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Neuroscience

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

Abstract

Neurônios de grânulo cerebelar (CGNs) são um modelo neuronal comumente usado, formando uma população homogénea abundante no cerebelo. Tendo em conta o seu desenvolvimento pós-natal, abundância e acessibilidade, CGNs são um modelo ideal para estudar processos neuronais, incluindo o desenvolvimento neuronal, a migração neuronal e estimulação da atividade neuronal fisiológica. Além disso, culturas CGN fornecem um modelo excelente para estudar os diferentes modos de morte celular, incluindo excitotoxicidade e apoptose. Dentro de uma semana em cultura, CGNs expressar receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), um receptor de glutamato de geleificação específicos com muitas funções críticas em saúde neuronal e doença. A adição de baixas concentrações de NMDA em conjunto com a despolarização da membrana para roedores culturas primárias de CGN tem sido usada para estimulação da atividade neuronal fisiológica do modelo enquanto a adição de altas concentrações de NMDA pode ser empregada para modelar excitotoxic lesão neuronal. Aqui, um método de isolamento e cultivo de CGNs de filhotes 6 dias de idade, bem como a manipulação genética de CGNs por adenovírus e lentivírus são descritos. Estamos também presentes protocolos otimizados em como estimular excitotoxicidade induzida por NMDA, baixo potássio-induzida apoptose, stress oxidativo e dano do ADN após transdução destes neurônios.

Introduction

Neurônios de grânulo cerebelar (CGNs) são bem caracterizados em cultura e têm servido como um modelo eficaz para estudar a morte neuronal e desenvolvimento 1,2,3,4,5, 6. a expressão inicial dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) no CGN culturas em vitro faz-lhes um modelo atraente para estudar induzida por NMDA sinalização. A ativação destes receptores com NMDA em conjunto com a despolarização da membrana é usada para modelar a estimulação da atividade neuronal fisiológica e tem permitido para pesquisa em mecanismos de plasticidade sináptica 7,8. Pelo contrário, excesso de estimulação desses receptores por ligante NMDA pode ser usado para modelar excitotoxicidade, um importante mecanismo de perda neuronal aguda doenças danos cerebrais e neurodegenerativas 9. Um mecanismo para a indução da excitotoxicidade é através da inanição de ATP com oxigênio reduzido, como pode ser visto com lesão neuronal aguda. Isso resulta na despolarização da membrana e liberação de níveis elevados de glutamato em sinapse. A superestimulação subsequente do receptor NMDA pelo glutamato elevado resulta em excessiva Ca2 + influxo através destes receptores, que por sua vez ativa diversos caminhos, incluindo Ca2 +-ativado proteases, fosfolipases, e endonucleases, resultando na degradação descontrolada da críticos componentes celulares e morte celular. Além disso, alta intracelular Ca2 + leva à geração de radicais livres de oxigênio e dano mitocondrial 10,11.

Enquanto a maioria da perda neuronal após excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA é devido ao influxo de cálcio e é independente de Bax/Bak, outros mecanismos de morte celular não podem ser excluídos deste modelo. A aparência de ambos necrótico e apoptose morte celular devido a excitotoxicidade é parcialmente devido a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e danos no DNA causados poralta intracelular Ca 2 + níveis 12. Dano do ADN resulta em morte neuronal através de mecanismos de apoptose, sendo correlacionados com marcas da morte de apoptose celular, como o aparecimento de massas de cromatina e corpos apoptotic. Indução da apoptose é mediada através da liberação de citocromo c da mitocôndria e foi mostrada para ser dependente de Bax/Bak oligomerização 13. Bax/Bak oligomerização promove a formação de poros na membrana mitocondrial externa, resultando em citocromo c liberação e ativação de pro-apoptotic reguladores como visto com lesão isquêmica leve 14.

