Summary
형광 -제자리 교 잡 (물고기) 종종 histopathology 및 맞춤 의학에서 치료의 선택에 대 한 분자 진단에 필요 합니다. 있도록 고품질 형태 론 적, 분자 그리고 물고기 분석 동일한 견본에서 포스트 고정 단계의 추가 의해 물고기를 제시 하기 전에 새로운 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액.
Abstract
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 샘플의 형태 론 적 평가 형태학의 그것의 우수한 보존으로 인해 수십 년 암 진단에 대 한 황금 표준 되었습니다. 맞춤된 의학은 점점 결합된 형태학 및 분자 분석 기술 및 진단으로 사용 하는 특징이 개별 질병에 대 한 개별적으로 적응 하 고 타겟 요법을 제공 합니다. 성능 같은 FFPE 견본에서 형태 론 적과 분자 분석 실험의 화학 수정으로 인해 포 르 말린의 부정적인 영향 때문에 도전 이며 핵 산 및 단백질의 cross-linking. 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액 즉 모두의 요구를 충족, FFPE 같은 형태학 및 곳을 알아내는-보존 같은 생체를 유지 하기 위해 최근에 개발 되었습니다. 생선 자주 함께 histopathology 및 분자 진단 필요, 이후이 새로운 정착 액으로 치료 하는 조직에 물고기 프로토콜의 적용 테스트. 우리는 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)에 있는 조직학의 비-크로스-연결, 포 르 말린-무료 및 파라핀 포함 (NCFPE) 유 방 암 조직 생성 해당 결과 FFPE 조직으로 그의 그 말린 후 고정 물고기 분석입니다. 이 프로토콜 양측 검정 조직학 섹션의 간단한 후 정착 단계에 의해 NCFPE 조직에 대 한 물고기 분석 결과 원래 개발 및 FFPE 직물에 대 한 유효성 검사를 사용 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
맞춤된 의학은 점점 형태학 및 분자 조직 분석을 포함 하는 다중 매개 변수 테스트에 의존 합니다. 금으로 조직의 포 르 말린 고정 우수한 형태 론 적 질1,2를 제공합니다. 그러나, 포 르 말린-유도 된 화학 수정 및 부정적인 단백질 및 핵 산3,,45 의 cross-linking 분자 분석6방해 합니다. 이러한 분자 수정 제한 핵 산 및 단백질의 품질 및 유전자 시퀀스 유물7 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 감소 된 감도에서 발생할 수 있습니다-기반 분석8. 주요 노력 FFPE 직물에 대 한 분자 테스트를 최적화 하기 위해 찍은, 비록 포 르 말린 고정 하기가 다른 보존 절차에 대 한 조직 샘플을 분할 하는 데 필요한 일반적인 우수한 곳을 알아내는-보존 조직입니다. 곳을 알아내는-보존 한 비-크로스-링크, 분자 분석에 대 한 필요성을 피하기 위해 포 르 말린-무료 통, PAXgene 조직 개발 되었다. 이 상용 시스템 정착 및 안정화 솔루션을 포함 하는 다른 알콜, 초 산 및 수용 성 유기 화합물의 구성 됩니다. 핵 산, 단백질 (phospo) 및 형태학의 적절 한 보존 여러 연구6,9,10,11,,1213에 표시 했다.
암 진단에서 특정 응용 프로그램 translocations, submicroscopic 삭제 등 확대 14염색체 변경의 포괄적인 범위를 감지 하는 물고기입니다. 침략 적인 유방암 종양의 20% 증폭 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)를 표시 하는 예를 들어 유전자15,,1617, 빈약한 예 지18와 관련 ,19. 물고기에 의해 유방암에서 HER2 overexpression 및 증폭 상태의 안티 HER2 감독 치료를 위한 환자를 선택 하는 데 필요한 이며 동반자 진단에 의해 연방 약 협회 (FDA) (http://www.fda.gov/에 나열 된 MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. 건강 관리에 물고기 기반 동행자 진단의 광범위 한 응용 프로그램을 허용 하기 위하여 분석 실험 개발 되었고 FFPE 직물에 대 한 승인.
이전 연구에서 우리는 NCFPE 조직 FFPE 직물에 대 한 승인 되었습니다 물고기 분석에 사용할 수 없습니다 다는 것을 보였다. 그러나, 일련의 다른 게시물 고정 프로시저가 NCFPE 조직 보여주는 버퍼링 4% 포름알데히드의 고정 시간 NCFPE 조직 단면도의 18 h 이상 게시 시간의 테스트 FFPE 직물14함께 동등한 결과 달성.
이 연구에서 상세한 프로토콜을 제공 하며 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 고정 및 24 시간 4%의 영향 같은 기본 조직 표본에서 HER2 물고기와 RNA 품질에 대 한 사용 되는 단면에 포름알데히드 후 고정 버퍼 보여 줍니다.
그림 1: 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 및 비 크로스 연결의 RNA 분석에 대 한 단계를 표시 하는 다이어그램, 무료 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (NCFPE) 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
연구는 그라츠의 의학 대학 (참조 번호 20-066)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 오스트리아. 환자 서 면된 동의 준 후 조직 샘플의 수술 절제 기본 침략 적인 유 방 암 두 경우에서 얻은 했다.
1. 조직 고정
참고: 고정은 조직 수행 중 표준 버퍼 말린 솔루션 (SBFS), pH 6.8 CEN/TS에 따르면 pH 7.2에 버퍼링 3.7% (4%의 볼륨 일부 해당) 포름알데히드의 질량 분 율을 포함 하는 10% 포 르 말린 솔루션으로 정의 16827-1:2015 또는 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 고정 시스템 (아래 대체 고정 솔루션 라고도 함) 구성 된 실내 온도 (RT)에 정착 제와 안정제.
- 2 개 반 각각 4mm 충분 한 조직 수량을 보장 하기 위해 두꺼운으로 유 메 마른 메스로 암 조직 샘플을 잘라. NCFPE 또는 SBFS 조직 고정에 대 한 최대 크기 4 x 15 x 15 m m를 사용 합니다.
- 표준 조직 카세트에 종양 견본의 각 절반을 배치 하 고 SBFS 또는 4 부분 정착 액 및 한 부분 조직 (4 mL/1 g 조직 (이상적으로 10ml/1 g))의 볼륨 비율 (v/v) 당 볼륨 24 h에 대 한 대체 고정 솔루션에 잠수함.
- 전송 또는 고정 샘플 2-72 h에 대 한 안정제 솔루션으로 컨테이너를 열고, 조직 카세트 180 ° 선회 하 고 그것을 잠수.
- 잔여 SBFS를 제거 하는 RT에 30 분 동안 250 mL 70% 에탄올에 SBFS 고정 샘플 조직 카세트를 넣습니다.
참고:이 단계는 생체의 보존을 위한 fixatives 비 크로스 연결의 도움이 속성을 파괴할 것 이다 자동된 조직 프로세서에서 정착 액 처리 샘플 비 크로스 연결의 SBFS 오염을 방지 해야 합니다.
주의: SBFS 위험한 솔루션, 피부 자극, 눈 손상, 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다, 그리고 유전적 결함을 일으키는 의심은, 암, 호흡기 자극, 장기에 졸음과 원인 손상을 일으킬 수 있습니다. 다른 정착 제는 흡입, 피부 접촉에 의해 독성 고 삼, 눈과 피부, 흡입, 피부 접촉을 통해 아주 심각한 돌이킬 수 없는 효력의 위험 자극 하는 경우 삼 킨 경우. 두 고정 솔루션에 대 한 흡입 및 신체 접촉을 피해 야 한다. 적당 한 방호 복, 장갑, 그리고 눈과 얼굴 보호를 착용 하십시오. 증기 두건에서 작동 합니다. - 조직 처리, 포함 및 조직 단면 (섹션 2, 3)로 이동 합니다.
2. 조직 처리 및 포함
- 70% (2 x 15 분), 80% (30 분), 90% (60 분), 그리고 99% (2 x 60 분) 에탄올, 크 실 렌 (2 x 60 분) 뒤에 고정된 조직 샘플 조직 카세트의 stepwise 탈수를 수행 합니다. 다음 자동된 조직 프로세서 (4 x 45 분)에 파라핀을 침투.
