 30 , i motsats till hos djur. Av dessa överväganden följer att 4-kärlet Provtagningsmetoden är tvärsektionen och i stor utsträckning observatorisk av naturen, och de erhållna data måste analyseras i enlighet därmed. Å andra sidan ger 4-kärls provtagningsmetod en unik möjlighet att studera human placenta fysiologi och patofysiologi in vivo , med alla interaktiva faktorer som spelar, en situation som aldrig kan reproduceras in vitro . Det ger ett utmärkt tillfälle att testa hypoteser som har uppstått från djur eller andra experimentella studier. På samma sätt kan det generera nya hypoteser som måste testas mekaniskt in vitro och i djurstudier.
Potentiella tillämpningar av 4-kärlmetoden
Vid patologiska graviditeter har moderna och fosterala arteriovenösa koncentrationsskillnader hittills studerats separat och tillåts för testning av några av de befintliga hypoteserna in vivo 15 , 16 ,Röv = "xref"> 31. 4-kärls provtagningsmetod erbjuder ett tilltalande tillfälle att studera maternell-, placenta- och fetaltenheten tillsammans i stället för som separata enheter i patologiska graviditeter och kan kasta nytt ljus på både gamla och nya frågor inom ramen för maternell-fetalt interaktion. 4-kärls provtagningsmetod kan tillämpas på ett brett spektrum av forskningsfrågor vid både normala och patologiska graviditeter beroende på de ytterligare analyserna av proverna. Valet av vacutainers, blodvolymen, placentaområdet och andra vävnadsprover bör bestämmas enligt forskningsfrågan. Burton et al. Har nyligen publicerat ett utmärkt papper som beskriver förfaranden för att säkerställa prov av placenta vävnad av god kvalitet och att tillåta sammanslagning av olika biobanker för att ta itu med vissa pussel som kräver en stor mängd prover som ska lösas 20 . 4-kärlproverna kan analyseras för att studera den specifika frisättningen av exosomer till mödrarAll cirkulation, överföring av medicinering, metaboliter och toxiner. Analyser med stor skala omics (metabolomics, proteomics and lipidomics) har potential att identifiera ämnen och metaboliter i moderplasma som utsöndras av placentan. Därigenom kan upprättandet av 4-kärlprovtagningsmetoden identifiera placenta-härledda faktorer i modercirkulationen och möjliga utplåna biomarkörer med placentafunktionen. Kombinerad med tekniker för att separera moderns motstående mikrofila och fosterbaserade plasmamembran från syncytiotrofoblast kan överföring av ett ämne studeras tillsammans med aktiviteten och placeringen av relevanta transportörproteiner 21 . Vidare kan mekanismer som reglerar näringsöverföring in vivo belysas genom analys av nivåerna av näringsämnen och mikronäringsämnen i de fyra kärlen och relaterar överföringen av näringsämnen till mätningar av näringsämnet och energiavkänningssystemet i placentan 32 33 . Glukosinfusion före leverans är ett annat möjligt tillvägagångssätt. Placental överföring kan relateras till maternella metaboliska variabler som BMI, glukos och plasma lipidprofiler och till fostrets resultat som födelsevikt och kroppssammansättning 18 . Tillsammans kommer dessa tillvägagångssätt eventuellt att belysa placentans integrativa roll, som ligger i mitten av samspelet mellan maternella och fostrets tillstånd och behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Först och främst tackar vi de mammor som deltog i projektet. Därefter erkänner vi all personal som biträdde och underlätta provtagningsförfarandet, anestesiologen, sjuksköterskans anestesiolog och de kirurgiska sjuksköterskorna. Projektet skulle inte ha varit möjligt utan finansiering från den regionala hälso- och sjukvårdsorganisationen Sydostasien och den norska rådgivande enheten för kvinnors hälsa, Oslo Universitet och lokal finansiering från Oslo Universitetssjukhus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
- Jansson, T., Powell, T. L. Role of the placenta in fetal programming: underlying mechanisms and potential interventional approaches. Clin Sci (Lond). 113 (1), 1-13 (2007).
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Guttmacher, A. E., Spong, C. Y. The human placenta project: it's time for real time. Am J Obstet Gynecol. 213, 4 Suppl 3-5 (2015).
- Battaglia, F. C., Regnault, T. R. Placental transport and metabolism of amino acids. Placenta. 22 (2-3), 145-161 (2001).
- Hay, W. W. Placental-fetal glucose exchange and fetal glucose metabolism. Trans Am Clin Climatol Assoc. 117, 321-339 (2006).
- Woollett, L. A. Review: Transport of maternal cholesterol to the fetal circulation. Placenta. 32, Suppl 2 218-221 (2011).
- Prenton, M. A., Young, M. Umbilical vein-artery and uterine arterio-venous plasma amino acid differences (in the human subject). J Obstet Gynaecol Br Commonw. 76 (5), 404-411 (1969).
- Cetin, I., et al. Plasma and erythrocyte amino acids in mother and fetus. Biol Neonate. 60 (2), 83-91 (1991).
- Filshie, G. M., Anstey, M. D. The distribution of arachidonic acid in plasma and tissues of patients near term undergoing elective or emergency Caesarean section. Br J Obstet Gynaecol. 85 (2), 119-123 (1978).
- Haberey, P. P., Schaefer, A., Nisand, I., Dellenbach, P. The fate and importance of fetal lactate in the human placenta -a new hypothesis. J Perinat Med. 10 (2), 127-129 (1982).
- Prendergast, C. H., et al. Glucose production by the human placenta in vivo. Placenta. 20 (7), 591-598 (1999).
- Metzger, B. E., Rodeck, C., Freinkel, N., Price, J., Young, M. Transplacental arteriovenous gradients for glucose, insulin, glucagon and placental lactogen during normoglycaemia in human pregnancy at term. Placenta. 6 (4), 347-354 (1985).
- Zamudio, S., et al. Hypoglycemia and the origin of hypoxia-induced reduction in human fetal growth. PLoS One. 5 (1), 8551 (2010).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Lorentzen, B., Michelsen, T. M., Henriksen, T. Placental glucose transfer: a human in vivo study. PLoS One. 10 (2), 0117084 (2015).
- Holme, A. M., Roland, M. C., Henriksen, T., Michelsen, T. M. In vivo uteroplacental release of placental growth factor and soluble Fms-like tyrosine kinase-1 in normal and preeclamptic pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 781-782 (2016).
- Paasche Roland, M. C., Lorentzen, B., Godang, K., Henriksen, T. Uteroplacental arterio-venous difference in soluble VEGFR-1 (sFlt-1), but not in soluble endoglin concentrations in preeclampsia. Placenta. 33 (3), 224-226 (2012).
- Brar, H. S., et al. Uteroplacental unit as a source of elevated circulating prorenin levels in normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 155 (6), 1223-1226 (1986).
- Myatt, L., et al. Strategy for standardization of preeclampsia research study design. Hypertension. 63 (6), 1293-1301 (2014).
- Kiserud, T., Rasmussen, S. How repeat measurements affect the mean diameter of the umbilical vein and the ductus venosus. Ultrasound Obstet Gynecol. 11 (6), 419-425 (1998).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Illsley, N. P., Wang, Z. Q., Gray, A., Sellers, M. C., Jacobs, M. M. Simultaneous preparation of paired, syncytial, microvillous and basal membranes from human placenta. Biochim Biophys Acta. 1029 (2), 218-226 (1990).
- Staff, A. C., Ranheim, T., Khoury, J., Henriksen, T. Increased contents of phospholipids, cholesterol, and lipid peroxides in decidua basalis in women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 180 (3), Pt 1 587-592 (1999).
- Catalano, P. M., Thomas, A. J., Avallone, D. A., Amini, S. B. Anthropometric estimation of neonatal body composition. Am J Obstet Gynecol. 173 (4), 1176-1181 (1995).
- Ellis, K. J., et al. Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model. Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).
- Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term. Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).
- Acharya, G., et al. Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep. Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).
- Wu, X., et al. Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy. Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).
- Tuckey, R. C. Progesterone synthesis by the human placenta. Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).
- Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. Fetal metabolic response to maternal starvation. Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).
- Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. Insulin effect on fetal glucose utilization. Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).
- Bujold, E., et al. Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin. J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).
- Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing. Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).
- Cetin, I. Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).