Geração de ROS é uma questão importante no cérebro devido os baixos níveis endógenos de antioxidantes, juntamente com a exigência de oxigênio grande para funcionamento neuronal 15. Quando exposta a um evento isquêmico, óxido nítrico sintase é upregulated, produzir o óxido nítrico e aumento de espécies reativas de oxigênio 14. A maior concentração de radicais de oxigênio pode resultar em danos ao DNA e indiretamente causar fome de energia. Altos níveis de quebras de dupla-hélice do DNA são corrigidos por ativação de poli ADP-ribose polimerase-1 (PARP-1), uma proteína de limite a cromatina eucariótica responsável por catalisar a transferência de unidades de ADP-ribose do NAD+, parte integrante de um processo Reparação de DNA 16. No entanto, com danos excessivos devido ao estresse oxidativo, ativação de PARP-1 pode causar fome de energia devido a drenagem aumentada no NAD+, um substrato necessário para a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Em última análise, estresse oxidativo irá desencadear a apoptose em uma maneira dependente de Bax/Bak levando a liberação c mitocondrial citocromo e foi mostrado para induzir a remodelação mitocondrial em CGNs 17.

Finalmente, mudanças na concentração de cloreto de potássio (KCl) em culturas CGN podem ser usadas para modelar baixo potássio/despolarização mediada por apoptose 18,19,20. Quando expostos a baixos níveis de K+, CGNs passam por mudanças fisiológicas distintas, resultando em reduções de respiração mitocondrial e glicólise, atribuído à diminuição da demanda de celulares 21, bem como a redução dos níveis de nuclear factor-κB (NFκB) que regula as atividades, incluindo a inflamação e a transmissão sináptica 22. Este modelo é de particular interesse para o estudo da morte celular durante o desenvolvimento neuronal. O ambiente de K+ baixo mais de perto se assemelha a condições fisiológicas e provoca marcas da morte celular durante o desenvolvimento neuronal 23.

Em resumo, CGNs fornecer um modelo de longa data para investigar os mecanismos moleculares subjacentes da morte neuronal e degeneração. O seguinte protocolo permitirá isolamento e cultivo de CGNs, expressão ou repressão um percurso genético específico usando o vírus e a indução de morte neuronal através de diferentes mecanismos que representa a degeneração e lesão neuronal.

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Protocol

este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que foram previamente descrito 18 , 24 , 25 , 26 , 27. o presente protocolo é aprovado pelo Comité de cuidado Animal na Universidade McGill.

1. preparação experimental

Nota: as seguintes soluções estoque podem ser preparadas e mantidas até o uso.