- 탈수와 파라핀 침투 샘플을 놓고 집게를 사용 하 여 (또는 SBFS 고정) 금속 금형에.
- 샘플을 포함 5-10 mL 녹은 파라핀 (응고 점 56-58 ° C)에서 계측 파라핀 포함을 사용 하 여.
- 30 분-5 ° C에 냉각 플레이트에 금형을 놓습니다.
- 금형에서 파라핀 끼워 넣어진 조직 구획을 복구 합니다.
- 결과 블록에 저장 (또는 고정, 파라핀 포함 (NCFPE) 및 SBFS 고정 파라핀 포함 (FFPE)) 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서.
3. 조직 단면 및 슬라이드 준비 물고기
참고: FFPE 섹션은 직접 사용 물고기, NCFPE 섹션 슬라이드 후 물고기 절차 전에 24 h에 대 한 SBFS에서 해결 하는 동안.
- 톰에 단일 사용 블레이드를 삽입 하 고 10 µ m에 톰을 조정 합니다.
- 냉각 플레이트에서 첫 번째 블록을가지고 하 고에 그것을 삽입 합니다.
- 심지어 표면 달성 될 때까지 블록을 잘라. 브러쉬를 사용 하 여 톰을 청소 하 고 처음 2-3 섹션 3 µ m. 삭제 조정.
- 3 µ m 섹션 NCFPE 및 FFPE 블록의 고 냉 수 목욕 (초순)에 넣어.
참고: 중복 핵 없이 더 나은 사진을 얻으려면, 여기, 3-5 µ m manufacturer´s 지침에서 권장 한 대로 대신 2 µ m 섹션의 이미지 표시 됩니다. - 벌금 페인트 브러시와 조직 단면도의 접착 코팅된 현미경 슬라이드에 바늘 각 부동 섹션을 선택 합니다.
- 따뜻한 (40 ° C)에이 슬라이드를 빠지게 목욕 물 고 완전히 스트레칭 섹션.
- 섹션 다시 슬라이드에 신중 하 게 물 밖으로 슬라이드를 당겨서 넣고 주름을 방지 합니다.
- 모든 섹션에서 1 시간에 대 한 실 온에서 건조 하 게.
- 슬라이드는 파라핀을 녹여를 인큐베이터에서 30 분 동안 70 ° C에서 열.
- 유리 항아리를 얼룩에 가로로 슬라이드를 넣어.
- 얼룩 항아리에 RT에서 stepwise 섹션 다음 액체의 각 250 mL 가득 rehydrate: 100% 크 실 렌 2 x 15 분, 96% 에탄올 2 x 15 분, 2 분, 2 분, 2 분, 50% 에탄올 70% 에탄올 80% 에탄올 90% 에탄올 2 분 소 주 및 물 2 x 10 분.
주의: 증기 두건에서 deparaffinization 및 리하이드레이션 단계를 수행, 독성 volatilized 용 매를 흡입 하지 마십시오.
참고: 섹션 조직에 따라, 그것은 필요할 수 있습니다 다른 보육 시간을 사전에 테스트를.
4입니다. 포스트 고정 NCFPE 표본
- 새로운 얼룩 항아리 가득 SBFS 실시간 장소 증기 두건에서 항아리에 24 h에 대 한 24 시간 후 정착 단계에 그들을 둬서 NCFPE 슬라이드 후 고정을 수행 합니다.
- 인산 염으로 세척 하 여 제거 초과 SBFS 염 (3 x 10 분)를 버퍼링 하 고 증류수 (2 x 10 분).
5. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)
참고: 여기 물고기 상용 HER2/CEN17 듀얼 컬러 프로브 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 수행 됩니다. 조직 단면도 교 잡 및 세척 단계 동안 건조를 허용 하지 않습니다. DNA 프로브와 4', 더 긴 기간 동안 빛에 노출 될 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain 솔루션을 허용 하지 않습니다. 어둠 속에서 다음이 단계를 수행 광선이 컨테이너를 사용 하 여. 시료의 고정 단계와 나이 따라 증가 또는 감소는 변성 시키기 하 고 더 나은 교 잡 결과 얻기 위해 온도 씻어.
- 열 전처리 솔루션 98 ° C 물 욕조에 식용 색소의 250 mL를 포함 하는 얼룩 항아리 장소.
- Rehydrated FFPE 배치 후 고정된 NCFPE 항아리에 슬라이드 하 고 15 분 동안 품 어.
- 즉시, dropwise-을-준비-사용 펩 신 솔루션 (2 mg/ml)를 적용 (~ 드롭 당 30 µ l) 조직 섹션 완전히 덮여 때까지. 하이브리드 시스템에서 37 ° C에서 9 분 동안 품 어.
참고: 5-15 분의 외피 시간 것이 좋습니다. 베이스에 대 한 최적의 시간에 미리 확인 해야 한다. - 워시 버퍼 SSC를 포함 하는 항아리에 슬라이드를 배치 하 고 5 분 동안 품 어.
- 실시간에서 1 분 동안 증류수에 슬라이드를 린스
- 다음 등급된 알콜 탈수 섹션의 수행: 50%, 70%, 90%, 100% 각 1 분 공기에 대 한 섹션을 건조.
- 교 잡, 말린된 조직 단면도에 HER2/CEN17 프로브의 피 펫 10 µ L는 coverslip로 각 샘플을 커버 하 고 고무 시멘트로 밀봉.
참고: 조사의 10 µ L 22 x 22 m 조직 영역 당 것 좋습니다. 탐사선의 부드러운 온난화 쉽게 pipetting 과정. 거품과 프로브 빛에 오래 노출 하지 마십시오. - 10 분 동안 75 ° C에 있는 교 잡 시스템에서 프로브 및 견본 DNA 변성 공동.
- 37 ° C에 하이브리드 시스템을 설정 하 고 하룻밤 교배.
- 조심 스럽게 후 교 잡 및 검출을 위한 집게와 고무 시멘트를 제거.
- 얼룩 항아리 포함 미리 예 열 하는 37 ° C 1 x 워시 버퍼에 A 5 분 제거에 대 한 슬라이드는 coverslips를 품 어.
- 사용 하 여 슬라이드는 37 ° c.에 5 분 동안 두 번 1 x 워시 버퍼 A에 미리 예 열 세척
- 70%, 90%, 100% 에탄올, 1 분 각 슬라이드를 탈수.
- 공기에서 샘플을 건조 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
- 얼룩, 적용 30 µ L 거품을 피하고 교배 지역 DAPI 솔루션. 커버는 coverslip로 섹션.
- 빛에서 보호 하는 15 분 동안 품 어.
- 조심 스럽게 필터 종이 사이 슬라이드를 부드럽게 눌러 초과 DAPI 솔루션을 제거.
- Confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 될 때까지 최대 2 주 동안 어둠 속에서 2-8 ° C에서 슬라이드 저장 합니다.
6. 공초점 영상과 물고기 슬라이드 스캔
- Confocal 이미징 및 40 x 갖춘 confocal 디지털 스캐너에 슬라이드의 검색을 수행 / 1.2 나 목표, 쿼드 밴드 필터 (DAPI/FITC/TRITC/Cy5)와 5.5Mpx, 16 비트, 냉각 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 카메라.
- 녹색 필터는 이미지를 수집 (여기: 503 nm, 방출: 528 nm)과 오렌지색 (여기: 547 nm, 방출: 572 nm) 채널.
7입니다. 해석
참고: HER2/CEN17 프로브는 빨간색 형광 색소 표시 CEN17 프로브 특정 염색체 17의 알파 위성 centromeric 지역에 대 한 (D17Z1) 및 녹색 형광 색소 표시 HER2 프로브 특정 HER2 유전자 (조사 위치 17q12)의 혼합물 이다. 증폭17득점 하 고 그 HER2:CEN17 비율 ≥2.0 반면 핵 당 HER2:CEN17 비율 ≤와 종양 표본 정상적으로 득점 된다.
- 오픈 소스 CaseViewer 2.120이미지의 품질 분석을 수행 합니다.
- 암 병리학 자에 의해 정의 된 대로의 침략 적 구성의 두 개의 다른 지역에 있는 적어도 20 셀을 평가 합니다. 계산 영역에 명확 하 게 구별할 수 잘 분산된 핵을 포함 합니다. 경계 및 철회 또는 압착 영역에서 조직 영역 계산에서 제외 합니다.
8. RNA 품질
- RNA 추출
- 모든 악기와 도구 RNAse 무료 인지 확인 합니다. RNAse 제거 솔루션을 사용 합니다.
- 잘라 단계 3.8까지 프로토콜 다음 톰을 사용 하 여 NCFPE 또는 FFPE 샘플의 10 ~ 20 섹션 (두께 5 µ m).
- NCFPE에서 RNA 추출 RNA 격리를 사용 하 여 샘플 키트 (재료의 표 참조). FFPE RNA 격리 키트를 사용 하 여 FFPE 샘플에서 RNA를 추출 합니다.
참고: 비-크로스-링크 fixatives에서 RNA 추출 고정 방법에 적응 하는 격리 방법을 필요 합니다. 어떤 다른 RNA 격리 방법 (예: Trizol, RNeasy FFPE, NCFPE 견본 등)를 사용 하지 마십시오. - RNA의 농도 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 합니다. 260에 흡 광도의 비율 nm 및 280 nm (A260/280) 해야 ~ 2.0.
- 추가 분석까지-70 ° C에서 고립 된 RNA를 저장 합니다.
- 수행 하는 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH) 실시간 반전 녹음 방송 PCR 뇌관을 사용 하 여 서로 다른 길이8,9amplicons 생성 하.
- Manufacturer´s 지침에 따라 cDNA 역방향 전송 키트를 사용 하 여 cDNA 합성에 대 한. 각 샘플의 500 ng RNA를 사용. 추가 사용까지-20 ° C에서 cDNA를 저장 합니다.
- Manufacturer´s 지침에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다.
- 384 잘 반응 판에 triplicates에 PCR 마스터 혼합 플라스틱 4 추가 1시 16분의 µ L 희석 cDNA (PCR 템플릿). Manufacturer´s 지침에 따라 PCR을 수행 합니다.
참고: 인간의 GAPDH에 대 한 다음 뇌관 사용 되었다: GAPDH 앞으로: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH 역: 71 혈압 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 혈압 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 혈압 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 혈압 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´, 및 530 혈압 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. - PCR 기계에 적용 되는 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 합니다. 일반적인 제품 녹는 곡선 분석21에 따라 제외 해야 합니다.
Representative Results
물고기 HER2 결정:
FFPE 및 NCFPE에서 HER2 물고기 신호 강도 유사한 (그림 2). 두 경우 모두 대부분의 세포에 빨간 신호 (CEN17 참조 유전자)에 비해 녹색 신호 (증폭된 HER2 유전자 소재 시의 지표)의 명확한 초과 표시. 따라서, 경우가이 환자 trastuzumab, 안티-HER2 타겟 치료에 응답 하는 것으로 예상 된다 의미 증폭된 HER2 유전자를 표시 됩니다. FFPE 견본 긍정적인 컨트롤로 제공 됩니다. 비 종양 약 셀 (모두 FFPE 및 NCFPE)에서 관찰 하는 신호 역할 및 HER2 유전자 증폭에 대 한 부정적인 제어. 모든 분석 시리즈에 대 한 알려진된 유전자 증폭 상태 하나 이상의 섹션 교 잡 반응에 대 한 긍정적인 제어로 사용 해야 합니다.
RNA 품질:
두 개의 서로 다른 경우에서 해당 FFPE 및 NCFPE 샘플 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 RNA 품질에 차이 보여 줍니다. 결과 표시 다른 amplicon 길이 대 한 다른 증폭 효율 (즉, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) GAPDH mRNA의. FFPE 샘플에서 가져온 모든 Ct (사이클 임계값) 값 NCFPE에서 그들 보다는 더 높았다. 이 차이 더 발음된 화학 수정 제안 FFPE 직물에서 고립 mRNA의 낮은 PCR amplificability를 보여 줍니다. 또한, 더 높은 Ct 값 긴 짧은 amplicons에 비해 대 한 mRNA 조각화에 대 한 표시기는. 비교에서는, 다른 amplicon 길이의 Ct 값 슬로프 발음 하는 FFPE mRNA 조각화 NCFPE 조직 (그림 3) 보다 보여줍니다.
