Summary
嗅觉神经元表达各种各样的轴突分选分子，建立适当的神经电路。该方案描述了一种免疫组织化学染色方法来观察嗅觉神经元轴突末端的轴突分选分子的组合表达。
Abstract
由于其简单的解剖结构，小鼠嗅觉系统通常用于研究神经回路形成的机制。嗅觉神经元（OSN）是具有单个枝晶和单个无分支轴突的双极细胞。 OSN仅表达一个嗅觉受体（OR）基因，表达给定类型的OR的OSN将其轴突收敛于嗅球（OB）中的几组不变的肾小球。 OSN预测的一个显着特征是表达的ORs在轴突投影中起到指导作用。 ORs调节多个轴突分选分子的表达，并在OSN轴突末端产生轴突分选分子的组合分子代码。因此，要了解OR特异性轴突引导机制的分子机制，在同一肾小球中的OSN轴突末端表征其表达谱是至关重要的。本文的目的是介绍收集尽可能多的肾小球的方法e在单个OB部分上，并使用多个抗体进行免疫染色。这将允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。
Introduction
在发育过程中，神经元彼此精确连接，形成适当的神经回路，这对正常脑功能至关重要。由于大脑中的异常神经回路被认为是自闭症和精神分裂症等精神障碍的原因，因此了解神经回路形成的机制是神经科学领域的主要挑战之一。
在小鼠嗅觉系统中，嗅觉上皮（OE）中的每个嗅觉感觉神经元（OSN）仅表达一个功能性嗅觉受体（OR）基因，并且表达相同OR的OSN在其定型位置收敛其轴突到特定的一对肾小球嗅球（OB） 1，2 。小鼠嗅觉系统是研究神经回路形成的分子机制的优秀模型系统，因为研究人员可以利用OR表达来识别特定的sOSN的ubtype和可视化OSN轴突的投影位点作为清晰的肾小球结构。 OSN投射的一个显着特征是ORs在将OSN轴突投影到OB 3，4，5，6等方面发挥了指导作用。更具体地说，在OSN轴突被引导到近似目标区域之后，它们以OR依赖的方式被分离以形成肾小球。以前的研究表明，OR分子控制轴突分选分子的表达，调节肾小球分离7,8 。此外，积累的证据表明OR分子通过轴突分选分子9的独特组合产生神经元识别码。因此，为了理解OR依赖性肾小球分离的机制，有必要表征轴突分选的表达谱OSN中的ecules。
荧光免疫染色是可视化特定基因表达的常用方法。由于轴突分选分子的蛋白质主要定位于OSN轴突，研究人员需要使用OB部分来表征其在OSN中的表达模式。 OB的冠状切片常规用于免疫染色。然而，该制剂在相同的OB部分中沿着前后轴线丢失了地形信息。因此，我们开发了OB的内侧的旁侧制剂，其可以在相同的OB部分上安装尽可能多的周围的肾小球。结合使用多种抗体的免疫染色，该制剂允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。
此外，已经提出了免疫组织化学染色方法，而不需要用PFA a进行固定nd蔗糖处理。这种方法允许研究人员获得足够高质量的染色数据进行多变量数据分析。本文介绍的方案将为研究嗅觉神经电路形成的研究人员提供有力的方法。
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Protocol
所有实验程序均经东京大学动物实验伦理委员会和东京大学批准实验动物护理和使用指南进行。
1.准备解决方案
- 准备0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）：将PBS片剂（0.14M NaCl，0.0027M KCl，0.010M PO 4 3- ，pH 7.4）加入到1L蒸馏水中，并在室温下搅拌直到其完全溶解。
- 在PBS中制备4％多聚甲醛（PFA）：将4g PFA加入到100mL PBS中。将溶液在60℃下搅拌直至完全溶解。
- 将PFA溶解在PBS中后，用1N氢氧化钠（NaOH）将溶液的pH调节至7.4。然后，在冰上冷却并通过滤纸过滤溶液以除去任何颗粒物。储存于4°C。
注意：使用这些试剂时，请妥善保管。处理小心使用手套，安全护目镜和化学罩下的实验室外套。
注意：使用2 d内制备的新鲜4％PFA溶液。
- 将PFA溶解在PBS中后，用1N氢氧化钠（NaOH）将溶液的pH调节至7.4。然后，在冰上冷却并通过滤纸过滤溶液以除去任何颗粒物。储存于4°C。
- 准备补充有0.3％Triton X-100（PBST）的0.01M PBS：加入3mL Triton X- 100至997mL PBS。在室温下搅拌该溶液直到其完全溶解。
- 制备1％和5％封闭溶液：加入10g脱脂乳至200 mL PBST，制备5％封闭溶液。在室温下搅拌直至完全溶解。用PBST稀释5％封闭溶液5次以制备1％封闭溶液。
Parasagittal OB部分的准备
- 使用1-2周龄的动物。这些年龄组适用于以下实验，因为肾小球清晰可见，可以用头骨切割大脑。
- 用腹膜内注射戊巴比妥（50mg / kg体重）麻醉动物。用冰冷的4％P经皮灌注动物FA在PBS。小心处理，使用手套，安全护目镜和化学罩下的实验室外套。
- 灌注后，用剪刀切开头部，小心地取出皮肤。然后，将剪刀刀片插入上下齿之间的空间，水平切割以去除下颚骨。用镊子和剪刀剪掉多余的组织，以留下嗅觉组织，包括OB和OE。
注意：不要去除OB周围的头骨，因为它保留了内侧肾小球垂直排列。 - 将嗅觉组织浸泡在PBS中以去除鼻腔中的空气。垂直切除脑后部，将嗅觉组织放置在嵌入模具的底部，切割面朝下。用最佳切割温度（OCT）复合物填充模具，然后将模具浸入液氮中。
- 化合物中的组织完全冷冻后，将其孵育在冷冻液中tat在-20℃下1小时。
- 用低温恒温器制作OB的串联旁路截面（10μm），并通过粘贴到MAS涂覆的玻璃片上收集。粘贴后，立即用吹风机干燥载玻片。
第1天：OB切片的四次免疫染色
- 在室温下用PBS洗涤载玻片5分钟。重复3次。
- 通过在RT下用5％封闭溶液孵育载玻片1小时来阻断非特异性结合位点。
- 在1％的封闭溶液中，将载玻片O / N与初级抗体混合（每个载玻片400μL）孵育。使用以下一抗：豚鼠抗Kirrel2抗体（1:1000），山羊抗Semaphorin-7A（Sema7A）抗体（1:500），大鼠抗OL-原螯合素（OLPC）抗体（1:500），和小鼠抗囊泡谷氨酸转运蛋白2（VGLUT2）抗体（1:500）。
4.第二天：OB的四次免疫染色片
- 弃去一级抗体溶液，并在室温下用PBST洗涤载玻片5分钟。重复3次。
- 在PBS中，用PBS中的二次抗体（每个载玻片400μL）混合1小时。使用以下二抗：驴抗小鼠Alexa Fluor 405（1:400），驴抗山羊Alexa Fluor 488（1:400），驴抗豚鼠Alexa Fluor 555（1:400）和驴抗 - 大鼠Alexa Fluor 647（1:400）。
注意：所有二级抗体应来自相同的宿主物种。为每个一级抗体选择不同波长的二级抗体荧光，以确保波长不重叠。 - 弃去溶液，并在室温下用PBS洗涤载玻片5分钟。重复3次。
- 在载玻片上安装盖玻片与安装介质。为此，在每张幻灯片上涂2滴安装介质，然后通过去除气泡放置盖玻片。
强度我asurements
- 用荧光显微镜获取荧光图像。使用以下过滤器立方体：对于Alexa Fluor 405信号的DAPI过滤器立方体（360/40nm激发，460/50nm发射和400nm分色镜），GFP滤光镜立方体（470/40nm激发，525/50nm发射，和用于Alexa Fluor 555的Alexa Fluor 488，TRITC滤色器立方体（545/25nm激发，605/70nm发射和565nm分色镜）和Cy5滤光器立方体（620/60nm激发，700 / 75nm发射和600nm二向色镜）用于Alexa Fluor 647。
注意：调整曝光时间以获得图像的荧光信号而不饱和。 - 通过VGLUT2的免疫荧光信号定义肾小球结构。用ImageJ测量肾小球内轴突分选分子的染色强度。
数据分析
- 从轴突分选分子的染色强度中减去背景信号。
- 准备e表达数据矩阵，其具有由轴突分选分子和由肾小球组成的行组成的列。
- 使用准备的表达式数据集执行主成分分析（PCA）。然后，获得每个主成分的PCA分数，贡献率和因子负荷。
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Representative Results
嗅肾小球图由初始全局靶向和随后的OSN轴突1,2的肾小球分离形成。通过由表达水平由表达的OR分子决定的轴突分选分子介导的粘附/排斥轴突相互作用调节肾小球分离7 。涉及肾小球偏析的轴突分选分子在OB 9中以位置无关的镶嵌方式表达。在本研究中，我们选择了以下基因： Kirrel2 ， Sema7A ， OLPC ， BIG-2和PCDH17 。这些轴突分选分子中的一些以活性依赖性方式表达7,8,10。
四倍免疫这里所示的方法允许同一部分同时显示四个分子的表达模式。这些轴突分选分子显示位置无关的镶嵌表现，但它们的图案不相同（ 图1A，B ）。肾小球结构由VGLUT2的荧光信号定义（ 图2A ）。轴突分选分子（Kirrel2，Sema7A，OLPC）在每个肾小球中差异表达;然而，用作肾小球标记的VGLUT2在肾小球中均匀表达（ 图2B，2C ）。
单个肾小球可以被认为是由多个变量表示的数据单元。为了分析该多变量表达数据，进行主成分分析（PCA）。 PCA定义了一个新的坐标系，使得第一个坐标具有最大的方差数据集，并且每个坐标系都成功坐标具有最大的残差方差。表达式数据集经受PCA并绘制在第一和第二主成分（PC1和PC2）的空间中（ 图3A ）。每个主成分的贡献率表示每个主成分在变量的总趋势中代表多少百分比。 PC1，PC2，PC3，PC4和PC5的贡献率分别为33.4％，28.2％，19.8％，17.3％和6.3％（ 图3B ）。 PCA还揭示了每个主要组成部分的因素负荷。平方因子加载指示原始变量中的方差百分比多少由一个因素解释。在PC1中，Sema7A，OLPC和Kirrel2的因子负载正负载，而BIG-2和PCDH17的因子载量不是（ 图3C ）。以前的研究分析了这些分子在缺陷型环核酸突变小鼠中的表达 （CNG）通道基因，其是嗅觉信号转导的组成部分11 ，并且显示出表达水平中CNG依赖性变化的模式类似于PC1 9中的因子负载。这些结果表明，这些分子的多种表达是由CNG通道介导的神经活动产生的。
图1：旁路OB部分的四次免疫染色。 （ A ）OE＆OB示意图。 （ B ）来自用针对vGLUT2（白色），Kirrel2（红色），Sema7A（绿色）和OLPC（蓝色））的抗体免疫染色的2周龄小鼠的旁矢状面。 Kirrel2（红色），Sema7A（绿色）和OLPC（蓝色）的合并图像显示在右侧。刻度棒=100μm。/files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2：轴突分选分子的表达分析。 （ A ）用VGLUT2（紫色），Kirrel2（红色），Sema7A（绿色）和OLPC（蓝色）的抗体免疫染色的旁侧嗅球（OB）切片。每个肾小球由VGLUT2（突触前突触）的荧光信号定义。肾小球结构被虚线包围。 （ B ）肾小球＃1，＃3，＃4和＃6中Kirrel2，Sema7A和OLPC的表达水平。在每个肾小球中测量轴突分选分子的染色强度。 （ C ）在肾小球之间比较轴突分选分子和VGLUT2的表达水平。这些分子的信号强度用ea测量ch肾小球图表上的灰色条表示表达水平的平均值。刻度棒=100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：轴突分选分子的表达数据的PCA。 （ A ）五个轴突分选分子（Kirrel2，Sema7A，OLPC，BIG-2和PCDH17）的表达数据集的主成分分析（PCA）分数（PC1Vs.PC2）。共分析了1799例肾小球。 （ B ）所有五个主要组成部分的缴款比率和累积缴款比率。 PC1，PC2，PC3，PC4和PC5的贡献率分别为0.334,0.282,0.198,0.173和0.063。 （ C ）Kirrel的因子载荷2，PC1-3中的Sema7A，OLPC，BIG-2和PCDH17。 PC1，PC2和PC3的特征值分别为1.67,1.16和0.99。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
旁分泌OB部分的四次免疫染色使得能够在大量肾小球中同时观察和定量多达四个轴突分选分子的表达水平。通过用PCA分析这些多变量数据，可以推测这些分子表达的特征。
为了成功染色，组织样品制备至关重要。一些方案表明组织应用4％PFA后固定，并用30％蔗糖处理以进行冷冻保护。但是，在本协议中省略了这些步骤。这是因为在许多情况下，这些步骤减少染色信号强度并增加背景。此外，切片不应该在任何步骤干燥，以避免染色时的高背景。
根据所使用的组织和抗体的类型，最佳染色条件是不同的。所以是必须的y确定每个实验的具体染色条件。此外，一抗的浓度也是重要的。当浓度过高时，会增加背景。然而，当浓度太低时，会降低信号。因此，重要的是确定适当的一级抗体浓度以获得高质量的染色结果。一个限制是该方法在很大程度上取决于一级抗体和一级抗体组合相对于动物物种的质量。
OB的冠状切片已经常规用于免疫染色。然而，在该方案中，使用OB的内侧的旁侧部分能够将更多的肾小球放置在单个部分上。由于这些部分保留了沿背腹和前后轴的肾小球的地形顺序，它们也可用于分析轴突指导分子，其确定OSN轴突的投影位点。
在本研究中，准备了OB的旁矢状切片以使更多的肾小球放置在单个部分上。此外，水平部分也可用于研究人员揭示沿内侧或前后轴的差异。随着可用于多种免疫染色的抗体的发展，这种四重染色方法不仅可以应用于OB，而且可以应用于其他脑区域。
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Disclosures
作者声明没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了三菱基金会，武田科学基金会，JST PRESTO和JSK KAKENHI Grant Number 16H06144的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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