هنا، نحن تصف تطبيق الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) لتحليل الفجوة تقاطع تعتمد على مكوك من ميرنا. على النقيض من الأساليب المطبقة عادة، 3D-فراب يسمح لكمية النقل بين الخلايا من الحمض النووي الريبي الصغيرة في الوقت الحقيقي، مع ارتفاع القرار المكاني والزماني.
الرنا الصغيرة المضادة للعدوى، مثل ميرنا و سيرنا، تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلوية وعلم الأمراض، وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كعوامل علاجية في علاج العديد من الأمراض. ويستند تطوير استراتيجيات جديدة ومبتكرة للعلاج ميرنا / سيرنا على معرفة واسعة من الآليات الكامنة. وتشير البيانات الأخيرة إلى أن رنا صغيرة يتم تبادلها بين الخلايا بطريقة تعتمد على تقاطع الفجوة، وبالتالي إحداث آثار تنظيمية الجينات في الخلية المتلقية. وتستخدم التقنيات البيولوجية الجزيئية وتدفق تحليل سايتوميتريك عادة لدراسة التبادل بين الخلايا من ميرنا. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر القرار الزماني العالي، وهو أمر ضروري عند دراسة الفجوة تدفق وظيفية من الجزيئات. لذلك، للتحقيق في تأثير ميرنا / سيرنا كما جزيئات الإشارات بين الخلايا، وهناك حاجة إلى أدوات جديدة من شأنها أن تسمح لتحليل هذه الرنا الصغيرة على المستوى الخلوي. يصف هذا البروتوكول أبتقطيع الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) المجهري لتوضيح التبادل تعتمد على تقاطع الفجوة من جزيئات ميرنا بين خلايا القلب. الأهم من ذلك، وهذا نهج التصوير الخلية الحية مباشرة وغير الغازية يسمح لتصور وتقدير من الفجوة التكتيكية الوصفي من رنا صغيرة فلورزنتلي المسمى في الوقت الحقيقي، مع قرار المكاني والزماني عالية. البيانات التي تم الحصول عليها من قبل 3D-فراب تؤكد مسار جديد من تنظيم الجينات بين الخلايا، حيث رنا الصغيرة بمثابة الجزيئات إشارة داخل الشبكة بين الخلايا.
الرنا الصغيرة غير المشفرة هي لاعبين مهمين في تنظيم الجينات الخلوية. وتتكون هذه الجزيئات من 20-25 النيوكليوتيدات التي ترتبط مرنا الهدف محددة، مما يؤدي إلى انسداد الترجمة أو إلى مرنا تدهور 1 ، 2 . العملية التنظيمية الجينية التي تقوم بها الرنا الصغيرة، مثل ميرنا و سيرنا، هو آلية المحافظة للغاية التي تم العثور عليها في العديد من الأنواع المختلفة 3 . على وجه الخصوص، جزيئات ميرنا ذات أهمية حاسمة لمجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك الانتشار، والتمايز، والتجديد 4 ، 5 . وبالإضافة إلى ذلك، يعزى إلى عدم انتظام التعبير ميرنا لكثير من الاضطرابات المرضية. في المقابل، وقد ثبت ميرناس لتكون مناسبة كما المؤشرات الحيوية للتشخيص وكعوامل علاجية للعلاج الجيني 6 ، 7 </suص>.
تقاطعات الفجوة (غس) هي هياكل البروتين المتخصصة في غشاء البلازما من اثنين من الخلايا المجاورة التي تسمح التبادل المنتشر للجزيئات مع الوزن الجزيئي تصل إلى 1 كيلو دالتون. وقد تبين أنها مهمة لتطوير الأنسجة، والتمايز، والموت الخلية، والاضطرابات المرضية مثل السرطان أو أمراض القلب والأوعية الدموية 8 ، 9 ، 10 . وقد وصفت عدة جزيئات بأنها قادرة على عبور قنوات جي جي، بما في ذلك الأيونات، الأيض، والنيوكليوتيدات. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على غس أيضا لتوفير مسار للحركة بين الخلايا من الرنا الصغيرة 11 ، 12 . وهكذا، ميرناس يمكن أن تعمل ليس فقط داخل الخلية التي يتم إنتاجها، ولكن أيضا داخل الخلايا المتلقية. هذا يسلط الضوء على دور ميرناس في نظام التنبيه إشارة بين الخلايا. وفي الوقت نفسه، تظهر البياناتأن الفجوة التواصل بين الخلايا اتصال بين يرتبط ارتباطا وثيقا وظيفة ميرنا. بسبب تأثير كبير من ميرنا و غس على التوازن الأنسجة، علم الأمراض، والتشخيص، وفهم شامل لوظيفة غس والديناميات بين الخلايا ذات الصلة ميرنا تساعد على توضيح آليات الأمراض القائمة على ميرنا ووضع استراتيجيات جديدة ل ميرنا العلاجات.
اعتمادا على مدى الفجوة اقتران الوصلي، ونقل جزيئات ميرنا بين الخلايا يمكن أن تكون عملية سريعة جدا. لذلك، هناك حاجة إلى منهجية تسمح التصور وكمية الحركة بين الخلايا السريعة من هذه الجزيئات تشوير التنظيمية. عادة، وقد تم تطبيق التدفق الخلوي والتقنيات البيولوجية الجزيئية لإثبات المكوك من الرنا الصغيرة 11 ، 12 ، 13 ، 14 . ومع ذلك، بدلا من ميكروس فرابنسخ، هذه النهج تفتقر إلى القرار الزماني عالية، وهو إلزامي عند تحليل تبادل ميرنا عبر غس. وعلاوة على ذلك، فراب المجهري هو أقل الغازية، وبالتالي يمثل قوية ورواية الخلية الحية تقنية التصوير لتقييم تبادل غ تعتمد على جزيئات في عدة أنواع الخلايا 15 ، 16 ، 17 .
هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف تطبيق 3D-فراب لتقييم ميرنا المكوك بين الخلايا العضلية. لهذا الغرض، تم ترانزفكتد كارديوميوسيتس مع ميرنا فلورزنتلي المسمى. وكانت خلية ملحوظ مع هذا ميرنا فوتوبلاشد، وسجل فجوة ميرنا الوريد إعادة تدفق من الخلايا المجاورة سجلت بطريقة تعتمد على الوقت. القرار الزماني العالي للتجارب فراب يوفر إمكانية لإجراء دراسات الحركية لتقييم دقيق لنقل بين ميرنا و سيرنا بين الخلايا الحية. Moreoحيث يمكن تبادل رنا صغيرة عن طريق آليات مختلفة مع حركية مختلفة للغاية، يمكن أن يساعد المجهر فراب لتوضيح مدى مشاركة غس في عمليات المكوكية ذات الصلة 18 . وبالإضافة إلى ذلك، 3D-فراب يمكن استخدامها للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية والمرضية في نفاذية غ وأثره على نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة 15 ، 19 .
ميرناس هي اللاعبين الرئيسيين في علم وظائف الأعضاء الخلوية، وتبين أنها تعمل كجزيئات الإشارات باستخدام-من بين أمور أخرى-غس كمسار لتبادل بين الخلايا 11 ، 12 ، 22 . يعرض البروتوكول الحالي تقنية التصوير في الخلية الحية <e…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث في ألمانيا (فكز 0312138A و فكز 316159)، و مكلنبورغ-ويسترن بوميرانيا الحكومية مع صناديق الاتحاد الأوروبي الهيكلية (إسف / إيفوم-B34-0030 / 10 و إسف / إيفبم-B35-0010 / 12)، و دفغ (DA1296-1)، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وبالإضافة إلى ذلك، ويدعم أردي من قبل برنامج فورون من المركز الطبي جامعة روستوك (889001)، ومؤسسة دامب، و بمبف (فيب + 00240).
neonatal NMRI mice | Charles River | ||
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
Cell culture plastic | TPP | ||
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Excel software | Microsoft | ||
α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |