Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لجمع السائل الخلالي القلب من معزولة، القلب الفئران بيرفوسد. لفصل جسديا انفصال الخلالي من الشريان التاجي الوريدي بيرفوسيت، يتم قلب قلب بيرفوسد لانجندورفف، ويتم جمع ترانزودات (السائل الخلالي) التي تشكلت على سطح القلب باستخدام غطاء اللاتكس لينة.
Abstract
يصف هذا البروتوكول نهج فريد من نوعه التي تمكن من جمع ترانزودات القلب (كت) من معزولة، المالحة بيرفوسد القلب الفئران. بعد العزلة والنضح إلى الوراء من القلب وفقا لتقنية لانجندورفف، قلب مقلوب إلى موقف رأسا على عقب واستقر ميكانيكيا من قبل القسطرة البالونية إدراجها في البطين الأيسر. ثم، يتم وضع غطاء اللاتكس رقيقة - يلقي سابقا لتتناسب مع متوسط حجم القلب الفئران - على سطح النخابية. يتم توصيل منفذ غطاء اللاتكس إلى أنابيب السيليكون، مع افتتاح القاصي 10 سم تحت مستوى القاعدة من القلب، وخلق شفط طفيف. كت التي تنتج بشكل مستمر على سطح النخابية يتم جمعها في قارورة تبريد الجليد لمزيد من التحليل. تراوحت نسبة تشكيل كت من 17 إلى 147 ميكرولتر / دقيقة (ن = 14) في السيطرة والقلوب احتشاء، والذي يمثل 0.1-1٪ من الشريان التاجي الوريدية بيرفوسيت. تحليل بروتيوميك وعالية بيرفوكشفت كروماتوغرافيا السائل رمانس (هبلك) أن كت التي تم جمعها يحتوي على مجموعة واسعة من البروتينات والأيض بورينرجيك.
Introduction
فشل القلب (هف) هو السبب الرئيسي للوفاة في البشر في جميع أنحاء العالم 1 . هف غالبا ما يحدث بسبب التهاب عضلة القلب، والإهانات الدماغية لعضلة القلب، والبطين الأيسر إعادة عرض، مما يؤدي إلى التدهور التدريجي في وظيفة مقلص القلب ونوعية المرضى من الحياة. وعلى الرغم من أن التقدم في أمراض القلب وجراحة القلب قد أدى إلى انخفاض ملحوظ في معدل الوفيات الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري، إلا أنها مجرد "مؤخر" مؤقت لعملية مرضية تقدمية لا محالة تحمل مراضة كبيرة. ولذلك، فإن النقص الحالي في العلاج الفعال يؤكد الحاجة إلى تحديد الأهداف الجزيئية الجديدة التي يمكن أن تمنع أو حتى عكس هف. وهذا يشمل التغيرات في المصفوفة خارج الخلية، والاستجابة المناعية القلبي غير المنضبط، والتفاعلات بين الخلايا القلبية وغير القلبية 2 .
من المهم أن ندرك أن المكروية التي تتعرض لخلايا القلب إلى ديريكتيلي الأشكال الاستجابة المناعية والتجدد من القلب المصاب. في القلب المعزول، المالح بيرفوسد، يتم إنشاء كت على سطح القلب في شكل قطرات صغيرة مستمدة من الفضاء السائل الخلالي ( أي المكروية)، سواء في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيائية المرضية 3 ، 4 ، 5 . ولذلك، فإن تحليل كت ( أي السائل الخلالي) قد يساعد على تحديد العوامل التي تنظم الأيض القلبية وظيفة مقلص 6 أو تؤثر على وظائف الخلايا المناعية بعد الهجرة إلى القلب المصاب. يحتمل أن يؤدي ذلك إلى وضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج هف.
جمع كت من قلوب الفئران هو من الناحية الفنية تحديا. في قلوب لانجندورفف بيرفوسد العادية، ومجموعة حصرية من كت صعبة لأن خليط من كت مع الشريان التاجيy الوريدية السائلة بيرفوسيت يضعف بشكل غير متوقع أي تركيز من الأيضات / الإنزيمات الصادرة عن الفضاء الخلالي. إحدى الاستراتيجيات الممكنة للتغلب على هذا القيد هو استبعاد النفايات السائلة الوريدية عن طريق تحفيز الرئة وفي نفس الوقت ربط الوريد الرئوي 7 . ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تواجه صعوبات المرتبطة القنية وربط الشريان الرئوي والوريد، مما تسبب في تسرب محتمل من النفايات السائلة الوريدية في ترانزودات القلب. تم استخدام مفهوم استخدام نموذج القلب العكسي لأول مرة من قبل مجموعة كامرميه التي قلبت قلب بيرفوسد المعزول في وضع رأسا على عقب ووضعت غطاء اللاتكس الرقيق على سطح النخابية لاستمرار عينة كت دون تلوث النفايات السائلة الوريدي 8 ، 9 . باستخدام هذا الإجراء، وقد أظهرت كت لتوفير مقياس حساس جدا من الأيض الصادرة عن القلب 9 ،ونقل الشعرية من الأحماض الدهنية 8 ، والجسيمات الفيروسية 10 .
في الآونة الأخيرة، وقد تورط العوامل باراكرين التي قد تنظم الاستجابة المناعية المحلية وزيادة الأوعية الدموية القلبية 11 في الآثار المفيدة للعلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض القلب. تحليل كت في قلب عكس قد يساعد على تحديد كيميائيا هذه العوامل باراكرين الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، كت قد يساعد على تحديد العوامل التي تنطوي عليها في تنشيط الجسم الحي من الخلايا المناعية في القلب.
الوصف المفصل لجمع كت من سطح القلب، المقدمة هنا، هو مفيد تجريبيا للباحثين دراسة التفاعل بين الخلايا المناعية، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، و كارديوميوسيتس فيما يتعلق وظيفة القلب الشاملة. كما ذكر أعلاه، السائل الخلالي يحمل المعلومات للاتصال خلية إلى خلية داخل القلب، وإش يمكن تقييم مريح من قبل مجموعة من كت. الوصف التقني المفصل، بما في ذلك بروتوكول الفيديو لكيفية جمع كت من قلب عكسها، ينبغي أن يسهل التطبيق المستقبلي لهذه التقنية الفريدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل الوكالة التنظيمية المحلية ( لانوف من نوردرهين-ويستفالين، ألمانيا)، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوان. تم تغذية الحيوانات مع نظام غذائي تشاو القياسية وتلقت مياه الصنبور ليبيتوم الإعلانية . جميع المعدات والمواد الكيميائية اللازمة لكل خطوة من خطوات التجربة متوفرة في جدول المواد .
1. إعداد كاب اللاتكس والبطين داخل البطيني
- جعل قالب الألومنيوم باستخدام آلة طحن يطابق متوسط حجم القلب الفئران (وزن الجسم من 300-350 ز). البولندية العفن مع رقيق (10/0) ورقة الصنفرة.
ملاحظة: وترد مقاييس مفصلة من القالب في الشكل 1A . - عموديا إصلاح الرقبة من قالب الألومنيوم إلى آلة طحن لإعداد غطاء اللاتكس.
ملاحظة: آلة الطحن يسبب العفن لتدوير ببطء. بدلا من ذلك، يمكن استخدام محرك كهربائي. لى> - صب 20 مل من اللاتكس السائل (شراؤها تجاريا، انظر جدول المواد ) في كوب زجاجي 50 مل.
- خفض العفن حتى مغمورة الجسم كله من القالب في حل اللاتكس.
- رفع ببطء القالب (5 سم / دقيقة) في حين الدورية.
- إبقاء الدورية العفن لمدة إضافية 15 دقيقة، حتى يتم تعزيز اللثي على سطح القالب.
- إضافة حوالي 1 غرام من مسحوق التلك إلى سطح القالب (مغطاة بالفعل من قبل فيلم اللاتكس رقيقة) لمنع الضرر أثناء فصل.
- فصل بلطف مع الأصابع غطاء اللاتكس المجففة بالفعل من سطح القالب. غطاء اللاتكس هو الآن جاهزة للاستخدام ( الشكل 1B ).
