Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Protokoll for HER2 fisk med en ikke kors-kobling, Formalin-fri vev bindemiddel kombinere fordelene Cryo-bevaring og Formalin fiksering

Published: December 25, 2017 doi: 10.3791/55885
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 3, 1,2
1Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology, Medical University Graz, 2Institute of Pathology, Medical University Graz, 3Research and Development, Qiagen GmbH

Summary

Fluorescens på plass hybridisering (fisk) kreves ofte i kombinasjon med histopatologi og molekylære diagnostikk for utvalg av terapi i personlig medisin. Et romanen ikke kors-kobling, formalin-fri vev bindemiddel som gir høy kvalitet morfologiske, molekylær og fisk analyser fra samme prøven av tillegg av en post fiksering trinn før FISKEN er presentert.

Abstract

Morfologiske vurdering av formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) har vært gullstandarden for kreft diagnostikk tiårene på grunn av sin utmerkede bevaring av morfologi. Personlig medisin gir stadig individuelt tilpasset og målrettet terapi for preget personlige sykdommer aktiveres av kombinerte morfologiske og molekylære analytisk teknologien og diagnose. Ytelsen til morfologiske og molekylære analyser fra samme FFPE prøven er utfordrende på grunn av den negative virkningen av formalin på grunn av kjemisk endring og cross-linking av nucleic syrer og proteiner. En ikke kors-kobling, formalin-fri vev bindemiddel er nylig utviklet å oppfylle begge krav, dvs, å bevare morfologi som FFPE og biomolecules som cryo-bevaring. Siden fisk er ofte nødvendig sammen med histopatologi og molekylære diagnostikk, testet vi anvendelse av fisk protokoller på papir behandlet med denne nye bindemiddel. Vi fant at formalin etter fiksering av histologiske deler av ikke kors-kobling, formalin-fri og parafin-embedded (NCFPE) bryst kreft vevet som generert tilsvarende resultater for de med FFPE vev i menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) FISK analyse. Denne protokollen beskriver hvordan en fisk analysen opprinnelig utviklet og godkjent for FFPE vev kan brukes for NCFPE vev av en enkel etter fiksering steg av histologiske deler.

Introduction

Personlig medisin avhengig stadig flere parameter tester med morfologiske og molekylære vev analyser. Formalin fiksering av vev som gullstandarden gir utmerket morfologiske kvalitet1,2. Imidlertid påvirker formalin-indusert kjemisk endring og cross-linking av proteiner og nukleinsyrer3,4,5 negativt molekylær analyse6. Endringene molekylær begrense kvaliteten på nucleic syrer og proteiner og kan resultere i genet sekvens gjenstander7 eller redusert følsomhet for polymerasekjedereaksjons (PCR)-baserte analyser8. Selv om stor innsats ble tatt å optimalisere molekylær tester for FFPE vev, er cryo-bevaring av vev generelt bedre formalin fiksering, noe som gjør det nødvendig å dele vevsprøver for ulike bevaring prosedyrer. For å unngå behovet for cryo-bevaring for molekylær analyser, en ikke kors-kobling, formalin-fri etappe, den stabiliserende, PAXgene vev ble utviklet. Kommersielt tilgjengelige systemet består av en fiksering og stabilisering løsning som inneholder forskjellige alkoholer, eddiksyre og et løselig organisk stoff. Forsvarlig bevaring nucleic syrer, (phospo) proteiner og morfologi ble vist i flere studier6,9,10,11,12,13.

En applikasjon i kreft diagnostikk er fisk oppdager et omfattende utvalg av chromosomal endringer, for eksempel translocations, submicroscopic sletting og amplifications 14. Tjue prosent av invasiv bryst kreften svulst viser for eksempel forsterkning av den menneskelige epidermal vekstfaktor reseptoren 2 (HER2) genet15,16,17, som er forbundet med dårlig prognose18 ,19. Fastsettelse av HER2 overuttrykte og forsterkningsnivå status i brystkreft av fisk er nødvendig å velge pasienter for anti-HER2-rettet terapi og er en følgesvenn diagnostiske oppført av Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. For å gi en bred anvendelse av fisk-baserte følgesvenn diagnostikk i helsevesenet, ble analyser utviklet og godkjent for FFPE vev.

I en tidligere studie viste vi at NCFPE vev ikke kan brukes for fisk analyser som er godkjent for FFPE vev. Men oppnådd tester for tiden rekke forskjellige innlegg fiksering prosedyrer av NCFPE vev med 4% bufret formaldehyd viste at legge fiksering ganger 18 h eller lengre NCFPE vev deler tilsvarende resultater for de med FFPE vev14.