그림 2: 해당 포 르 말린 고정 파라핀에 대 한 HER2 물고기의 대표적인 결과 포함 (FFPE) 및 크로스 연결 비, 포 르 말린 고정된 파라핀 (NCFPE) 조직 단면도 포함. 동일한 FFPE (A)와 NCFPE (B) 조직에서 해당 샘플 표시 됩니다. 일반 interphase 세포 (C), 두 개의 녹색 (HER2)와 2 개의 레드 (CEN17) 신호는 예상 달리 증폭된 HER2 유전자 소재 시와 셀 대표 녹색 신호 (HER2)의 여러 복사본 (D). HER2 증폭 상태는 FFPE와 (A, B) 후 고정된 NCFPE 섹션 모두에서 동일 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: RNA 품질 관리에 사용 되는 실시간 반전 녹음 방송 PCR 분석 결과의 결과. Y 축: Ct (사이클 임계값) 값 GAPDH 유전자의 다른 amplicon 길이 대 한 표시 됩니다 (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 323, bp bp) x 축에. mRNA는 FFPE 및 두 개의 서로 다른 유 방 암 조직 샘플 병렬 및 cDNA를 베낀 PCR를 위한 처리의 NCFPE에서 분리 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
결과 두 가지 주요 결과 보여 줍니다. 첫째, NCFPE 조직에서 잘라내기 섹션의 간단한 24 h SBFS 후 정착 단계 물고기 분석 FFPE 직물에 대 한 승인 물고기 분석 실험을 사용 하 여 (참조14참조)에서 그 FFPE 동일한 결과 얻을 수 충분 하다. 이 프로토콜의 물고기 분석 원래 개발 하 고 승인 FFPE 포괄적인 재검사 필요 없이 (예를 들어, 교차 연결 된 조직에 대 한 사전 교 잡 조건을 최적화)를 사용 하 여 장점이 있습니다. 물고기 프로토콜은 제조업체의 지침에 설명 된 대로 정확 하 게 사용할 수 있습니다.
제조업체에서 명시적으로 권장 이전 적응에서이 프로토콜 (예: 조직 섹션 직경 및 부 화 기간 deparaffinization 단계에서) 결과에서 설명 하는 manufacturer´s 지침에서 약간의 수정 때문에 다른 조직 유형 및 고정 방법의 사용.
후 정착 단계가 18-24 h는 1 일 하 여 분석 시간을 확장 하지만 같은 일일 워크플로 FFPE 직물 (그림 1)에 대 한 개발의 화학 반응 시간을 필요로 하기 때문에 중요 합니다. SBFS 시간22 조직 유형23,24에 따라 2 h 5 m m 당 1 밀리미터의 평균 속도로 조직에 침투 하는 것으로 알려졌다. 18 h의 머리말 붙인된 후 고정 기간만 FFPE 섹션, NCFPE의 속성을 변경할 수 관찰이 나타냅니다 화학 반응에 정착 액의 침투를 하지1 원하는 결과 달성 하기 위한 중요 한 ,14.
둘째,는 생체는 잘 보존 된 후 고정을 위한 사용 되지 않는 나머지 NCFPE 조직은 추가 분자 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 반전 녹음 방송 실시간 PCR (그림 3)에 의해 입증 되었다. 분석 결과 더 과민 하 고 electropherogram 파생 린 값 보다 (RNA 무결성 번호) RNA 품질 (화학 수정 및 조각화) 파라핀 끼워 넣어진 조직8에서 고립 mRNA에 관해서는 특정. 품질 관리 제한 했다이 연구에서 실시간 PCR에 때문에 독립적인 그룹 나타났습니다 뿐만 아니라 RNA, DNA와 단백질 NCFPE에서 분리의 품질 FFPE 직물 8,9, 에서 그 보다 더 13.
프로토콜 해당 되는 경우 다음과 같이, 제시 (예를 들어, SBFS 제조 법, 고정 조건, RNA 품질 관리, 검증), 체 외 진단 (IVD)에 대 한 사전 분석 절차에 대 한 CEN 기술 규격의 요구 사항 최근으로 유럽 위원회의 규격화 (CEN) 출시 되었습니다 (예: CEN/TS 16827-ISO 15189 표준 참조 FFPE 조직에서 RNA 격리에 대 한 1:2015).
메서드를 사용 하면이 특정 정착 액으로 제한 됩니다. 비록 생체 및 비 크로스 연결, 말린 무료 정착 액을 사용 하 여 형태학의 좋은 보존 여러 연구에서 제시 되는 일반적인 의료 응용 분야에 연구에 주로 사용 된다. 이유 중 하나는 골드 표준 SBFS를 대체 다른 정착 제에 의해 고정 것 요구 이다 유효성 검사 연구의 다양 한 FFPE 자료에 대 한 최적화 된 모든 프로토콜 비 크로스 연결 fixatives 고정 재료 사용할 수 있는. 다른 조직의 고정 방법 하지이 물고기 프로토콜에 대 한 테스트 되었습니다.
이 원고에 설명 된 간단한 후 정착 단계는 FFPE 및 NCFPE 조직에 대 한 승인 IVD 분석 모두를 사용의 이점이 있다.
Disclosures
D.G.는 Qiagen에 의해 고용 하 고 회사의 연금에 스톡 옵션 또는 채권 보유를 있다. 이 원고는 데이터 PAXgene 조직 시스템, 공동 노력에서 Qiagen와 PreAnalytiX에 의해 개발 되었습니다를 참조 하십시오. Qiagen은 Biobanking 기술과 Biospecimen 연구에 대 한 공공 지원을 받는 기독교 도플러 실험실의 산업 파트너입니다. 모든 저자는 충돌의 관심 및 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
우리는 그들의 전문성에 대 한 의료 대학 그라츠의 병 리 연구소에서 분자 병 리에 대 한 실험실의 팀을 감사 하 고 지원 합니다. 또한, 우리는 감사 아이리스 Kufferath와 다니엘 Pabst 기술 지원에 대 한 집 엔 Rieger와 HER2 경우를 처리 하기 위한 실비아 Eidenhammer Kinga Szurian (병리학 자) 및 Tamas Regényi (3DHISTEC). 우리가 원고 교정을 위해 페넬로페 Kungl 감사 합니다. 이 작품 재정적으로 기독교 도플러 연구 기금, 과학의 오스트리아 연방 정부, 연구 및 경제 및 국가 기초에 의해 연구, 기술 및 개발을 지원 하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany | www.sav-lp.de | FN-200L-4-1 | Tissue fixative |
| Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada | www.simport.com | M-498 | Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples. |
| Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765112 | For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER. |
| ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 813150 | Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration |
| Merck Millipore, Munich, Germany | www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html | MC1009834000 | Dehydration of tissue samples |
| VWR Chemicals, Darmstadt, Germany | https://at.vwr.com | 10293EP | Dehydration of tissue samples |
| ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria | www.herba-chemosan.at | 2549662 32 | Paraffin used in a tissue processing device |
| Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria | www.LeicaBiosystems.com | 39602004 | Paraffin embedding medium |
| Sanova Diagnostik, Vienna, Austria | www.sanova.at | 5229 | Paraffin embedding instrument for tissues for histology |
| Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria | www.histocom.info | M 910010 | This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument. |
| Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark | www.chem.agilent.com | K802021-2 | Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. |
| Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 73504 | For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
| Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765134 | For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
| ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany | www.zytovision.com | Z-2015-200 | For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples. |
| 3DHISTEC, Budapest, Hungary | www.3dhistech.com | Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera. | |
| ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
| ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
| ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE | www.thermofisher.com | Ser. Nr. F239 | Spectrophotometer for nucleic acid quantification. |
| QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
| Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A | www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order | e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 | Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures. |
References
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
- Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
- Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
- Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
- Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
- Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
- Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
- Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
- Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
- Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
- Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
- Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
- Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
- Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
- Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
- Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
- Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
- Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
- Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
- Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
- Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
- NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
- Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
- Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).
