Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Det här protokollet beskriver en enkel metod för att isolera och odla primära mus cerebral granule nervceller (CGNs) från 6-7 dag gammal PUP, effektiv cellsignalering av CGNs för förlust och vinst av funktion studier, och modellering NMDA-inducerad neuronala excitotoxicitet, låg-kalium-inducerad celldöd, DNA-skador och oxidativ stress med hjälp av samma kultur-modellen.

Abstract

Cerebellär granule neuroner (CGNs) är en vanligt förekommande neuronala modell, bildar en riklig homogen population i lillhjärnan. Mot bakgrund av deras postnatal utveckling, överflöd och tillgänglighet är CGNs en idealmodell att studera neuronala processer, inklusive neuronal utveckling, neuronala migration och fysiologiska neuronal aktivitet stimulering. Dessutom ger CGN kulturer en utmärkt modell för att studera olika lägen av celldöd inklusive excitotoxicitet och apoptos. Inom en vecka i kultur express CGNs N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer, en specifik jonotropa glutamat receptor med många kritiska funktioner i neuronala hälsa och sjukdom. Tillägg av låga koncentrationer av NMDA tillsammans med membran depolarisation till gnagare primära CGN kulturer har använts för att modellera fysiologiska neuronal aktivitet stimulering medan tillägg av höga koncentrationer av NMDA kan användas för att modellera excitotoxic neuronal skada. Här beskrivs en metod för isolering och odling av CGNs från 6 dagar gamla ungar samt genetisk manipulering av CGNs av adenoviruses och lentiviruses. Vi också närvarande optimerade protokollen om hur man kan stimulera NMDA-inducerad excitotoxicitet, låg-kalium-inducerad apoptos, oxidativ stress och DNA-skada efter transduktion av dessa nervceller.

Introduction

Cerebellär granule nervceller (CGNs) är väl karakteriserade i kultur och har tjänat som en effektiv modell för att studera neuronala dödsfall och utveckling 1,2,3,4,5, 6. ett tidigt uttryck för N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer i CGN kulturer in vitro- gör dem en attraktiv modell att studera NMDA-inducerad signalering. Aktivering av dessa receptorer med NMDA tillsammans med membran depolarisation används för att modellera fysiologiska neuronal aktivitet stimulering och har tillåtit för forskning i mekanismerna bakom synaptisk plasticitet 7,8. Tvärtom, kan över-stimulering av receptorerna av NMDA ligand användas att modellera excitotoxicitet, en viktig mekanism av neuronala förlust i akuta hjärnskador och neurodegenerativa sjukdomar 9. En mekanism för induktion av excitotoxicitet är genom ATP svält med nedsatt syre, som sett med akut neuronal skada. Detta resulterar i membran depolarisation och förhöjda nivåer av glutamat släpp på synapsen. Den efterföljande överstimulering av NMDA-receptorn av förhöjda glutamat leder till överdriven Ca2 + inflödet via dessa receptorer, som i sin tur aktiverar flera vägar, inklusive Ca2 +-aktiverade proteaser, phospholipases, och endonucleases, vilket resulterar i okontrollerad nedbrytning av viktiga cellulära komponenter och celldöd. Dessutom leder höga intracellulära Ca2 + till produktion av fria syreradikaler och mitokondriell skada 10,11.

Medan majoriteten av neuronala förlust efter NMDA-inducerad neuronala excitotoxicitet är på grund av kalcium inflöde och Bax/Bak oberoende, uteslutas andra mekanismer för celldöd från denna modell. Utseendet på både nekrotisk och apoptotisk celldöd på grund av excitotoxicitet är delvis på grund av generationen av reaktiva syreradikaler (ROS) och DNA-skador som orsakas avhöga intracellulära Ca 2 + nivåer 12. DNA-skador leder till neuronala döden genom apoptotiska mekanismer, är korrelerade med kännetecken för apoptotisk celldöd, såsom uppkomsten av kromatin massorna och apoptotiska kroppar. Induktion av apoptos medieras genom frisättning av cytokrom c från mitokondrierna, och har visat sig vara beroende av Bax/Bak oligomerisering 13. Bax/Bak oligomerisering främjar pore-formationen i yttre mitokondriella membranet, vilket resulterar i cytokrom c release och aktivering av pro-apoptotiska regulatorer som sett med mild ischemisk skada 14.

Generation av ROS är ett betydande problem i hjärnan på grund av de låga endogena nivåerna av antioxidanter, tillsammans med stora syre kravet för neuronala fungerande 15. När de utsätts för en ischemisk händelse, är kväveoxid syntas uppreglerad, producerar kväveoxid och ökar reaktivt syre arter 14. Den öka koncentrationen av syreradikaler kan resultera i DNA-skador och indirekt orsaka energi svält. Höga nivåer av DNA dubbelsträngat raster avhjälps genom aktivering av poly ADP-ribos polymeras-1 (PARP-1), en eukaryota kromatin-bundna protein ansvarar för katalysera överföringen av ADP-ribos enheter från NAD+, en integrerad del av processen DNA reparation 16. Men, med skador på grund av oxidativ stress, PARP-1 aktivering kan orsaka energi svält på grund av ökad avloppet på NAD+, nödvändiga substrat för ATP produktionen genom oxidativ fosforylering. Slutändan, oxidativ stress utlöser apoptos i ett Bax/Bak beroende sätt leder till mitokondriell cytokrom c release och har visats inducera mitokondriell remodelling CGNs 17.

Slutligen, förändringar i koncentrationen av kaliumklorid (KCl) i CGN kulturer kan användas att modellera lågt kalium/depolarisation medierad apoptos 18,19,20. När de utsätts för låga nivåer av K+, genomgå CGNs olika fysiologiska förändringar, vilket resulterar i minskningar av både mitokondrie andning och glykolys, tillskrivas minskad cellulär efterfrågan 21, samt minskning av nivåerna av nuclear factor-κB (NFκB) som reglerar aktiviteter inklusive inflammation och synaptisk transmission 22. Denna modell är av särskilt intresse för studier av celldöd under neuronal utveckling. Lågt K+ miljö närmare liknar fysiologiska förhållanden, och orsakar kännetecken för celldöd sett under neuronal utveckling 23.

Sammanfattningsvis ger CGNs en långvariga modell för att undersöka de underliggande molekylära mekanismerna av neuronala dödsfall och degeneration. Följande protokoll gör att isolering och odling av CGNs, uttryck eller förtryck av en viss genetisk väg med virus och induktion av neuronala dödsfall via olika mekanismer som representerar neuronal skada och degeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

detta protokoll baseras på ändringar av förfaranden som har beskrivits tidigare 18 , 24 , 25 , 26 , 27. detta protokoll är godkänd av Animal Care kommittén vid McGill University.

1. experimentell förberedelse

Obs: följande lager lösningar kan förberedas och fortsätta fram till användning.

  1. Dissektion lösning
    1. Lös 3.62 g natriumklorid (NaCl), 0,2 g kaliumklorid (KCl), 0.069 g natriumfosfat (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), och 1.306 g D-(+)-glukos i 500 mL destillerat H 2 O. Lägg sedan till 12,5 mL HEPES buffert, 450 µL fenolrött lösning och 20 mL av BSA bråkdel V lösningen. Justera till pH 7,4 med 1 N natriumhydroxid (NaOH).
    2. Sterilize med 0,22 µm filter och förvaras vid 4 ° C. Denna lösning förblir stabila i upp till en vecka till 10 dagar.
  2. Trypsin
    1. förbereda en utgångslösning med en koncentration på 25 g/L av trypsin i 0,9% natriumklorid. Förvara lösningen vid -20 ° C.
  3. Trypsin-hämmare
    1. förbereda ett lager med en koncentration på 10 mg/mL genom upplösning 1 g kyckling äggvita trypsin-inhibitor i 100 mL av 1 mM HCl. Store denna lösning vid -20 ° C.
  4. DNAS
    1. Lös DNAS 1 100 mg i 10 mL sterilt vatten för att generera en 10 mg/mL lager. Förvara lösningen vid -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. tillsätt 6,02 g magnesiumsulfat (MgSO 4) till 50 mL destillerat vatten (H 2 O) att generera en 1 M lager. Förvara lösningen vid 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. Lös 0,735 g kalciumklorid (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) i 50 mL destillerat H 2 O en lager koncentration på 100 mM. Förvaras vid 4 ° C.
  7. KCl
    1. Lös 3.7275 g av KCl i 50 mL destillerat H 2 O en lager koncentration på 1 M. Store lösning vid 4 ° C.
  8. D-(+)-glukos
    1. Lös 1.802 g D-(+)-glukos i 50 mL destillerat H 2 O en lager koncentration på 100 mM. Förvaras vid 4 ° C.
  9. Cell kulturmassmedia
    1. förbereda cell kulturmassmedia enligt följande: 5 mL av värme inaktiverat dialyseras fetalt bovint Serum, 500 µL av 200 mM L-glutamin, 100 µL av 50 mg/mL Gentamycin och 1 mL av 1,0 M KCL bör läggas till 45 mL av filter steriliseras Eagle ' s minimal viktiga medier (E-MEM) som kompletteras med 1,125 g/L D-glukos att generera 50 mL av cerebellär granule neuron kultur media. Lagra media vid 4 ° C.
  10. Cytosin Beta-D-Arabino Furanoside
    1. Lös 48 mg cytosin beta-D-arabino furanoside i 10 mL av tillväxtmassmedia till ett lager koncentration av 20 mM. Förvaras vid -20 ° C.
  11. Poly-D-lysin
    1. för att generera en 2 mg/mL poly D-lysin lager, tillsätt 10 mL steril H 2 O 20 mg poly D-lysin. Beståndet poly D-lysin ska förvaras vid-80 ° C i 100 µL alikvoter.
  12. Obs: följande lösningar bör förberedas före dissektion och underhöll vid 4 ° C fram till användning.
  13. MgSO 4 kompletteras dissektion lösning
    1. lägga till 300 µL av lager MgSO 4 250 ml av dissektion lösning.
  14. Trypsin dissektion lösning
    1. Tillsätt 100 µL av lager trypsin och 12 µL av lager MgSO 4 till 10 mL dissektion lösning.
  15. Trypsin hämmare lösning 1
    1. lägga till 164 µL av lager trypsin-hämmare, 250 µL lager DNAS 1 och 12 µL av lager MgSO 4 till 10 mL dissektion lösning.
  16. Trypsin hämmare lösning 2
    1. lägga till 1040 µL av lager trypsin-hämmare, 750 µL lager DNAS 1 och 12 µL av lager MgSO4 10 ml av dissektion lösning.
  17. CaCl 2 kompletteras dissektion lösning
    1. Lägg till 10 µL av lager CaCl 2 och 25 µL i lager MgSO 4 till 10 mL dissektion lösning.
  18. Poly D-lysin belagd kultur rätter
    1. för att bestryka kultur rätter, späd 100 µL av lager poly D-lysin i 40 mL steril H 2 O. För 35 mm Nunc kultur rätter, tillsätt 2 mL av utspädda poly D-lysin lösning. För 4 plattor väl, tillsätt 300 µL utspädda poly D-lysin till varje brunn.
    2. Låt poly D-lysin sit för 1 h innan aspirera och tvätt varje brunn med 4 mL eller 600 µL (för 35 mm kultur rätter eller 4 väl plattor, respektive) av sterila H 2 O. Sedan aspirera H 2 O och låt lufttorka rätter för 1 h.

2. Brain utvinning och isolering av lillhjärnan

  1. Decapitate en 6-7 dag gamla mus pup med halshuggning sax. Utföra dissektion av hjärnan i en steril vävnadsodling huva.
  2. Ta bort hjärnan, ta tag i huvudet med ett par pincett och skära igenom huden mot den främre av huvudet med lokalt sax som framgår i figur 1. Sedan skär genom skallbenet med ett nytt par sax för att minimera risken för kontaminering. Ta bort skallen som täcker hjärnan med hjälp av pincetten och reta sig hjärnan med hjälp av pincett eller en spatel.
    1. Som behövs, skär genom synnerven att underlätta att få hjärnan ut som helhet.
  3. Placera hjärnan i dissektion lösningen som kompletteras med MgSO 4. Håll lösningen och hjärnan på ice.
  4. Följande hjärna borttagning, under en dissektion Mikroskop, dissekera ut lillhjärnan från hjärnan medan fortfarande i MgSO 4 kompletteras dissektion lösning och ta bort hjärnhinnor med fin pincett. Slå lillhjärnan dess ventrala sida och försäkra borttagning av plexus koroidea.
  5. Pool i cerebella i en 35 mm skål innehållande ~ 1 mL MgSO 4 kompletteras dissektion lösning.
  6. Hacka vävnaden i små bitar och överför till en 50 mL tub innehållande 30 mL MgSO 4 buffrade dissektion lösning.

3. Mus cerebellär Granule Neuron isolering och Culturing

  1. Centrifugera det 50 mL tub som innehåller hackad cerebral vävnad för 5 min på 644 x g och 4 ° C.
  2. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL av trypsin dissektion lösning. Skaka sedan röret med hög hastighet under 15 minuter vid 37 ° C.
  3. Tillsätt 10 mL av trypsin hämmare lösning 1 till röret och rock försiktigt i 2 min.
  4. Centrifugera röret för 5 min på 644 x g och 4 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten och tillsätt 2 mL trypsin hämmare lösning 2 och överför sedan till en 15 mL tub.
  6. Pulverisera vävnaden i 15 mL röret tills lösningen blir skumma. Låt sedan nöja sig med 5 min.
  7. Ta bort klara supernatanten och överför supernatanten till en ny tub som innehåller 1 mL CaCl 2 kompletteras dissektion lösning.
  8. Lägga till ytterligare mL trypsin hämmare lösning 2 till botten av röret som innehåller pelleten från steg 3.6. Pulverisera igen och låt kvitta för 5 min. avlägsna supernatanten och lägga till röret som innehåller supernatanten från steg 3,7 (som är en upprepning av steg 3.6-3.7). Upprepa denna process tills de flesta av vävnad är mekaniskt dissocierade.
  9. Lägg till 0,3 mL CaCl 2 kompletteras dissektion lösning supernatant insamling för varje mL av supernatanten.
  10. Blanda innehållet i röret och sedan Centrifugera i 5 min på 644 x g.
  11. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL av färska media till pelleten och blanda.
  12. Celler kan sedan räknas och spätt till en koncentration av 1,5 x 10 6 celler/mL. Observera att i allmänhet 10 miljoner celler förväntas från varje dissekerade hjärna, beroende på trypsinization tid och effektivitet av dissektion. Platta celler på tidigare gjorda poly D-lysin tallrikar. För 4-bra plattor, plåt 0,5 mL, ger 7,5 x 10 5 celler per brunn. För 35 mm rätter, tallrik 4 mL, vilket ger 6 x 10 6 celler per platta.
  13. Efter 24 h, lägga till cytosin-β-arabino furanoside (AraC) plattorna att reducera gliaceller kontaminering. För varje mL media krävs 0,5 µL 20 mm AraC. Tillägg av AraC kräver inte en media förändring. Om cellerna bevaras för 7-8 dagar, upprepa denna behandling på dag 3.
  14. Upprätthålla kulturer i en 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C och mata med 100 µL av 100 mM glukos till kulturen för varje 2 mL media varannan dag senaste 5 dagarna. En komplett media förändring krävs inte.

4. Lentivirus förpackning, rening och titrering

Obs: protokollet för förpackning, koncentration, rening och titrering av lentivirus har tidigare beskrivits i detalj utan användning av ett kit 28, inbegripet alternativa metoder för titrering, såsom flöde flödescytometri 29. Här presenterar vi kortfattat det protokoll som används i vårt labb för produktion av lentivirus för att studera neuronal skada med speedy virus rening lösning och en qPCR kit-lentiviral titrering.

  1. Plattan Hek293T celler i 10 cm kultur rätter med Dulbecco ' s modified Eagle ' s väsentliga minimalmedium (DMEM) kompletteras med 10% FBS. För att erhålla en hög viral titer, växa minst 5 plattor av Hek293T celler för varje transfection. Kontrollera att på dagen för transfection celler är 70% konfluenta. Ändra media tre timmar före transfection.
  2. För varje transfection, förbereda två rör. I röret lägga 1 till 1,5 mL MEM-reducerad serum media och 41 µL transfection reagens, blanda väl. I tube 2, lägga till 1,5 mL MEM-reducerad serum media och 6 µg av överföring plasmid, 6 µg av pCMV-dR8.2 vektor (förpackning plasmid), 3 µg pCMV-VSV-G vektor (kuvert plasmid) och 35 µL p3000 enhancer reagens (levereras med lipofectamine). Blanda väl, och kombinera rör 1 och 2, vortex och inkubera i 15 min.
  3. Bort 50% av media från Hek293T tallrikar och Lägg till DNA-lipid komplex celler. Inkubera i 6 h vid 37 ° C, 5% CO 2. Ta bort media och ersätta med 5 mL färsk DMEM, inkubera över natten.
  4. På 24 h efter transfection, samla in det första partiet av viral supernatanten från varje platta. Håll viral media vid 4 ° C och tillsätt 5 mL av färska media in varje platta av Hek293T celler. Inkubera över natten.
  5. 48 h efter transfection, samla in den andra omgången av viral supernatanten, kombinera det med den första omgången och centrifugera kombinerade viral supernatanten för 10 min vid 600 x g.
  6. Filtrera supernatanten genom ett filter med 45 µm porstorlek.
  7. Renar den virus användande en lösning för rening av speedy virus. För varje 45 mL viral supernatanten, tillsätt 5 mL av lentiviral bindande lösning, mix och Centrifugera i 10 min vid > 5.000 x g- och 4 ° C.
  8. Ta bort supernatanten försiktigt så att inte störa pelleten.
  9. Lägg till 20-40 µL av medium och resuspendera pelleten. Delprov och förvaras vid -80 ° C.
  10. Att få lentiviral titern, en qPCR lentiviral titrering kit används. Späd 2 µL av renat virus i 500 µL av PBS. Tillsätt 2 µL utspädda viruset i 18 µL virus lyseringsbuffert (medföljer i satsen).
  11. Uppsättning upp tre olika RT-q-PCR reaktioner i tripletter och märka dem som, virala lysat, positiv kontroll 1 (STD1) och positiv kontroll 2 (STD2). För varje reaktion lägger till 12,5 µL av 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µL av antingen virala lysat eller STD1 (medföljer i satsen) eller STD2 (medföljer i satsen) och 10 µL av reagens-mix (medföljer i satsen) i 0,2 mL PCR-rören.
  12. Ange PCR-programmet enligt följande: 20 min vid 42 ° C för omvänd Transkription, 10 min vid 95 ° C för enzym aktivering, 40 cykler av 15 s vid 95 ° C denaturering och 1 min vid 60 ° C för glödgning/förlängning.
  13. Beräkna viral titern med följande formel:
    Titer av virala lysat = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = genomsnittliga Ct-värde för okända provet, Ct1 = medelvärdet av STD1, Ct2 = medelvärdet av STD2.
    Obs: CGNs kan vara bästa sensorik med lentiviruses eller infekterade med adenoviruses beroende på läge skada som studeras. Tillägg av lentiviruses på en MOI på 2-3 till cell kultur lösning vid tidpunkten för plätering används för att studera NMDA inducerad signalering dag 7 av kulturen. Detta resulterar i mer än 80% transduktion och är lämpligt att fortsätta med biokemiska analyser av dessa nervceller ( figur 2). Tillägg av adenoviruses på dag 5 av kultur (vid MOI 50) och studera NMDA inducerad signalering vid dag 7-8 används för andra tekniker såsom imaging. Denna behandling resulterar i mindre än 10% infektion av nervceller, vilket gör den idealisk för avbildning och samtidig lokalisering av proteiner. Adenoviruses kan användas vid tidpunkten för plätering för att studera DNA skada inducerad celldöd genom tillsats av camptothecin på dag 2-3 eller oxidativ stress genom tillsats av väteperoxid. Förekomsten av fluorescerande protein (GFP, RFP, gemensamma fiskeripolitiken eller YFP) taggade till genen av intresse kan användas för att uppskatta procent transduktion och potentiella giftighet. Med den rekommendera MOI, ser vi minimal toxicitet och maximal transduction ( figur 3).

5. Modeling Neuronal skada

  1. att framkalla NMDA inducerad neuronala excitotoxicitet, efter 7 dagar i vitro, behandla CGNs med 100 µM NMDA och 10 µM glycin för 1 h. ersätta alla medium med luftkonditionerade medium från parallella kulturer med nr behandling. Denna koncentration leder till celldöd 50% på 24 h efterbehandling ( figur 3 c). Mitokondriell fragmentering är uppenbar vid 6-8 h efterbehandling (se Jahani-Asl o.a. 26 , 27).
  2. för att framkalla ROS-inducerad celldöd (oxidativ stress), behandla neurons med 75-100 µM väteperoxid (H 2 O 2) och växla till luftkonditionerade medier från parallella kulturer efter 5 min exponering för H 2 O 2. Observera att på grund av instabiliteten i H 2 O 2, optimera koncentrationen till en nivå som inducerar celldöd 50-70% i kultur efter 24 h behandling.
  3. Att inducera DNA skada inducerad celldöd, behandla CGNs med 10 µM camptothecin. Denna koncentration inducerar mer än 50% celldöd i 24 h. mitokondriell fragmentering och tidiga apoptotiska signalering sker 2-3 h efter tillsats av camptothecin vid denna koncentration (se Jahani-Asl et al. 18)
  4. för att framkalla låga K + inducerad neuronala apoptos i CGNs, ändra media som innehåller 25 mM K + till lågt kalium media med 5 mM K + efter 7 dagar in vitro-.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med noggrann dissektion, bör intakt hjärnan tas bort med minimal skada som kan ses i figur 1A-B. Ansträngning bör vidtas för att minimera skador på hjärnan under avlägsnandet, särskilt skador på lillhjärnan. Skada i lillhjärnan gör för svårare identifiering och avlägsnande av hjärnhinnorna, och ökar risken för kontaminering av neuronala kultur. När hjärnhinnorna har tagits bort, kan lillhjärnan dissekeras från den återstående vävnaden som kan ses i figur 1 c och förberett för dissociation.

Före plätering, kan CGNs sensorik med lentivirus eller infekterade med adenovirus som beskrivs i figur 2. Vi hitta maximal effektivitet och minimal toxicitet med MOI 50 för infektion med adenovirus och en MOI för 2-3 dag av plätering för lentivirus (figur 3).

Sensorik friska CGN kulturer på 7 DIV presenteras i figur 3A. Om ett stort antal glia kvar i kulturen, kan koncentrationen av AraC ökas för att säkerställa en ren neuronala befolkning. Gliaceller tar också upp viruset lättare än nervceller och det blir kritiskt om transductions utförs på dag 5. Förekomsten av nervceller som genomgår programmerad celldöd kan bedömas genom bildandet av pyknotiska kärnor som kan ses i figur 3 c. Alla koncentrationer av NMDA, H2O2och Camptothecin är optimerade för att inducera celldöd 50% efter 24 h. Detta tillåter för att studera andra tidiga händelser som föregår neuronala förlust såsom mitokondriell fragmentering.

Figure 1
Figur 1: borttagning av mus hjärnan och dissektion av lillhjärnan. (A) att extrahera hjärnan av en 6-7 dag gammal mus, med ett par pincett, förstå huvudet och skära huden anteriorly längs de streckade linjerna med hjälp av ett par lokalt sax. Var noga med att skära endast hud och bindväv, alltför djupa snitt kan punktera skallen och skada hjärnan. Dessa tre snitt, rakt längs mittlinjen, och två svängda sidled, Tillåt för huden att skjutas tillbaka avslöjar skallen. När utsatt, kan skallen vara penetrerade med spetsen på saxen och skär anteriorly. Vara måste mycket försiktig för att inte skada i lillhjärnan för att underlätta identifiering och avlägsnande av hjärnhinnorna. En gång skar, kan tången användas att skala tillbaka skallen, utsätter hjärnan som då kan vara benas ut till cool dissektion lösning med ett par pincett eller spatel. För att ta bort hjärnan, kan synnerven behöva avskiljas. (B) när bort från skallen, meningerna bör tas bort från lillhjärnan med ett par fina lutad pincett. (C) använda ett par fina lutad pincett, lillhjärnan är dissekeras från den återstående vävnaden och kontrolleras för att säkerställa fullständig borttagning av hjärnhinnorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Modeling neuronal skada i lillhjärnan granule nervceller. Isolerade cerebella från dag 6-7 möss dissocieras i enstaka celler enligt förfarandet som presenteras i del 3. Efter dissociation, cellerna räknas och resuspended i en volym av kultur media att generera 1,5 x 106 cells/mL.For 35 mm rätter, 4 mL är förgylld, ger 6 x 106 celler per platta. För imaging diabilder, är 0,5 mL klädd, ger 7,5 x 105 celler per brunn. CGNs kan sedan sensorik med lentivirus eller infekterade med adenovirus. Med hjälp av adenovirus på dagen för plätering (0 dagar i vitro (DIV)) ger mer än 90% transfection effektivitet och möjliggör studiet av neuronal skada genom oxidativ stress och DNA-skador. Tillägg av 10 µM camptothecin (CPT) kommer inducerar DNA-skador, medan 75-100 µM väteperoxid (H2O2) kommer att inducera oxidativ stress. Koncentrationen av H2O2 måste optimeras för att inducera celldöd 50% efter 24 h. Infektera med adenoviruses på 5 DIV ger en lägre transduktion verkningsgrad på mindre än 10%. På 7 DIV när NMDA-receptorer är berikad i kultur, kan nervceller behandlas med 100 µM NMDA och 10 µM glycin inducera excitotoxicitet. Detta är idealiskt för efterföljande imaging analys eller spåra en enda neuron. Slutligen transducing med lentivirus på 0 DIV, följt av att behandla med 100 µM NMDA och 10 µM glycin på 7 DIV, ger en tillräckligt hög transduktion effektivitet (> 80%) att tillåta för biokemisk analys av kultur, inklusive ChIP sekvensering, undersöka proteinuttryck, och uppträda live/dead analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: cerebellär granule neuroner. (A) nervceller var sensorik med lentiviruses för RFP på en MOI 3 vid tidpunkten för plätering, och fixeras och färgas på 7 dagar in vitro. Colocalization av RFP signal, MAP2 och Hoechst visas att demonstrera friska nervceller som är fullt sensorik av lentiviruses. (B) bilderna representerar levande döda assay analyser av nervceller infekterade med olika MOI, att mäta toxicitet. CGNs infekterade med adenovirus uttrycker Lindholm på en MOI mellan 25 och 50 möjliggör maximal effektivitet samtidigt som minimal toxicitet. Mindre än 1% skillnad i cellöverlevnad jämfört med kontroll ses när smitta på detta MOI. (C) Hoechst färgning av kontroll CGNs och CGNs behandlas med NMDA inducera celldöd. Observera bildandet av pyknotiska kärnor med NMDA-behandling. Detta är vägledande av celldöd och kan ses hos cirka 50% av den kultur 24 h efter behandling med 100 µM NMDA och 10 µM glycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här tillhandahåller vi en enkel metod för odling av primära mus cerebellär granule nervceller (CGNs), förlust och vinst av funktion studier och modellering olika mekanismer för celldöd. Flera faktorer påverkar reproducerbarheten för resultaten med denna procedur som kräver noggrann övervakning. Dessa inkluderar renheten av den kulturen inklusive eliminering av gliaceller i kultur, sammanflödet av kultur, och att upprätthålla friska celler. Att införa variabilitet i dessa faktorer kan bias resultaten och utmana reproducerbarhet. Nedan beskriver vi hur man kan minimera de faktorer som negativt påverkar resultaten.

För att eliminera gliaceller från CGNs kulturen och upprätta en ren neuronala befolkning, använder vi 10 µM av cytosin-β-arabino furanoside (AraC), en pyrimidin antimetabolit som dödar prolifererande celler genom att hämma DNA-syntes. Om det finns fortfarande en befolkning av gliaceller närvarande, kan koncentrationen av AraC ökas till 15 µM. Detta är också mycket beroende. Dessutom för kulturer som behålls för upp till 7-8 dagar, kan en andra AraC behandling utföras på dag 3. För att få en ren neuronala befolkning och undvika celldöd, är det viktigt att skala alla hjärnhinnorna av lillhjärnan innan skära vävnaden i bitar, följt av trypsinization. Detta bör göras inom en rimligt kort tidsperiod (inte längre än 7-10 min per lillhjärnan). Förekomsten av hjärnhinnorna i neuronala kulturen resulterar i ohälsosam kultur och så småningom celldöd. En annan faktor som kan leda till död av nervceller innan behandling är den trypsinization tiden. Det är viktigt att cellerna inte är alltför trypsinized. Däremot, kräver under-trypsinization ytterligare mekaniska dissociation av celler som kan skada dem eller leda till en låg avkastning. Därför trypsinization tiden kräver optimering och det är mycket beroende av.

Den nästa faktorn som bör beaktas är sammanflödet av cellerna vid tidpunkten för användningen. Olika konfluens kan generera variabilitet i resultaten. Detta är särskilt viktigt beroende på utslaget i experimenten. Med låg sammanflödet stat börjar nervceller klampa efter 2-3 dagar. Ett för lågt eller för högt sammanflödet tillstånd av nervceller försämrar signalering. Det är viktigt att räkna antalet levande celler för korrekt plätering.

Andra metoder för CGN kulturer har beskrivits, särskilt titta på grundläggande odling procedurer Papain Dissociation system med kit 30 som väl så efter odling förfaranden och manipulation av CGN för att studera neuronala migration och morfologi 31. Det protokoll som presenteras av Lee et al. Beskriver användning av Papain Dissociation System Kit. De rekommenderar två metoder för att öka renheten av de isolerade CGNs: kör cellerna genom en Percoll gradient separation, liksom före plätering på en poly-D-lysin tallrik i 20 min. Båda metoderna är till stöd i separation av CGNs från gliaceller föroreningar. Detta rekommenderas om behandling med AraC ensam inte är tillräcklig för att berika för neuronal renkultur. Dessutom använder Lee 4-6 dag gammal musungar, medan detta serverar en effektiv modell för att undersöka neuronal differentiering; Vi hitta med CGNs från 6-7 dag gammal musungar är lämpligare för studien av neuronal skada. Holubowska et al. presenterar ett protokoll för transfection inlägget mitotiska cerebellär nervceller använder kalciumfosfat metod i vitro och elektroporation i vivo. Dessa är utmärkta metoder för genetisk manipulation av nervceller där en enda neuron kan spåras. Transfection effektivitet kalciumfosfat metoden kan variera från 0,1-5%. Därför finner vi att användningen av lentiviruses för biokemiska analyser inklusive ChIP-Seq analyser, Co-immunoprecipitation och immunoblotting, är lämpligare eftersom det leder till mer än 80% transduktion när sensorik vid tidpunkten för plätering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av naturvetenskap och Engineering Research Council of Canada och den kanadensiska institut för hälsa forskning bidrag till A.J.-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

Neurovetenskap frågan 129 lillhjärnan cerebellär Granule nervceller (CGN) Adenovirus Lentiviral transduktion excitotoxicitet N-metyl-D-aspartat (NMDA) apoptos kaliumklorid (KCl) Camptothecin väteperoxid (H2O2)
Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter