Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

doi: 10.3791/55870 Published: June 19, 2017

Summary

هنا، نحن تصف تطبيق الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) لتحليل الفجوة تقاطع تعتمد على مكوك من ميرنا. على النقيض من الأساليب المطبقة عادة، 3D-فراب يسمح لكمية النقل بين الخلايا من الحمض النووي الريبي الصغيرة في الوقت الحقيقي، مع ارتفاع القرار المكاني والزماني.

Abstract

الرنا الصغيرة المضادة للعدوى، مثل ميرنا و سيرنا، تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلوية وعلم الأمراض، وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كعوامل علاجية في علاج العديد من الأمراض. ويستند تطوير استراتيجيات جديدة ومبتكرة للعلاج ميرنا / سيرنا على معرفة واسعة من الآليات الكامنة. وتشير البيانات الأخيرة إلى أن رنا صغيرة يتم تبادلها بين الخلايا بطريقة تعتمد على تقاطع الفجوة، وبالتالي إحداث آثار تنظيمية الجينات في الخلية المتلقية. وتستخدم التقنيات البيولوجية الجزيئية وتدفق تحليل سايتوميتريك عادة لدراسة التبادل بين الخلايا من ميرنا. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر القرار الزماني العالي، وهو أمر ضروري عند دراسة الفجوة تدفق وظيفية من الجزيئات. لذلك، للتحقيق في تأثير ميرنا / سيرنا كما جزيئات الإشارات بين الخلايا، وهناك حاجة إلى أدوات جديدة من شأنها أن تسمح لتحليل هذه الرنا الصغيرة على المستوى الخلوي. يصف هذا البروتوكول أبتقطيع الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) المجهري لتوضيح التبادل تعتمد على تقاطع الفجوة من جزيئات ميرنا بين خلايا القلب. الأهم من ذلك، وهذا نهج التصوير الخلية الحية مباشرة وغير الغازية يسمح لتصور وتقدير من الفجوة التكتيكية الوصفي من رنا صغيرة فلورزنتلي المسمى في الوقت الحقيقي، مع قرار المكاني والزماني عالية. البيانات التي تم الحصول عليها من قبل 3D-فراب تؤكد مسار جديد من تنظيم الجينات بين الخلايا، حيث رنا الصغيرة بمثابة الجزيئات إشارة داخل الشبكة بين الخلايا.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الرنا الصغيرة غير المشفرة هي لاعبين مهمين في تنظيم الجينات الخلوية. وتتكون هذه الجزيئات من 20-25 النيوكليوتيدات التي ترتبط مرنا الهدف محددة، مما يؤدي إلى انسداد الترجمة أو إلى مرنا تدهور 1 ، 2 . العملية التنظيمية الجينية التي تقوم بها الرنا الصغيرة، مثل ميرنا و سيرنا، هو آلية المحافظة للغاية التي تم العثور عليها في العديد من الأنواع المختلفة 3 . على وجه الخصوص، جزيئات ميرنا ذات أهمية حاسمة لمجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك الانتشار، والتمايز، والتجديد 4 ، 5 . وبالإضافة إلى ذلك، يعزى إلى عدم انتظام التعبير ميرنا لكثير من الاضطرابات المرضية. في المقابل، وقد ثبت ميرناس لتكون مناسبة كما المؤشرات الحيوية للتشخيص وكعوامل علاجية للعلاج الجيني 6 ، 7

تقاطعات الفجوة (غس) هي هياكل البروتين المتخصصة في غشاء البلازما من اثنين من الخلايا المجاورة التي تسمح التبادل المنتشر للجزيئات مع الوزن الجزيئي تصل إلى 1 كيلو دالتون. وقد تبين أنها مهمة لتطوير الأنسجة، والتمايز، والموت الخلية، والاضطرابات المرضية مثل السرطان أو أمراض القلب والأوعية الدموية 8 ، 9 ، 10 . وقد وصفت عدة جزيئات بأنها قادرة على عبور قنوات جي جي، بما في ذلك الأيونات، الأيض، والنيوكليوتيدات. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على غس أيضا لتوفير مسار للحركة بين الخلايا من الرنا الصغيرة 11 ، 12 . وهكذا، ميرناس يمكن أن تعمل ليس فقط داخل الخلية التي يتم إنتاجها، ولكن أيضا داخل الخلايا المتلقية. هذا يسلط الضوء على دور ميرناس في نظام التنبيه إشارة بين الخلايا. وفي الوقت نفسه، تظهر البياناتأن الفجوة التواصل بين الخلايا اتصال بين يرتبط ارتباطا وثيقا وظيفة ميرنا. بسبب تأثير كبير من ميرنا و غس على التوازن الأنسجة، علم الأمراض، والتشخيص، وفهم شامل لوظيفة غس والديناميات بين الخلايا ذات الصلة ميرنا تساعد على توضيح آليات الأمراض القائمة على ميرنا ووضع استراتيجيات جديدة ل ميرنا العلاجات.

اعتمادا على مدى الفجوة اقتران الوصلي، ونقل جزيئات ميرنا بين الخلايا يمكن أن تكون عملية سريعة جدا. لذلك، هناك حاجة إلى منهجية تسمح التصور وكمية الحركة بين الخلايا السريعة من هذه الجزيئات تشوير التنظيمية. عادة، وقد تم تطبيق التدفق الخلوي والتقنيات البيولوجية الجزيئية لإثبات المكوك من الرنا الصغيرة 11 ، 12 ، 13 ، 14 . ومع ذلك، بدلا من ميكروس فرابنسخ، هذه النهج تفتقر إلى القرار الزماني عالية، وهو إلزامي عند تحليل تبادل ميرنا عبر غس. وعلاوة على ذلك، فراب المجهري هو أقل الغازية، وبالتالي يمثل قوية ورواية الخلية الحية تقنية التصوير لتقييم تبادل غ تعتمد على جزيئات في عدة أنواع الخلايا 15 ، 16 ، 17 .

هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف تطبيق 3D-فراب لتقييم ميرنا المكوك بين الخلايا العضلية. لهذا الغرض، تم ترانزفكتد كارديوميوسيتس مع ميرنا فلورزنتلي المسمى. وكانت خلية ملحوظ مع هذا ميرنا فوتوبلاشد، وسجل فجوة ميرنا الوريد إعادة تدفق من الخلايا المجاورة سجلت بطريقة تعتمد على الوقت. القرار الزماني العالي للتجارب فراب يوفر إمكانية لإجراء دراسات الحركية لتقييم دقيق لنقل بين ميرنا و سيرنا بين الخلايا الحية. Moreoحيث يمكن تبادل رنا صغيرة عن طريق آليات مختلفة مع حركية مختلفة للغاية، يمكن أن يساعد المجهر فراب لتوضيح مدى مشاركة غس في عمليات المكوكية ذات الصلة 18 . وبالإضافة إلى ذلك، 3D-فراب يمكن استخدامها للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية والمرضية في نفاذية غ وأثره على نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة 15 ، 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم تنفيذ جميع الخطوات في هذا البروتوكول التي تنطوي على الفئران حديثي الولادة في المبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوان من المركز الطبي جامعة روستوك.

1. إعداد أطباق ثقافة الخلية والمتوسطة للثقافة كارديوميوسيت

  1. معطف لوحة ثقافة الخلية مع 0.1٪ الجيلاتين في برنامج تلفزيوني واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إزالة الجيلاتين والسماح لها لتجف تحت العقيمة تدفق الهواء الصفحي.
  2. إعداد وسط ثقافة الخلية تتألف من 50 مل من دمم تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). قبل دافئ إلى 37 درجة مئوية.