  1. Solução de dissecação
    1. dissolver 3,62 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 0,069 g de fosfato de sódio (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) e 1,306 g de D-(+)-glicose em 500 mL de água destilada H 2 O. Em seguida, adicione 12,5 mL de tampão HEPES, 450 µ l de solução de vermelho de fenol e 20 mL da fração BSA V à solução. Ajustar o pH 7,4 usando 1 N de hidróxido de sódio (NaOH).
    2. Esterilize com 0,22 µm filtro e em 4 ° C. Esta solução permanecerá estável por até uma semana a 10 dias.
  2. Tripsina
    1. preparar uma solução com uma concentração de 25 g/L de tripsina em cloreto de sódio 0,9%. Armazenar a solução a -20 ° C.
  3. Inibidor de tripsina
    1. preparar um estoque com uma concentração de 10 mg/mL, dissolvendo 1 g de inibidor de tripsina de clara de ovo de galinha em 100 mL de HCl. loja de 1 mM esta solução a -20 ° C.
  4. DNase
    1. dissolver 100 mg de DNase 1 em 10 mL de água estéril para gerar um estoque de 10 mg/mL. Armazenar a solução a -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. Adicionar 6,02 g de sulfato de magnésio (MgSO 4) a 50 mL de água destilada (H 2 O) para gerar um estoque de 1 M. Conservar a solução em 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. dissolver 0,735 g de cloreto de cálcio (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) em 50 mL de água destilada H 2 O a uma concentração de ações de 100 mM. Conservar a solução em 4 ° C.
  7. KCl
    1. dissolver 3.7275 g de KCl em 50 mL de água destilada de H 2 O a uma concentração de ações da solução de armazenamento de 1 M. em 4 ° C.
  8. D-(+)-glicose
    1. dissolver 1,802 g de D-(+)-glicose em 50 mL de água destilada de H 2 O a uma concentração de ações de 100 mM. Conservar a solução em 4 ° C.
  9. Meios de cultura de célula
    1. preparar meios de cultura celular da seguinte maneira: 5 mL de calor inativada dializados soro bovino Fetal, 500 µ l de 200 mM L-glutamina, 100 µ l de 50 mg/mL de gentamicina e 1 mL de 1,0 M de KCL devem ser adicionados aos 45 mL de filtro esterilizado águia ' s essencial media mínimos (E-MEM) que são suplementados com 1,125 g/L D-glicose para gerar 50 mL de meios de cultura de neurônio cerebelar do grânulo. Armazenar a mídia em 4 ° C.
  10. Furanoside de Beta-D-Arabino citosina
    1. dissolver 48 mg de furanoside de beta-D-arabino citosina em 10 mL de meio de crescimento para uma concentração das ações de 20 mM. Armazenar a solução a -20 ° C.
  11. Poli-lisina-D
    1. para gerar um poli de 2 mg/mL estoque D-lisina, adicionar 10 mL de estéril H 2 O a 20 mg de poli D-lisina. Ações poli D-lisina deve ser armazenado a-80 ° C em 100 alíquotas µ l.
  12. Nota: as seguintes soluções devem ser preparadas antes dissecação e mantidas a 4 ° C até o uso.
  13. MgSO 4 solução de dissecação Supplemented
    1. Adicionar 300 µ l de estoque MgSO 4 a 250 mL de solução de dissecação.
  14. Solução de tripsina dissecação
    1. Adicione 100 µ l de estoque tripsina e 12 µ l de estoque MgSO 4 a 10 mL de solução de dissecação.
  15. 1 de solução de inibidor de tripsina
    1. Adicionar 164 µ l do inibidor de tripsina estoque, 250 µ l de estoque DNase 1 e 12 µ l de estoque MgSO 4 a 10 mL de solução de dissecação.
  16. 2 de solução de inibidor de tripsina
    1. Adicionar 1040 µ l do inibidor de tripsina estoque, 750 µ l de estoque DNase 1 e 12 µ l de estoque MgSO4 a 10 mL de solução de dissecação.
  17. CaCl 2 suplementado solução dissecação
    1. Adicionar 10 µ l de estoque CaCl 2 e 25 µ l de estoque MgSO 4 a 10 mL de solução de dissecação.
  18. Poli D-lisina revestido cultura pratos
    1. para revestir pratos de cultura, diluir 100 µ l de estoque poli D-lisina em 40 mL de estéril H 2 O. Para pratos de cultura Nunc 35mm, adicione 2 mL de poli diluído solução D-lisina. Para 4 placas bem, adicionar 300 µ l de diluídos poli D-lisina em cada Pocito.
    2. Deixa o poli-lisina D sentar-se por 1h antes de aspirar e lavar cada um bem com 4 mL ou 600 µ l (para 35 milímetros cultura pratos ou 4 placas de bem, respectivamente) de estéril H 2 O. Depois Aspire o H 2 O e deixe o ar de pratos secar por 1 h.

2. Extração e isolamento do cerebelo do cérebro

  1. Decapitate por 6-7 dia filhote de rato velho usando tesouras de decapitação. Faz a dissecação do cérebro em uma capa de cultura de tecido estéril.
  2. Para remover o cérebro, segure a cabeça usando um par de pinças e cortar a pele em direção a parte anterior da cabeça usando tesouras microdissection conforme demonstrado na Figura 1. Então corte através do osso do crânio usando um novo par de tesouras para minimizar o risco de contaminação. Remover o crânio que cobrem o cérebro usando fórceps e destrinchar o cérebro usando uma espátula de fórceps.
    1. Conforme necessário, cortar o nervo óptico para facilitar sair o cérebro como um todo.
  3. Coloque o cérebro na solução de dissecação, que é complementada com MgSO 4. Manter a solução e o cérebro no gelo
  4. Seguinte remoção, sob um microscópio de dissecação do cérebro, dissecar o cerebelo do cérebro enquanto ainda na solução de dissecação MgSO 4 completadas e remover as meninges usando pinça fina. Vire o cerebelo para seu lado ventral e garantir a remoção do plexo coroide.
  5. o cerebella do pool em um prato de 35mm contendo ~ 1 mL de solução de dissecação MgSO 4 completadas.
  6. Cortar o tecido em pequenos pedaços e transferir para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de dissecação MgSO 4 buffer.

3. Mouse cerebelar grânulo neurônio isolamento e Culturing

  1. centrifugar o tubo de 50 mL contendo o tecido cerebral picado por 5 min em 644 x g e 4 ° C.
  2. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de solução de dissecação de tripsina. Em seguida, agitar o tubo em alta velocidade por 15 min a 37 ° C.
  3. Adicionar 10 mL de solução de inibidor de tripsina 1 para o tubo e a pedra delicadamente por 2 min.
  4. Centrifugar o tubo por 5 min em 644 x g e 4 ° C.
  5. Remover o sobrenadante e adicionar 2 mL de solução de inibidor de tripsina 2 e depois transferir para um tubo de 15 mL.
  6. Triture o tecido no tubo de 15 mL até que a solução torna-se turva. Então deixe de se contentar com 5 min.
  7. Remover o sobrenadante claro e transferir o sobrenadante para um novo tubo contendo 1 mL de solução de dissecação CaCl 2 suplementado.
  8. Adicionar outra mL de solução de inibidor de tripsina 2 para o fundo do tubo contendo a pelota da etapa 3.6. Triture novamente e deixa-se por 5 min. Retire o sobrenadante e adicioná-lo ao tubo contendo o sobrenadante da etapa 3.7 (que é uma repetição de passos 3.6-3.7). Repita este processo até que a maioria do tecido é mecanicamente dissociado.
  9. Adicionar 0,3 mL de CaCl 2 suplementado solução de dissecação à coleção sobrenadante para cada mL do sobrenadante.
  10. Misturar o conteúdo do tubo e centrifugar durante 5 min à 644 x g..
  11. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de mídia fresca ao pellet e misture.
  12. Células podem ser contadas e diluídas a uma concentração de 1,5 x 10 6 células/mL. Por favor, note que, em geral, 10 milhões de células são esperados de cada cérebro dissecado, dependente do tempo tripsinização e eficiência de dissecação. Placa de células em placas de poli anteriormente feito D-lisina. Para placas 4 boas, chapa de 0,5 mL, dando 7,5 x 10 5 células por poço. Para pratos de 35 mm, placa de 4 mL, dando 6 x 10 6 células por placa.
  13. Após 24 h, adicionar citosina-β-arabino furanoside (AraC) para as placas para reduzir a contaminação glia. Para cada mL de mídia 0,5 µ l de 20mm AraC é necessária. Adição de AraC não exige uma mudança de mídia. Se as células são para ser mantida por 7 a 8 dias, repetir este tratamento no dia 3.
  14. Manter culturas numa incubadora 5% CO 2 a 37 ° C e alimentar com 100 µ l de glicose de 100 mM, adicionado à cultura para cada 2 mL de mídia a cada 2 dias últimos 5 dias. Uma mudança completa de meios de comunicação não é necessária.

4. Embalagens de Lentivirus, purificação e titulação

Nota: O protocolo para a embalagem, concentração, purificação e titulação de lentivirus anteriormente foi descrito em detalhe sem o uso de um kit 28, incluindo métodos alternativos para a titulação, tais como fluxo cytometry 29. Aqui apresentamos brevemente o protocolo usado no nosso laboratório para a produção de lentivirus para estudar a lesão neuronal usando solução de purificação de vírus rápida e um kit de titulação Lentivirus qPCR.

