형광 -제자리 교 잡 (물고기) 종종 histopathology 및 맞춤 의학에서 치료의 선택에 대 한 분자 진단에 필요 합니다. 있도록 고품질 형태 론 적, 분자 그리고 물고기 분석 동일한 견본에서 포스트 고정 단계의 추가 의해 물고기를 제시 하기 전에 새로운 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액.
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 샘플의 형태 론 적 평가 형태학의 그것의 우수한 보존으로 인해 수십 년 암 진단에 대 한 황금 표준 되었습니다. 맞춤된 의학은 점점 결합된 형태학 및 분자 분석 기술 및 진단으로 사용 하는 특징이 개별 질병에 대 한 개별적으로 적응 하 고 타겟 요법을 제공 합니다. 성능 같은 FFPE 견본에서 형태 론 적과 분자 분석 실험의 화학 수정으로 인해 포 르 말린의 부정적인 영향 때문에 도전 이며 핵 산 및 단백질의 cross-linking. 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액 즉 모두의 요구를 충족, FFPE 같은 형태학 및 곳을 알아내는-보존 같은 생체를 유지 하기 위해 최근에 개발 되었습니다. 생선 자주 함께 histopathology 및 분자 진단 필요, 이후이 새로운 정착 액으로 치료 하는 조직에 물고기 프로토콜의 적용 테스트. 우리는 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)에 있는 조직학의 비-크로스-연결, 포 르 말린-무료 및 파라핀 포함 (NCFPE) 유 방 암 조직 생성 해당 결과 FFPE 조직으로 그의 그 말린 후 고정 물고기 분석입니다. 이 프로토콜 양측 검정 조직학 섹션의 간단한 후 정착 단계에 의해 NCFPE 조직에 대 한 물고기 분석 결과 원래 개발 및 FFPE 직물에 대 한 유효성 검사를 사용 하는 방법을 설명 합니다.
맞춤된 의학은 점점 형태학 및 분자 조직 분석을 포함 하는 다중 매개 변수 테스트에 의존 합니다. 금으로 조직의 포 르 말린 고정 우수한 형태 론 적 질1,2를 제공합니다. 그러나, 포 르 말린-유도 된 화학 수정 및 부정적인 단백질 및 핵 산3,,45 의 cross-linking 분자 분석6방해 합니다. 이러한 분자 수정 제한 핵 산 및 단백질의 품질 및 유전자 시퀀스 유물7 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 감소 된 감도에서 발생할 수 있습니다-기반 분석8. 주요 노력 FFPE 직물에 대 한 분자 테스트를 최적화 하기 위해 찍은, 비록 포 르 말린 고정 하기가 다른 보존 절차에 대 한 조직 샘플을 분할 하는 데 필요한 일반적인 우수한 곳을 알아내는-보존 조직입니다. 곳을 알아내는-보존 한 비-크로스-링크, 분자 분석에 대 한 필요성을 피하기 위해 포 르 말린-무료 통, PAXgene 조직 개발 되었다. 이 상용 시스템 정착 및 안정화 솔루션을 포함 하는 다른 알콜, 초 산 및 수용 성 유기 화합물의 구성 됩니다. 핵 산, 단백질 (phospo) 및 형태학의 적절 한 보존 여러 연구6,9,10,11,,1213에 표시 했다.
암 진단에서 특정 응용 프로그램 translocations, submicroscopic 삭제 등 확대 14염색체 변경의 포괄적인 범위를 감지 하는 물고기입니다. 침략 적인 유방암 종양의 20% 증폭 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)를 표시 하는 예를 들어 유전자15,,1617, 빈약한 예 지18와 관련 ,19. 물고기에 의해 유방암에서 HER2 overexpression 및 증폭 상태의 안티 HER2 감독 치료를 위한 환자를 선택 하는 데 필요한 이며 동반자 진단에 의해 연방 약 협회 (FDA) (http://www.fda.gov/에 나열 된 MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. 건강 관리에 물고기 기반 동행자 진단의 광범위 한 응용 프로그램을 허용 하기 위하여 분석 실험 개발 되었고 FFPE 직물에 대 한 승인.
이전 연구에서 우리는 NCFPE 조직 FFPE 직물에 대 한 승인 되었습니다 물고기 분석에 사용할 수 없습니다 다는 것을 보였다. 그러나, 일련의 다른 게시물 고정 프로시저가 NCFPE 조직 보여주는 버퍼링 4% 포름알데히드의 고정 시간 NCFPE 조직 단면도의 18 h 이상 게시 시간의 테스트 FFPE 직물14함께 동등한 결과 달성.
이 연구에서 상세한 프로토콜을 제공 하며 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 고정 및 24 시간 4%의 영향 같은 기본 조직 표본에서 HER2 물고기와 RNA 품질에 대 한 사용 되는 단면에 포름알데히드 후 고정 버퍼 보여 줍니다.
그림 1: 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 및 비 크로스 연결의 RNA 분석에 대 한 단계를 표시 하는 다이어그램, 무료 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (NCFPE) 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
결과 두 가지 주요 결과 보여 줍니다. 첫째, NCFPE 조직에서 잘라내기 섹션의 간단한 24 h SBFS 후 정착 단계 물고기 분석 FFPE 직물에 대 한 승인 물고기 분석 실험을 사용 하 여 (참조14참조)에서 그 FFPE 동일한 결과 얻을 수 충분 하다. 이 프로토콜의 물고기 분석 원래 개발 하 고 승인 FFPE 포괄적인 재검사 필요 없이 (예를 들어, 교차 연결 된 조직에 대 한 사전 교 잡 조건을 최적화)를 사용 하 여 장점이 있습니다. 물고기 프로토콜은 제조업체의 지침에 설명 된 대로 정확 하 게 사용할 수 있습니다.
제조업체에서 명시적으로 권장 이전 적응에서이 프로토콜 (예: 조직 섹션 직경 및 부 화 기간 deparaffinization 단계에서) 결과에서 설명 하는 manufacturer´s 지침에서 약간의 수정 때문에 다른 조직 유형 및 고정 방법의 사용.
후 정착 단계가 18-24 h는 1 일 하 여 분석 시간을 확장 하지만 같은 일일 워크플로 FFPE 직물 (그림 1)에 대 한 개발의 화학 반응 시간을 필요로 하기 때문에 중요 합니다. SBFS 시간22 조직 유형23,24에 따라 2 h 5 m m 당 1 밀리미터의 평균 속도로 조직에 침투 하는 것으로 알려졌다. 18 h의 머리말 붙인된 후 고정 기간만 FFPE 섹션, NCFPE의 속성을 변경할 수 관찰이 나타냅니다 화학 반응에 정착 액의 침투를 하지1 원하는 결과 달성 하기 위한 중요 한 ,14.
둘째,는 생체는 잘 보존 된 후 고정을 위한 사용 되지 않는 나머지 NCFPE 조직은 추가 분자 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 반전 녹음 방송 실시간 PCR (그림 3)에 의해 입증 되었다. 분석 결과 더 과민 하 고 electropherogram 파생 린 값 보다 (RNA 무결성 번호) RNA 품질 (화학 수정 및 조각화) 파라핀 끼워 넣어진 조직8에서 고립 mRNA에 관해서는 특정. 품질 관리 제한 했다이 연구에서 실시간 PCR에 때문에 독립적인 그룹 나타났습니다 뿐만 아니라 RNA, DNA와 단백질 NCFPE에서 분리의 품질 FFPE 직물 8,9, 에서 그 보다 더 13.
프로토콜 해당 되는 경우 다음과 같이, 제시 (예를 들어, SBFS 제조 법, 고정 조건, RNA 품질 관리, 검증), 체 외 진단 (IVD)에 대 한 사전 분석 절차에 대 한 CEN 기술 규격의 요구 사항 최근으로 유럽 위원회의 규격화 (CEN) 출시 되었습니다 (예: CEN/TS 16827-ISO 15189 표준 참조 FFPE 조직에서 RNA 격리에 대 한 1:2015).
메서드를 사용 하면이 특정 정착 액으로 제한 됩니다. 비록 생체 및 비 크로스 연결, 말린 무료 정착 액을 사용 하 여 형태학의 좋은 보존 여러 연구에서 제시 되는 일반적인 의료 응용 분야에 연구에 주로 사용 된다. 이유 중 하나는 골드 표준 SBFS를 대체 다른 정착 제에 의해 고정 것 요구 이다 유효성 검사 연구의 다양 한 FFPE 자료에 대 한 최적화 된 모든 프로토콜 비 크로스 연결 fixatives 고정 재료 사용할 수 있는. 다른 조직의 고정 방법 하지이 물고기 프로토콜에 대 한 테스트 되었습니다.
이 원고에 설명 된 간단한 후 정착 단계는 FFPE 및 NCFPE 조직에 대 한 승인 IVD 분석 모두를 사용의 이점이 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 전문성에 대 한 의료 대학 그라츠의 병 리 연구소에서 분자 병 리에 대 한 실험실의 팀을 감사 하 고 지원 합니다. 또한, 우리는 감사 아이리스 Kufferath와 다니엘 Pabst 기술 지원에 대 한 집 엔 Rieger와 HER2 경우를 처리 하기 위한 실비아 Eidenhammer Kinga Szurian (병리학 자) 및 Tamas Regényi (3DHISTEC). 우리가 원고 교정을 위해 페넬로페 Kungl 감사 합니다. 이 작품 재정적으로 기독교 도플러 연구 기금, 과학의 오스트리아 연방 정부, 연구 및 경제 및 국가 기초에 의해 연구, 기술 및 개발을 지원 하고있다.
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