Summary
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco dal cuore isolato del ratto perfuso. Per separare fisicamente il transudato interstiziale dal perfusato effluente venoso coronarico, il cuore perfuso di Langendorff viene invertito e il liquido intradito (transversato) formato sulla superficie cardiaca viene raccolto usando un tappo morbido in lattice.
Abstract
Il presente protocollo descrive un approccio unico che consente la raccolta del transudato cardiaco (CT) dal cuore isolato del ratto perfuso-salino. Dopo l'isolamento e la perfusione retrograda del cuore secondo la tecnica Langendorff, il cuore viene invertito in posizione verticale e stabilizzato meccanicamente da un catetere a palloncino inserito nel ventricolo sinistro. Quindi, un cappuccio di lattice sottile - precedentemente gettato per abbinare la dimensione media del cuore del topo - è posto sopra la superficie epicardica. L'uscita del tappo in lattice è collegata al tubo di silicone, con l'apertura distale 10 cm sotto il livello base del cuore, creando una leggera aspirazione. Il CT prodotto continuamente sulla superficie epicardica è raccolto in flaconi raffreddati al ghiaccio per ulteriori analisi. Il tasso di formazione di CT variava da 17 a 147 μL / min (n = 14) nei cuori di controllo e infarto, che rappresenta lo 0,1-1% del perfusato venoso effusivo coronarico. Analisi proteomica e alto perfoLa cromatografia liquida rmance (HPLC) ha rivelato che la CT raccolta contiene un ampio spettro di proteine e metaboliti purinergici.
Introduction
L'insufficienza cardiaca (HF) è la principale causa di morte negli esseri umani in tutto il mondo 1 . L'HF si verifica spesso a causa della miocardite, insulti ischemici al miocardio e rimodellamento ventricolare sinistro, che porta al progressivo deterioramento della funzione contrattile cardiaca e alla qualità della vita dei pazienti. Sebbene i progressi nella cardiologia e nella chirurgia cardiaca abbiano notevolmente ridotto la mortalità della HF, essi servono semplicemente come "ritardatori" transitori di un processo di malattia inevitabilmente progressivo che ha una grave morbosità. Pertanto, l'attuale mancanza di trattamento efficace sottolinea la necessità di identificare nuovi bersagli molecolari che possono impedire o addirittura invertire l'HF. Ciò include cambiamenti nella matrice extracellulare, risposta immunitaria incontrollata cardiaca e interazioni tra cellule cardiache e non cardiache 2 .
È importante riconoscere che il microambiente che le cellule cardiache sono esposte a direcForma la risposta immunitaria e rigenerativa del cuore infortunato. Nel cuore isolato, salato-perfuso, CT viene generato sulla superficie del cuore sotto forma di piccole gocce derivate dallo spazio fluido interstiziale ( cioè, microambiente), sia in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 3 , 4 , 5 . Pertanto, l'analisi del CT ( cioè il fluido interstiziale) può aiutare a identificare fattori che regolano il metabolismo cardiaco e la funzione contrattile 6 o influenzano le funzioni delle cellule immunitarie dopo la migrazione nel cuore ferito. Potenzialmente, ciò può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento dell'HF.
La raccolta di CT da cuori murine è tecnicamente impegnativa. Nei corpi regolari di Langendorff, la collezione esclusiva di CT è difficile perché la miscela di CT con coronarL'effluente venoso effusivo diluisce imprevedibilmente qualsiasi concentrazione di metaboliti / enzimi liberati dallo spazio interstiziale. Una possibile strategia per superare questa limitazione è quella di escludere l'effluente venoso cannulando il polmone e contemporaneamente legando la vena polmonare 7 . Tuttavia, questo metodo affronta difficoltà associate alla cannulazione e alla legatura dell'arteria e della vena polmonare, causando perdite potenziali di effluenti venosi nel transudato cardiaco. Il concetto di utilizzo di un modello di cuore inverso è stato introdotto per la prima volta dal gruppo di Kammermeier, che ha invertito il cuore isolato e perfuso in una posizione capovolta e ha posto un cappuccio di lattice sottile sulla superficie epicardica per continuare a campionare CT senza la contaminazione dell'effetto venoso 8 , 9 . Utilizzando questa procedura, CT è stato dimostrato di fornire una misura molto sensibile dei metaboliti liberati dal cuore 9 ,Il trasferimento capillare di acidi grassi 8 e le particelle virali 10 .
Più recentemente, i fattori paracrini che possono regolare la risposta immunitaria locale e aumentare l'angiogenesi cardiaca 11 sono stati implicati negli effetti benefici della terapia basata sulle cellule staminali per le malattie cardiache. L'analisi della CT nel cuore inverso può aiutare a identificare chimicamente questi fattori paracrini individuali. Inoltre, la CT può aiutare a identificare i fattori coinvolti nell'attivazione in vivo di cellule immunitarie nel cuore.
La descrizione dettagliata della raccolta CT dalla superficie del cuore, fornita qui, è sperimentalmente utile per i ricercatori che studiano l'interazione di cellule immunitarie, fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti in relazione alla funzione cardiaca globale. Come detto sopra, il fluido interstiziale trasporta le informazioni per la comunicazione cellulare da cellule nel cuore, whChe può essere convenientemente valutato dalla raccolta di CT. La descrizione tecnica dettagliata, incluso un protocollo video su come raccogliere CT dal cuore invertito, dovrebbe facilitare l'applicazione futura di questa tecnica unica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'agenzia locale di regolamentazione ( LANUV di Nordrhein-Westfalen, Germania) e sono state eseguite secondo le linee guida dell'uso animale. Gli animali sono stati nutriti con una dieta standard di chow e hanno ricevuto acqua di rubinetto ad libitum . Tutte le apparecchiature e le sostanze chimiche necessarie per ogni fase dell'esperimento sono disponibili nella Tabella dei Materiali .
1. Preparazione del tappo in lattice e del palloncino intraventricolare
- Fai uno stampo in alluminio usando una fresatrice che corrisponda alla dimensione media del cuore del topo (peso corporeo di 300-350 g). Pellicola lo stampo con carta smerigliatrice superfine (10/0).
NOTA: Le metriche dettagliate dello stampo sono mostrate in Figura 1A . - Fissare verticalmente il collo dello stampo in alluminio alla fresatrice per preparare il tappo in lattice.
NOTA: La macchina di fresatura provoca la rotazione dello stampo lentamente. In alternativa, è possibile utilizzare un motore elettrico. li> - Versare 20 ml di lattice liquido (acquistato in commercio, vedere la tabella dei materiali ) in un bicchiere di vetro da 50 ml.
- Abbassare lo stampo fino a quando l'intero corpo dello stampo è immerso nella soluzione del lattice.
- Sollevare lentamente lo stampo (5 cm / min) mentre ruota.
- Continuare a ruotare lo stampo per altri 15 minuti, finché il lattice sulla superficie dello stampo non si solidifica.
- Aggiungere circa 1 g di polvere di talco alla superficie dello stampo (già coperto da una sottile pellicola di lattice) per evitare danni durante la staccatura.
- Separare delicatamente con le dita il tappo in lattice già asciutto dalla superficie dello stampo; Il tappo di lattice è ora pronto per l'uso ( figura 1B ).
- Collegare l'uscita del tappo in lattice a tubo di silicio da 15 cm (ID = 0,2 mm), utilizzata in seguito per la raccolta di CT.
- Riempire il pallone ventricolare del lattice con acqua e fissarlo saldamente su una cannula metallica a forma di L collegata ad una siringa da 1 ml, ricoperta d'acqua (> Figura 1C).
NOTA: questa verrà utilizzata per assicurare il posizionamento verticale del cuore (vedi sotto). - Assicurarsi che il palloncino sia ermetico eseguendo diverse prove di deflazione / gonfiaggio con la siringa attaccata da 1 ml.
- Collegare la cannula, tramite una sosta a tre vie, a un trasduttore di pressione per la misurazione futura della pressione sviluppata intraventricolare ( Figura 1C ).
2. Preparazione del Krebs-Henseleit Buffer (KHB) e del Langendorff Perfusion System
- Impostare un sistema di perfusione Langendorff utilizzando un flusso costante (guidato da una pompa a rulli) o una pressione costante (generata da una pressione statica in una colonna di vetro).
NOTA: i dettagli del preparato cardiaco Langendorff sono stati descritti in precedenza 12 . - Preparare 2 L di una KHB modificata (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgS04,7H2O, 1,21 K 2 HPO 4 2 · 2H 2 O, 24,88 NaHCO 3 , 8,30 D-glucosio e 2,0 piruvato di sodio).
- Pesare tutte le sostanze chimiche ma CaCl 2 e sciogliere in 1,8 L di acqua doppia-distillata in un pallone da 2 L.
- Bolle il mezzo con carbogeno (95% O 2 /5% CO 2 ) per almeno 5 min per equilibrare (pH: 7.4) sotto agitazione magnetica.
- Aggiungere 0,74 g di CaCl2.2H2O e portare il volume totale a 2 L con acqua doppia distillata.
- Continuare a mescolare e far bollire il mezzo con carbogeno per altri 5 minuti.
- Filtrare il KHB attraverso un filtro da 0,2 μm per eliminare piccole particelle che potrebbero ostacolare la microcircolazione del cuore.
- Preparazione del sistema di perfusione Langendorff.
- Posizionare il KHB filtrato in un bagno d'acqua pre-riscaldato (38 ° C); Continuare a bolle con carbogen per generare una pressione di 100 cmH 2 O insidE il serbatoio KHB.
- Collegare il serbatoio alla colonna di vetro per stabilire una pressione idrostatica da 100 cmH 2 O per la perfusione Langendorff con KHB; Continuare a bolle il KHB all'interno della colonna con carbogen.
- Regolare la temperatura del sistema di riscaldamento in modo che la temperatura alla cannula aortica sia di 37 ° C.
- Assicurarsi che il sistema di tubazioni sia privo di bolle.
- Ossigenare KHB con carbogeno per altri 5 minuti, finché la PO 2 nella KHB non raggiunge i 500-600 mmHg (misurata da un analizzatore di sangue-gas).
- Impostare il sistema di perfusione per funzionare a una pressione costante di 100 cmH 2 O o ad un flusso costante di circa 10-20 ml / min usando la commutazione manuale. In alternativa, utilizzare un regolatore di pompa STH intercambiabile per passare immediatamente alla modalità di perfusione.
3. Isolamento e cannulazione del cuore
NOTA: Ratti maschi Wistar con pesi corporei di 300-350 g sono stati utilizzati in modo che le dimensioni dei cuori abbinassero il tappo di lattice pre-cast. I ratti sono stati sottoposti a una legatura della discendenza arteriosa sinistra (LAD) per 50 min, seguita da reperfusione o sono stati operati con un tosatore. Dettagli della metodologia per l'induzione dell'infarto miocardico (MI) sono stati riportati altrove 13 . Gli esperimenti in cuore inverso negli animali infarto sono stati eseguiti 5 giorni dopo l'operazione.
- Anestetizzare i ratti utilizzando un vaporizzatore isoflurano (2% V / V) collegato ad una camera di contenimento animale (20 L).
- Trasferire i ratti ad una tabella di funzionamento (non a temperatura controllata) dopo che si raggiunge l'anestesia profonda.
- Sollevare la pelle e il muscolo appena sotto lo sterno utilizzando le pinze e tagliare intorno al margine inferiore delle costole con forbici pesanti.
- Usando forbici belle, fare un piccolo taglio nel diaframma, sul margine della nervatura. Tagliare le nervature caudalmente per fare una falda di tutta la parete ventrale della cassa.
- Afferrare delicatamente il cuore con il pollice aIndice e dita medie e sollevarlo lentamente in modo che i vasi cardiaci diventino leggermente allungati.
- Accendere il cuore fino a quando l'aorta è completamente esposta.
- Collocare il cuore in un bicchiere da 100 ml contenente 50 ml di KHB ghiaccio freddo (4 ° C) e trasferirlo all'apparato di perfusione.
- Immediatamente montare il cuore attraverso l'aorta su una cannula gocciolante e fissarlo saldamente con una sutura (4-0). Evitare le bolle d'aria che entrano nel cuore.
- Applicare pressione costante di perfusione (100 cmH 2 O). In alternativa, è possibile applicare una portata totale (a partire da 20 mL / min).
Nota: il tempo dall'apertura del torace all'attacco del cuore alla cannula di perfusione dovrebbe durare circa 3 minuti nelle mani di un operatore esperto.
4. Modello inverso del cuore
- Ruotare delicatamente la cannula aortica finché la parete posteriore del cuore non è visibile.
- Rimuovere il tessuto connettivo con le forbiciPer esporre l'apertura dell'atrio sinistro, rendendola pronta per la cannulazione intraventricolare.
- Inserire il palloncino deflato in lattice attaccato ad un catetere rigido attraverso l'atrio sinistro nel ventricolo sinistro.
- Gonfiare il pallone fino a riempire l'intera cavità ventricolare (il volume di gonfiaggio è pre-contrassegnato sulla siringa).
- Invertire il cuore fino a quando non è capovolto, sostenendolo dal catetere a palloncino intraventricolare.
- Come dimostrato nella figura 1C , stabilizzare meccanicamente il cuore invertito in posizione verticale usando il pallone intraventricolare con un catetere metallico rigido.
- Regolare la posizione del cuore per evitare una torsione eccessiva della radice aortica.
- Regolare la pressione diastolica a 3-5 mmHg (misurata dal palloncino intra-ventricolare, vedere la Figura 1C ).
- Osservare la superficie epicardica del cuore e assicurare che piccole gocce formino.
- Posizionare il tappo in lattice oSulla superficie del cuore premendolo delicatamente per coprire l'intero cuore usando le dita.
- Assicurarsi che il tappo in lattice copre la maggior parte della superficie ventricolare.
- Rimuovere eventualmente le bolle d'aria, all'interno del tappo e del tubo, facendo pipistrare con una siringa da 1 ml.
- Regolare l'apertura distale del tubo di rilascio CT a 10 cm sotto il livello orizzontale del cuore.
NOTA: Questa procedura assicura una leggera suzione da pressione idrostatica negativa. - Raccogliere gocce di CT in un tubo di raccolta da 1,5 ml posto in ghiaccio mescolato 1: 1 con NaCl. Raccogliere circa 0,15-1,5 ml di CT.
NOTA: La miscela di ghiaccio / NaCl stabilizza la temperatura nel tubo di raccolta sotto zero (circa -4 ° C).
NOTA: Il tempo di campionamento dipende dallo scopo sperimentale. La velocità di flusso della CT è di circa 27 ± 20 μL / min negli animali trattati con tosse (n = 3) e 100 ± 47 μL / min per gli animali coronarici (n = 11). - Pesare e congelare i campioni CTIn azoto liquido e conservarli a -80 ° C per le misurazioni successive.
5. Analisi della CT
- Utilizzare il fluido CT per l'analisi dei metaboliti, a seconda della domanda scientifica.
NOTA: I dati mostrati in Figura 2 e Figura 3 sono stati raccolti da una perfusione a pressione costante (100 cmH 2 O) e circa 0,15-1,5 ml di liquido CT è stato raccolto entro un periodo di 10 minuti. Questa volta e volume erano sufficienti per la proteomica (minima: 50 μL; Figura 2 ) 14 e HPLC (minimo: 20 μL; Figura 3 ) 15 analisi di vari purini.
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Representative Results
Il modello a forma di cuore inversa permette di raccogliere il transudato interstiziale cardiaco in un cuore ratto isolato e retro-perfuso ( Figura 1A- C ). Quando si perfusione ad una pressione costante di 100 cmH2O, la velocità di formazione di fluidi interstiziali variava tra 17 e 147 μL / min, pari allo 0,1-1% dell'effluente venoso coronarico nel cuore isolato.
Il contenuto proteico della TC, misurato con l'analisi dell'acido bicinconico (BCA), è risultato essere 1,08 ± 0,40 mg / ml (n = 6). L'analisi di elettroforesi a gel di una dimensione (SDS-PAGE) ha rivelato un ampio spettro di proteine presenti nel transudato cardiaco ( Figura 2A ). L'elettroforesi a gel di differenza di fluorescenza bidimensionale (2D-DIGE) è stata eseguita su CT dal cuore sottoposto a 50 min di ischemia / reperfusione. Come mostrato in Tra le proteine identificate, il 70,1% erano proteine della matrice extracellulare, il 4,6% erano proteine della membrana cellulare, il 17,2% le proteine citoplasmatiche e il 2,3% erano nucleari Proteine ( Tabella 1 ).
Le purine sono da tempo considerate molecole di segnalazione centrali che regolano la risposta immunitaria cardiaca, il tono vasomotore e la funzione cardiaca, in particolare dopo lesioni ischemiche. La raccolta di CT consente la misura di una varietà di metaboliti presenti nel liquido interstitiale cardiaco in condizioni patofisiologiche, come ad esempio MI. Come mostrato nella figura 3 , la concentrazione di AMP, GMP, NADP, adenosina, ipoxantina e acido urico misurata mediante HPLC dove maggiore nel cuore ischemico, che è simile ai risultati precedentemente riportati utilizzando altri metodi 16 ,Class = "xref"> 17.
Tabella 1: Elenco di proteine regolate nella CT dei cuori ischemici. La CT da cuore ischemico è stata analizzata da 2D-DIGE e identificata dalla proteomica. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1: Disegni schematici del modello di cuore inverso. ( A ) Uno stampo in alluminio è stato costruito da un cuore a ratto opportunamente sagomato e formato. ( B ) Dopo aver immerso lo stampo in soluzione di lattice, è stato lanciato un cappuccio in lattice, con uno spessore di circa 0,01 mm. ( C ) In un LAngendorff, il cuore è stato perfuso attraverso l'aorta usando una cannula aortica, che è stata successivamente invertita in una posizione verticale e sostenuta meccanicamente da un palloncino intra-ventricolare collocato nel ventricolo sinistro. Lo sviluppo della pressione intraventricolare è stato monitorato tramite un trasduttore di pressione. Il coperchio del lattice ha coperto quasi il 90% della superficie del ventricolo destro e sinistro, e la presa è stata collegata al tubo di silicone (ID = 0,2 mm), con l'apertura distale 10 cm sotto la base del cuore. Questa generava una pressione idrostatica leggermente negativa. Il transudato cardiaco Viene solitamente raccolto in un tubo da 1,5 ml raffreddato al ghiaccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: PrAnalisi otteomica della CT. Le proteine nella TC sono state separate da SDS-PAGE ( A ) e identificate mediante analisi 2D-DIGE ( B ). Per (A), le righe 1-4 indicano campioni cardiaci da singoli cuori (1 e 2 = sham; 3 e 4 = infarto). Per (B), 2D-DIGE è stato eseguito sulla CT da un cuore infarto. L'identità proteica è stata confermata mediante cromatografia liquida (LC) -MS / MS 14 , 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Purine nella CT. Le varie purine presenti nella CT sono state analizzate mediante HPLC. Rappresentante HPLC corre dall'esposizione cardiaca (blu) e infarto (nero) che il cuore infarto presenta un livello superioreConcentrazione interstiziale di AMP e adenosina, ma non ipoxantina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello di cuore invertito si basa sulla ben nota tecnica di perfusione del cuore Langendorff 12 e viene eseguita semplicemente invertendo il cuore in una posizione capovolta e tenendo questa posizione utilizzando un rigido catetere a palloncino intra-ventricolare. In tal modo, il transudato interstiziale cardiaco può essere fisicamente separato dal perfusato effluente venoso coronarico, gocciolando per gravità dalla base del cuore 9 . La CT può essere raccolta in continuo per mezzo di un tappo di lattice sottile e flessibile posto sulla superficie dell'intero cuore.
Il metodo è facile da eseguire, con un costo minimo in aggiunta a quello dell'apparecchio Langendorff. Tuttavia, alcuni passaggi sono tecnicamente critici per ottenere risultati riproducibili e stabili. Queste includono assicurare che il tappo del lattice si adatta correttamente alla forma dei cuori e copre circa il 90% della superficie dei ventricoli, non l'atria. Il tempo da excIl cuore dell'animale fino alla prestazione della retro-perfusione dovrebbe essere inferiore a 3 minuti, poiché l'ischemia prolungata ha il rischio di alterare il metabolismo cardiaco e la formazione del transudato cardiaco. La pressione ventricolare sinistra diastolica, misurata dal palloncino intra-ventricolare, dovrebbe essere impostata per riempire la cavità ventricolare (3-5 mmHg). Un palloncino sovra-gonfiato può alterare il flusso coronarico mediante compressione vascolare. Il flaconcino di campionamento (tubo da 1,5 ml) deve essere mantenuto su ghiaccio per evitare possibili degradazioni dei metaboliti e delle proteine di interesse.
Inoltre, gli esperimenti di successo sono criticamente dipendenti dalla buona manipolazione manuale durante la preparazione, l'isolamento e la cannulazione del cuore. Ciò richiede la pratica. Per proteggere i cuori da danno ischemico, tutte le preparazioni devono essere eseguite con KHB ghiacciata. Poiché le dimensioni dei cuori possono variare tra i ratti, nonostante i pesi corporei simili, si consiglia di preparare cappellini in lattice con lieveDiverse dimensioni che si adattano alle diverse dimensioni dei cuori.
Il metodo isolato a cuore inverso è stato descritto in precedenza per il ratto isolato 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 e il cuore di cavie 16 ed è stato utilizzato per scopi diversi. Nella nostra attuale descrizione della metodologia, abbiamo introdotto alcune modifiche alla configurazione sperimentale e al processo di campionamento. Ad esempio, la cannulazione dell'arteria polmonare, come introdotta da Deckere et al. 7 , non è stata eseguita qui, in quanto la posizione invertita del cuore impedisce la contaminazione potenziale con effusione venosa perfusata. Il dispositivo di raccolta per CT è stato semplificato introducendo una leggera pressione negativa abbassando l'apertura dei tubi di rilascio CTFino a 10 cm sotto il cuore inverso. Questo rende più facile raffreddare immediatamente i campioni transudati. Per garantire il rapido raffreddamento del campione CT, le tazze di raccolta sono state precede- mate a una temperatura di -4 ° C collocandole in una miscela di ghiaccio e NaCl uguale a volume ( cioè un rapporto 1: 1). Ciò ha permesso il raffreddamento rapido dei campioni CT raccolti.
In generale, si deve tenere presente che il cuore del ratto isolato differisce dalle condizioni fisiologiche in vivo , in quanto la formazione di fluidi interstiziali è molto probabilmente inferiore a quella del cuore profuso dalla soluzione salina. La CT formata dal cuore isolato può quindi non imitare completamente la vera composizione del fluido interstiziale in vivo . Inoltre, la configurazione attuale non consente l'esclusione completa della contaminazione potenziale con perfusato venoso effluente. Tuttavia, dal momento che l'uscita venosa si trova alla base cardiaca (il livello più basso del cuore retto), non crediamoChe la contaminazione contribuisce al processo di raccolta.
Il presente protocollo descrive un metodo unico per campionare il liquido interstiziale cardiaco, che contiene una moltitudine di metaboliti e proteine rilasciate nel fluido interstiziale da cardiomiociti e cellule non cardiache, quali cellule immunitarie, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari, fibroblasti e periciti. Il transudato interstiziale cardiaco è formato come risultato del trasporto fluido attraverso la barriera endoteliale 10 , unitamente ad una piccola frazione di liquido linfatico. Contiene una miscela di metaboliti cardiaci 7 , fattori solubili nello spazio interstiziale e segreti di cellule cardiache e / o non cardiache 9 . Pertanto, diversi tipi di cellule contribuiscono alla formazione di CT. Inoltre, ci sono diversi fattori che influenzano il tasso di formazione. In primo luogo, la pressione oncotica sembra essere un determinante importante che regola la trans-capillPoiché l'aumento della pressione oncotica aggiungendo il dextran o l'albumina al mezzo di perfusione ha ridotto significativamente la formazione di CT 9 , 10 . In secondo luogo, un aumento della permeabilità vascolare durante l'ipossia 9 , 16 , compreso MI, aumenta l'estravasi del perfusato e quindi la formazione di CT. Pertanto, in studi futuri, l'aumento della pressione oncotica può essere un mezzo idoneo a ridurre al minimo il volume di CT, arricchendo così le molecole di interesse.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da NSFC 81570244, FoKo 23/2013 e SFB 1116 / B01 e dall'Istituto di Ricerca Cardiovascolare Düsseldorf (CARID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
| Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
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