Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um kardiale interstitielle Flüssigkeit aus dem isolierten, perfundierten Rattenherz zu sammeln. Um das interstitielle Transudat aus dem koronaren venösen Abwässer-Perfusat körperlich zu trennen, wird das Langendorff-Perfundherz umgekehrt, und das auf der Herzoberfläche gebildete Transudat (interstitielle Flüssigkeit) wird mit einer weichen Latexkappe gesammelt.
Abstract
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen einzigartigen Ansatz, der die Sammlung von Herz-Transudat (CT) aus dem isolierten, salz-perfundierten Rattenherz ermöglicht. Nach der Isolierung und retrograden Perfusion des Herzens nach der Langendorff-Technik wird das Herz in eine umgekehrte Position umgekehrt und wird durch einen in den linken Ventrikel eingeführten Ballonkatheter mechanisch stabilisiert. Dann wird eine dünne Latexkappe, die zuvor auf die durchschnittliche Größe des Rattenherzens abgestimmt ist, über die Epikardoberfläche gelegt. Der Auslaß der Latexkappe ist mit dem Silikonschlauch verbunden, wobei die distale Öffnung 10 cm unterhalb des Grundniveaus des Herzens liegt und eine leichte Absaugung erzeugt. CT, das kontinuierlich auf der Epikardoberfläche erzeugt wird, wird in eisgekühlten Fläschchen zur weiteren Analyse gesammelt. Die Rate der CT-Bildung reichte von 17 bis 147 μl / min (n = 14) in Kontroll- und Infarktherzen, was 0,1-1% des koronaren venösen Abwassersperfusats entspricht. Proteomische Analyse und hohe PerfoRmance liquid chromatography (HPLC) zeigte, dass die gesammelte CT ein breites Spektrum an Proteinen und purinergischen Metaboliten enthält.
Introduction
Herzinsuffizienz (HF) ist die führende Todesursache bei Menschen weltweit 1 . HF tritt häufig wegen der Myokarditis, der ischämischen Beleidigung des Myokards und der linksventrikulären Remodelierung auf, was zur fortschreitenden Verschlechterung der kontraktilen Herztierfunktion und der Lebensqualität der Patienten führt. Obwohl Fortschritte in der Kardiologie und Herzchirurgie die HF-Sterblichkeit merklich gesenkt haben, dienen sie lediglich als vorübergehende "Verzögerer" eines unvermeidlich fortschreitenden Krankheitsprozesses, der eine signifikante Morbidität aufweist. Daher unterstreicht der derzeitige Mangel an wirksamer Behandlung die Notwendigkeit, neuartige molekulare Ziele zu identifizieren, die HF verhindern oder sogar umkehren können. Dazu gehören Veränderungen in der extrazellulären Matrix, unkontrollierte Herz-Immunantwort und Wechselwirkungen zwischen Herz- und Nicht-Herz-Zellen 2 .
Es ist wichtig zu erkennen, dass die Mikroumgebung, die Herzzellen ausgesetzt sindUm die Immun- und Regenerationsreaktion des verletzten Herzens zu formen. In dem isolierten, salzperfundierten Herz wird CT auf der Herzoberfläche in Form von kleinen Tröpfchen erzeugt, die aus dem interstitiellen Fluidraum ( dh Mikroumgebung), sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen 3 , 4 , 5, abgeleitet sind . Daher kann die Analyse der CT ( dh interstitielle Flüssigkeit) dazu beitragen, Faktoren zu identifizieren, die den Herzmetabolismus und die kontraktile Funktion 6 regulieren oder die Immunzellenfunktionen nach der Migration in das verletzte Herz beeinflussen. Potenziell kann dies zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Behandlung von HF führen.