- توصيل منفذ من غطاء اللاتكس إلى 15 سم أنابيب السيليكون (إد = 0.2 مم)، وتستخدم في وقت لاحق لجمع كت.
- ملء بالون البطين اللاتكس بالماء وثبات إصلاحه على قنية معدنية على شكل L متصلة 1 مل، حقنة مملوءة بالماء (> الشكل 1C).
ملاحظة: سيتم استخدام هذا لضمان وضع مستقيم من القلب (انظر أدناه). - تأكد من أن البالون محكم من خلال إجراء العديد من اختبارات الانكماش / تضخيم مع حقنة 1 مل المرفقة.
- ربط قنية، عن طريق وقف ثلاث نقاط، إلى محول الضغط لقياس المستقبل للضغط داخل البطين المتقدمة ( الشكل 1C ).
2. إعداد كريبس-هنسليت العازلة (جسر الملك حسين) ونظام لانجندورفف الإرواء
- إعداد نظام نضح لانجندورفف باستخدام إما تدفق ثابت (مدفوعا مضخة الأسطوانة) أو الضغط المستمر (التي تم إنشاؤها بواسطة ضغط ثابت في عمود الزجاج) واسطة.
ملاحظة: وقد وصفت تفاصيل إعداد القلب لانجندورفف سابقا 12 . - إعداد 2 لتر من جسر الملك حسين المعدل (في ملي: 116.02 كلوريد الصوديوم، 4.63 بوكل، 1.10 مغسو 4 · 7H 2 O، 1.21 K 2 هبو 4 2 · 2H 2 O، 24.88 ناهكو 3 ، 8.30 D- الجلوكوز، و 2.0 البيروفات الصوديوم).
- تزن جميع المواد الكيميائية ولكن كاكل 2 وحلها في 1.8 لتر من الماء المقطر المزدوج في قارورة 2 لتر.
- فقاعة المتوسطة مع الكربوجين (95٪ O 2 /5٪ كو 2 ) لمدة 5 دقائق على الأقل للتوازن (الرقم الهيدروجيني: 7.4) تحت التحريك المغناطيسي.
- إضافة 0.74 غرام من كاكل 2 .2H 2 O ورفع الحجم الإجمالي إلى 2 لتر مع الماء المقطر المزدوج.
- مواصلة التحريك و فقاعات وسط مع كاربوجين لمدة 5 دقائق إضافية.
- تصفية جسر الملك حسين من خلال مرشح 0.2 ميكرون للقضاء على الجسيمات الصغيرة التي قد تعيق دوران الأوعية الدقيقة للقلب.
- إعداد نظام نضح لانجندورفف.
- وضع جسر الملك حسين تصفيتها في حمام الماء قبل تحسنت (38 درجة مئوية). والحفاظ على محتدما مع كاربوجين لتوليد ضغط 100 سمه 2 O إنزيد(ه) خزان الملك حسين.
- ربط الخزان إلى العمود الزجاجي لإنشاء 100 سمه 2 O الضغط الهيدروستاتيكي ل نضح لانغندورفف مع جسر الملك حسين. مواصلة فقاعة جسر الملك حسين داخل العمود مع الكربوجين.
- ضبط درجة حرارة نظام الاحترار بحيث درجة الحرارة في منفذ القنية الأبهر هو 37 درجة مئوية.
- تأكد من أن نظام أنابيب خالية من فقاعة.
- أكسجين جسر الملك حسين مع الكربوجين لمدة 5 دقائق إضافية، حتى بو 2 في جسر الملك حسين يصل إلى 500-600 مم زئبق (يقاس من قبل محلل غاز الدم).
- إعداد نظام نضح لتشغيل إما على ضغط مستمر من 100 سمه 2 O أو في تدفق مستمر من حوالي 10-20 مل / دقيقة باستخدام التبديل اليدوي. بدلا من ذلك، استخدم قابلة للتبديل سث تحكم مضخة للتبديل على الفور إلى وضع نضح.
3. عزل والقنية من القلب
ملاحظة: ذكر الفئران ويستار مع وزن الجسم من 300-350 غرام استخدمت بحيث أحجام قلوب المتطابقة قبل-- يلقي اللاتكس كاب. خضعت الفئران إما ربط من اليسار الشرياني تنازلي (لاد) لمدة 50 دقيقة، تليها ضخه أو كانت تعمل الشام. تم الإبلاغ عن تفاصيل منهجية تحريض احتشاء عضلة القلب (مي) في مكان آخر 13 . أجريت التجارب قلب قلب في الحيوانات احتشاء بعد 5 أيام من العملية.
- تخدير الفئران باستخدام المرذاذ إيسوفلوران (2٪ V / V) متصلا غرفة عقد الحيوان (20 L).
- نقل الفئران إلى جدول العملية (وليس درجة الحرارة التي تسيطر عليها) بعد التوصل التخدير العميق.
- رفع الجلد والعضلات تحت القص مباشرة باستخدام ملقط وقطع حول الهامش السفلي من الأضلاع مع مقص الثقيلة.
- باستخدام مقص غرامة، وجعل قطع صغيرة في الحجاب الحاجز، على هامش الضلع. قطع الأضلاع كودالي لجعل رفرف من جدار الصدر البطني بأكمله.
- انتزاع بلطف القلب مع الإبهام أند مؤشر والوسطى الأصابع ورفع ببطء ذلك صعودا بحيث الأوعية القلبية تصبح امتدت قليلا.
- استئصال القلب حتى الشريان الأورطي يتعرض بالكامل.
- وضع القلب في كوب 100 مل تحتوي على 50 مل من جسر الملك حسين الباردة الجليد (4 درجات مئوية) ونقله إلى جهاز نضح.
- على الفور جبل القلب عن طريق الشريان الأبهر على قنية نازف وتشديد بشكل آمن مع خياطة (4-0). تجنب فقاعات الهواء دخول القلب.
- تطبيق ضغط نضح المستمر (100 سمه 2 O). بدلا من ذلك، يمكن تطبيق معدل تدفق كامل (بدءا من 20 مل / دقيقة).
ملاحظة: الوقت من افتتاح الصدر إلى المرفق من القلب إلى قنية نضح يجب أن يستغرق حوالي 3 دقائق في أيدي مشغل من ذوي الخبرة.
4. عكس قلب نموذج
- تدوير بلطف قنية الأبهر حتى الجدار الخلفي للقلب هو في إن وجه الرأي.
- إزالة النسيج الضام مع مقصلفضح فتح الأذين الأيسر، مما يجعلها جاهزة للقنية داخل البطيني.
- إدراج البالون اللاتكس مفرغة تعلق على قسطرة جامدة عبر الأذين الأيسر في البطين الأيسر.
- تضخيم البالون حتى يملأ تجويف البطين بأكمله (يتم تضخيم حجم تضخيمها مسبقا على حقنة).
- قلب القلب حتى رأسا على عقب، ودعمه من قبل القسطرة البالونية داخل البطين.
- كما هو مبين في الشكل 1C ، استقرار ميكانيكيا قلب مقلوب في وضع مستقيم باستخدام البالون داخل البطيني مع قسطرة معدنية جامدة.
- ضبط الموقف من القلب لتجنب التواء المفرط للجذر الأبهر.
- ضبط الضغط الانبساطي إلى 3-5 ملم زئبقي (يقاس بالون داخل البطين؛ انظر الشكل 1C ).
- مراقبة سطح النخابية من القلب والتأكد من أن قطرات صغيرة تشكل.
- ضع غطاء اللاتكس oإلى سطح القلب عن طريق دفعه بلطف لتغطية كامل القلب باستخدام الأصابع.
- تأكد من أن غطاء اللاتكس يغطي معظم سطح البطين.
- إزالة فقاعات الهواء، إن وجدت، داخل الغطاء والأنابيب عن طريق امتصاص بلطف مع حقنة 1 مل.
- ضبط افتتاح القاصي من أنابيب كت كتل إلى 10 سم تحت المستوى الأفقي للقلب.
ملاحظة: هذا الإجراء يضمن امتصاص طفيف من قبل الضغط الهيدروستاتيكي السلبي. - جمع قطرات من كت في أنبوب جمع 1.5 مل وضعها في الجليد مختلطة 1: 1 مع كلوريد الصوديوم. جمع حوالي 0.15-1.5 مل من كت.
ملاحظة: خليط الجليد / كلوريد الصوديوم يستقر درجة الحرارة في أنبوب جمع إلى أقل من الصفر (حوالي -4 درجة مئوية).
ملاحظة: الوقت أخذ العينات يعتمد على الغرض التجريبي. معدل تدفق كت هو حوالي 27 ± 20 ميكرولتر / دقيقة في الحيوانات التي تسيطر عليها صور (ن = 3) و 100 ± 47 ميكرولتر / دقيقة للحيوانات تاج التاجي (ن = 11). - وزن و المفاجئة تجميد عينات كتفي النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للقياسات في وقت لاحق.
5. تحليل كت
- استخدام السائل كت لتحليل الأيض، اعتمادا على السؤال العلمي.
ملاحظة: تم جمع البيانات الواردة في الشكل 2 والشكل 3 من نضح الضغط المستمر (100 سمه 2 O)، وحوالي 0.15-1.5 مل من السائل المقطعي تم جمعها في غضون فترة 10 دقيقة. هذه المرة وحجم كانت كافية للبروتين (الحد الأدنى: 50 ميكرولتر؛ الشكل 2 ) 14 و هبلك (الحد الأدنى: 20 ميكرولتر؛ الشكل 3 ) 15 تحليل مختلف البيورين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج قلب عكس تمكن جمع القلب ترانزودات الخلالي في معزولة، الرجعية بيرفوسد القلب الفئران ( الشكل 1A -C ). عندما بيرفوسد عند ضغط مستمر من 100 سمه 2 O، تراوحت نسبة تشكيل السوائل الخلالي بين 17 و 147 ميكرولتر / دقيقة، والتي تصل إلى 0.1-1٪ من النفايات السائلة الوريدية في القلب المعزول.
تم العثور على محتوى البروتين من كت، كما تم قياسه مع حمض البيكينشونينيك (بكا) الفحص، لتكون 1.08 ± 0.40 ملغ / مل (ن = 6). كشف تحليل هلام الكهربائي واحد الأبعاد (سدز-بادج) مجموعة واسعة من البروتينات الموجودة في ترانزديات القلب ( الشكل 2A ). تم إجراء ثنائي الأبعاد الفرق مضان هلام الكهربائي (2D-ديج) على كت من القلب يتعرض إلى 50 دقيقة من نقص التروية / ضخه. كما هو مبين في شفيغ "> الشكل 2B، تم العثور على عدة بروتينات في أوبريغولاتد في كت من قلوب الدماغية، من بين البروتينات التي تم تحديدها، 70.1٪ من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، و 4.6٪ من البروتينات الغشاء الخلوي، و 17.2٪ البروتينات السيتوبلاسمي، و 2.3٪ البروتينات ( الجدول 1 ).
وقد اعتبرت البورينات منذ فترة طويلة جزيئات الإشارات المحورية التي تنظم الاستجابة المناعية للقلب، لهجة حركي، وظيفة القلب، وخاصة بعد إصابة الدماغية. جمع كت يسمح قياس مجموعة متنوعة من الأيض الموجودة في السائل الخلالي القلب في ظل الظروف المرضية المرضية، مثل مي. كما هو مبين في الشكل (3) ، وتركيز أمب، غمب، نادب، الأدينوزين، هيبوكسانتين، وحمض اليوريك تقاس هبلك حيث أعلى في القلب الدماغية، وهو ما يشبه النتائج التي سبق الإبلاغ عنها باستخدام أساليب أخرى 16 ،كلاس = "كريف"> 17.
الجدول 1: قائمة بروتينات أوبريغولاتد في كت من قلوب الدماغية. تم تحليل كت من قلوب الدماغية من قبل 2D-ديج والتي تم تحديدها من قبل بروتيوميكس. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الشكل 1: رسومات تخطيطية لنموذج قلب عكس. ( A ) تم بناء قالب من الألومنيوم من قلب الفئران على شكل مناسب والحجم. ( B ) بعد غمر القالب في حل اللاتكس، وكان صب غطاء اللاتكس، بسماكة حوالي 0.01 ملم. ( C ) في Lوكان القلب بيرفوسد عن طريق الشريان الأبهر باستخدام قنية الأبهر، والتي تم عكسها في وقت لاحق إلى موقف رأسا على عقب وكان مدعوما ميكانيكيا من قبل البالون داخل البطين وضعت في البطين الأيسر. تم رصد تطوير الضغط داخل البطيني عن طريق محول الضغط. تغطية غطاء اللاتكس ما يقرب من 90٪ من سطح كل من البطين الأيمن واليسار، وكان متصلا منفذ إلى أنابيب السيليكون (إد = 0.2 مم)، مع افتتاح القاصي 10 سم تحت قاعدة القلب. وقد أدى ذلك إلى حدوث ضغط هيدروستاتيكي سلبي طفيف. القلب ترانزودات وعادة ما يتم جمعها في أنبوب تبريد 1.5 مل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيأرتحليل الذرية من كت. تم فصل البروتينات في كت بواسطة سدز-بادج ( A ) والتي حددها تحليل 2D-ديج ( B ). (A)، تشير الممرات 1-4 عينات القلب من قلوب الفردية (1 و 2 = الشام؛ 3 و 4 = احتشاء). ل (B)، تم إجراء 2D-ديج على كت من القلب احتشاء. تم تأكيد هوية البروتين بواسطة اللوني السائل (لك) -MS / مس 14 ، 15 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البيورين في كت. تم تحليل مختلف البيورين الموجودة في كت بواسطة هبلك. هبلك ممثل يعمل من الشام (الأزرق) و إنفاركتد (أسود) تظهر القلب أن القلب احتشاء يظهر أعلىتركيز الخلالي من أمب والأدينوسين، ولكن ليس هيبوزانتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند نموذج قلب عكس على راسخة لانجندورفف تقنية نضح القلب 12 ويتم تنفيذها ببساطة عن طريق قلب القلب إلى موقف رأسا على عقب وعقد هذا الموقف باستخدام جامدة البالون داخل البطين القسطرة. في مثل هذه الطريقة، يمكن أن ينفصل القلب ترانزديتات الخلالي جسديا من الشريان التاجي الوريدي السائلة بيرفوسيت، نازف بواسطة الجاذبية من قاعدة القلب 9 . كت يمكن جمعها باستمرار عن طريق غطاء اللاتكس رقيقة ومرنة وضعت على سطح القلب بأكمله.
طريقة سهلة لأداء، مع الحد الأدنى من التكلفة بالإضافة إلى ذلك من جهاز لانجندورفف. ومع ذلك، فإن بعض الخطوات حاسمة تقنيا للحصول على نتائج استنساخه ومستقرة. وتشمل هذه ضمان أن غطاء اللاتكس يناسب بشكل صحيح شكل قلوب ويغطي حوالي 90٪ من سطح البطينين، وليس الأذينين. الوقت من العفريتوهو القلب من الحيوان لأداء الرجعية نضح يجب أن يكون أقل من 3 دقائق، كما أن نقص التروية لفترات طويلة يحمل خطر تغيير التمثيل الغذائي في القلب وتشكيل ترانزودات القلب. وينبغي ضبط الضغط البطيني الأيسر الانبساطي، يقاس بالون داخل البطين، لملء تجويف البطين (3-5 ملم زئبقي). قد تضخم البالون المفرط تضخيم الشريان التاجي بسبب ضغط الأوعية الدموية. يجب أن تبقى قارورة أخذ العينات (أنبوب 1.5 مل) على الجليد لتجنب أي تدهور محتمل من الأيض والبروتينات من الفائدة.
بالإضافة إلى ذلك، التجارب الناجحة تعتمد بشكل حاسم على التعامل مع دليل جيد أثناء إعداد والعزلة، وقنية القلب. وهذا يتطلب ممارسة. لحماية القلوب من الأضرار الدماغية، وينبغي أن تتم جميع الاستعدادات مع جسر الملك حسين الباردة الجليد. وبما أن أحجام القلوب قد تختلف بين الفئران، على الرغم من وزن الجسم المماثل، فإنه من المستحسن أن يكون قبعات اللاتكس أعدت مع قليلy أبعاد مختلفة التي تناسب أحجام مختلفة من قلوب.
وقد تم وصف طريقة قلب عكس معزولة سابقا للفئران معزولة 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 وخنزير خنزير غينيا 16 واستخدمت لأغراض مختلفة. في وصفنا الحالي للمنهجية، أدخلنا بعض التعديلات على الإعداد التجريبي ومعالجة العينات. على سبيل المثال، قنية الشريان الرئوي، كما قدمها دي ديكير وآخرون. 7 ، لم يتم تنفيذ هنا، منذ موقف مقلوب من القلب يمنع التلوث المحتمل مع السائلة وريدي بيرفوسيت. تم تبسيط جهاز جمع كت عن طريق إدخال ضغط سلبي طفيف عن طريق خفض افتتاح كت-السماح توبينانوغرام إلى 10 سم تحت القلب العكسي. هذا يجعل من السهل على الفور تبرد عينات ترانزودات. لضمان التبريد السريع للعينة المقطعية، تم تحضير أكواب التجميع مسبقا لدرجة حرارة -4 درجة مئوية عن طريق وضعها في خليط متساوي الحجم من الجليد و كلوريد الصوديوم ( أي نسبة 1: 1). وقد سمح ذلك بالتبريد السريع للعينات المقطعية المحصلة.
عموما، ينبغي للمرء أن نأخذ في الاعتبار أن القلب الفئران معزولة يختلف عن في الظروف الفسيولوجية الجسم الحي ، في أن تشكيل السوائل الخلالي هو على الأرجح أقل من في القلب المالحة بيرفوسد. وبالتالي فإن كت التي شكلها القلب معزولة قد لا تقليد تماما التكوين الحقيقي للفي الجسم الحي السائل الخلالي. بالإضافة إلى ذلك، فإن الإعداد الحالي لا يسمح الاستبعاد الكامل للتلوث المحتمل مع السائلة وريدي بيرفوسيت. ومع ذلك، منذ منفذ وريدي يقع في قاعدة القلب (أدنى مستوى من القلب تستقيم)، ونحن لا نعتقدأن التلوث يساهم في عملية الجمع.
يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة لعينة السائل الخلالي القلب، والذي يحتوي على عدد وافر من الأيض والبروتينات صدر في السائل الخلالي عن طريق الخلايا العضلية والخلايا غير القلبية، مثل الخلايا المناعية والخلايا البطانية والأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء، الخلايا الليفية، و pericytes. يتم تشكيل ترانزديت الخلالي القلب نتيجة لنقل السوائل عبر الحاجز البطانية 10 ، جنبا إلى جنب مع جزء صغير من السائل اللمفاوي. أنه يحتوي على خليط من الأيض القلبية 7 ، والعوامل القابلة للذوبان في الفضاء الخلالي، وسرياتوم من خلايا القلب و / أو غير القلب 9 . لذلك، تساهم عدة أنواع الخلايا في تشكيل كت. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من العوامل التي تؤثر على معدل التكوين. أولا، يبدو أن الضغط الشرياني هو محدد رئيسي لتنظيم العبورحركة السائل أري، منذ زيادة الضغط أونكوتيك بإضافة ديكستران أو الألبومين إلى المتوسطة نضح تقلص إلى حد كبير في تشكيل كت 9 ، 10 . ثانيا، زيادة في نفاذية الأوعية الدموية خلال نقص الأكسجة 9 ، 16 ، بما في ذلك مي، يقوي التسرب من بيرفوسيت، وبالتالي تشكيل كت. لذلك، في الدراسات المستقبلية، قد تكون زيادة الضغط أونكوتيك وسيلة مناسبة لتقليل حجم كت، وبالتالي إثراء الجزيئات المستهدفة من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من قبل نسك 81570244، فوكو 23/2013، و سفب 1116 / B01 ومعهد بحوث القلب والأوعية الدموية دوسلدورف (كاريد).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