I denne studien vi tilbyr en detaljert protokoll og viser virkningen av ikke kors-kobling, formalin-fri vev fiksering og 24 h 4% bufret formaldehyd etter fiksering på delene som brukes for HER2 fisk og RNA kvalitet fra samme primære vev prøven.

Figure 1
Figur 1: Diagram som viser trinnene for fluorescens i situ hybridisering (fisk) og RNA analyse av formalin fast parafin innebygd (FFPE) og ikke-cross-kobling, formalin uten fast parafin innebygd (NCFPE) vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Studien ble godkjent av den etiske komiteen av medisinske universitet av Graz (referanse nummer 20-066), Østerrike. Vevsprøver ble innhentet fra to tilfeller av kirurgisk resected primære invasiv brystkreft etter at pasientene hadde gitt skriftlig samtykke.

1. vev fiksering

Merk: Vev fixation er utføres enten standard bufrede formalin løsning (SBFS), definert som 10% formalin løsning som inneholder en masse brøkdel av 3,7% (tilsvarer en volum brøkdel av 4%) formaldehyd bufret til pH 6.8 til pH 7.2 ifølge CEN/TS 16827-1:2015 eller ikke kors-kobling, formalin-fri vev fiksering systemet (også referert til som den alternative fiksering løsningen nedenfor) som består av et bindemiddel og en stabilisator løsning ved romtemperatur (RT).

  1. Kutt brystet kreft vevsprøver med sterilt skalpell i to halvdeler hver 4 mm tykk for å sikre tilstrekkelig vev antallet. Bruk en maksimal størrelse 4 x 15 x 15 mm for NCFPE eller SBFS vev fiksering.
  2. Plasser hver halvdel av svulst prøven i en standard vev kassett og dukke det i SBFS eller alternativ fiksering løsningen for 24 timer med volum per volumkontrollen (v/v) 4 deler bindemiddel og en del vev (4 mL/1 g vev (ideelt 10 mL/1 g)).
  3. Overføre alternativt-fast prøvene til stabilisator løsningen for 2-72 h ved å åpne beholderen, slår vev kassetten ved 180° og submerging det.
  4. Plass vev kassettene med SBFS-fast prøvene i 250 mL 70% etanol i 30 min på RT fjerne gjenværende SBFS.
    Merk: Dette trinnet er viktig å unngå SBFS forurensning av ikke-cross-kobling bindemiddel-behandlet prøver i automatiserte vev prosessoren, som vil ødelegge den fordelaktige beliggenheten til ikke-cross-kobling fiksativene for bevaring av biomolecules.
    FORSIKTIG: SBFS er en farlig løsning, forårsaker hudirritasjon, alvorlig øyeskade, kan forårsake allergiske hudreaksjoner, er mistenkt for å forårsake genetiske defekter, kan forårsake kreft, luftveier, døsighet og forårsaker skader organer. Den alternative bindemiddel er giftig ved innånding, hudkontakt og svelging irriterer øynene og huden, fare for uhelbredelig skadevirkning ved innånding, hudkontakt og svelging. Innånding og fysisk kontakt bør unngås for begge fiksering løsninger. Bruk egnede verneklær, hansker og øye og ansikt beskyttelse. Arbeid i avtrekksvifte.
  5. Videre til vev behandling, innebygging og vev snitting (avsnitt 2 og 3).

2. vev behandling og innebygging

  1. Utføre gradvis dehydrering av vev kassetter med de faste vevsprøver i 70% (2 x 15 min), 80% (30 minutter), 90% (60 minutter) og 99% (2 x 60 min) etanol, etterfulgt av xylen (2 x 60 minutter). Deretter infiltrere med parafin i en automatisert basert vevsprosessor (4 x 45 min).
  2. Ved hjelp av pinsett, plassere dehydrert og parafin-infiltrated prøvene (alternativt og SBFS-fast) i metall støpeformer.
  3. Bygge inn prøvene i 5-10 mL flytende parafin (størkning punkt 56-58 ° C) bruker en parafininnstøper instrument.
  4. Plass formene på en kjøleplate på 5 ° C i 30 min.
  5. Gjenopprette parafin-embedded vev blokker fra formene.
  6. Lagre den resulterende blokker (alternativt-fast, parafin-embedded (NCFPE) og SBFS-fast parafin-embedded (FFPE)) i mørket på 4 ° C før bruk.

3. vev snitting og skyv forberedelse for fisk

Merk: FFPE inndelinger brukes direkte på fisk, mens lysbilder med NCFPE inndelinger er etter fast i SBFS for 24 timer før du fisk prosedyren.

  1. Sette inn et engangs blad i mikrotomen og justere mikrotomen 10 µm.
  2. Ta den første blokken fra kjøleplaten og sett den inn i apparatet.
  3. Trim blokken til en jevn overflate er oppnådd. Rengjør mikrotomen med en pensel og tilpasse den til 3 µm. kast de første 2-3-delene.
  4. Skjær 3 µm deler av NCFPE og FFPE og legg dem i kaldt vann badekar (ultrapure vann).
    Merk: For å få bedre bilder uten overlappende kjerner, her bilder av 2 µm deler i stedet for 3-5 µm som anbefalt i manufacturer´s instruksjonene vises.
  5. Plukke opp hver flytende del med en fin maling pensel og en nål på en belagt microscope skyve for vedheft av vev.
  6. Kaste dette lysbildet inn i en varm (40 ° C) vann bad og la delen strekke helt.
  7. Sette delen tilbake på lysbildet ved å trekke forsiktig lysbildet ut av vannet og unngå rynker.
  8. La alle deler tørr på ved romtemperatur 1t.
  9. Varme lysbildene ved 70 ° C i 30 minutter i en inkubator å smelte parafinen.
  10. Satt lysbilder vannrett i et glass flekker glasset.
  11. Rehydrate delene gradvis på RT i flekker glassene fylt med 250 mL hver av følgende væske: 100% xylen 2 x 15 min, 96% etanol 2 x 15 min, 90% etanol 2 min, 80% etanol 2 min, 70% etanol 2 min, 50% etanol 2 min , og destillert vann 2 x 10 min.
    FORSIKTIG: Utfører deparaffinization og rehydrering i avtrekksvifte, ikke pust giftige volatilized løsemidler.
    Merk: Avhengig av deler og vev, kan det være nødvendig å teste ulike inkubasjon ganger på forhånd.

4. etter fiksering av NCFPE

  1. Utføre etter fiksering av NCFPE lysbilder ved å legge dem i en ny flekker jar fylt med SBFS 24 h på rett sted glasset i avtrekksvifte under 24 timer etter fiksering trinn.
  2. Fjern overflødig SBFS ved å vaske med fosfat bufres saltvann (3 x 10 min) og destillert vann (2 x 10 min).

5. fluorescens i situ hybridisering (fisk)

Merk: Her fisk ved hjelp av kommersielt tilgjengelig HER2/CEN17 to farger sonden Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Tillat ikke delene vev tørke hybridization og vaske trinnene. Ikke la det DNA sonde og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain løsninger å utsettes for lys for en lengre periode. Fremgangsmåten i mørket med lystette beholdere. Avhengig av alder og fiksering trinn i utvalget materialet, øke eller redusere den denaturing og vask temperaturer å oppnå bedre hybridisering resultater.

  1. Plass en flekker glasset som inneholder 250 mL av varme forbehandling løsning sitronsyre i et vannbad 98 ° C.
  2. Plasser den utvannet FFPE og post-fixes NCFPE glir inn i glasset og ruge i 15 min.
Ikke bruk mer enn seks lysbilder per flekker glasset.
  • Vask lysbildene i destillert vann i 3 minutter på RT i en ny flekker jar.
  • For proteolyse, plassere lysbildene i en temperaturstyrt hybridisering system på 37 ° C.
    1. Umiddelbart, bruke det-klar-å-bruke Pepsin løsning (2mg/ml) dropwise (~ 30 µl per slipp) vev delene før det er helt dekket. Inkuber for 9 min på 37 ° C i hybridisering systemet.
      Merk: Anbefales en inkubasjon tid på 5-15 min. Det optimale tidspunktet for proteolyse bør ascertained på forhånd.
    2. Plasser lysbildene i en krukke med vaskebuffer SSC og ruge i 5 min.
    3. Skyll lysbildene i destillert vann til 1 min på RT.
    4. Utføre dehydrering delene i følgende gradert alkoholer: 50%, 70%, 90% og 100% hver i 1 luften tørr delene.
    5. Hybridisering, pipette 10 µL av HER2/CEN17 sonde på delene tørket vev dekke hver prøve med en dekkglassvæske og forsegle den med gummi sement.
      Merk: 10 µL av sonden anbefales per 22 x 22 mm vevet området. En mild oppvarming av sonden gjør pipettering prosessen enklere. Unngå bobler og lang eksponering av sonden lys.
    6. Co denature sonde og prøven DNA i hybridisering systemet ved 75 ° C i 10 min.
    7. Definere hybridisering 37 ° c og hybridize over natten.
    8. Fjern forsiktig gummi sement med tang for post hybridisering og gjenkjenning.
    9. Inkuber lysbildene i en flekker glasset som inneholder 37 ° C før varmet 1 x vaskebuffer A for 5 min. fjerne coverslips.
    10. Vask lysbildene bruker pre varmet 1 x vaske bufferen A to ganger for 5 min på 37 ° C.
    11. Tørke lysbildene i 70%, 90% og 100% etanol, 1 min.
    12. Tørr eksemplene i luften og beskytte mot lyset.
    13. Flekker, gjelde 30 µL DAPI-løsning til hybridisert området unngå bobler. Dekk delene med en dekkglassvæske.
    14. Inkuber i 15 min beskyttet mot lyset.
    15. Nøye fjerne overflødig DAPI-løsningen ved å forsiktig trykke lysbildet mellom filter papir.
    16. Lagre lysbilder i 2-8 ° C i mørket 2 uker til evaluering av AC confocal mikroskopi.

    • 6. AC confocal imaging og skanning av fisk lysbilder

    1. AC confocal imaging og skanning av lysbildene i en AC confocal digital skanner utstyrt med en 40 x / 1.2 NA mål, kvadrant bånd filtre (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) og en 5.5Mpx, 16 bit, avkjølt vitenskapelige complementary metal Oxice semiconductor (CMOS) kameraet.
    2. Kjøpe bildene med filtre for grønn (eksitasjon: 503 nm, utslipp: 528 nm) og oransje (eksitasjon: 547 nm, utslipp: 572 nm) kanaler.

    7. tolkning

    Merk: HER2/CEN17 sonden er en blanding av en rød fluorochrome-merket CEN17 sonde bestemt for alfa satellitt centromeric regionen av kromosom 17 (D17Z1) og en grønn fluorochrome-merket HER2 sonde bestemt for HER2 genet (sonde plassering 17q12). Svulst prøver med en HER2:CEN17 forholdet ≤2.0 per kjerne er scoret som normalt, mens de med en HER2:CEN17 forholdet ≥2.0 scoret som forsterket17.

    1. Utføre kvalitet analyse av bildene med åpen kildekode CaseViewer 2.120.
      1. Vurdere minst 20 celler som finnes i to regioner av invasiv komponenten av karsinom som definert av en patologen. Inkluder klart kan skilles godt fordelt kjerner i området teller. Utelukke fra teller vev områder på grensen og trukket inn eller presset.

    8. RNA kvalitet

    1. RNA utvinning
      1. Kontroller at alle instrumenter og verktøy er RNAse gratis. Bruke en RNAse-fjerning løsning.
      2. Kuttet 10 til 20 deler (5 µm tykk) av NCFPE eller FFPE-prøver ved en mikrotom følger protokollen til trinn 3.8.
      3. Ekstra RNA fra NCFPE prøver ved RNA isolering kit (se tabell for materiale). Ekstra RNA fra FFPE prøver av benytter en FFPE RNA isolering kit.
        Merk: Utvinning av RNA fra ikke kors-kobling fiksativene krever en isolasjon metoden tilpasset metoden fiksering. Ikke bruk andre RNA isolasjon metoden (f.eks Trizol, RNeasy FFPE, etc. NCFPE prøven).
      4. Bestemme RNA konsentrasjon og renhet bruker et spektrofotometer. Forholdet mellom absorbansen på 260 nm og 280 nm (A260/280) skal ~ 2.0.
      5. Lagre den isolerte RNA ved-70 ° C til videre analyse.
    2. Utføre en glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) sanntid omvendt transkripsjon PCR bruker primere for å generere amplicons av forskjellige lengder8,9.
      1. Bruk en cDNA omvendt transkripsjon kit i henhold til manufacturer´s instruksjoner for cDNA syntese. Bruke 500 ng RNA i hver prøve. Lagre cDNA på 20 ° C til fremme bruk.
      2. Klargjør PCR master blandingen i henhold til manufacturer´s instruksjoner.
      3. Pipetter PCR master mix i triplicates i en 384-vel reaksjon plate. Legge til 4 µL av 1:16 fortynnet cDNA (PCR mal). Utføre PCR i henhold til manufacturer´s instruksjoner.
        Merk: For menneskelig GAPDH, følgende primerne ble brukt: GAPDH frem: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omvendt: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ og 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. Analysere resultatene med en programvare for PCR maskinen. Uspesifisert produkter utelates basert smelte curve analyse21.

    Representative Results

    FISK HER2 besluttsomhet:

    HER2-fisk signal intensiteter fra FFPE og NCFPE er lignende (figur 2). Begge tilfeller i de fleste cellene viser en klar overskudd av grønne signalet (indikativ av forsterket HER2 genet locus) i forhold til det røde signalet (CEN17 referanse gen). Derfor viser saken en forsterket HER2 genet, noe som betyr at denne pasienten er ventet å svare til trastuzumab, en anti-HER2 målrettet terapi. FFPE prøven var positiv kontroll. Signalene i ikke-neoplastic celler (både i FFPE og NCFPE) tjene som intern referanse og negativ kontroll for HER2 genet forsterkning. For hver analyse serien, bør minst én del med kjente gene forsterkning status brukes som positive kontroll for hybridisering reaksjonen.

    RNA kvalitet:

    Tilsvarende FFPE og NCFPE prøver fra to ulike tilfeller viser forskjeller i RNA kvalitet ved hjelp av sanntids omvendt transkripsjon PCR. Resultatene viser forskjellige forsterkning effektivitet for forskjellige amplicon lengder (dvs. 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) av GAPDH mRNA. Alle Ct (syklus terskel) verdier Hentet fra FFPE prøver var høyere enn fra NCFPE. Denne forskjellen viser lavere PCR amplificability av mRNA isolert fra FFPE vev, antyder en tydeligere kjemisk endring. Videre er høyere Ct verdiene for lang i forhold til korte amplicons en indikator for mRNA fragmentering. Sammenligning Ct verdien bakkene i forskjellige amplicon lengder viser mer uttalt mRNA fragmentering i FFPE enn NCFPE vev (Figur 3).

    Figure 2
    Figur 2: representant resultater av HER2 fisk for tilsvarende formalin fast parafin innebygd (FFPE) og ikke kors-kobling, formalin-fri fast parafin innebygd (NCFPE) vev delene. Tilsvarende eksempler fra samme FFPE (A) og NCFPE (B) vev vises. I motsetning til vanlig interphase celler (C), hvor to grønne (HER2) og to røde (CEN17) signaler er forventet, cellene med forsterket HER2 genet locus representerer flere kopier av grønne signaler (HER2) (D). HER2 forsterkning status var identiske i post-fixes NCFPE delene (A, B) og FFPE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3: resultatene av en sanntid omvendt transkripsjon PCR analysen brukes for RNA kvalitetskontroll. Y-aksen: Ct (syklus terskel) verdiene av GAPDH genet vises for forskjellige amplicon lengder (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) på x-aksen. mRNA ble isolert fra FFPE og NCFPE av to ulike bryst kreft behandles parallelt og transkribert til cDNA for PCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    Resultatene viser to viktige funn. Først er litt enkel 24 h SBFS etter fiksering av kuttet fra NCFPE vev tilstrekkelig til å oppnå tilsvarende resultater for de med FFPE i fisk analyser med fisk analyser godkjent for FFPE vev (se også referanse14). Denne protokollen har fordelen av benytter fisk analyser opprinnelig utviklet og godkjent for FFPE uten behov for omfattende forlengelse (f.eks ved å optimalisere pre hybridisering betingelsene for ikke-krysskoblet vev). FISK protokollen kan brukes akkurat som beskrevet i instruksjonene fra produsenten.

    Mindre endringer fra manufacturer´s-instruksjonene som er beskrevet i denne protokollen (f.eks vev delen diameter og inkubasjon perioder på deparaffinization trinnene) resultatet fra tidligere tilpasninger, som er eksplisitt anbefalt av produsenten på grunn av bruk av ulike vev og fiksering metoder.

    Etter fiksering trinnet er kritisk fordi det krever en kjemisk reaksjon tid med 18-24 h, som utvider analyse tiden av en dag, men gir samme daglig arbeidsflyten som utviklet for FFPE vev (figur 1). SBFS rapporteres å trenge vev til en gjennomsnittlig rente på 1 mm per time22 til 5 mm i 2t avhengig av vev type23,24. Observasjon at bare etter fiksering lengre mer enn 18 h kan endre egenskapene til NCFPE til FFPE deler, indikerer at ikke gjennomtrengning av bindemiddel men kjemiske reaksjonstid er avgjørende for å oppnå de ønskede resultatene1 ,14.

    Andre kan gjenværende NCFPE vev som ikke brukes til etter fiksering brukes for videre molekylær analyser som biomolecules er godt bevart. Dette ble demonstrert av sanntids omvendt transkripsjon PCR (Figur 3). Analysen er mer følsom og spesifikk enn electropherogram-avledet RIN verdien (RNA integritet tall) med hensyn til RNA kvalitet (dvs. kjemisk endring og fragmentering) for mRNA isolert fra parafin-embedded vev8. Kvalitetskontroll var begrenset i denne studien til sanntid PCR siden uavhengig grupper har vist at i tillegg til RNA, kvaliteten på DNA og proteiner isolert fra NCFPE er bedre enn fra FFPE vev 8,9, 13.

    Protokollen presentert følger, der det er aktuelt (f.eks SBFS oppskrift, fiksering forhold, RNA kvalitetskontroll, validering), kravene CEN tekniske spesifikasjoner for pre analytisk prosedyrer for in vitro diagnostikk (IVD), som har vært nylig utgitt av europeiske komité for standardisering (CEN) (f.eks CEN/TS 16827-1:2015 for RNA-isolasjon fra FFPE vev som refererer til ISO 15189-standarden).

    Metoden er begrenset til denne bestemte bindemiddel. Selv om god bevaring av biomolecules og morfologi bruker ikke kors-kobling, formalin-fri bindemiddel er presentert i flere studier, er det hovedsakelig brukt i forskning, men ikke i rutinemessige medisinske anvendelser. En grunn er at erstatte gullstandarden SBFS fiksering av en annen bindemiddel ville kreve en rekke validering studier som ikke alle protokollene optimalisert for FFPE materiale kan brukes for materialer fast med ikke-cross-kobling fiksativene. Andre vev fiksering metoder ble ikke testet for denne fisk-protokollen.

    Det enkle etter fiksering trinnet beskrevet i dette manuskriptet har fordelen av benytter IVD godkjent analyser både for FFPE og NCFPE vev.

    Disclosures

    D.G. er ansatt hos Qiagen og har aksje alternativer eller bond holdings selskapets pensjonsordning. I dette manuskriptet refererer til det PAXgene vev, som er utviklet i en felles innsats av Qiagen og PreAnalytiX. Qiagen er industrielle partner i den offentlig finansiert kristne Doppler Laboratory for Biospecimen forskning og Biobanking teknologi. Alle forfattere har noen interessekonflikt og ingen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    Vi takke teamet for laboratorium for molekylær patologi ved Institutt for patologi medisinske universitet Graz for sin ekspertise og støtte. Videre takker vi Iris Kufferath og Daniela Pabst for teknisk assistanse, Bernadette Rieger og Sylvia Eidenhammer saksbehandling HER2 samt Kinga Szurian (patologen) og Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi takker Penelope Kungl for korrekturlesing manuskriptet. Dette arbeidet har vært økonomisk støttet av den kristne Doppler Research Fund, den østerrikske føderale Ministry of Science, forskning og økonomi og National Foundation for forskning, teknologi og utvikling.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany www.sav-lp.de FN-200L-4-1 Tissue fixative
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada www.simport.com M-498 Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765112 For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 813150 Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
    Merck Millipore, Munich, Germany www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html MC1009834000 Dehydration of tissue samples
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germany https://at.vwr.com 10293EP Dehydration of tissue samples
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria www.herba-chemosan.at 2549662 32 Paraffin used in a tissue processing device
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria www.LeicaBiosystems.com 39602004 Paraffin embedding medium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austria www.sanova.at 5229 Paraffin embedding instrument for tissues for histology
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria www.histocom.info M 910010 This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark www.chem.agilent.com K802021-2 Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 73504 For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765134 For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany www.zytovision.com Z-2015-200 For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
    3DHISTEC, Budapest, Hungary www.3dhistech.com Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4368814 The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4367659 PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE www.thermofisher.com Ser. Nr. F239 Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System www.thermofisher.com 4485701 PCR machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

    Tags

    Kreftforskning problemet 130 brystkreft ikke kors-kobling formalin-fri vev bindemiddel formalin pre analytics HER2 fisk analyse molekylær diagnostikk
    Protokoll for HER2 fisk med en ikke kors-kobling, Formalin-fri vev bindemiddel kombinere fordelene Cryo-bevaring og Formalin fiksering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Loibner, M., Oberauner-Wappis, L.,… More

    Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter