荧光原位杂交 (fish) 通常需要结合组织病理学和分子诊断技术来选择个性化药物治疗。一种新的非连接, 无福尔马林组织固定剂, 允许高品质的形态, 分子和鱼类分析从同一标本, 加入了 post-fixation 步骤之前, 鱼提出。
福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 组织标本的形态学评估是几十年来癌症诊断的黄金标准, 因为它具有优良的形态学保存。个性化药物越来越多地提供单独的适应和靶向治疗的特点个别疾病的组合形态和分子分析技术和诊断。由于化学修饰和核酸和蛋白质交联的影响, 甲醛对同一 FFPE 标本的形态学和分子检测的性能具有挑战性。最近开发了一种非连接的无福尔马林组织固定剂, 以满足这两种要求, 即保存像 FFPE 和生物分子的形态, 如冷冻保存。由于鱼类通常需要与组织病理学和分子诊断结合, 我们测试了鱼协议的适用性, 在这个新的定影剂治疗。我们发现, 福尔马林 post-fixation 的组织学切片的非连接, 无福尔马林和石蜡嵌入 (NCFPE) 乳腺癌组织产生的等效结果与 FFPE 组织的人表皮生长因子受体 2 (HER2)鱼分析。该协议描述了最初开发和验证的 FFPE 组织的鱼分析, 可以用简单的组织学切片 post-fixation 步骤用于 NCFPE 组织。
个性化医学越来越依赖于多参数测试, 包括形态学和分子组织分析。福尔马林固定组织作为金本位提供优异的形态学品质1,2。然而, 福尔马林诱导的蛋白质和核酸的化学修饰和交联3,4,5 , 对分子分析产生负面干扰6。这些分子修饰限制了核酸和蛋白质的质量, 并可能导致基因序列的人工制品7或降低了聚合酶链式反应 (PCR) 的灵敏度 (基于检测)8。尽管为优化 FFPE 组织的分子试验作出了重大努力, 但冷冻保存的组织总体上优于福尔马林固定, 因此有必要将组织标本分成不同的保存程序。为避免分子分析需要冷冻保存, 研制了一种非链、无福尔马林固定剂、PAXgene 组织。这种商用系统包括固定和含有不同醇、醋酸和可溶性有机化合物的稳定溶液。正确保存核酸, (phospo) 蛋白质和形态学显示在几个研究6,9,10,11,12.
癌症诊断的一个特殊应用是鱼类检测到一系列的染色体改变, 如易位、亚删除和放大14。例如, 20% 的浸润性乳腺癌肿瘤显示人表皮生长因子受体 2 (HER2) 基因的放大15,16,17, 这是与不良预后相关的18 ,19。HER2 在乳腺癌中的过度表达和扩增状态的测定需要选择患者进行 anti-HER2-directed 治疗, 并且是由联邦药物协会 (FDA) 列出的辅助诊断 (http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431. htm)17。为了在医疗保健中广泛应用鱼伴诊断, 制定并批准了 FFPE 组织的化验。
在先前的研究中, 我们发现 NCFPE 组织不能用于已被批准用于 FFPE 组织的鱼类化验。然而, 4% 缓冲甲醛的 NCFPE 组织不同后固定术后的时间序列测试显示, NCFPE 组织切片的18小时或更长的后固定时间达到了与 FFPE 组织的等效结果 (14。
在这项研究中, 我们提供了一个详细的协议, 并证明了非的影响, 无福尔马林组织固定和24ĥ4% 缓冲甲醛 post-fixation 的部分用于 HER2 鱼和 RNA 质量从同一主要组织标本。
图 1: 显示荧光步骤的图表原位杂交 (fish) 和 RNA 分析福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 和非连接, 无福尔马林固定石蜡 (NCFPE) 组织.请单击此处查看此图的较大版本.
结果显示了两个关键的发现。首先, 一个简单的 24 h SBFS post-fixation 步骤的切片从 NCFPE 组织是足以获得相同的结果, 与 FFPE 鱼分析使用的鱼化验批准 FFPE 组织 (也请参阅参考14)。本议定书的优势是使用最初开发和批准的鱼类化验 FFPE 不需要全面重新验证 (例如, 通过优化、条件非连接组织)。可以按照制造商的说明中所描述的那样使用 FISH 协议。
根据本协议中描述的 manufacturer´s 指令 (例如, deparaffinization 步骤中的组织切片直径和潜伏期) 进行的细微修改是由制造商明确推荐的。由于使用不同的组织类型和固定方法。
post-fixation 步骤非常关键, 因为它需要一个18-24 小时的化学反应时间, 它将分析时间延长一天, 但允许与 FFPE 组织相同的每日工作流 (图 1)。据报道, 根据组织类型23、24, SBFS 的平均每小时1毫米22到 5 mm 的穿透组织。观察到只有长时间的 post-fixation 期超过18小时, 才能改变 NCFPE 对 FFPE 节的性质, 表明不渗透的固定剂, 但化学反应时间是关键的达到预期的结果1 ,14。
其次, 剩余的 NCFPE 组织, 不用于 post-fixation 可以用于进一步的分子分析, 因为生物分子是保存完好。real-time 反向转录 PCR (图 3) 演示了这一点。该方法比从石蜡包埋组织中分离出的 rna 质量 (即化学修饰和分裂) 的电泳值 (rna 完整性数) 更敏感、更具体.8。本研究对 real-time PCR 的质量控制进行了限制, 因为独立组已表明, 除了 RNA 外, 从 NCFPE 中分离出的 DNA 和蛋白质的质量优于 FFPE 组织, 8,9,13。
所提出的协议如下, 在适用的情况下 (例如, SBFS 配方, 固定条件, RNA 质量控制, 验证), 要求的岑技术规范的分析程序的体外诊断 (IVD),这是最近由欧洲标准化委员会 (岑) (例如, 岑/TS 16827-1: 2015 的 RNA 分离的 FFPE 组织, 这是指 ISO 15189 标准)。
该方法仅限于此特定的定影液。虽然生物分子和形态学的良好保存使用非连接, 无福尔马林固定剂已提出了一些研究, 它主要用于研究, 但不是在常规医疗应用。其中一个原因是, 用另一个固定剂取代金本位 SBFS 固定, 需要进行各种验证研究, 因为并非所有为 FFPE 材料优化的协议都可以用于非连接固定的材料。其他的组织固定方法没有对此鱼议定书进行测试。
本手稿中描述的简单 post-fixation 步骤具有使用 IVD 认证的 FFPE 和 NCFPE 组织的方法的优势。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢格拉茨医学院病理研究所分子病理学实验室的团队, 他们的专业知识和支持。此外, 我们感谢虹膜 Kufferath 和 Daniela Pabst 技术援助, 伯纳黛特丽格和西尔维亚 Eidenhammer 处理 HER2 病例以及坤 Szurian (病理学家) 和翳 Regényi (3DHISTEC)。我们感谢佩内洛普 Kungl 校对手稿。这项工作得到了基督教多普勒研究基金、奥地利联邦科学、研究和经济部以及国家研究、技术和发展基金会的资助。
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