Fluorescens på plass hybridisering (fisk) kreves ofte i kombinasjon med histopatologi og molekylære diagnostikk for utvalg av terapi i personlig medisin. Et romanen ikke kors-kobling, formalin-fri vev bindemiddel som gir høy kvalitet morfologiske, molekylær og fisk analyser fra samme prøven av tillegg av en post fiksering trinn før FISKEN er presentert.
Morfologiske vurdering av formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) har vært gullstandarden for kreft diagnostikk tiårene på grunn av sin utmerkede bevaring av morfologi. Personlig medisin gir stadig individuelt tilpasset og målrettet terapi for preget personlige sykdommer aktiveres av kombinerte morfologiske og molekylære analytisk teknologien og diagnose. Ytelsen til morfologiske og molekylære analyser fra samme FFPE prøven er utfordrende på grunn av den negative virkningen av formalin på grunn av kjemisk endring og cross-linking av nucleic syrer og proteiner. En ikke kors-kobling, formalin-fri vev bindemiddel er nylig utviklet å oppfylle begge krav, dvs, å bevare morfologi som FFPE og biomolecules som cryo-bevaring. Siden fisk er ofte nødvendig sammen med histopatologi og molekylære diagnostikk, testet vi anvendelse av fisk protokoller på papir behandlet med denne nye bindemiddel. Vi fant at formalin etter fiksering av histologiske deler av ikke kors-kobling, formalin-fri og parafin-embedded (NCFPE) bryst kreft vevet som generert tilsvarende resultater for de med FFPE vev i menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) FISK analyse. Denne protokollen beskriver hvordan en fisk analysen opprinnelig utviklet og godkjent for FFPE vev kan brukes for NCFPE vev av en enkel etter fiksering steg av histologiske deler.
Personlig medisin avhengig stadig flere parameter tester med morfologiske og molekylære vev analyser. Formalin fiksering av vev som gullstandarden gir utmerket morfologiske kvalitet1,2. Imidlertid påvirker formalin-indusert kjemisk endring og cross-linking av proteiner og nukleinsyrer3,4,5 negativt molekylær analyse6. Endringene molekylær begrense kvaliteten på nucleic syrer og proteiner og kan resultere i genet sekvens gjenstander7 eller redusert følsomhet for polymerasekjedereaksjons (PCR)-baserte analyser8. Selv om stor innsats ble tatt å optimalisere molekylær tester for FFPE vev, er cryo-bevaring av vev generelt bedre formalin fiksering, noe som gjør det nødvendig å dele vevsprøver for ulike bevaring prosedyrer. For å unngå behovet for cryo-bevaring for molekylær analyser, en ikke kors-kobling, formalin-fri etappe, den stabiliserende, PAXgene vev ble utviklet. Kommersielt tilgjengelige systemet består av en fiksering og stabilisering løsning som inneholder forskjellige alkoholer, eddiksyre og et løselig organisk stoff. Forsvarlig bevaring nucleic syrer, (phospo) proteiner og morfologi ble vist i flere studier6,9,10,11,12,13.
En applikasjon i kreft diagnostikk er fisk oppdager et omfattende utvalg av chromosomal endringer, for eksempel translocations, submicroscopic sletting og amplifications 14. Tjue prosent av invasiv bryst kreften svulst viser for eksempel forsterkning av den menneskelige epidermal vekstfaktor reseptoren 2 (HER2) genet15,16,17, som er forbundet med dårlig prognose18 ,19. Fastsettelse av HER2 overuttrykte og forsterkningsnivå status i brystkreft av fisk er nødvendig å velge pasienter for anti-HER2-rettet terapi og er en følgesvenn diagnostiske oppført av Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. For å gi en bred anvendelse av fisk-baserte følgesvenn diagnostikk i helsevesenet, ble analyser utviklet og godkjent for FFPE vev.
I en tidligere studie viste vi at NCFPE vev ikke kan brukes for fisk analyser som er godkjent for FFPE vev. Men oppnådd tester for tiden rekke forskjellige innlegg fiksering prosedyrer av NCFPE vev med 4% bufret formaldehyd viste at legge fiksering ganger 18 h eller lengre NCFPE vev deler tilsvarende resultater for de med FFPE vev14.
I denne studien vi tilbyr en detaljert protokoll og viser virkningen av ikke kors-kobling, formalin-fri vev fiksering og 24 h 4% bufret formaldehyd etter fiksering på delene som brukes for HER2 fisk og RNA kvalitet fra samme primære vev prøven.
Figur 1: Diagram som viser trinnene for fluorescens i situ hybridisering (fisk) og RNA analyse av formalin fast parafin innebygd (FFPE) og ikke-cross-kobling, formalin uten fast parafin innebygd (NCFPE) vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Resultatene viser to viktige funn. Først er litt enkel 24 h SBFS etter fiksering av kuttet fra NCFPE vev tilstrekkelig til å oppnå tilsvarende resultater for de med FFPE i fisk analyser med fisk analyser godkjent for FFPE vev (se også referanse14). Denne protokollen har fordelen av benytter fisk analyser opprinnelig utviklet og godkjent for FFPE uten behov for omfattende forlengelse (f.eks ved å optimalisere pre hybridisering betingelsene for ikke-krysskoblet vev). FISK protokollen kan brukes akkurat som beskrevet i instruksjonene fra produsenten.
Mindre endringer fra manufacturer´s-instruksjonene som er beskrevet i denne protokollen (f.eks vev delen diameter og inkubasjon perioder på deparaffinization trinnene) resultatet fra tidligere tilpasninger, som er eksplisitt anbefalt av produsenten på grunn av bruk av ulike vev og fiksering metoder.
Etter fiksering trinnet er kritisk fordi det krever en kjemisk reaksjon tid med 18-24 h, som utvider analyse tiden av en dag, men gir samme daglig arbeidsflyten som utviklet for FFPE vev (figur 1). SBFS rapporteres å trenge vev til en gjennomsnittlig rente på 1 mm per time22 til 5 mm i 2t avhengig av vev type23,24. Observasjon at bare etter fiksering lengre mer enn 18 h kan endre egenskapene til NCFPE til FFPE deler, indikerer at ikke gjennomtrengning av bindemiddel men kjemiske reaksjonstid er avgjørende for å oppnå de ønskede resultatene1 ,14.
Andre kan gjenværende NCFPE vev som ikke brukes til etter fiksering brukes for videre molekylær analyser som biomolecules er godt bevart. Dette ble demonstrert av sanntids omvendt transkripsjon PCR (Figur 3). Analysen er mer følsom og spesifikk enn electropherogram-avledet RIN verdien (RNA integritet tall) med hensyn til RNA kvalitet (dvs. kjemisk endring og fragmentering) for mRNA isolert fra parafin-embedded vev8. Kvalitetskontroll var begrenset i denne studien til sanntid PCR siden uavhengig grupper har vist at i tillegg til RNA, kvaliteten på DNA og proteiner isolert fra NCFPE er bedre enn fra FFPE vev 8,9, 13.
Protokollen presentert følger, der det er aktuelt (f.eks SBFS oppskrift, fiksering forhold, RNA kvalitetskontroll, validering), kravene CEN tekniske spesifikasjoner for pre analytisk prosedyrer for in vitro diagnostikk (IVD), som har vært nylig utgitt av europeiske komité for standardisering (CEN) (f.eks CEN/TS 16827-1:2015 for RNA-isolasjon fra FFPE vev som refererer til ISO 15189-standarden).
Metoden er begrenset til denne bestemte bindemiddel. Selv om god bevaring av biomolecules og morfologi bruker ikke kors-kobling, formalin-fri bindemiddel er presentert i flere studier, er det hovedsakelig brukt i forskning, men ikke i rutinemessige medisinske anvendelser. En grunn er at erstatte gullstandarden SBFS fiksering av en annen bindemiddel ville kreve en rekke validering studier som ikke alle protokollene optimalisert for FFPE materiale kan brukes for materialer fast med ikke-cross-kobling fiksativene. Andre vev fiksering metoder ble ikke testet for denne fisk-protokollen.
Det enkle etter fiksering trinnet beskrevet i dette manuskriptet har fordelen av benytter IVD godkjent analyser både for FFPE og NCFPE vev.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke teamet for laboratorium for molekylær patologi ved Institutt for patologi medisinske universitet Graz for sin ekspertise og støtte. Videre takker vi Iris Kufferath og Daniela Pabst for teknisk assistanse, Bernadette Rieger og Sylvia Eidenhammer saksbehandling HER2 samt Kinga Szurian (patologen) og Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi takker Penelope Kungl for korrekturlesing manuskriptet. Dette arbeidet har vært økonomisk støttet av den kristne Doppler Research Fund, den østerrikske føderale Ministry of Science, forskning og økonomi og National Foundation for forskning, teknologi og utvikling.
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany | www.sav-lp.de | FN-200L-4-1 | Tissue fixative |
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada | www.simport.com | M-498 | Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765112 | For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 813150 | Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration |
Merck Millipore, Munich, Germany | www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html | MC1009834000 | Dehydration of tissue samples |
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany | https://at.vwr.com | 10293EP | Dehydration of tissue samples |
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria | www.herba-chemosan.at | 2549662 32 | Paraffin used in a tissue processing device |
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria | www.LeicaBiosystems.com | 39602004 | Paraffin embedding medium |
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria | www.sanova.at | 5229 | Paraffin embedding instrument for tissues for histology |
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria | www.histocom.info | M 910010 | This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument. |
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark | www.chem.agilent.com | K802021-2 | Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 73504 | For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765134 | For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany | www.zytovision.com | Z-2015-200 | For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples. |
3DHISTEC, Budapest, Hungary | www.3dhistech.com | Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera. | |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE | www.thermofisher.com | Ser. Nr. F239 | Spectrophotometer for nucleic acid quantification. |
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A | www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order | e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 | Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures. |