2. عزل كارديوميوسيتس حديثي الولادة

  1. التضحية الفئران حديثي الولادة (1-2 أيام من العمر) بواسطة قطع الرأس مع مقص العقيمة وفتح الصدر على طول القص. إزالة القلب باستخدام ملقط أثناء الضغط قليلا على الصدر معا ونقل القلب إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على الجليد الباردة هبس(بدون كا 2 + و مغ 2+ ).
  2. إزالة الأنسجة غير القلبية وأوعية أكبر باستخدام ملقط معقم. نقل قلوب تنظيفها في أنبوب 1.5 مل تحتوي على الجليد هبس الباردة. استخدام الحد الأقصى من 5 قلوب لكل أنبوب للهضم الأنزيمي.
  3. يخلط القلوب مع مقص صغير في <0.5 إلى 1 مم³ قطعة.
  4. غسل قلوب المفروم مع هبس مرتين عن طريق الشفط / إضافة هبس باستخدام ماصة ميكروليتر 1 مل. إزالة هبس تماما قبل إضافة الإنزيمات.
  5. للحصول على الهضم الأنزيمي من قلوب حديثي الولادة، استخدم عدة متوفرة تجاريا واتبع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد ). هز الأنبوب الذي يحتوي على قلوب المفروم كل 5 دقائق أثناء احتضان مع الانزيمات عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
  6. البذور علقت الخلايا على غير المغلفة أطباق ثقافة الخلية التي تحتوي على خلية ثقافة المتوسطة لمدة 1.5-2 ساعة للسماح للالتزام من جزء غير كارديوميوسيت. كرر هذه الخطوة إذا كان نقاء عاليةمن كارديوميوسيتس. إذا رغبت في ذلك، مزيد من الثقافة الجزء غير كارديوميوسيت.
    ملاحظة: لتعليق خلية من 15 قلوب، يمكن إجراء خطوة ما قبل الطلاء على 75 سم ² قوارير ثقافة الخلية. عادة، ~ 5 × 10 5 خلايا يتم الحصول عليها من قلب حديثي الولادة.
  7. جمع طاف في أنبوب مخروطي 15 مل وطرد مركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من خلية ثقافة المتوسطة.
  8. عد الخلايا مع عدادة الكريات غرفة نيوباور، أو استخدام طريقة مكافئة.
  9. لوحة كارديوميوسيتس معزولة على لوحات 6 جيدا مع كثافة 3 × 10 5 خلايا / سم ². احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
    ملاحظة: اختياريا، يمكن أيضا الخلايا ترانزفكتد في هذه المرحلة. ومع ذلك، لوحظ زيادة القدرة على البقاء عندما تم استزراع الخلايا لمدة يوم واحد قبل أن يتعرض لل إليكتروبوراتيون.

3. ترنسفكأيشن مع ميرنا فلورزنتلي المسمى

  1. ما قبل(انظر الخطوة 1.2) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو جهاز مماثل.
  2. إعداد حل 20 ميكرومتر الأسهم من ميرنا الفلورسنت في المياه المعاد خالية من ريبونوكلياز.
  3. إعداد إليكتروبوراتيون عازلة تحتوي على 90 ملي نا 2 هبو 4 ، 90 ملي ناه 2 بو 4 ، 5 ملي بوكل، 10 ملي مغكل 2 ، و 10 ملي سكسينات الصوديوم وضبط درجة الحموضة إلى 7.2، يمكن تخزين العازلة إليكتروبوراتيون في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. فصل الخلايا من طبق الثقافة باستخدام 0.05٪ التربسين لمدة 5 دقائق. تعطيل التربسين عن طريق إضافة خلية ثقافة المتوسطة.
  5. عد الخلايا مع عدادة الكريات غرفة نيوباور، أو استخدام طريقة مكافئة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. ريسوسبيند الخلايا في العازلة إليكتروبوراتيون للحصول على تركيز 4 × 10 5 خلايا لكل 100 ميكرولتر.
  7. مزيج 100 ميكرولتر من تعليق خلية مع ميرنا الفلورسنت (التركيز النهائي: 0.25 ميكرومتر) في أنبوب وتحميل الخليط في كوفيت إليكتروبوراتيون.
    1. تحديد تجريبيا كمية مناسبة من ميرنا، اعتمادا على نوع الخلية.
  8. أداء إليكتروبوراتيون باستخدام جهاز إليكتروبوراتيون (انظر جدول المواد )، وذلك باستخدام برنامج "G-009".
  9. إضافة 500 ميكرولتر من مرحلة ما قبل تحسنت زراعة الخلايا المتوسطة ونقل تعليق خلية كاملة (4 × 10 5 خلايا) في بئر من 4-جيدا الشرائح الزجاج أسفل الغرفة. ثقافة الخلايا لمدة 1 يوم عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 الغلاف الجوي.
    ملاحظة: لتحليل فراب، وكثافة الخلايا من ~ 80٪ هو الأمثل. ترنسفكأيشن من ميرنا المسمى ينبغي أن يؤديها حصرا باستخدام إليكتروبوراتيون. منذ التوزيع المتجانسة لجزيئات ميرنا المسمى هو مفيد لقياس فراب، لا ينصح ترنسفكأيشن القائم على كاشف.