  1. Placa Hek293T células em pratos de cultura de 10 cm com Dulbecco ' s modificado águia ' s essencial meio mínimo (DMEM) suplementado com 10% FBS. Para a obtenção de um alto título viral, cresce pelo menos 5 placas de células Hek293T para cada transfeccao. Certifique-se que no dia de células de transfeccao são 70% de Confluencia. Mudar a mídia três horas antes do transfection.
  2. Para cada transfeccao, preparar dois tubos. No tubo 1 Adicione 1,5 mL soro MEM-reduzida media e 41 µ l de reagente de transfeccao, misture bem. No tubo 2, adicione 1,5 mL de mídia soro MEM-reduzido e 6 µ g de plasmídeo de transferência, 6 µ g de pCMV-dR8.2 vetor (plasmídeo de embalagem), vetor de pCMV-VSV-G 3 µ g (plasmídeo de envelope) e 35 µ l de reagente de potenciador p3000 (fornecido com lipofectamine). Misture bem e combinar tubos 1 e 2, vórtice e incube por 15 min.
  3. Retire 50% da mídia Hek293T chapas e adicionar complexos lipídios-DNA às células. Incube durante 6 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Meios de remover e substituir com 5 mL de DMEM fresco, incubar durante uma noite.
  4. Em 24 h após transfeccao, coletar o primeiro lote de viral sobrenadante de cada prato. Mantenha a mídia viral a 4 ° C e adicionar 5 mL de mídia fresca em cada placa de células Hek293T. Incubar durante uma noite.
  5. 48 h pós-transfection, coletar o segundo lote de sobrenadante viral, combiná-lo com o primeiro lote e centrifugar o sobrenadante viral combinada durante 10 minutos a 600 x g.
  6. Filtrar o sobrenadante através de um filtro com tamanho de poro 45 µm.
  7. Purificar o vírus usando uma solução de purificação de vírus de rápida. Para cada 45 mL de sobrenadante viral, adicionar 5 mL de solução de vinculação Lentivirus, mistura e centrifugar durante 10 minutos a > 5.000 x g e 4 ° C.
  8. Remover o sobrenadante cuidadosamente para não perturbar o sedimento.
  9. Adicionar 20 a 40 µ l de meio e ressuspender o sedimento. Alíquota e conservar a -80 ° C.
  10. Para obter o título de Lentivirus, um kit de titulação Lentivirus qPCR é usado. Dilua 2 µ l de vírus purificado em 500 µ l de PBS. Adicionar 2 µ l do vírus diluído a 18 µ l de tampão de lise de vírus (fornecido no kit).
  11. Conjunto de três diferentes reações de PCR-RT-q em triplica e rotulá-los como, controle de lisado, positivo viral 1 (STD1) e controle positivo 2 (STD2). Para cada reação adicionar, 12,5 µ l de 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µ l de qualquer viral lisado ou STD1 (fornecido no kit) ou STD2 (fornecido no kit) e 10 µ l de reagente-mix (fornecido no kit) em tubos PCR de 0,2 mL.
  12. Definir o programa PCR como segue: 20 min a 42 ° C, durante a transcrição reversa, 10 min a 95 ° C, para a ativação da enzima, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C para desnaturação e 1 min a 60 ° C para recozimento/extensão.
  13. Calcular o título viral usando esta fórmula:
    Título do viral lisado = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = valor médio do Ct da amostra desconhecida, Ct1 = valor médio da STD1, Ct2 = valor médio de STD2.
    Nota: CGNs pode ser melhor transduzidas com lentivírus ou infectados com adenovírus dependendo do modo da lesão a ser estudado. Adição de lentivírus em um MOI de 2-3 para a solução de cultura celular no momento do chapeamento é usada para estudar NMDA induzido sinalização no 7º dia da cultura. Isso resulta em mais de 80% transdução e é apropriado para prosseguir com as análises bioquímicas destes neurônios ( Figura 2). Adição de adenovírus no dia 5 de cultura (em MOI 50) e estudando NMDA induzido sinalização no dia 7-8 é usada por outras técnicas como a imagiologia. Este tratamento resulta em menos de 10% infecção dos neurônios, tornando-se ideal para geração de imagens e localização co de proteínas. Adenovírus podem ser usados no momento do chapeamento para estudar a morte de pilha do DNA danos induzidos pela adição de camptothecin no dia 2-3 ou estresse oxidativo pela adição de peróxido de hidrogênio. A presença de proteínas de fluorescência (GFP, RFP, PCP ou YFP) marcada para o gene de interesse pode ser usada para estimar a porcentagem transdução e toxicidade potencial. Com o MOI recomendada, vemos toxicidade mínima e máxima transdução ( Figura 3).

5. Modelagem de lesão Neuronal

  1. para induzir NMDA induzida excitotoxicidade neuronal, após 7 dias em vitro, tratar CGNs com 100 µM NMDA e glicina de 10 µM para 1 h. Substitua todo o meio meio condicionado de culturas paralelas com n tratamento. Esta concentração resulta em morte celular de 50% no tratamento de post de 24 h ( Figura 3). Fragmentação mitocondrial é evidente no tratamento de post de 6-8 h (ver Jr-Asl et al 26 , 27).
  2. para induzir a morte celular induzida por ROS (estresse oxidativo), tratar neuroNS com 75-100 µM de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) e interruptor para condicionado meios de culturas paralelas, após a exposição de 5 min a H 2 O 2. Nota, devido à instabilidade de H 2 O 2, otimizar a concentração a um nível que induz a morte celular de 50-70% na cultura após 24 h de tratamento.
  3. Para induzir DNA dano morte celular induzida, tratar CGNs com 10 µM camptothecin. Esta concentração induz a mais do que a morte celular de 50% em 24 h. fragmentação mitocondrial e sinalização precoce de apoptose ocorre 2-3 h após a adição de camptothecin nessa concentração (ver Jr-Asl et al 18)
  4. para induzir baixo K + induzida neuronal apoptosis em CGNs, mudar a mídia contendo 25 mM K + a mídia de baixo nível de potássio com 5 mM K + após 7 dias em vitro.

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Representative Results

Com dissecção cuidadosa, o cérebro intacto deve ser removido com danos mínimos, como pode ser visto na figura 1A-B. Esforço deve ser tomado para minimizar os danos ao cérebro durante a remoção, particularmente danos no cerebelo. Danificar o cerebelo faz mais difícil identificação e remoção completa das meninges e aumenta a probabilidade de contaminação da cultura neuronal. Uma vez que foram removidas das meninges, o cerebelo pode ser dissecado do tecido remanescente, como visto na Figura 1 e preparado para dissociação.

Antes de chapeamento, CGNs pode ser transfectadas com lentivirus ou infectados com o vírus adenoide, conforme descrito na Figura 2. Encontramos a máxima eficiência e toxicidade mínima com 50 MOI de infecção com o adenovírus e um MOI de 2-3 no dia de chapeamento de lentivirus (Figura 3).

Culturas CGN transduzidas saudáveis na DIV 7 são apresentadas na Figura 3A. Se um grande número de glia permanecem presente na cultura, a concentração de AraC pode ser aumentada para garantir uma população neuronal pura. Também células gliais ocupam o vírus mais facilmente do que os neurônios e isso torna-se crítica se as transductions são realizadas no dia 5. A presença de neurônios submetidos a morte celular pode ser avaliada pela formação de núcleos picnóticos, como visto na Figura 3. Todas as concentrações do NMDA, H2O2e Camptothecin são otimizados para induzir a morte celular de 50% após 24 h. Isto permite estudar outros primeiros eventos que precedem a perda neuronal como fragmentação mitocondrial.

Figure 1
Figura 1: remoção de cérebro de rato e dissecação do cerebelo. (A) para extrair o cérebro de um rato de 6-7 dias de idade, usando um par de pinças, segure a cabeça e cortar a pele anteriormente ao longo das linhas pontilhadas usando um par de tesouras de microdissection. Tenha cuidado para cortar somente a pele e o tecido conjuntivo, uma incisão profunda também pode perfurar o crânio e danificar o cérebro. Estas três incisões, em linha reta ao longo da linha mediana e dois, curvando-se lateralmente, permitem que a pele ser empurrado de volta revelando o crânio. Uma vez expostos, o crânio pode ser penetrado com a ponta da tesoura e cortar anteriormente. Grande cuidado deve ser tomado para não danificar o cerebelo para facilitar a identificação e remoção das meninges. Uma vez cortado, fórceps pode ser usado para descascar o crânio, expondo o cérebro, que então pode ser esmiuçado para fora em solução de dissecação legal usando um par de pinças ou espátula. A fim de remover o cérebro, o nervo óptico pode precisar de ser cortada. (B) uma vez retirados do crânio, das meninges deverá ser retiradas o cerebelo usando um par de pinças de ponta fina. (C) usando um par de pinça com ponta fina, o cerebelo é dissecado do tecido remanescente e inspecionado para garantir a remoção completa das meninges. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: modelagem lesão neuronal em neurônios Cerebelares grânulo. Cerebella isolado do dia que 6-7 ratos são dissociados em células individuais, seguindo o procedimento apresentado na parte 3. Após dissociação, as células são contadas e resuspended em um volume de meios de cultura para gerar 1,5 x 106 cells/mL.For pratos de 35 mm, 4 mL são banhados, dando 6 x 106 células por placa. Para imagens slides, 0,5 mL é chapeado, dando 7,5 x 105 células/poço. CGNs pode então ser transfectadas com lentivirus ou infectados com o vírus adenoide. Usando adenovírus no dia do chapeamento (0 dias em vitro (DIV)) dá maior que 90% de eficiência de transfeccao e permite o estudo da lesão neuronal através de stress oxidativo e dano do ADN. A adição de 10 µM camptothecin (CPT) irá induzir dano do ADN, enquanto 75-100 µM peróxido de hidrogênio (H2O2) irá induzir o estresse oxidativo. A concentração de H2O2 deve ser otimizada para induzir a morte celular de 50% após 24 h. Infectando com adenovírus na DIV 5 dá uma baixa eficiência de transdução de menos de 10%. Na DIV 7 quando os receptores NMDA são enriquecidos na cultura, neurônios podem ser tratados com 100 µM NMDA e glicina de 10 µM para induzir excitotoxicidade. Isto é ideal para posterior análise de imagem ou rastreamento de um único neurônio. Finalmente, transducing com lentivirus no DIV 0, seguido pelo tratamento com NMDA de 100 µM e 10 µM glicina, na DIV 7, dá uma eficiência de transdução suficientemente alta (> 80%) para permitir a análise bioquímica da cultura, incluindo ChIP sequenciamento, examinando expressão da proteína e realizando ensaios ao vivo/morto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: neurônios Cerebelares grânulo. (A) neurônios foram transformados com lentivírus para RFP em um MOI de 3 no momento do chapeamento e fixo e manchados em 7 dias in vitro. Colocalization do sinal RFP, MAP2 e Hoechst é mostrado para demonstrar neurônios saudáveis que são totalmente transformados por lentivírus. (B) as imagens representam análises ao vivo morto ensaio de neurônios infectados com MOI diferente, para medir a toxicidade. CGNs infectados com adenovírus expressando LacZ em um MOI entre 25 e 50 permite a máxima eficiência, mantendo a toxicidade mínima. Menos do que uma diferença de 1% na sobrevivência da pilha em relação ao controle é vista quando infectando a este MOI. (C) Hoechst coloração de controle CGNs e CGNs tratados com NMDA para induzir a morte celular. Observe a formação de núcleos picnóticos com tratamento de NMDA. Isso é indicativo de morte celular e pode ser visto em aproximadamente 50% da cultura 24 h após o tratamento com NMDA de 100 µM e 10 µM glicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui nós fornecemos um método simples para o cultivo de neurônios de grânulo cerebelar mouse principal (CGNs), perda e ganho de estudos de função e modelagem de diferentes mecanismos de morte celular. Vários fatores afetam a reprodutibilidade dos resultados usando este procedimento que requerem monitoramento de perto. Estes incluem a pureza da cultura, incluindo a eliminação das células gliais na cultura, a confluência da cultura e manter as células saudáveis. Introdução de variabilidade nesses fatores pode influenciar os resultados e desafiar a reprodutibilidade. Abaixo descrevemos como minimizar os fatores que afetam negativamente os resultados.

Para eliminar as células gliais da cultura CGNs e estabelecer uma população neuronal pura, usamos 10 µM de citosina-β-arabino furanoside (CH), um antimetabolite pirimidina que mata pilhas proliferating inibindo a síntese de DNA. Se ainda houver uma população de células gliais presentes, a concentração de AraC pode ser aumentada para 15 µM. Isto também é muito dependente. Além disso, para culturas que são mantidas por até 7-8 dias, um segundo tratamento AraC pode ser realizado no dia 3. Para obter uma população neuronal pura e evitar a morte celular, é importante descascar todas as meninges fora o cerebelo antes de cortar o tecido em pedaços, seguidos por tripsinização. Isso deve ser feito em um período razoavelmente curto de tempo (não mais de 7-10 min por cerebelo). A presença de meninges nos resultados da cultura neuronal em cultura insalubre e, eventualmente, morte celular. Outro fator que pode resultar na morte de neurônios antes do tratamento é o tempo de tripsinização. É importante que as células não são excessivamente trypsinized. Por outro lado, sob-tripsinização requer mais uma dissociação mecânica das células que podem danificá-los ou resultar em um baixo rendimento. Portanto, o tempo de tripsinização requer otimização e é muito dependente.

O próximo fator a ser considerado é a confluência das células no momento da utilização. Confluência de diferente pode gerar variabilidade nos resultados. Isto é particularmente importante dependendo a leitura nos experimentos. Com um estado de baixa afluência, neurônios começam a amontoar-se após 2-3 dias. Um estado muito baixo ou muito alto de confluência dos neurônios prejudica a sinalização. É importante contar o número de células vivas para o chapeamento preciso.

Outros métodos de culturas CGN têm sido descritos, particularmente olhando para os procedimentos básicos de cultivo usando um sistema de dissociação de papaína kit 30 como manipulação de CGN e procedimentos bem como pós-cultivo a fim de estudar a migração neuronal e morfologia de 31. O protocolo apresentado por Lee et al . Descreve o uso do Kit de sistema de dissociação de papaína. Eles recomendam dois métodos para aumentar a pureza dos CGNs isolados: executando as células através de uma separação de gradiente de Percoll, bem como pré-chapeamento em uma placa de poli-D-lisina por 20 min. Ambos os métodos são para auxiliar na separação de CGNs de contaminantes gliais. Isso é recomendado no caso de tratamento com AraC sozinho não é suficiente para enriquecer para pura cultura neuronal. Além disso, Lee usa filhotes de rato de 4-6 dias de idade, enquanto isto serve um modelo efetivo para examinar a diferenciação neuronal; Podemos encontrar usar CGNs de filhotes de rato de 6-7 dias de idade é mais apropriado para o estudo da lesão neuronal. Holubowska et al apresenta um protocolo para transfeccao de post mitóticos neurônios Cerebelares usando o fosfato de cálcio método in vitro e eletroporação em vivo. Estas são excelentes métodos para manipulação genética dos neurônios, em que um único neurônio pode ser rastreado. A eficiência de transfeccao usando método de fosfato de cálcio pode variar de 0.1-5%. Portanto, encontramos que para análises bioquímicas, incluindo ChIP-Seq análises Co-imunoprecipitação e immunoblotting, uso do lentivírus é mais adequado que resulta em mais de 80% transdução quando transfectadas aquando do chapeamento.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado por ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá e os institutos canadenses de pesquisa em saúde concede ao AJ-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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References

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Neurociência edição 129 cerebelo neurônios de grânulo cerebelar (CGN) adenovírus transdução Lentivirus excitotoxicidade N-metil-D-aspartato (NMDA) apoptose cloreto de potássio (KCl) Camptothecin peróxido de hidrogênio (H2O2)
Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios
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Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

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