Die Sammlung von CT aus murinen Herzen ist technisch anspruchsvoll. In regelmäßigen Langendorff-perfundierten Herzen ist die exklusive CT-Sammlung schwierig, weil die Mischung der CT mit CoronarY venöse Abwässerperfusate verdreht unvorhersehbar jede Konzentration von Metaboliten / Enzymen, die aus dem interstitiellen Raum freigesetzt werden. Eine mögliche Strategie, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, den venösen Abfluss durch Kanülen des Pulmonals auszuschließen und gleichzeitig die Lungenvene zu lenken 7 . Diese Methode steht jedoch vor Schwierigkeiten, die mit der Kanülierung und Ligation der Pulmonalarterie und der Vene verbunden sind, was ein potentielles Auslaufen von venösen Abwässern in das Herztransudat verursacht. Das Konzept der Verwendung eines umgekehrten Herzmodells wurde zuerst von der Gruppe von Kammermeier eingeführt, die das isolierte, perfundierte Herz in eine umgekehrte Position umwandelte und eine dünne Latexkappe auf die Epikardoberfläche legte, um kontinuierlich CT ohne die Verunreinigung des venösen Abwassers abzutasten 8 , 9 Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigte CT eine sehr empfindliche Messung der aus dem Herzen 9 freigesetzten Metaboliten,Die Kapillartransfer von Fettsäuren 8 und die Viruspartikel 10 .
In jüngster Zeit wurden parakrine Faktoren, die die lokale Immunantwort regulieren und die Herzangiogenese 11 erhöhen können, in die vorteilhaften Wirkungen einer Stammzell-Therapie auf Herzerkrankungen verwickelt. Die Analyse der CT im umgekehrten Herzen kann dazu beitragen, diese einzelnen parakrinen Faktoren chemisch zu identifizieren. Darüber hinaus kann CT helfen, die Faktoren, die bei der in vivo Aktivierung von Immunzellen im Herzen beteiligt sind, zu identifizieren.
Die detaillierte Beschreibung der CT-Sammlung von der Herzoberfläche, die hier zur Verfügung gestellt wird, ist experimentell nützlich für Forscher, die das Zusammenspiel von Immunzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten im Zusammenhang mit der Gesamt-Herzfunktion untersuchen. Wie oben erwähnt, trägt die interstitielle Flüssigkeit die Information für die Zell-zu-Zell-Kommunikation innerhalb des Herzens, whIch kann bequem durch die Sammlung von CT beurteilt werden. Die ausführliche technische Beschreibung, einschließlich eines Videoprotokolls, wie man CT aus dem umgekehrten Herzen sammelt, sollte die zukünftige Anwendung dieser einzigartigen Technik erleichtern.
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Protocol
Alle Experimente wurden von der örtlichen Regulierungsbehörde ( LANUV Nordrhein-Westfalen, Deutschland) genehmigt und wurden nach den Richtlinien der Tiernutzung durchgeführt. Die Tiere wurden mit einer Standard-Chow-Diät gefüttert und erhielten Leitungswasser ad libitum . Alle Geräte und Chemikalien, die für jeden Schritt des Experiments notwendig sind, sind in der Tabelle der Materialien verfügbar.
1. Vorbereitung der Latexkappe und des intraventrikulären Ballons
- Machen Sie eine Aluminiumform mit einer Fräsmaschine, die der durchschnittlichen Größe des Rattenherzens entspricht (Körpergewicht von 300-350 g). Polieren Sie die Form mit superfeinem (10/0) Schmirgelpapier.
HINWEIS: Die detaillierten Metriken der Form sind in Abbildung 1A dargestellt . - Vertikal fixieren Sie den Hals der Aluminium-Form auf die Fräsmaschine, um die Latex-Kappe vorzubereiten.
HINWEIS: Die Fräsmaschine bewirkt, dass sich die Form langsam dreht. Alternativ kann ein Elektromotor verwendet werden. Li> - 20 ml flüssiger Latex (handelsüblich, siehe Tabelle der Materialien ) in einen 50 ml Glasbecher geben.
- Senken Sie die Form, bis der gesamte Körper der Form in die Latexlösung eingetaucht ist.
- Langsam die Form (5 cm / min) beim Drehen heben.
- Halten Sie die Form für weitere 15 Minuten, bis der Latex auf der Oberfläche der Form verfestigt ist.
- Füge etwa 1 g Talkumpuder zur Oberfläche der Form hinzu (bereits mit einem dünnen Latexfilm bedeckt), um Schäden beim Ablösen zu vermeiden.
- Vorsichtig mit den Fingern die bereits getrocknete Latexkappe von der Formoberfläche abziehen; Die Latexkappe ist nun betriebsbereit ( Bild 1B ).
- Verbinden Sie den Auslass der Latexkappe mit einem 15-cm-Silizium-Schlauch (ID = 0,2 mm), der später für die Sammlung von CT verwendet wird.
- Füllen Sie den ventrikulären Latexballon mit Wasser und fixieren Sie ihn fest auf eine L-förmige Metallkanüle, die mit einer 1 mL wassergefüllten Spritze (> Fig. 1C).
HINWEIS: Dies wird verwendet, um die aufrechte Positionierung des Herzens zu gewährleisten (siehe unten). - Vergewissern Sie sich, dass der Ballon luftdicht ist, indem Sie mehrere Entlüftungs- / Aufblasversuche mit der beigefügten 1-ml-Spritze durchführen.
- Verbinden Sie die Kanüle über einen Dreiwege-Anschlag mit einem Druckaufnehmer für die zukünftige Messung des intraventrikulär entwickelten Drucks ( Abbildung 1C ).
2. Vorbereitung von Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) und dem Langendorff-Perfusionssystem
- Richten Sie ein Langendorff-Perfusionssystem ein, indem Sie entweder Konstantstrom (angetrieben durch eine Rollenpumpe) oder einen konstanten Druck (erzeugt durch einen statischen Druck in einer Glassäulen) -Modus verwenden.
HINWEIS: Details der Langendorff-Herzpräparation wurden zuvor beschrieben 12 . - 2 L eines modifizierten KHB (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO & sub4; · 7H & sub2; O, 1,21 K & sub2; HPO & sub4; 2 · 2H 2 O, 24,88 NaHCO 3 , 8,30 D-Glucose und 2,0 Natriumpyruvat).
- Wiegen alle Chemikalien, aber CaCl 2 und lösen sie in 1,8 l doppelt destilliertem Wasser in einem 2-l-Kolben auf.
- Das Medium mit Carbogen (95% O 2 /5% CO 2 ) für mindestens 5 min bei Äquilibrierung (pH: 7,4) unter magnetischem Rühren aufblasen.
- 0,74 g CaCl 2 · 2H 2 O zugeben und das Gesamtvolumen auf 2 l mit doppelt destilliertem Wasser auffüllen.
- Setzen Sie das Rühren fort und sprudeln Sie das Medium mit Carbogen für weitere 5 min.
- Filtern Sie die KHB durch einen 0,2 μm Filter, um kleine Partikel zu eliminieren, die die Mikrozirkulation des Herzens behindern können.
- Vorbereitung des Langendorff-Perfusionssystems
- Den gefilterten KHB in ein vorgewärmtes Wasserbad (38 ° C) stellen; Bleiben Sie mit Carbogen sprudeln, um einen Druck von 100 cmH 2 O Inside zu erzeugenDer KHB-Reservoir.
- Verbinden Sie den Vorratsbehälter mit der Glassäule, um 100 cmH 2 O hydrostatischen Druck für die Langendorff-Perfusion mit KHB herzustellen; Weiterhin die KHB in der Säule mit Carbogen sprudeln.
- Stellen Sie die Temperatur des Erwärmungssystems so ein, dass die Temperatur am Aortenkanülenauslass 37 ° C beträgt.
- Stellen Sie sicher, dass das Schlauchsystem blasenfrei ist.
- Oxygenieren Sie das KHB mit Carbogen für weitere 5 min, bis die PO 2 im KHB 500-600 mmHg erreicht (gemessen mit einem Blutgasanalysator).
- Stellen Sie das Perfusionssystem so auf, dass es bei einem konstanten Druck von 100 cmH 2 O oder bei konstantem Durchfluss von ca. 10-20 mL / min mit manueller Umschaltung läuft. Alternativ können Sie mit einem austauschbaren STH-Pumpenregler sofort in den Perfusionsmodus wechseln.
3. Isolierung und Kanülierung des Herzens
HINWEIS: Männliche Wistar-Ratten mit Körpergewichten von 300-350 g wurden verwendet, so dass die Größen der Herzen auf die vorgegossene Latexkappe abgestimmt waren. Ratten wurden entweder eine Ligation der linken Arterienabsenkung (KOPF) für 50 min, gefolgt von Reperfusion oder wurden sham betrieben. Einzelheiten der Methodik zur Induktion von Myokardinfarkt (MI) wurden an anderer Stelle angegeben 13 . Die umgekehrten Herzversuche an den Infarkttieren wurden 5 Tage nach der Operation durchgeführt.
- Anästhesieren von Ratten unter Verwendung eines Isofluranverdampfers (2% V / V), der mit einer Tierhaltekammer (20 L) verbunden ist.
- Übertragen Sie die Ratten auf eine Operationstabelle (nicht temperaturgesteuert), nachdem eine tiefe Anästhesie erreicht ist.
- Heben Sie die Haut und Muskeln knapp unter dem Brustbein mit Pinzette und schneiden Sie den unteren Rand der Rippen mit schweren Scheren.
- Mit feinen Scheren, machen Sie einen kleinen Schnitt in das Zwerchfell, am Rippenrand. Schneiden Sie die Rippen kaudal, um eine Klappe der gesamten ventralen Brustwand zu machen.
- Gönnen Sie sich das Herz mit dem DaumenNd Index und Mittelfinger und langsam heben Sie es nach oben, so dass die Herzgefäße leicht gestreckt werden.
- Heben Sie das Herz an, bis die Aorta vollständig ausgesetzt ist.
- Legen Sie das Herz in ein 100 ml-Becherglas mit 50 ml eiskaltem KHB (4 ° C) und verschieben Sie es in den Perfusionsapparat.
- Sofort das Herz über die Aorta auf eine tropfende Kanüle bringen und mit einer Naht (4-0) festziehen. Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz eindringen.
- Einen konstanten Perfusionsdruck (100 cmH 2 O) anwenden. Alternativ kann eine volle Durchflussrate (beginnend mit 20 mL / min) angewendet werden.
Anmerkung: Die Zeit von der Öffnung des Thorax bis zur Anbringung des Herzens an die Perfusionskanüle sollte etwa 3 min in den Händen eines erfahrenen Betreibers dauern.
4. umgekehrtes Herzmodell
- Die Aortenkanüle vorsichtig drehen, bis die hintere Wand des Herzens in Sicht ist.
- Das Bindegewebe mit einer Schere entfernenUm die Öffnung des linken Vorhofs auszusetzen, so dass es für die intraventrikuläre Kanülierung bereit ist.
- Setzen Sie den entleerten Latexballon an einen starren Katheter über den linken Vorhof in den linken Ventrikel.
- Den Ballon aufblasen, bis er die gesamte Ventrikelhöhle füllt (das Aufblasvolumen ist auf der Spritze vormarkiert).
- Invertiere das Herz, bis es umgedreht ist und es durch den intraventrikulären Ballonkatheter unterstützt.
- Wie in Abbildung 1C gezeigt , mechanisch stabilisieren Sie das umgekehrte Herz in einer aufrechten Position unter Verwendung des intraventrikulären Ballons mit einem starren Metallkatheter.
- Passen Sie die Position des Herzens an, um eine übermäßige Verdrehung der Aortenwurzel zu vermeiden.
- Den diastolischen Druck auf 3-5 mmHg einstellen (gemessen durch den intraventrikulären Ballon, siehe Abbildung 1C ).
- Beobachten Sie die epikardiale Oberfläche des Herzens und stellen Sie sicher, dass kleine Tröpfchen bilden.
- Legen Sie die Latexkappe oNto die Oberfläche des Herzens durch sanftes Drücken, um das ganze Herz mit den Fingern zu decken.
- Vergewissern Sie sich, dass die Latexkappe den größten Teil der ventrikulären Oberfläche bedeckt.
- Entfernen Sie die Luftblasen, falls vorhanden, in die Kappe und den Schlauch, indem Sie mit einer 1-ml-Spritze vorsichtig saugen.
- Stellen Sie die distale Öffnung des CT-Rohrs auf 10 cm unterhalb der horizontalen Höhe des Herzens ein.
HINWEIS: Diese Vorgehensweise sorgt für ein geringes Ansaugen durch negativen hydrostatischen Druck. - Sammeln Sie Tropfen von CT in einem 1,5 ml Sammelröhrchen, das in Eis gemischt 1: 1 mit NaCl gegeben ist. Sammle etwa 0,15-1,5 ml CT.
HINWEIS: Die Eis / NaCl-Mischung stabilisiert die Temperatur im Sammelröhrchen unter Null (ca. -4 ° C).
HINWEIS: Die Probenahmezeit hängt vom experimentellen Zweck ab. Die Durchflussrate des CT beträgt bei den koronar-ligierten Tieren (n = 11) etwa 27 ± 20 μl / min bei scheinoperierten Tieren (n = 3) und 100 ± 47 μl / min. - Wäge- und Snap-Freeze-CT-ProbenIn flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C für spätere Messungen.
5. Analyse der CT
- Verwenden Sie die CT-Flüssigkeit für die Analyse der Metaboliten, abhängig von der wissenschaftlichen Frage.
HINWEIS: Die in Fig. 2 und Fig. 3 gezeigten Daten wurden aus einer Konstantdruckperfusion (100 cmH & sub2; O) gesammelt und etwa 0,15-1,5 ml CT-Fluid wurden innerhalb einer Zeitspanne von 10 min gesammelt. Diese Zeit und das Volumen waren ausreichend für das Proteom (Minimum: 50 μl, Abbildung 2 ) 14 und HPLC (mindestens 20 μl, Abbildung 3 ) 15 Analyse verschiedener Purine.
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Representative Results
Das umgekehrte Herzmodell ermöglicht die Sammlung von Herz-Interstitial-Transudat in einem isolierten, retro-perfundierten Rattenherz ( Abbildung 1A -C ). Wenn sie bei einem konstanten Druck von 100 cmH 2 O perfundiert wurde, lag die Rate der interstitiellen Fluidbildung zwischen 17 und 147 & mgr; l / min, was 0,1 bis 1% des koronaren venösen Abwassers im isolierten Herzen betrug.
Der Proteingehalt der CT, gemessen mit dem Bicinchoninsäure-Test (BCA), betrug 1,08 ± 0,40 mg / ml (n = 6). Eine eindimensionale Gelelektrophorese-Analyse (SDS-PAGE) zeigte ein breites Spektrum von Proteinen, die im Herz-Transudat vorhanden waren ( Abbildung 2A ). Die zweidimensionale Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) wurde am CT aus dem Herzen durchgeführt, das 50 min Ischämie / Reperfusion ausgesetzt war. Wie gezeigt in In den untersuchten Proteinen waren 70,1% extrazelluläre Matrixproteine, 4,6% waren zelluläre Membranproteine, 17,2% waren zytoplasmatische Proteine und 2,3% waren nuklear Proteine ( Tabelle 1 ).
Purine sind seit langem als zentrale Signalmoleküle, die die Herz-Immunantwort, vasomotorischen Ton und Herz-Funktion, insbesondere nach ischämischen Verletzungen zu regulieren. Die CT-Sammlung erlaubt die Messung einer Vielzahl von Metaboliten, die in der kardialen interstitiellen Flüssigkeit unter pathophysiologischen Bedingungen, wie MI, vorhanden sind. Wie in Fig. 3 gezeigt , ist die Konzentration von AMP, GMP, NADP, Adenosin, Hypoxanthin und Harnsäure, gemessen durch HPLC, wo höher im ischämischen Herzen, was ähnlich ist, wie es zuvor mit anderen Methoden 16 ,Class = "xref"> 17
Tabelle 1: Liste der hochregulierten Proteine in der CT der ischämischen Herzen. CT aus ischämischen Herzen wurde durch 2D-DIGE analysiert und durch Proteomik identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Schematische Zeichnungen des umgekehrten Herzmodells. ( A ) Eine Aluminiumform wurde aus einem entsprechend geformten und bemessenen Rattenherz konstruiert. ( B ) Nach dem Eintauchen der Form in eine Latexlösung wurde eine Latexkappe mit einer Dicke von etwa 0,01 mm gegossen. ( C ) In einem LAntagorff Herzapparat, wurde das Herz über die Aorta mit einer Aortenkanüle perfundiert, die später in eine umgekehrte Position umgekehrt wurde und mechanisch von einem intraventrikulären Ballon in den linken Ventrikel gelegt wurde. Die Entwicklung des intraventrikulären Drucks wurde über einen Druckwandler überwacht. Die Latexkappe bedeckte fast 90% der Oberfläche des rechten und linken Ventrikels, und der Auslaß war mit Siliziumschlauch (ID = 0,2 mm) verbunden, wobei die distale Öffnung 10 cm unterhalb des Herzens lag. Dies erzeugte einen leicht negativen hydrostatischen Druck. Das Herz-Transsudat Wird gewöhnlich in ein eisgekühltes 1,5 ml-Röhrchen gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: PrOteomische Analyse der CT. Proteine im CT wurden durch SDS-PAGE ( A ) getrennt und durch 2D-DIGE-Analyse ( B ) identifiziert. Für (A) zeigen die Spuren 1-4 Herzproben aus einzelnen Herzen (1 und 2 = Schein, 3 und 4 = Infarkt). Für (B) wurde 2D-DIGE auf dem CT aus einem Infarktherz durchgeführt. Die Proteinidentität wurde durch Flüssigchromatographie (LC) -MS / MS 14 , 15 bestätigt . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Purine im CT. Verschiedene Purine, die in der CT vorhanden sind, wurden durch HPLC analysiert. Repräsentative HPLC-Läufe aus dem Schein (blau) und Infarkt (schwarz) Herz zeigen, dass das Infarktherz eine höhere zeigtInterstitielle Konzentration von AMP und Adenosin, aber nicht Hypoxanthin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das umgekehrte Herzmodell basiert auf der etablierten Langendorff-Herzperfusionstechnik 12 und wird durch einfaches Invertieren des Herzens in eine umgekehrte Position und Halten dieser Position unter Verwendung eines starren intraventrikulären Ballonkatheters durchgeführt. Auf diese Weise kann das kardiale interstitielle Transudat physisch von dem koronaren venösen Abflussperfusat getrennt werden, das durch die Schwerkraft von der Basis des Herzens 9 tropft. Die CT kann kontinuierlich mit Hilfe einer dünnen und flexiblen Latexkappe gesammelt werden, die auf der Oberfläche des gesamten Herzens angeordnet ist.
Die Methode ist einfach durchzuführen, mit minimalen Kosten zusätzlich zu der des Langendorff Gerätes. Dennoch sind einige Schritte technisch entscheidend für die Erzielung reproduzierbarer und stabiler Ergebnisse. Dazu gehören sicherzustellen, dass die Latexkappe richtig in die Form der Herzen passt und etwa 90% der Oberfläche der Ventrikel bedeckt, nicht die Vorhöfe. Die Zeit von excDas Herz vom Tier bis zur Aufführung der Retro-Perfusion sollte weniger als 3 min betragen, da eine verlängerte Ischämie das Risiko einer Veränderung des Herzmetabolismus und der Bildung von Herztransudat trägt. Der diastolische linksventrikuläre Druck, gemessen durch den intraventrikulären Ballon, sollte so eingestellt werden, dass er den ventrikulären Hohlraum (3-5 mmHg) füllt. Ein überblasender Ballon kann den Koronarfluss durch vaskuläre Kompression verändern. Die Probenamplitude (1,5 ml Röhrchen) sollte auf Eis gehalten werden, um jeglichen möglichen Abbau von Metaboliten und Proteinen von Interesse zu vermeiden.
Darüber hinaus sind erfolgreiche Experimente kritisch abhängig von guter manueller Handhabung während der Vorbereitung, Isolierung und Kanülierung des Herzens. Das erfordert Praxis. Um die Herzen vor ischämischen Schäden zu schützen, sollten alle Vorbereitungen mit eiskaltem KHB durchgeführt werden. Da die Grösse der Herzen zwischen den Ratten variieren können, ist es trotz ähnlicher Körpergewichte ratsam, Latexkappen mit leichtem zu versehenY verschiedene Dimensionen, die den verschiedenen Größen der Herzen entsprechen.
Die isolierte Umkehr-Herz-Methode wurde zuvor für die isolierte Ratte 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 und Meerschweinchenherz 16 beschrieben und wurde für verschiedene Zwecke verwendet. In unserer vorliegenden Beschreibung der Methodik haben wir einige Modifikationen an der experimentellen Einrichtung und der Probenverarbeitung eingeführt. Zum Beispiel ist die Kanülierung der Pulmonalarterie, wie sie von Deckere et al. 7 , wurde hier nicht durchgeführt, da die umgekehrte Position des Herzens eine potentielle Kontamination mit venösen Abwässerperfusat verhindert. Die Auffangvorrichtung für CT wurde durch Einführen eines leichten Unterdrucks durch Absenken der Öffnung der CT-Trennwannen vereinfachtNg bis 10 cm unter dem umgekehrten Herz. Dies erleichtert das sofortige Abkühlen der Transudatproben. Um die schnelle Abkühlung der Proben-CT zu gewährleisten, wurden die Sammelbecher auf eine Temperatur von -4 ° C vorgekühlt, indem sie in eine gleichvolumige Mischung aus Eis und NaCl ( dh ein Verhältnis von 1: 1) gegeben wurden. Dies erlaubte die schnelle Abkühlung der gesammelten CT-Proben.
Im Allgemeinen sollte man sich vor Augen halten, dass sich das isolierte Rattenherz von den in vivo physiologischen Bedingungen unterscheidet, da die interstitielle Fluidbildung höchstwahrscheinlich geringer ist als im salzperfundierten Herzen. Die durch das isolierte Herz gebildete CT kann daher nicht vollständig die wahre Zusammensetzung der in vivo interstitiellen Flüssigkeit nachahmen. Darüber hinaus erlaubt die vorliegende Einrichtung nicht den vollständigen Ausschluss einer potentiellen Kontamination mit venösen Abwässer-Perfusat. Da jedoch der venöse Auslaß an der Herzbasis (dem niedrigsten Niveau des aufrechten Herzens) liegt, glauben wir nichtDass die Kontamination zum Sammelprozess beiträgt.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode, um kardiale interstitielle Flüssigkeit zu untersuchen, die eine Vielzahl von Metaboliten und Proteinen enthält, die in die interstitielle Flüssigkeit durch Kardiomyozyten und nicht-kardiale Zellen, wie Immunzellen, Endothelzellen, vaskuläre glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Pericytes Herz-Interstitial-Transudat wird als Ergebnis des Fluidtransports über die endotheliale Barriere 10 zusammen mit einem kleinen Anteil an lymphatischem Fluid gebildet. Es enthält eine Mischung aus Herzmetaboliten 7 , löslichen Faktoren im interstitiellen Raum und Geheimnisse von Herz- und / oder Nicht-Herzzellen 9 . Daher tragen mehrere Zelltypen zur Bildung von CT bei. Darüber hinaus gibt es mehrere Faktoren, die die Rate der Bildung beeinflussen. Zuerst scheint der onkotische Druck eine wichtige Determinante zu sein, die trans-Capill reguliertDa die Zunahme des onkotischen Drucks durch Zugabe von Dextran oder Albumin zum Perfusionsmedium die Bildung von CT 9 , 10 signifikant reduziert hat. Zweitens erhöht die Zunahme der vaskulären Permeabilität während der Hypoxie 9 , 16 einschließlich MI die Extravasation des Perfusats und damit die Bildung von CT. Daher kann in zukünftigen Studien die Zunahme des onkotischen Drucks ein geeignetes Mittel sein, um das CT-Volumen zu minimieren, wodurch die angestrebten Moleküle von Interesse angereichert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde gefördert von NSFC 81570244, FoKo 23/2013 und SFB 1116 / B01 und vom Herz-Kreislauf-Forschungsinstitut Düsseldorf (CARID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
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