4. تطبيق 3D-فراب المجهري (يوم 3)

  1. الاحماء الحاضنة المجهر إلى 37 درجة؛ C والتبديل على نظام المجهر متحد البؤر لا يقل عن 2 ساعة قبل قياس فراب لإنشاء التوازن الحراري وتقليل إمكانية الانجراف. إذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على 5٪ كو 2 الغلاف الجوي.
  2. إدراج الشريحة غرفة في حامل عينة المرحلة.
  3. العثور على مجموعة من كارديوميوسيتس ترانزفكتد باستخدام هدف النفط 1.4 نا (التكبير 400X) و 561 نانومتر ليزر ضوء الإثارة في طاقة الليزر منخفضة، مع مجموعة الكشف عن 570-680 نانومتر.
    ملاحظة: تم تحديد إعدادات فراب، والحصول على الصور، والتحليل باستخدام برامج المجهر محددة (انظر جدول المواد ).
  4. قم بتنشيط أزرار "z-ستاك" و "تايم سيريز" و "بليتشينغ" و "ريجيونس" في "سيتوب ماناجر".
  5. تحديد المعلمات فراب.
    1. تحديد إعدادات الحصول على الصور في "وضع الاكتساب" القائمة عن طريق وضع "حجم الإطار(4)؛ إلى 512 × 512، "خطوة خط" إلى 1، و "وقت الفحص" إلى <1 ثانية.
    2. في القائمة "القنوات"، وضبط قوة الليزر، تعويض، واكتساب إعدادات للحصول على مضان القصوى من الحد الأدنى الإثارة الليزر (على سبيل المثال، قوة الليزر: 1-5٪). ضبط لتجنب تشبع كثافة. تعيين "حجم الثقب" إلى 2 ميكرون.
    3. بعد ذلك، في قائمة "المناطق"، حدد "أداة رسم عائد الاستثمار" واستخدم المؤشر لوضع علامة على الخلية المستهدفة والخلية المرجعية ومنطقة الخلفية. إذا لزم الأمر، حدد عدة خلايا الهدف ل فوتوبلاشينغ.
    4. ضبط إعدادات فوتوبلاشينغ في القائمة "التبييض" (على سبيل المثال، التكرارات: 9-14، قوة الليزر ل فوتوبلاشينغ: 100٪، الفاصل الزمني من الحصول على الصور: 60 ثانية، دورات: 15). تحديد بداية التبييض بعد 3 المسح الأولي.
    5. في القائمة "z- المكدس"، وتحديد حدود اكتساب ض المكدس، اعتمادا على سمك الخلايا. اضبط الرقم "of z-لايرس "إلى 12 - 15.
    6. بدء تجربة فراب وتسجيل الانتعاش مضان.
      ملاحظة: منذ إعدادات تجربة فراب تعتمد على نوع الخلية، وصبغ الفلورسنت، ونظام المجهر، فمن الأفضل لإجراء تجارب تجريبية لتحديد المعلمات المثلى ل فراب. وينبغي أن يكون التبييض كافيا للحد من كثافة مضان الأولية بنسبة 50٪ على الأقل. عادة، ينبغي تسجيل الانتعاش مضان كل 30-60 ثانية حتى يتم التوصل إلى مرحلة الهضبة.

5. تحليل البيانات

  1. إنشاء أقصى التوقعات من اكتساب Z- أكوام والحصول على قيم شدة مضان من الخلايا المستهدفة ابيض، الخلية المرجعية، والخلفية. باستخدام برنامج المجهر محددة، انقر فوق "معالجة" → "أقصى كثافة إسقاط" → حدد ملف → "تطبيق".
    1. بدلا من ذلك، استخدم أداة تحليل صورة مكافئة (
  2. نسخ بيانات كثافة مضان في جميع نقاط الوقت من الخلية المستهدفة، والخلفية، والخلية المرجعية في جدول بيانات.
    1. طرح كثافة الخلفية وشدة الخلية المرجعية من قيم شدة الخلية المستهدفة لتصحيح ل فوتوبلاشينغ الناجمة أثناء عملية الاستحواذ. إجراء التصحيحات الخلفية والخلايا المرجعية لكل نقطة زمنية.
    2. تطبيع البيانات فراب تصحيح إلى كثافة مضان الأولية قبل التبييض عن طريق قسمة كل قيمة من قبل مضان الأولي.
    3. للحصول على منحنيات فراب، تعيين خط الأساس لشدة مضان مباشرة بعد التبييض عن طريق طرح من قيم كثافة كل نقطة زمنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، نقدم 3D-فراب المجهري باعتبارها تقنية غير الغازية لدراسة الفجوة التكتيكي الوصلي من ميرنا الفلورسنت ضمن العضلية حديثي الولادة. كشفت العضلية معزولة نموذجي α- الأكتينين مخطط وضمت لويحات كبيرة من Cx43 على طول حدود خلية الخلية ( الشكل 1A ، السهام البيضاء)، والذي سمح للتدفق بين الخلايا عالية من الجزيئات. تم تقييم نقاء كارديوميوسيتس معزولة عن طريق القياس المجهري للخلايا إيجابية α- الأكتينين. على الرغم من أن بعض الخلايا غير كارديوميوسيتس (α- الأكتينين الخلايا السلبية) كانت موجودة في الثقافة، العضلية حديثي الولادة تمثل نوع الخلية الرئيسية بعد العزلة (79.62 ± 3.68٪، الشكل 1B ).

للتحقيق في الفجوة التبادل الوصلي من ميرنا، ترانزفكتد الخلايا مع ميرنا فلورزنتلي المسمى. ايلىكتروبوراتيون هو الأسلوب المفضل لتقديم جزيئات ميرنا إلى الخلايا، لأنه يضمن كفاءة ترنسفكأيشن عالية والتوزيع المتجانس للمركبات ترانزفكتد، وهو إلزامي لتحليل فراب. في الإعداد التجريبي لدينا، حققنا كفاءة ترنسفكأيشن من ~ 45٪، كما يحددها التدفق الخلوي ( الشكل 2A ). إعداد كارديوميوسيتس ل فراب يتضمن مفرزة من لوحة الثقافة، إليكتروبوراتيون، وإعادة التعلق على الشرائح الغرفة. كشفت تدفق سايتوميتريك الحية / مقايسة ميت أن الغالبية العظمى من الخلايا أظهرت قابلية عالية، وهو أمر مهم عند تحليل الفجوة التواصل الوصلي ( الشكل 2B ). وعلاوة على ذلك، كثافة الخلية هي معلمة حاسمة التي تؤثر على نتائج فراب. للحصول على قياسات فراب الأمثل، يجب أن تكون البذور المصنف بكثافة ~ 80٪ للسماح لتشكيل مجموعات الخلايا وإنشاء فجوات وظيفية تقاطع بين الخلايا ( الشكل2C).

لتحليل فراب، يتم تحديد الخلايا المستهدفة داخل كتلة الخلايا و فوتوبلاشد مع قوة الليزر 100٪، مما يؤدي إلى انخفاض ميرنا مضان في الخلايا المحددة ( الشكل 3A ، التبييض). وفي وقت لاحق، يتم تسجيل الانتعاش مضان لتصور نقل ميرنا من الخلايا المجاورة في منطقة ابيض. منذ تم التوصل إلى مرحلة الهضبة من الانتعاش مضان بعد 13 دقيقة، وقد استخدمت هذه الفترة الزمنية للحصول على الصور في التجارب فراب. وأظهر التحليل الكمي وتطبيع البيانات المكتسبة معدل انتعاش متوسط ​​قدره 20٪. وأظهرت البيانات أيضا أن فراب المجهري يسمح للتسجيل السريع من ميرنا النقل بالسكك الحديدية مع القرار الزمني العالي. اعتمادا على خصائص الصبغة، يمكن تغيير المعلمات اكتساب لزيادة القرار الزمني.

استخدام 3D-فراب تمكنمقارنة غ نفاذية ل ميرنا تحت ظروف مختلفة. للتدليل على هذا، ونحن تسببت في ضربة قاضية بوساطة سيرنا من Cx43، مما يؤدي إلى انخفاض التعبير البروتين ( الشكل 3C ) وتثبيط الاتصالات التواصل الفجوة. ونتيجة لذلك، تم تقليل الانتعاش مضان بنسبة أكثر من 50٪، مشيرا إلى أن كفاءة نقل ميرنا تعتمد بشدة على مدى الفجوة اقتران الوصل بين الخلايا ( الشكل 3B ، ضربة قاضية Cx43). للتأكد من أن الانتعاش مضان يعكس مرور فلورنسنتلي المسمى ميرنا، بدلا من Dy547 العلامة منفصلة، ​​كما حصلنا على البيانات فراب لصبغ كالسين ( الشكل 3D ). كالسين له وزن جزيئي مقارن لوزن Dy547 وبالتالي يمتلك ديناميات نقل مشابهة. على النقيض من الانتعاش مضان من ميرنا Dy547 المسمى، أظهرت كالسين زيادة الفجوة التبادل الوصلي، مشيرا إلى أن العلامة Dy547 طق غير منفصلة من جزيء ميرنا ( الشكل 3D ).

تكون ظروف التركيز الثابتة إلزامية طوال تجربة فراب، خاصة عندما يتم تنفيذ القياسات طويلة المدى. بالمقارنة مع التطبيقات 2D، 3D-فراب يمكن تعويض عن الانجراف التركيز المحتمل. كما هو مبين في الشكل 4 ، حتى تغييرات التركيز طفيف تؤثر على الكشف السليم للإشارة مضان من ميرنا عندما يتم استخدام طبقة 2D واحدة فقط لتجربة فراب ( الشكل 4B ). في المقابل، ل 3D-فراب، يتم تسجيل كامل Z كومة من الخلية المستهدفة، وتخضع أقصى التوقعات لتحليل البيانات ( الشكل 4A ). ويصور تأثير الانجراف التركيز على منحنيات تطهير كثافة مضان في الشكل 4C . في حين أن الانتعاش مضان يزيد بشكل مطرد مع مرور الوقت في 3D-فراب، 2D-فراب الاستحواذ يؤدي إلى انخفاض سf إشارة مضان.

بجانب التعويض من التغييرات التركيز، 3D-فراب كما يوفر البيانات المكانية من التبادل الوصلي الفجوة من ميرنا. ويبين الشكل 5 عرض سطح ثلاثي الأبعاد لتجربة فراب. بالمقارنة مع أقصى التوقعات، واقتناء Z- مداخن يمكن استخدامها لإنشاء 3D إعادة البناء للتحقيق في توطين والتنقل من ميرنا داخل الخلايا ( الشكل 5 ). شارك في وضع العلامات مع العضيات سيسمح للتحقيق في مشاركة المكونات الخلوية الأخرى في نقل ميرنا.

شكل 1
الشكل 1: صور ميكروسكوبية الممثل من كارديوميوسيتس الوليد المعزولة. ( A ) يظهر المجهر إضاءة منظم التعبير عالية من Cx43، الذي يتراكم في ص كبيرلاكيس، إلى، سيل-سيل، الحدود، (أروهيدز). تشكيل وضوحا من غس مع الخلايا المجاورة تمكن تبادل واسع من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك ميرنا. شريط مقياس = 20 ميكرون ( B ) نقاء الخلايا العضلية المعزولة. وسمها من أكتينين α يدل على أن العضلية تمثل نوع الخلية الرئيسية بعد العزلة. شريط مقياس = 50 ميكرون. كانت ملطخة الخلايا مع مكافحة Cx43 (الأخضر) والأجسام المضادة المضادة α- الأكتينين (الأحمر). تم تصور النوى باستخدام دابي (الأزرق). ويرد وصف للمجهر الإضاءة منظم والوسم المناعي في المنشورات السابقة 20 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: ترنسفكأيشن الكفاءة، الجدوى ، وكثافة الخلية من ثقافة كارديوميوسيت حديثي الولادة. ( A ) كشف التدفق الخلوي أن miR547 إليكتروبوراتيون أسفرت عن كفاءة ترنسفكأيشن من ~ 45٪. ( ب ) بقاء الخلية من خلايا عضلية تستخدم ل فراب. بعد العزلة، إليكتروبوراتيون، وإعادة، تعرضت كارديوميوسيتس للعيش والميتة تلطيخ الخلية وأظهرت بقاء الخلية عالية. ( C ) صورة مجهرية من كارديوميوسيتس mir547-ترانزفكتد أعدت لفراب المجهري. كثافة الخلايا من 80-90٪ يضمن تشكيل وضوحا من فجوة الاتصالات خلية خلية وظيفية. شريط مقياس = 50 ميكرون. وهناك طريقة لتحليل تدفق سايتوميتريك من كفاءة ترنسفكأيشن وتلطيخ البقاء على قيد الحياة المذكورة في المنشورات السابقة 20 ، 21 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أونتنت "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> الشكل 3
الشكل 3: غ تعتمد على ميرنا في كارديوميوسيتس حديثي الولادة. ( A ) صور ممثل لتجربة فراب. بعد ترنسفكأيشن مع ميرنا المسمى، يتم استهداف الخلايا المستهدفة داخل كتلة الخلايا فوتوبلاشد بواسطة نبض ليزر قوي (قبل التبييض مقابل التبييض). اعتمادا على مدى الفجوة اقتران الوصلي، وتدفق فجوة وظيفية من ميرنا من الخلايا المجاورة يؤدي إلى زيادة كثافة مضان في الخلايا المستهدفة ابيض (بعد التبييض ر = 3 و 6 و 9 و 13 دقيقة). مقياس شريط = 20 ميكرون ( B ) التحليل الكمي للبيانات فراب المكتسبة يظهر الانتعاش مضان من 20٪ بعد 13 دقيقة. لتأكيد مشاركة غس في النقل بين الخلايا من ميرنا، تم تنفيذ ضربة قاضية cx43، مما أدى إلى انخفاض قوي في الانتعاش مضان (50٪). ( C ) إمونوستينينغ مع مكافحة CX43الأجسام المضادة وما بعدها المجهري متحد البؤر تثبت ضربة قاضية Cx43 على مستوى البروتين. شريط مقياس = 50 ميكرون. ( D ) مقارنة البيانات فراب من MiR547 وصبغ كالسين تظهر ديناميات نقل مختلفة. أدى الوزن الجزيئي أصغر من كالسين في زيادة الانتعاش مضان بالمقارنة مع جزيئات ميرنا dy547 الموسومة. منحنيات فراب تلخيص البيانات من خلايا ن ≥56، كما هو مبين في المتوسط ​​± سيم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أنوفا ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار بونفيروني التالي (P <0.05، ** P <0.01، P <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: تعويض التركيز الانجراف باستخدام 3D-فراب المجهري. ( B ) صور الممثل للخلية فوتوبلاشد (الخط الأحمر) تثبت تأثير الانجراف التركيز على كثافة مضان خلال التجارب 3D- و 2D-فراب. ( A ) في 3D-فراب، يتم تسجيل Z- مداخن لكل نقطة زمنية، وتستخدم الإسقاطات القصوى لتحليل البيانات، والذي يصحح للانجراف التركيز. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( ب ) في المقابل، ل 2D-فراب، يتم عرض مجرد طبقة 2D واحدة لتحليل البيانات. وبالتالي، فإن كثافة مضان العام هو انخفاض عميق من خلال التغيرات في التركيز. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( C ) ممثل تطبيع منحنيات شدة مضان من التجارب 3D- و 2D-فراب تشير إلى تأثير قوي من الانجراف التركيز على الانتعاش مضان وتظهر فوائد اكتساب 3D عند دراسة ميرنا النقل بالسكك الحديدية بين الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثهو الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: تقديم سطح ثلاثي الأبعاد لتجربة 3D-فراب. (يسار) التوقعات القصوى لقياس فراب. الخلية فوتوبلاشد (الإطار الأحمر) يدل على زيادة في كثافة مضان بسبب نقل ميرنا من الخلايا المجاورة. (يمين) اكتسبت Z- مداخن من نفس الخلية فوتوبلاشد (الأحمر) تعرضوا لتقديم سطح 3D لتصور التوزيع المكاني لل ميرنا. شريط مقياس = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ميرناس هي اللاعبين الرئيسيين في علم وظائف الأعضاء الخلوية، وتبين أنها تعمل كجزيئات الإشارات باستخدام-من بين أمور أخرى-غس كمسار لتبادل بين الخلايا 11 ، 12 ، 22 . يعرض البروتوكول الحالي تقنية التصوير في الخلية الحية في المختبر لتوصيف هذه التكتيكية التي تعتمد على غ باستخدام ميرناس الفلورسنت داخل مجموعات الخلايا.

تم تطوير بروتوكول على الخلايا العضلية كنظام نموذج الخلية. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج على عدة أنواع الخلايا إذا إليكتروبوراتيون هو وسيلة مناسبة ل ترنسفكأيشن ميرنا. بالإضافة إلى تبادل خلية إلى خلية، والتقنية المعروضة هي أيضا مناسبة للتحقيق في التنقل داخل الخلايا من جزيئات ميرنا (على سبيل المثال، لتحديد آليات النقل الممكنة داخل الخلية) 23 ، 24 .

المحتوى "> التحقيق في نقل ميرنا من قبل المجهر فراب يتطلب فلورزنتلي الموسومة جزيئات ميرنا ( الشكل 2 ). وسمها من ميرناس الخلوية محددة ليست ممكنة، فقط خارجي، أدخلت ميرنا المسمى يمكن استخدامها ل 3D-فراب لتحليل التنقل بين الخلايا في تجاربنا، كانت الخلايا ترنسفكتد مع 250 نانومتر ميرنا، وكان هذا التركيز أعلى بكثير بالمقارنة مع الظروف الفسيولوجية، حيث يتراوح مستوى ميرنا من 10 إلى 50،000 جزيئات في الخلية 27 ، 28. هذه تركيزات منخفضة لا يمكن استخدامها في التجارب فراب، كما هو مطلوب مستوى معين من جزيئات ميرنا الفلورسنت للحصول على إشارة مضان كافية وضمان التمييز السليم بين مضان الخلفية و فلورزنتلي المسمى ميرنا، ولكن اعتمادا على نظام التصوير مبائر وخصائص صبغ، واستخدام تركيزات ميرنا في انخفاض يجب أن يكون نطاق -nm ممكنا لفحوصات فراب. </ P>

يتم تطبيق تقنيات مختلفة عادة لدراسة نقل ميرنا بين الخلايا، بما في ذلك التدفق الخلوي، ير، وفحوصات مراسل لوسيفيراس 12 ، 13 . هذه الأساليب كشف ميرنا المكوك مع قرار الزمانية منخفضة ( أي ساعات إلى أيام). في المقابل، 3D-فراب المجهري يسمح لتصور وكمي لنقل ميرنا والتنقل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى فجوة الاتصالات خلية خلية وظيفية، يتم أيضا بوساطة المكوكات بين الخلايا من ميرنا بواسطة آليات أخرى، مثل إكسوسوميس 18 ، 29 ، 30 . فقط 3D-فراب يوفر قرار الزمانية عالية بما فيه الكفاية للتمييز بين نقل إكسوسومال وفجوة الوصل. وهكذا، فإنه يسمح لإجراء تحقيق محدد في التأثير المباشر لل غ نفاذية على ميرنا يشير في ظل الظروف المرضية أو الفسيولوجية مختلفة (فيغوري 2).

نوصي باستخدام 3D-فراب، الذي هو متفوق على 2D-فراب التقليدية، كما أنه يوفر بيانات أكثر دقة على نقل ميرنا غ تعتمد. وتشمل القياسات 3D-فراب كامل حجم الخلية، وهو أمر مهم عند استخدام أنواع الخلايا الكبيرة السائبة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تعويض تغييرات التركيز أو تحركات الخلايا، والتي تبين أن يضعف بشكل كبير الانتعاش مضان في 2D-فراب ( الشكل 3 ). وأخيرا، فإن تسجيل Z- مداخن في تجارب 3D-فراب يوفر إمكانية الحصول على المعلومات المكانية، وهو أمر غير ممكن عند استخدام طبقة 2D واحدة فقط لتحليل شدة مضان ( الشكل 3B ).

منذ الانتعاش مضان يعتمد على تدفق ميرنا من الخلايا المجاورة، وعدد الخلايا المتصلة الخلية ابيض أمر بالغ الأهمية ويجب أن تكون مماثلة عبر قياسات مختلفة للحصول على بيانات موثوقة. ولذلك، يتطلب ارتفاع كثافة الخلاياد لضمان تشكيل المجموعات الخلوية الأنسب لتحليل فراب. وعلاوة على ذلك، يجب إجراء التجارب الأولية لتحديد ظروف تبييض خفيفة ( أي قوة الليزر، وقت التبييض، وإعدادات المسح الضوئي) لتجنب الآثار الضوئية الناجمة عن كثافة الليزر عالية 25 ، 26 . وهذا سوف يساعد أيضا على تقليل فوتوبلاشينغ التي تحدث أثناء عملية الاستحواذ.

على الرغم من القيود، وتظهر بياناتنا أن 3D-فراب هو أداة قوية لتقييم دور ميرناس كما جزيئات الإشارات داخل الشبكة الخلوية. تأثير تكوين كونيكسين على ميرنا المكوك أو نفاذية انتقائية من غس ل ميرناس محددة يمكن معالجتها مع الكمي المباشر من كفاءة النقل. 3D-فراب يمكن أن توفر معلومات هامة لتحسين تطوير علاجات جديدة يضم ميرنا و سيرنا، مثل عن طريق تحديد الظروف المناسبة التي تسهل التوزيعn من رنا الصغيرة عبر شبكة غ 31 ، 32 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث في ألمانيا (فكز 0312138A و فكز 316159)، و مكلنبورغ-ويسترن بوميرانيا الحكومية مع صناديق الاتحاد الأوروبي الهيكلية (إسف / إيفوم-B34-0030 / 10 و إسف / إيفبم-B35-0010 / 12)، و دفغ (DA1296-1)، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وبالإضافة إلى ذلك، ويدعم أردي من قبل برنامج فورون من المركز الطبي جامعة روستوك (889001)، ومؤسسة دامب، و بمبف (فيب + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136, (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61, (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27, (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101, (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166, (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10, (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6, (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4, (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70, (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38, (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19, (1), 15001 (2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38, (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27, (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25, (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230, (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13, (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113, (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113, (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8, (1), 166 (2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12, (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).More

Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter