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Developmental Biology

मैकेनिकल टिशू डिसोसिएशन और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा स्तनधारी नर मृदा कोशिकाओं की बहुपक्षीय शोधन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55913
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह काम विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण ऊतक से शुद्ध जर्म सेल आबादी प्राप्त करने के लिए एक विधि के मानकीकरण का वर्णन करता है। यह एक सरल प्रोटोकॉल है जो मैकेनिकल टेस्टिस डिज़ेबेशन को जोड़ती है, होच्स्ट -33342 और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ धुंधला हो जाना, और एफएसीएस सॉर्टिंग, पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान के तुलनात्मक अध्ययनों में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ।

Abstract

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) स्तनधारी वृषण कोशिका कोशिकाओं की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए पसंद के तरीकों में से एक है। वर्तमान में, यह उच्च उपज और शुद्धता के साथ 9 म्यूरीन जर्म सेल आबादी के भेदभाव की अनुमति देता है। शुक्राणुजनन के दौरान क्रोमैटिन संरचना और मात्रा में अद्वितीय परिवर्तनों के कारण भेदभाव और शुद्धि में यह उच्च संकल्प संभव है। ये पैटर्न फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी रंजक जैसे होकस्ट -33342 (होकस्ट) के साथ दागकर नर जर्म कोशिकाओं के प्रवाह cytometry द्वारा कब्जा किए जा सकते हैं। ये स्तनधारियों वृषण वृषण कोशिकाओं को अलग करने के लिए हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल का विस्तृत वर्णन है। संक्षेप में, एकल कोशिका निलंबन यांत्रिक पृथक्करण द्वारा वृषण के ऊतकों से उत्पन्न होते हैं, डबल होईक्स्ट और प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग और प्रवाह कोशिकामितीय द्वारा संसाधित। विभिन्न डीएनए सामग्री (एचईसीएस तीव्रता) के साथ जीवित कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) के चयन सहित एक सीरियल गेटिंग रणनीति, मैंएस एफएसीएस के दौरान 5 जर्म सेल प्रकार तक भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। इनमें शामिल हैं औसत सूक्ष्मता मूल्यांकन (माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन द्वारा निर्धारित): शुक्राणु (66%), प्राथमिक (71%) और माध्यमिक (85%) शुक्राणुओं, और शुक्राणुओं (90%), आगे राउंड (9 3%) में विभाजित और बढ़ाव (87%) उप-जनसंख्या पूरे वर्कफ़्लो का निष्पादन सीधा है, उचित एफएसीएस मशीन के साथ-साथ 4 सेल प्रकारों के अलगाव की अनुमति देता है, और 2 घंटे से कम में किया जा सकता है। पूर्व विवो कोशिकाओं के फिजियोलॉजी को संरक्षित करने के लिए प्रोसेसिंग का समय कम होना महत्वपूर्ण है, इस पद्धति में नर जर्म सेल बायोलॉजी के डाउनस्ट्रीम हाई-थ्रूपुट अध्ययन के लिए आदर्श है। इसके अलावा, स्तनधारी जर्म कोशिकाओं के multispecies शुद्धि के लिए एक मानक प्रोटोकॉल चर के तरीकों के स्रोतों को समाप्त कर देता है और विभिन्न जानवरों के मॉडल के लिए अभिकर्मकों के एक सेट का उपयोग करने की अनुमति देता है।

Introduction

शुक्राणुजनन प्रगति के इन विट्रो सिस्टम प्रतिनिधि की कमी को देखते हुए, और वृषण में महान सेलुलर विविधता की उपस्थिति, नर रोगाणु कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के समृद्ध आबादियों को अलग करने के लिए मजबूत तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस प्रयोजन 1 , 2 , 3 , 4 , 5 के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है क्योंकि यह उच्च उपज और शुद्धता प्रदान करता है, और रोगाणु सेल प्रकारों की संख्या में अन्य अलगाव विधियों को पार करता है जो इसे पहचान सकते हैं और 6 , 7 , 8 का चयन करें प्रवाह कोशिकामितीय विश्लेषण का सिद्धांत एकल कोशिकाओं के लेजर बीम उत्तेजना के बाद अंतर प्रकाश पैटर्न का पता लगाने पर आधारित है। एक सेल के रूप में लेजर के माध्यम से गुजरता है, यह प्रतिबिंबित करता है / स्कैटर प्रकाशसभी कोणों पर, सेल आकार (आगे बिखराव, एफएससी) और इंट्रासेल्यूलर जटिलता (साइड स्कैटर, एसएससी) के आनुपातिक। प्रवाह साइटमैट्री पर विस्तृत जानकारी के लिए ऑरमेरोड 9 देखें।

शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में नर जर्म कोशिकाओं डीएनए सामग्री, क्रोमेटिन संरचना, आकार और आकार में विशिष्ट संशोधनों से गुजरती हैं। इस प्रकार, विशिष्ट सेल आबादी को पहचान लिया जा सकता है और फ्लोरोसेंट रंजक 10 , 11 के साथ प्रकाश बिखरने और डीएनए धुंधला के संयोजन के द्वारा अलग किया जा सकता है। इस प्रयोजन के लिए कई रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है (गीजरिंग और रॉड्रिग्ज़-कसूरीगा 3 में समीक्षा की गई), जैसे होकस्ट -33342 (होचस्ट), जिसे पिछले दशक 1 , 2 , 4 , 10 से वृषण कोशिकाओं के प्रवाह कोशिकामितीय विश्लेषण में अक्सर प्रयोग किया जाता है , 12 Upoयूवी प्रकाश के साथ एन उत्तेजना, होक्स्ट सेलुलर डीएनए सामग्री के लिए आनुपातिक नीली प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, जबकि अभी तक लाल प्रतिदीप्ति क्रोमेटिन संरचना और संयोग 1 , 13 , 14 में परिवर्तनशीलता को दर्शाती है। नतीजतन, एचईसीएससी के दाग वाले एकल सेल निलंबन (हो-एफएसीएस; 1 , 12 ) के एफएसीएस के दौरान भेदभाव के विभिन्न चरणों में पुरुष जर्म कोशिकाओं के विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि शुक्राणुओं के दौरान केवल सक्रिय होने वाले डाई फुलक्स की एक तंत्र के कारण, होशेस्ट ब्लू फ्लोरोसेंस की तीव्रता इन कोशिकाओं में क्रोमेटिन सामग्री का आनुपातिक नहीं है, और वे हो-एफएसीएस 15 के दौरान एक आबादी के रूप में क्लस्टर हैं। इसके अलावा, गैर-पारगम्य डाई प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ हईचस्ट स्टैनिंग के संयोजन में उपयोगकर्ताओं को एफएसीएस 1 के दौरान मृत (पीआई पॉजिटिव) कोशिकाओं से लाइव (पीआई नकारात्मक)Sup>, 2 , 10 , 12 इस रणनीति का इस्तेमाल पहले वृषण वृक्क कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण में किया गया है और माउस में बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया गया है ताकि 9 कोशिकाओं के सेल प्रकार के साथ भेदभाव किया जा सके, जिनमें अर्धसूत्रीविभाजन I 1 , 2 , 4 , 16 के 4 विभिन्न चरणों में कोशिकाएं शामिल हैं। इस काम के उद्देश्य के लिए, हईचस्ट स्नेनिंग के तीन मुख्य लाभ हैं। सबसे पहले, माउस-मॉडल 1 , 2 , 12 , और चूहे और गिनी पिग 17 , 18 , 1 9 जैसे अन्य कृन्तकों में नर जर्म कोशिकाओं के अलगाव के लिए हो-एफएसीएस सफलतापूर्वक लागू किया गया है। दूसरा, हईचस्ट एक सेल-पारगम्य डाई है और इसे झिल्ली परमिटिएजीज़ की ज़रूरत नहीं है, इसलिए यह प्रीपररVes सेल अखंडता अंत में, हेक्स्ट ने डीआईए और प्रोटीन के अलावा डीएनए 1 , 20 , डीएनए अनुक्रम 1 , 20 को प्राथमिकतापूर्वक पाली (डी [एटी]) डीएनए अनुक्रमों को संरक्षित करने के लिए आरएनएई उपचार की आवश्यकता नहीं है, और इसके अतिरिक्त जीवाणु के आगे की ओर के आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिका विशिष्टीकरण।

फ्लो साइटमैट्री में जीवाइज़र और रॉड्रिग्ज़-कसूरीगा 3 में समीक्षा किए गए डीएनए प्लॉएडे और / या डेनटेबिलिटी में समानता के बावजूद, फ्लो साइटमैट्री द्वारा नर जर्म सेल अलगाव के लिए वर्णित प्रोटोकॉल में परिवर्तनशीलता का एक अच्छा सौदा रहा है। अलग-अलग अध्ययनों ने ऊतक विघटन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, और विभिन्न डीएनए बाध्यकारी रंजक (अकेले या संयोजन में) और विभिन्न मॉडल जीवों में मुख्य रूप से माउस, चूहा और गिनी पिग में एफएसीएस गटिंग रणनीतियों का इस्तेमाल किया है। इसलिए, विभिन्न प्रजातियों के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों की प्रत्यक्ष तुलना अनको से प्रभावित हो सकती हैबेकार तकनीकी कलाकृतियों, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तनशीलता के बीच अंतर है। महत्वपूर्ण बात, स्तनधारी शुक्राणुजनन (2 एन -4 एन-2 एन-1 एन) में क्रोमैटिन गतिशीलता के हड़ताली संरक्षण से पता चलता है कि एक मानक प्रोटोकॉल को विविध प्रकार के स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है।

इस अध्ययन का लक्ष्य एक एकल वर्कफ़्लो को विकसित करना था जो विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों पर लागू होता है, जो पिछली बार प्रकाशित तकनीकों को जोड़कर और अनुकूल करते हुए 2 , 20 ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक विधि का मानकीकरण, एंजाइमेटिक पाचन 5 के लिए आवश्यक प्रजातियों-विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता से उबरने के लिए यांत्रिक पृथक्करण के द्वारा प्राप्त किया गया था। यह उल्लेखनीय है कि कृत्रिम वृषण वृषण के यांत्रिक पृथक्करण एंजाइमेटिक टिशू पाचन 20 से बेहतर प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है और दोनों तरीकों के प्रदर्शन से उत्पन्न एकल सेल निलंबन के हो-एफएसीएसयह तुलनीय परिणाम 5 सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, यह प्रोटोकॉल 5 जर्म सेल आबादी तक अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स का वर्णन करता है: शुक्राणुता (एसपीजी); प्राथमिक (एसपीसी I) और माध्यमिक शुक्राणुशोधन (एसपीसी II), और शुक्राणु (एसपीडी) - गोल (आरएसपीडी) और बढ़ाव (ईएसपीडी) महत्वपूर्ण बात, प्रयोगशाला में यह आसान है कि ऊतक विघटन के लिए प्रणाली और यूवी लेजर से लैस एक सेल सॉर्टर तक पहुंच की मुख्य आवश्यकता के साथ। यह वर्कफ़्लो ( चित्रा 1 ) तेज और सीधा है और 2 से कम समय में ताजे वृषण के ऊतकों से 4 जर्म सेल आबादी के साथ-साथ अलगाव की अनुमति देता है। आगे की बहाली प्रक्रियाओं के लिए सेलुलर अखंडता बनाए रखने के लिए कम संसाधन समय महत्वपूर्ण है इसके अलावा, 5 अलग-अलग प्रजातियों में इसका सफल प्रदर्शन बताता है कि यह व्यापक रूप से स्तनधारी clade के भीतर लागू किया जा सकता है, यह स्तनधारी पुरुष प्रजनन biol के तुलनात्मक अध्ययन के लिए रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए आदर्श तरीका है।सादृश्य।

यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक कदमों से अलग तीन प्रमुख वर्गों से बना है: (1) वृषण के ऊतक के यांत्रिक विघटन और (2) होक्स्ट और पीआई के साथ टेस्टिकुलर कोशिकाओं के धुंधला हो जाना, इसके बाद (3) एफएसीएस प्रासंगिक शुक्राणु कोशिकाओं का वर्गीकरण करता है। इकट्ठा किए जाने के बाद, विभिन्न स्तनधारी वृषण कोशिकाओं के इन समृद्ध आबादी का उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कई अलग-अलग स्तनधारी प्रजातियों के नर जर्म कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए "एक आकार सभी फिट बैठता है" पृथक्करण विधि। अध्ययन के प्रकार के आधार पर उपयोगकर्ताओं को पृथक रोगाणु कोशिकाओं के साथ व्यवहार करना चाहते हैं, अन्य मीडिया या बफ़र्स का उपयोग किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण एक पूरे मूरीन टेस्टिस से सिंगल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हैं

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Protocol

सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में पशु अध्ययन समिति के नियमों के अनुरूप नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाएं।

1. यांत्रिक पृथक्करण प्रोटोकॉल के लिए तैयारी

  1. संपूर्ण मूरीन वृषण के विच्छेदन के लिए 50 माइक्रोन डिस्पोजेबल ऊतक असंगति कारतूस पूर्व-गीला करें।
    नोट: इस डिस्पोजेबल ऊतक असंगति कारतूस में लगभग 100 हेक्सागोनल छेद वाले ऊतकों को काटने और एक स्थिर स्टील जाल के लिए डिज़ाइन किए गए माइक्रोब्लैड्स शामिल हैं। ऊतक अव्यवस्था कारतूस के लिए जाल के विभिन्न आकार प्रजातियों और वांछित सेल प्रकारों के आधार पर इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए उपलब्ध हैं। इस कागज में वर्णित सभी स्तनधारी प्रजातियों के लिए 50 माइक्रोन कारतूस का उपयोग किया गया था।
    1. 50 मिलीमीटर डिस्पोजेबल ऊतक अव्यवस्था कारतूस पर बर्फ के ठंडे फिनोल लाल मुक्त 1x डुलबेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) के 1 एमएल लोड करें।
      नोट: फेनोल लाल लाल फ्लुरों का पता लगाने में हस्तक्षेप कर सकता हैएफएसीएस के दौरान सींस
    2. सिरिंज बंदरगाह से डिस्पोजेबल 3 एमएल सुई-कम सिरिंज के साथ टिशू असंगति कारतूस से 1x डीएमईएम की आकांक्षा।
  2. "चालू" बटन दबाकर ऊतक असंगति प्रणाली चालू करें इस प्रणाली को "गर्म" समय की आवश्यकता नहीं है
  3. बर्फ ठंडा 1x डीएमईएम के साथ पहले से गीला तीन 40 माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर। एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर प्रत्येक 40 सुक्ष्ममापी डिस्पोजेबल फिल्टर रखें। पिपेट 1 एमएल 1x डीएमईएम और तरल के माध्यम से गुजारें।
  4. वृषण के ऊतकों के संग्रह के लिए 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश तैयार करें। पेटी डिश पर 500 μL का 1x डीएमईएम पिपेट।

2. मैकेनिकल डिसोसिएशन प्रोटोकॉल के लिए टेस्टिक्युलर टिशू की तैयारी

  1. सर्जिकल कैंची और संदंश के साथ ताजा पूरे टेस्टेस या टेस्टिक्युलर टुकड़े (यदि अन्य स्तनधारी प्रजातियों के साथ काम करना) को ध्यान से हटाने के लिए एक पुरुष माउस को काटना।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतकों वसा और परिगलन से मुक्त हैं। फादर एश टेस्टिकिटर्स के ऊतकों को जमे हुए ऊतकों की तुलना में बेहतर एकल सेल निलंबन गुणवत्ता उत्पन्न होती है।
    1. 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश युक्त 500 μL 1x डीएमईएम युक्त तैयार किए गए टेस्ट्स / टुकड़ों को स्थानांतरित करें।
    2. धीरे-धीरे लाल रक्त कोशिकाओं को निकालने के लिए 1x डीएमईएम में ऊतक को कुल्ला।
  2. ध्यान से ट्यूनिका अलबगिनी को हटा दें ट्यूनिका अल्बुनी की मोटाई विभिन्न प्रजातियों में भिन्न होगी।
    1. संदंश के साथ वृषण के एक छोर को पकड़ो।
    2. एक स्केलपेल के साथ वृषण के दूसरे छिद्र को पंचक बनाते हुए, जबकि पिछले चरण से संदंश के साथ वृषण के एक छोर को पकड़ते हुए।
    3. स्टेप 2.2.1 से संदंश के साथ वृषण के एक छोर को पकड़े हुए एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए वृषण वृषण का परिमार्जन करें।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए ~ 2-3 मिमी 3 के टुकड़े में वृषण के नलिकाएं कट करें।

3. टेस्टिक्युलर ऊतक के यांत्रिक विघटन द्वारा एकल सेल सस्पेंशन प्राप्त करना

ध्यान दें: नीचे वर्णित पृथक्करण चरण एक वयस्क माउस वृषण के लिए हैं। किशोर चूहों या गैर-मुरीन प्रजातियों से वृषण के ऊतकों की मात्रा को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। किशोर जानवरों में रोगाणु कोशिकाओं के सभी चरणों में शामिल नहीं हो सकते हैं। गैर-संभोग के मौसम की तुलना में वृक्षारोपण के मौसम के दौरान वृषण टिशू रचना परिवर्तन।

  1. छोटे वृषण ट्यूबली टुकड़े को पूर्व-गीले 50 माइक्रोन ऊतक असंगति कारतूस को संदंश का उपयोग करके ट्रांसफ़र करें और 1 एमएल 1x डीएमईएम जोड़ दें।
  2. टिशू असंगति कारतूस को ऊतक अव्यवस्था प्रणाली और 5 मिनट के लिए घुमक्कड़ को "स्टैंडबाय" से "रन" मोड में बदल कर लोड करें।
  3. टिशू असंगति प्रणाली से टिशू असंगति कारतूस निकालें और सिरिंज बंदरगाह से डिस्पोजेबल 3 एमएल सुई-कम सिरिंज के साथ एस्पिपेट सेल निलंबन निकालें।
    1. टिशू असंगति कारतूस से सभी तरल निकालने के लिए कई बार आकांक्षा। नहींऊतक असंगति कारतूस से सभी 1 एमएल को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।
  4. दो डिस्पोजेबल प्री-गीलेटेड 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एस्पिरेटेड सेल निलंबन पास करें। किसी भी सेल समुच्चय को हटाने के लिए दो बार फ़िल्टर करें
    1. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक पूर्व गीले 40 माइक्रोन फिल्टर रखें। सीरिंज में 40 माइक्रोन फिल्टर पर सीधे एस्पिरेटेड कोशिकाओं को जोड़ें। डिस्पोजेबल पिपेट के साथ पिपेट पास-थ्रू एकल-सेल निलंबन
    2. प्रयुक्त प्री-गीलेटेड 40 माइक्रोन फिल्टर निकालें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक और पूर्व गीले 40 माइक्रोन फिल्टर रखें। साफ 40 माइक्रोन फिल्टर पर एकत्र एकल कक्ष निलंबन पिपेट
    3. साफ डिस्पोजेबल विंदुक के साथ फ़िल्टर किए गए एकल-कक्ष निलंबन को लीजिए।
  5. पिपेट को 50 सुक्ष्ममापी ऊतक अव्यवस्था कारतूस और एक ऊतक अव्यवस्था प्रणाली में एक और 5 मिनट के लिए प्रक्रिया वापस सेल निलंबन वापस।
  6. ऊतक विघटन से सभी तरल पुनर्प्राप्त करेंकारतूस पर

4. होईक्स्ट और प्रेजिडियम इओडाइड (पीआई) के साथ धुंधला हो जाना

  1. स्थानांतरण 50 सुक्ष्ममापी ऊतक असंगति कारतूस से एक स्वच्छ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए सेल निलंबन पुनर्प्राप्त। एकल-सेल निलंबन के लगभग 1-1.5 एमएल को ठीक किया जाएगा।
  2. पुनर्प्राप्त एकल-कक्ष निलंबन को चार 1.5 एमएल या 5 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें।
    1. पहले तीन ट्यूबों के लिए, चार ट्यूबों (लगभग 550 μL एकल-सेल निलंबन) में एकल सेल निलंबन के एकल सेल निलंबन और पिपेट बाकी के 150 μL पिपेट करें।
      नोट: अंतिम ट्यूब में सिंगल सेल निलंबन की मात्रा चरण 3.6 में सेल निलंबन वसूली की दक्षता के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  3. एफएसीएस सत्र के लिए एक अस्थिर नियंत्रण के रूप में चार ट्यूबों की पहली ट्यूब सेट करें।
  4. नियंत्रण के रूप में सिंगल डाई स्टेन्ड (पीआई या होचस्ट) सेल निलंबन तैयार करें प्रत्येक ट्यूब के लिए एचईसीएसटी के 2.5 μL या पीआई के 1 μL को जोड़ें (दूसरा और थाईआरडी)।
  5. एक डबल-दाग़ी ट्यूब तैयार करें इसका उपयोग जर्म कोशिका उप-जनसंख्या इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा। आखिरी ट्यूब में 2.5 μL होक्स्ट और पीआई के 1 μL जोड़ें।
    नोट: Hoechst 2-3 महीने की एक शैल्फ जीवन है डाई के पुराने शेयरों का इस्तेमाल करना एफएसीएस सत्र के दौरान महत्वपूर्ण बदलाव का कारण होगा।
  6. अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। एक ट्यूब रोटेटर में नमूने रखें या हर 5-10 मिनट में 1.5 एमएल ट्यूबों को पलटना।
  7. पूर्व-गीले 40 माइक्रोग्राम झरनी के साथ सेल निलंबन को फ़िल्टर करें और एफएसीएस सत्र तक फ़िल्टर्ड समाधान बर्फ पर रखें और अंधेरे में रखें।
    नोट: एफएसीएस के लिए सेल क्लंप को रोकने के लिए निस्पंदन चरण आवश्यक है इसके अतिरिक्त, सेल क्लंपिंग को सीमित करने के लिए डीएनस ( चित्रा 1 देखें) या 2-नेप्थोल -6,8-डिस्फ़ोनिक एसिड डीपोटासियम नमक (एनडीए 20 ) के साथ इलाज किया जा सकता है। लंबी प्रतीक्षा अवधि एफएसीएस के दौरान पाए जाने वाले फ्लोरोसेंट संकेत को प्रभावित करेगी और सेल की मृत्यु बढ़ सकती है।

    5. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (एफएसीएस) टेस्टिक्युलर सेल्स के सेटअप और शुद्धि

    1. एफएसीएस संग्रहण ट्यूबों को तैयार करें
      1. सेल संग्रह के लिए 400 μL एफबीएस के साथ कोट 5 एमएल पॉलीप्रोपीलेन गोल-नीचे ट्यूब या 1.5 एमएल ट्यूब। कोटिंग के बाद अतिरिक्त एफबीआई को घटाएं।
      2. ट्यूबों में एफएसीएस संग्रह मध्यम (1x डीएमईएम + 10% भ्रूण बोवाइन सीरम, एफबीएस) जोड़ें: 5 एमएल ट्यूबों के लिए 1 एमएल या 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए 100 μL।
    2. सेल सॉर्टर और सॉफ़्टवेयर में उपयुक्त सॉर्टिंग की शर्तें सेट करें
      नोट: अन्य सेल सॉर्टिंग मशीन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग नीचे वर्णित समान सेटअप और गैटिंग रणनीति के साथ किया जा सकता है। यहां वर्णित शर्तों को Gaysinskaya और Bortvin 2 , Geisinger और Rodriguez-Casuriaga 3 , और Getun, एट अल से अनुकूलित किया गया । 4
      1. 463/2 के साथ एक पराबैंगनी लेजर लोड करेंHoechst नीले और 680 एनएम एलपी बैंड पास फिल्टर का पता लगाने के लिए 5 एनएम बैंड पास फ़िल्टर, Hoechst लाल का पता लगा सकता है और पीआई का पता लगा सकता है।
      2. लाल प्रतिदीप्ति से नीले भेद करने के लिए 555 डीएलपी डाइक्रोकिक मिरर का उपयोग करें।
      3. 1000-2000 कोशिकाओं / सेकंड की दर से 70 माइक्रोन नोजल और सॉर्ट सेल का उपयोग करें।
        नोट: छंटनी की दक्षता सीधे प्रवाह दर से प्रभावित होती है उच्च प्रवाह दर (> 3500 इवेंट / एस) सॉर्टिंग की गति बढ़ाते हैं लेकिन जनसंख्या के प्रदूषण में परिणाम होता है। अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 12 देखें।
    3. नियंत्रण नमूने का उपयोग कर द्वार सेट करें
      1. लोड और अस्थिर नमूना चलाएं।
      2. एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट पैटर्न के आधार पर सेल मलबे को छोड़ दें। सेल मलबे साजिश के निचले बाएँ चतुर्भुज में पॉप अप करेंगे। उपयोगकर्ता या सेल सॉर्टर तकनीशियन द्वारा सेल मलबे के लिए दहलीज निर्धारित करें
      3. एफएससी और पल्स चौड़ाई के लिए थ्रेशोल्ड एडजस्ट करके सिंगल सेल पर गेट अलग-अलग सेल सॉर्टर्स के पास अलग-अलग तरीके हैंगिटार सिंगलल्स चूंकि पल्स चौड़ाई लेसरों को पार करने के लिए समय की कोशिकाओं को दर्शाती है, बहुकोशिकीय समुच्चय की तुलना में एकल कोशिकाओं में कम मूल्य होता है। एफएससी बनाम पल्स चौड़ाई के लिए एक साजिश पर थ्रेशोल्ड को समायोजित करने के लिए सिंगलल्स के चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      4. इष्टतम फोटोमल्टीप्लियर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज सेट करें।
      5. पीआई या हईचस्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल की दहलीज स्थापित करने के लिए दोनों अस्थिर और एकल डाई स्टेन्ड सेल का उपयोग करें।
        नोट: प्रत्येक रंग के लिए उचित प्रतिदीप्ति रेंज स्थापित करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं के लिए आधारभूत पीटीएम वोल्टेज का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। इष्टतम संकेत का पता लगाने और संवेदनशीलता के लिए यह महत्वपूर्ण है बिना अस्थिर और एकल दाग नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग पीआई और / या हॉचस्ट रंगों के साथ नकारात्मक और सकारात्मक दाग कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए किया जाता है और संकेतों में शोर को कम करता है। नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग करते हुए पीएमटी वोल्टेज के अनुकूलन के बारे में अधिक स्पष्टीकरण के लिए, कृपया गेयसिंग्काया और बोर्त्विन 2 का संदर्भ लें
      6. लाइव सेल पर गेटएस पीआई धुंधला (पीआई नकारात्मक) और एफएससी प्लॉट पर आधारित है। पीआई प्रतिदीप्ति के लिए मृत कोशिकाओं सकारात्मक होंगे
      7. Hoechst नीले प्रतिदीप्ति के आधार पर सेल गणना के हिस्टोग्राम की साजिश रचने से डीएनए सामग्री गेट सेट करें Hoechst नीले प्रतिदीप्ति की बढ़ती सांद्रता के साथ 3 चोटियों, हप्पलोइड (1 सी), द्विगुणित (2 सी), और टेट्राप्लाइड (4 सी) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। 3 फाटक सेट करें, प्रत्येक शिखर के लिए एक।
      8. रोगाणु सेल आबादी पर गेट करने के लिए आगे बढ़ने से पहले एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट पर कम से कम 500,000 घटनाओं को देखें।
    4. गेट के विभिन्न जर्म सेल आबादी
      1. लोड होकस्ट / पीआई सना हुआ नमूना
      2. पहले 3 माता पिता के द्वार सेट करें, जो सभी आबादी के लिए आम हैं।
        1. एफएससी बनाम एसएससी साजिश के आधार पर सेल मलबे हटा दें। FSC बनाम नाड़ी-चौड़ाई वाली साजिश के आधार पर सिंगल का चयन करें। पीआई नकारात्मक कोशिकाओं को मारकर लाइव कोशिकाओं का चयन करें।
      3. शुक्राणुओं के द्वार को परिभाषित करें
      4. प्लस पीआई नकारात्मक कोशिकाएं हईचस्ट नीले और लाल प्रतिदीप्ति पर आधारित होती हैंतीव्रता। स्पर्मटोगोनिया एक पक्ष की आबादी के रूप में प्रकट होता है ( चित्र 1 देखें)।
      5. शेष जर्म सेल आबादी के लिए फाटकों को परिभाषित करें। नोट: विज़ुअल विवरणों के लिए 1 आंकड़ा और अनुपूरक आंकड़ा 2 देखें।
      6. डीएनए सामग्री गेट में प्लॉट पीआई नकारात्मक कोशिकाएं
        1. शुक्राणुओं के फाटक के लिए सबसे कम हईचस्ट फ्लोरोसेंस (1 सी) वाला शिखर
        2. शुक्राणु II के लिए, द्वितीयक मध्यवर्ती Hoechst प्रतिदीप्ति (2 सी) के साथ चोटी।
        3. शुक्राणुओं के लिए मैं, उच्चतम एचईचस्ट प्रतिदीप्ति (4 सी) के साथ चरम गेट।
      7. डीएनए सामग्री फाटकों से शुक्राणुओं और शुक्राणु जनसंख्या को परिष्कृत करने के लिए प्लॉट होकस्ट नीले और लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता।
    5. पहले से तैयार किए गए संग्रह ट्यूबों में चयनित उपपॉपन फाटक ले लीजिए। प्रत्येक उपसर्गी प्रत्येक उप-जनन के लिए लगभग 0.5-6.0 x 10 6 कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए औसत से 45 मिनट से 1.5 घंटे ले लेगा।
      नोट: Hoechst मा के लिए लंबे समय तक सेल एक्सपोजरवाई समय के साथ आबादी के स्थान को थोड़ा सा स्थानांतरित कर देता है एफएसीएस के 20-30 मिनट के बाद सेटिंग्स को ताज़ा करें प्रत्येक उप-जनन के लिए अधिकतम उपज पृथक्करण चरण की दक्षता पर आकस्मिक होगा।

    6. शुद्ध कोशिकाओं का सूक्ष्म मूल्यांकन

    1. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500-600 xg पर एकत्रित कोशिकाओं को स्पिन करें
    2. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड 1x फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) या 1x डीएमईएम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करना।
      नोट: फिर से निलंबन मात्रा को क्रमबद्ध कोशिकाओं की संख्या और वांछित अंतिम एकाग्रता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
    3. एक साफ ग्लास स्लाइड पर 40 μL धोया कोशिकाओं के पिपेट और एक कवरलाप रखें।
    4. शेष कोशिकाओं को 4% पैराफार्मैडाइहाइड (पीएफए) के साथ ठीक करें और भविष्य में संदर्भ के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित कोशिकाओं को स्टोर करें।
      1. पिपेट 100 μL 4% पीएफए ​​संग्रह ट्यूबों में सीधे।
      2. सेल निलंबन के अच्छी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में संक्षेप में ट्यूब या विंदुक भंवर।
    5. एक 63V उद्देश्य के तहत Hoechst fluorescence का पता लगाने के लिए एक यूवी दीपक से लैस माइक्रोस्कोप में तैयार स्लाइड्स को विज़ुअलाइज़ करें परिणामों के अनुभागों को देखें - सॉर्टेड जर्म सेल आबादी के मोर्फ़ोलिक मूल्यांकन - विशिष्ट रोगाणु सेल प्रकारों की पहचान करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए

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Representative Results

वृषण ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण से सिंगल सेल निलंबन

चित्रा 2 चित्रा 2 विभिन्न शर्तों के तहत माउस testicular ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण से प्राप्त एकल सेल निलंबन की तुलना। ताजा ऊतक, अस्थिर ( चित्रा 2 ए ) प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त नमूनों या हईचस्ट ( चित्रा 2 बी ) के साथ दाग, अलग-अलग चरणों में एकल कोशिकाओं की उपस्थिति को दिखाते हैं, और महत्वपूर्ण बात यह है कि, सेलुलर संरचना को संरक्षित किया गया है, जिसमें शुक्राणु के फ्लैगैला शामिल है। हालांकि कुछ clumping और मलबे सना हुआ नमूनों में मनाया गया था, जो पृथक्करण ( चित्रा 2 डी ) के बाद DNase जोड़कर कम किया गया था, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हईचस्ट धुंधला एकल कक्ष निलंबन की गुणवत्ता को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित नहीं करता है। दिलचस्प है, एकल कक्ष निलंबितयांत्रिक पृथक्करण द्वारा चूहे, कुत्ते, गिनी-डुबकी और मिनी-सुअर ( अनुपूरक चित्रा 1 ) - माउस के लिए जमे हुए ऊतक से ( चित्रा 2 सी ) और अन्य स्तनधारी प्रजातियां प्राप्त हो सकती हैं। विभिन्न सेल प्रकार उन नमूनों में दिखाई और पहचान योग्य होते हैं; हालांकि, जमे हुए ऊतक के प्रसंस्करण में सेल की बढ़ोतरी और क्लम्पिंग बढ़ जाती है, और एक संपूर्ण कम सेलुलर उपज होता है। जैसे, इसके लिए आगे की बहाली के अनुप्रयोगों के लिए ताजा ऊतक से सिंगल सेल निलंबन तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

माउस, चूहे, कुत्ते, गिनी सुअर और मिनी सुअर की ताजी वृषण के ऊतक से तैयार एकल कक्ष निलंबन की गुणवत्ता का मूल्यांकन हो-एफएसीएस ( तालिका 1 ) के दौरान किया गया था। सेल्यूलर मलबे के बहिष्करण के बाद, 95.7-98.4% कोशिका एकल होते हैं, और उन 86.5-93.8% जीवित हैं, जैसा कि पीआई नकारात्मक कोशिकाओं ( प्रोटोकॉल देखें) के रूप में दिखाया गया है। ये रिजोलटीएस से संकेत मिलता है कि यांत्रिक पृथक्करण विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण ऊतक से प्रवाह cytometry के लिए एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है।

Ho-FACS विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण ऊतक से रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए

यांत्रिक पृथक्करण के बाद, एक सेल निलंबन Hoechst और पीआई के साथ दाग रहे हैं और एफएसीएस द्वारा प्रोसेस किया गया है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, होइचस्ट स्टैनिंग, क्रोमेटिन मात्रा और संरचना पर आधारित भेदभाव के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है, जबकि गैर-पारगम्य कोशिकाओं के पीआई धुंधला मृत कोशिकाओं से अलग करती है। इसलिए, सेल मलबे और बहुकोशिकीय समुच्चय को छानने के बाद, पीआई द्वार बरकरार झिल्ली (पीआई नकारात्मक; चित्रा 1 ) के साथ कोशिकाओं का चयन करता है। एचईचस्ट प्रतिदीप्ति के आधार पर लाइव कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाता है: नीले रंग डीएनए सामग्री के अनुपात में होते हैं और बढ़ती लालप्रतिदीप्ति कम गाढ़ा chromatin और संरचनात्मक रूपों को दर्शाता है। जैसे, विभिन्न चरणों के पुरुष कोशिकाओं के कोशिकाओं को नीले / लाल हईचस्ट प्रतिदीप्ति ( चित्रा 3 ए ) के कार्य की साजिश रचने वाले cytograms के विशिष्ट क्षेत्रों में क्लस्टर होने की उम्मीद है।

दरअसल, विभिन्न प्रजातियों के लिए उत्पन्न हो-एफएसीएस भूखंड, हईचस्ट फ्लोरोसेंस ( चित्रा 3 बी -3 सी ) पर आधारित अलग-अलग सेल आबादी की उपस्थिति दिखाते हैं। यद्यपि ये भूखंड जर्म सेल आबादी को भेदभाव के लिए पर्याप्त हैं, हालांकि, एक डीएनए सामग्री (सी) गेट 2 परिभाषित किया जा सकता है ताकि पार संदूषण को सीमित किया जा सके। यह गेट Hoechst नीले प्रतिदीप्ति तीव्रता के कार्य में सेल की गणना के हिस्टोग्राम द्वारा उत्पन्न होता है सभी प्रजातियों के लिए, तीन चोटियों का पता लगाया जा सकता है और 1 सी, 2 सी और 4 सी ( चित्रा 1 और पूरक आंकड़े 2-5 ) के साथ कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। विशेष रूप से, प्रीवी के रूप मेंउल्लेखित, शुक्राणुगोई एक पक्ष की आबादी है और डीएनए सामग्री के हिस्टोग्राम के आधार पर भरोसेमंद नहीं हो सकते। इसलिए, इस जनसंख्या को Hoechst नीली / लाल प्रतिदीप्ति भूखंडों ( चित्रा 1 ) के आधार पर मृत कोशिकाओं के बहिष्करण के बाद किया गया है। यह रणनीति चित्रा 1 में चूहे के लिए और शेष प्रजातियों के लिए पूरक आंकड़े 2-5 में प्रस्तुत किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चूंकि अकेले Hoechst प्रतिदीप्ति अलग-अलग जर्म कोशिकाओं के प्रकार को भेद कर सकते हैं, दोनों पीआई और डीएनए सामग्री फाटक वैकल्पिक हैं। उन्हें जीवित कोशिकाओं का चयन करने और क्रॉस-संदूषण को क्रमशः कम करने के लिए इस रणनीति में शामिल किया गया था। जैसा कि तालिका 1 में संक्षेप, डीएनए सामग्री गेट में कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात को दर्शाता है। उम्मीद के अनुसार, 1 सी कोशिका सबसे अधिक प्रचुर मात्रा में हैं और शुक्राणु जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं, उसके बाद 2 सी कोशिकाओं (एसपीसी II) और 4 सी कोशिकाएं (एसपीसी आई) के अनुसार। importaNtly, यह पैटर्न प्रजातियों में संरक्षित है और छोटे मतभेद कोशिकाओं में interspecific परिवर्तनशीलता और seminiferous उपकला 21 के चक्र को प्रतिबिंबित कर सकते हैं।

हो-एफएसीएस के बाद, सेल अखंडता को ट्रिपैन ब्लू स्केनिंग का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। एफएसीएस के 1 घंटे के बाद लाइव कोशिकाओं का अनुपात माउस के लिए 27% (एससीपी I) से लेकर 67% (एसपीडी) तक होता है, यह दर्शाता है कि होईचस्ट की छंटनी की अवधि और कोशिका मृत्यु बढ़ जाती है। सॉफ़्टवेयर के लिए सॉर्ट किए गए कक्षों की खोज करने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए, एचईसीएस एकाग्रता और हो-एफएसीएस की अवधि को सेल अस्तित्व में सुधार के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। बहरहाल, आरएनए अनुक्रमण डेटा इस पद्धति (जंग एट अल । अप्रकाशित) का उपयोग करके पृथक एकल कोशिकाओं के लिए उत्पन्न हो गया है, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं में रोगाणु सेल जीव विज्ञान के आणविक अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। इस डेटासेट का उपयोग मस्तिष्क कोशिकाओं के साथ रोगाणु सेल आबादी के संभावित संदूषण का पता लगाने के लिए किया गया था ( अनुपूरक चित्रा 6

सॉर्टेड रोगाणु सेल आबादी का आकृति मूल्यांकन

चूंकि शुक्राणुजनन के दौरान रोगाणु कोशिकाएं कठोर रूपिकीय परिवर्तन से गुजरती हैं, माइक्रोस्कोपी द्वारा पृथक आबादी की पवित्रता का अनुमान लगाने के लिए संभव है। एक संदर्भ के रूप में, चित्रा 4 में 4 स्तनधारी प्रजातियों (लिमा, एट अल 5 से ) के विभिन्न नर जर्म सेल प्रकार के सामान्य आकारिकी को दिखाया गया है। क्रोमैटिन वितरण और संक्षेपण, साथ ही साथ सेल आकार और आकार, विभिन्न सेल प्रकारों में अद्वितीय और अच्छी तरह से वर्णित पैटर्न दिखाते हैं। एसपीजी अलग असाविक हेट्रोक्रोमैटिन है, जो हईचस्ट के लिए तेजस्वी दाग ​​है, और आकार में छोटे और गोल ( चित्रा 4 बी में एसपीजी) हैं। शुक्राणु कोशिकाओं को बड़े दानेदार कोशिकाएं हैं एसपीसी के नाभिक मैं आसानी से पहचाना जा सकता हूं, क्रोमेटिन वैरिएटियो के साथमेयोटिक कोशिकाओं (एसपीसी I में चित्रा 4 बी ) की एन एस विशेषता, जबकि एसपीसी II बिनकिकेटेड या डायनाकिरिसिस ( चित्रा 4 बी में एसपीसी II) में है। अंत में, एसपीडी गोल या लम्बी आकार ( चित्रा 4 बी में एसपीडी) के साथ छोटे हैंल्पलेस कोशिकाएं हैं। उल्लेखनीय रूप से, आरएसपीडी आकार और आकार में एसपीजी के समान है, लेकिन स्थानीयकृत क्रोमास्केंटर्स की उपस्थिति से स्पष्ट रूप से अलग किया गया है। इन विशेषताओं के आधार पर, क्रमबद्ध सेल आबादी का मूल्यांकन विशिष्ट सेल प्रकार ( तालिका 1 ) के संवर्धन के लिए किया गया था। एसपीडी और एसपीसी II की आबादी सेल प्रकार के हित के लिए बेहद समृद्ध थी, जबकि एसपीसी 1 और एसपीजी ने विशेष रूप से गिनी पिग और मिनी पिग नमूनों के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ कुछ प्रदूषण दिखाया। दिलचस्प बात यह है कि, कुत्ते के नमूने के लिए शुक्राणुओं को बढ़ाकर गोल करने के लिए गेटिंग की रणनीति पर्याप्त थी ( चित्रा 3C ; पूरक चित्रा 3 ; तालिका 1

आकृति 1
चित्रा 1: स्तनधारी नर जर्म कोशिकाओं के हो-एफएसीएस अलगाव का कार्यप्रवाह। यह छवि स्तनधारी जर्म कोशिकाओं के रोगाणु सेल अलगाव के लिए सामान्य प्रोटोकॉल को दिखाता है, इस प्रोटोकॉल के प्रयोग से प्रतिनिधि आंकड़ों को चूहा टेस्टिस के साथ। हो: होचस्ट लीमा से, एट अल अनुमति के साथ 5 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: यांत्रिक खंडन द्वारा उत्पन्न एकल सेल निलंबन माउस वृषण ऊतक ताजा ऊतक ( एबी ) से मिली नमूने बरकरार जर्म सेल प्रकार और बहुत कम मलबे दिखाते हैं। अस्थिर कोशिकाओं ( ए ) की तुलना में, एचओसीएसटी दाग़ कोशिका निलंबन ( बी ) के लिए कुछ सेल क्लम्पिंग को देखा गया था, जो कि पृथक्करण ( डी ) के तत्काल बाद नमूने में डीएनसी (10 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) को जोड़कर कम किया जा सकता है। फ्रोजन वृषण ऊतक का उपयोग यांत्रिक विस्थापन ( सी ) द्वारा एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, ऐसा प्रतीत होता है कि ऊतक विघटन से पहले फ्लैश फ्रीज़िंग और पिघलना की प्रक्रिया से अधिक मलबे, कोशिका मृत्यु और समग्र कम सेलुलर उपज में परिणाम होता है। पृथक्करण (प्रोटोकॉल देखें) के बाद, नमूनों को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घूमने और स्लाइड्स को बढ़ने से पहले 1x डीएमईएम में पुनः निलंबित किया गया था। काली सलाखों = 50 माइक्रोन यूवी दीपक से लैस ईमानदार सफेद रोशनी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गईं।Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: स्तनधारी जर्म कोशिकाओं के हो-एफएसीएस विशिष्ट जनसंख्या एफएसीएस ( ए ) के दौरान हईचस्ट फ्लोरोसेंस के अनूठे पैटर्न पेश करते हैं। जैसे ही होछ्स्ट नीली प्रतिदीप्ति हैप्लोइड ( सी ) के क्रोमैटिन सामग्री समूहों में भिन्नता दर्शाती है ; द्विगुणित (2 सी) और टेट्राप्लाइड (4 सी) कोशिकाएं एफएसीएस साजिश के क्षेत्रों में स्थित हैं जो कि हईचस्ट ब्लू फ्लोरोसेंस विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के परीक्षण ( बीसी ) के लिए अलग सेल आबादी के हचस्ट ब्लू / रेड फ्लोरोसेंट शो क्लस्टर्स के एक समारोह के रूप में उत्पन्न भूखंड। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; SPC I: प्राथमिक शुक्राणुओं; प्री-लेप: प्री-लेप्टोटीन शुक्राणुओं; लेप: लेप्टोटीन शुक्राणुओं; डुबकी: डिप्लोटिन शुक्राणुओं; छठे वेतन आयोगद्वितीय: माध्यमिक शुक्राणुओं; एसपीडी: स्पर्मैट्स; ईएसपीडी: शुक्राणुओं को बढ़ाकर; आरएसपीडी: दौर शुक्राणुओं लीमा, एट अल से अनुकूलित अनुमति के साथ 5 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: चार स्तनधारी प्रजातियों के विभिन्न विकास चरणों में जर्म कोशिकाओं का आकृति विज्ञान। यह आंकड़ा हॉचस्ट (ए) के साथ दागदार वृषण ऊतक के वर्गों और चूहे, गिनी डुक्कर, कुत्ते और मिनी सुअर से हो-एफएसीएस (बी) द्वारा अलग-अलग नर जर्म सेल प्रकार के सामान्य पहलू का सामान्य पहलू दर्शाता है। चूंकि शुक्राणुजनन में सेल आकार, आकृति और क्रोमैटिन रचना नाटकीय रूप से भिन्न होती है, इन्हें भेदभाव के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को सौंपने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्पर्मटोगोनिया (एसपीजी) छोटे और गोल सी हैंविशिष्ट धमनीय हेट्रोरामाइटिन के साथ ells और Hoechst प्रतिदीप्ति की एक उच्च तीव्रता का प्रदर्शन। स्पर्मटोक्येट्स सबसे बड़े जर्म सेल हैं और वे चर क्रोमेटिन कन्वर्मेशन दिखाते हैं। प्राथमिक शुक्राणु कोशिकाओं (एसपीसी आई) के नाभिक मेयूओटिक कोशिकाओं की विशेषता क्रोमैटिन विविधताएं, जबकि द्वितीयक शुक्राणु (एसपीसी II) बिन्यूक्लिएटेड या डायनाकिरिसिस में हैं। स्पर्मैटिड (एसपीडी) गोल या लम्बी आकार का है, शुक्राणुजनन के स्तर पर निर्भर करता है और छोटे अस्थायी कोशिकाओं हैं। हालांकि दौर शुक्राणुओं और शुक्राणुनाशक आकार और आकृति में समान हैं, पूर्व स्थानीयकृत क्रोमास्केंटर्स की उपस्थिति से अलग किया जा सकता है। हो-एफएसीएस के बाद प्रत्येक सॉर्ट किए गए सेल टाइप के लिए स्लाइड्स तैयार किए गए थे और इन्हें इन्फोकल माइक्रोस्कोप में देखा गया था: 63x आवर्धन लेंस, (कम पैनल) या बिना (ऊपरी पैनल) सफेद प्रकाश संचरण। लीमा से, एट अल अनुमति के साथ 5 कृप्याइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

डीएनए सामग्री गेट में% कोशिकाओं सॉर्टेड जर्म सेल आबादी (%) की पवित्रता
जाति % सिंगलल्स % लाइव सेल 1C 2C 4C एसपीजी एसपीसी आई एसपीसी II एसपीडी rSpd eSpd
माउस 98.4 92.5 34.7 3.9 3.72 74 82 87.5 95.2 95 * 92 *
चूहा 95.7 93.8 37.7 5.3 5.4 83 81 82 87 । ।
गिनी पिग 96.2 92.1 39.3 7.6 5.8 48 68.7 85 87 । ।
कुत्ता 97.9 86.5 16.4 3 0.5 78 । 87 । 91 81
मिनी सुअर 95.9 93.2 26.9 6.4 3.5 49 52 82 92 । ।
* एंजाइमिक पृथक्करण और gated द्वारा प्राप्तएफएससी और एसएससी मापदंडों पर आधारित (लीमा एट अल 2016 से, अनुमति के साथ)

तालिका 1: यांत्रिक जुदाई द्वारा प्राप्त नर जर्म सेल निलंबन के हो-एफएसीएस के आंकड़े।

अनुपूरक चित्रा 1: जमे हुए वृषण वृषण के यांत्रिक पृथक्करण से प्राप्त एकल कक्ष निलंबन। यांत्रिक पृथक्करण प्रजातियों-विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता के बिना विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण ऊतक से एकल कक्ष निलंबन की पीढ़ी की अनुमति देता है। विभिन्न पैनल 4 स्तनधारी प्रजातियों के लिए प्राप्त सेल निलंबन दिखाते हैं। नमूनों को जमे हुए वृषणदार ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण से प्राप्त किया गया और हईचस्ट के साथ दाग किया गया। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; SPC I: प्राइमरी स्पार्माटोसाइट; एसपीसी II: माध्यमिक स्पर्मोटाइइट; एसपीडी: स्पर्मैटिड; एसपीजेड: स्पर्मटोज़ाआ स्लाइड एक confoca में देखा गया था एल माइक्रोस्कोप (कम पैनल) या बिना (ऊपरी पैनल) सफेद प्रकाश संचरण। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: जीवा पुरुष जर्म कोशिकाओं के अलग-अलग माउस टेस्टिक्युलर एकल सेल निलंबन के हो-एफएसीएस द्वारा गेटिंग रणनीति। लाइव कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) को हईचस्ट प्रतिदीप्ति के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है। स्पर्माटोगोनिया (एसपीजी) को सीधे हईचस्ट-ब्लू और लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से पहचाना जाता है। एक डीएनए सामग्री गेट Hoechst नीले प्रतिदीप्ति पर आधारित कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है: haploid (सी); द्विगुणित (2 सी) और टेट्राप्लाइड (4 सी) हिस्टोग्राम के प्रत्येक शिखर में कोशिकाओं को फिर से नीले और लाल प्रतिदीप्ति के समारोह की साजिश रचने से हल किया जाता है। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; एसपीडी: स्पर्मैट्स; एसपीसी II: माध्यमिक शुक्राणुओं; SPC I: प्राथमिक शुक्राणुओंD / 55913 / Supp_fig.2.tif "> कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: कुत्ते परीक्षण वृषण एकल कक्ष निलंबन के हो-एफएसीएस द्वारा जीवित नर जर्म कोशिकाओं के अलग होने की रणनीति तैयार कर रहा है। लाइव कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) को हईचस्ट प्रतिदीप्ति के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है। स्पर्माटोगोनिया (एसपीजी) को सीधे हईचस्ट-ब्लू और लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से पहचाना जाता है। एक डीएनए सामग्री गेट Hoechst नीले प्रतिदीप्ति पर आधारित कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है: haploid (सी); द्विगुणित (2 सी) और टेट्राप्लाइड (4 सी) हिस्टोग्राम के प्रत्येक शिखर में कोशिकाओं को फिर से नीले और लाल प्रतिदीप्ति के समारोह की साजिश रचने से हल किया जाता है। हेप्लॉयड कोशिकाओं वाले चोटी को हचस्ट नीली तीव्रता की सीमा के अनुसार विभाजित किया जा सकता है और शुक्राणुओं के दो उप-प्रजातियों का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है: शुक्राणुओं (गेट सी) और गोल शुक्राणुओं (गेट सी '') को बढ़ाकर। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; ईएसपीडी: शुक्राणुओं को बढ़ाकर; आरएसपीडी: दौर शुक्राणुओं; एसपीसी II:माध्यमिक शुक्राणुओं; SPC I: प्राथमिक शुक्राणुओं कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 4: गिनिया पिग टेस्टिक्युलर एकल सेल निलंबन के हो-एफएसीएस द्वारा जीवित पुरुष जर्म कोशिकाओं को अलग करने के लिए गेटिंग रणनीति। लाइव कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) को हईचस्ट प्रतिदीप्ति के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है। स्पर्माटोगोनिया (एसपीजी) को सीधे हईचस्ट-ब्लू और लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से पहचाना जाता है। एक डीएनए सामग्री गेट Hoechst नीले प्रतिदीप्ति पर आधारित कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है: haploid (सी); द्विगुणित (2 सी) और टेट्राप्लाइड (4 सी) हिस्टोग्राम के प्रत्येक शिखर में कोशिकाओं को फिर से नीले और लाल प्रतिदीप्ति के समारोह की साजिश रचने से हल किया जाता है। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; एसपीडी: स्पर्मैट्स; एसपीसी II: माध्यमिक शुक्राणुओं; SPC I: प्राथमिक शुक्राणुओं कृपया करने के लिए यहां क्लिक करेंइस फाइल wnload

अनुपूरक चित्रा 5: मिनी सुअर testicular एकल कक्ष निलंबन के हो-एफएसीएस द्वारा जी पुरुष नरम कोशिकाओं को अलग करने के लिए रणनीति गेटिंग। लाइव कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) को हईचस्ट प्रतिदीप्ति के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है। स्पर्माटोगोनिया (एसपीजी) को सीधे हईचस्ट-ब्लू और लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से पहचाना जाता है। एक डीएनए सामग्री गेट Hoechst नीले प्रतिदीप्ति पर आधारित कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है: haploid (सी); द्विगुणित (2 सी) और टेट्राप्लाइड (4 सी) हिस्टोग्राम के प्रत्येक शिखर में कोशिकाओं को फिर से नीले और लाल प्रतिदीप्ति के समारोह की साजिश रचने से हल किया जाता है। एसपीजी: स्पर्मटोगोनिया; एसपीडी: स्पर्मैट्स; एसपीसी II: माध्यमिक शुक्राणुओं; SPC I: प्राथमिक शुक्राणुओं कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 6: दैहिक कोशिका contaminat की परीक्षाहो-एफएसीएस क्रमबद्ध आबादी में आयन तीन एफएसीएस सबपॉप्यूलेशन गेट्स (एबी) से लगभग 600 सिंगल-सेल ट्रांस्क्रिप्टम की स्टेचस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग (टी-एसएनई) प्लॉट टी-वितरित। टी-एसएनई प्लॉट पर, प्रत्येक बिंदु ट्रांसस्क्रिप्टम स्पेस में एक एकल कक्ष की अनूठी स्थिति को दर्शाता है और प्रत्येक सेल को इसके एफएसीएस उपपॉपिओपमेंट गेट मूल (ए) के साथ लेबल किया जाता है। एफएसीएस एकल-सेल टी-एसएनई प्लॉट (बी) पर सेल-टाइप विशिष्ट मार्करों की दृश्य मात्रा का ठहराव दैहिक कोशिकाओं से संदूषण 5% से कम होने का अनुमान है और यह एक हो-एफएसीएस आबादी गेट के लिए विशिष्ट नहीं है। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्तनधारियों में शुक्राणुजनन के दौरान अति-संरक्षित क्रोमैटिन गतिशीलता को देखते हुए, इस काम का लक्ष्य विभिन्न स्तनपायी वृषण टिश्यू ( चित्रा 1 ) से भेदभाव के अलग-अलग चरणों में पुरुष जर्म कोशिकाओं को पृथक करने के लिए एक प्रोटोकोल विकसित करना था। विभिन्न जानवरों के मॉडल के एकल वर्कफ़्लो के आवेदन में प्रमुख अवरोधों में से एक प्रजातियों-विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता है, विशेष रूप से ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल के संबंध में। वर्तमान पद्धति ज्यादातर एंजाइमेटिक टिशू पाचन पर भरोसा करती हैं और प्रोटोकॉल अक्सर 12 प्रजातियों के भीतर भी बदलती हैं इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण नमूनों से एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए यांत्रिक ऊतक पृथक्करण के आवेदन को दर्शाता है। परिणाम बताते हैं कि इस प्रणाली के साथ ताजा वृषण ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण अच्छा प्रदर्शन करता है ( चित्रा 2 ए -2 बी 20 महत्वपूर्ण बात, एचईचस्ट स्टैनिंग एकल सेल निलंबन की गुणवत्ता को काफी प्रभावित नहीं करता है। हालांकि दागयुक्त नमूनों ( चित्रा 2 बी ) में अधिक सेल क्लंपिंग दिखाई दे रहा है, हालांकि डीएनसी ( चित्रा 2 डी ) या एनडीए 20 के साथ इलाज इस समस्या को रोकने में मदद कर सकता है। पिछली रिपोर्ट बताती है कि वृषण ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण एंजाइमेटिक टिशू पाचन 5 , 20 के मुकाबले बेहतर या कुशल है। इसके अनुसार, यहां प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि होक्-एफएसीएस प्रसंस्करण के लिए वृषण ऊतक से एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए यांत्रिक पृथक्करण एक विश्वसनीय तरीका है।

हेक्स्ट के साथ ऊष्मायन एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि यह फ्लो साइमेट्री के दौरान संकेतों को प्रभावित करता है। लंबे समय तक धुंधला कोशिका कोशिकाओं के प्रकार के बेहतर भेदभाव प्रदान करते हैंविषाक्त हो सकता है, जिससे कोशिका मृत्यु हो जाती है और इंट्रासेल्युलर प्रोग्रामिंग 22 में परिवर्तन हो सकता है। इस विधि से जर्म सेल संस्कृतियों को स्थापित करने का इरादा रखने वाले प्रयोक्ता Hoechst 3 , 22 के लंबे समय के जोखिम के जीनोटॉक्सिक प्रभाव का मूल्यांकन करना चाहिए और पर्याप्त एकाग्रता और धुंधला हो जाने का समय निर्धारित करना चाहिए। यहां, 30 मिनट का धुंधला रोगाणु सेल आबादी ( चित्रा 3 बी -3 सी ) के विश्वसनीय विभाजन प्रदान करने के लिए पर्याप्त था। धुंधला हो जाने की अवधि को संभवतः 10 मिनट तक कम किया जा सकता है, जैसा कि रॉड्रिग्ज़-कसूरीगा, एट अल द्वारा दिखाया गया है । 20 , और उपयोगकर्ताओं द्वारा ब्याज की प्रजातियों के लिए आगे मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

जैसा प्रतीत होता है, चार जर्म सेल आबादी का लगातार पता लगाया जा सकता है - एसपीजी, एसपीसी आई, एसपीसी II और एसपीडी- विभिन्न प्रजातियों से वर्णित कोशिकाओं के क्रोमेटिन विविधताओं पर आधारित ( चित्रा 3 बी -3 सी (तालिका 1) के लिए प्राप्त की, और अलग अलग स्तनधारी प्रजातियों (पूरक आंकड़े 2- के लिए gating रणनीति इस कार्यप्रवाह में अपनाया (चित्रा 1) का समर्थन 5 ) यह अभी भी उचित है कि उपयोगकर्ताओं को कुछ जनसंख्या (तालिका 1) के लिए क्रॉस संदूषण को कम करने के लिए प्रजातियों और ब्याज की आबादी के अनुसार गैटिंग का अनुकूलन किया जाता है। यह धुंधला होने के दौरान अधिक ऊष्मायन अवधि के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है18 , कम प्रवाह दर 2 और कम गेट के आकार। एसपीजी अलग करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हैं क्योंकि वे वृषणों में सबसे नाजुक सेल प्रकार हैं और समय 1 , 15 के दौरान डाई फुलक्स के कारण भी। हालांकि हो-एफएसीएस द्वारा अलग-अलग एसपीजी आबादी का पता लगाना संभव है, जैसा कि यहां दिखाया गया है, केवल स्टेम कोशिका जीव विज्ञान पर ध्यान केंद्रित किए जाने वाले अध्ययन को अधिक कठोर तकनीक जैसे कि चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस; 23 ) से फायदा होगा। विशेष रूप से, एसपीडी (ईएसपीडी और आरएसपीडी) के उप-जनसंख्या को स्पष्ट रूप से कुत्ते के लिए अलग किया जा सकता है लेकिन अन्य प्रजातियों के लिए नहीं ( चित्रा -3 सी और अनुपूरक चित्रा 3)। संभावित रूप से, इन उप-जननुमापन को गैटिंग सेटिंग्स का समायोजन करके हल किया जा सकता है, जैसा कि माउस 5 के लेखकों द्वारा वर्णित है। कोशिका के आकार और ग्रैन्युलैरिटी (एफएससी वीएस एसएससी) के लिए उत्पन्न साइटोग्राम, जो कि एचईचस्ट ब्लू / रेड फ्लुरेसस के समारोह की साजिश रचने से पहलेएनसीई, गोलाकार (उच्च एफएससी + एसएससी) शुक्राणु उप-उप-योगों से बढ़त (एफएससी + एसएससी कम) का भेदभाव करता है। गोल और बढ़ाव वाले शुक्राणु उप-प्रजातिओं को अलग करने से शुक्राणुजनन की गहराई से जांच की जा सकती है, जिससे शुक्राणु भेदभाव के दौरान होने वाली विशिष्ट आणविक घटनाओं में नए अंतर्दृष्टि आती है। इसके अलावा, जैसा कि माउस 1 , 2 , 12 के लिए वर्णित है, एफएसीएस फाटकों को समायोजित करके, मैयियटिक चरणों का और संकल्प प्राप्त करना संभव है। इस तरह के दृष्टिकोण से बड़े पैमाने पर मेयोटिक घटनाओं के तुलनात्मक अध्ययनों को फायदा होगा। यद्यपि सेल अखंडता हो-एफएसीएस के दौरान परेशान होती है, इस पद्धति (जंग एट अल। , अप्रकाशित ; अनुपूरक चित्रा 6 ) से क्रमबद्ध कोशिकाओं के लिए प्राप्त एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण आंकड़े इंगित करते हैं कि यह रोगाणु सेल के आणविक अध्ययन के लिए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण है जीव विज्ञान। बहरहाल, उपयोगकर्ताओं को प्रजनन assays, जैसे r के प्रदर्शन करने का इरादा हैहो-एफएसीएस द्वारा अलग-थलग कोशिकाओं का उपयोग करके शुक्राणु इंजेक्शन (आरओएसआई), सॉर्ट किए गए कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करना चाहिए और वैकल्पिक तरीकों 24 , 25 को तलाशना चाह सकता है।

संक्षेप में, यह काम विभिन्न स्तनधारियों से वृषण कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक मानकीकृत पद्धति का वर्णन करता है , जो 2 , 12 , 20 की पहले स्थापित तकनीकों पर निर्माण और परिशोधन जोड़ रहा है। इस तरह के मानकीकरण, विभिन्न प्रकार के स्तनधारी प्रजातियों पर अभिकर्मकों के एक समूह के उपयोग और एकल वर्कफ़्लो का उपयोग करने की अनुमति देता है, जिससे रोगाणु सेल जीव विज्ञान के तुलनात्मक अध्ययन के लिए डाटा पीढ़ी को सुविधाजनक बनाते हैं। इसके अलावा, यांत्रिक ऊतक विस्थापन प्रजातियों-विशिष्ट समायोजनों की बाधाओं पर काबू पाता है जो कि पद्धतिगत परिवर्तनशीलता का परिचय दे सकता है जो लगभग किसी भी खाते में असंभव है। इसके अतिरिक्त, कम निष्पादन समय और हेरफेर पूर्व विवो सेल की उलझन को प्रतिबंधित करता हैएक न्यूनतम करने के लिए लुलर फिजियोलॉजी इस संबंध में, एसईए-पीयूटी और एलिट्रीएशन 6 , 7 जैसे जर्म सेल अलगाव के अन्य तरीकों की तुलना में हो-एफएसीएस काफी तेज है। इसके अलावा, एक ही प्रयोग में 4 अंकुश जनसंख्या के एक साथ पृथक्करण केवल एफएसीएस द्वारा संभव है। Hoechst डाई, सेल संरचना और आरएनए प्रजातियों के गुणों को देखते हुए संरक्षित किया जाता है, और इसलिए कोशिकाओं को आगे की ओर के आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, चूंकि हो एफएसीएस जर्म सेल के प्रकारों को भेदभाव करने के लिए क्रोमैटिन गुणों पर निर्भर करता है, इसलिए 5 अलग-अलग प्रजातियों में इस वर्कफ़्लो का सफल प्रदर्शन अन्य स्तनधारियों को अपने आवेदन का समर्थन करता है। यहां प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि शुक्राणुजनन सेल भेदभाव की एक अनूठी प्रक्रिया हो सकती है जो एक एकल प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई स्तनधारी प्रजातियों में निपटा जा सकता है। जैसे, "ओमिक्स" और सिस्टम जीव विज्ञान युग में, यह तकनीक एक विकासवादी ऐप के लिए साधन प्रदान करती हैशुक्राणुजनन के दौरान एपिजेनेटिक्स, विनियमन, और प्रोटीन विविधता के अध्ययन सहित, पुरुष रोगाणु सेल जीव विज्ञान के सवालों पर रोच।

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Disclosures

सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धात्मक हितों की घोषणा नहीं करते हैं

Acknowledgments

लेखक कुत्ता परीक्षणों के लिए पहाड़ी पशु अस्पताल (सेंट लुइस, एमओ) का धन्यवाद करते हैं; संग्रह के साथ सहायता करने के लिए चूहे टेस्ट्स और ब्रायन टैपर प्रदान करने के लिए सेंट लुइस (वाशिंगटन) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जेसन आंड और डा। टेड सिसरो की प्रयोगशाला; जरेद हार्टॉक और डाइ। नमक की लैब, वाशिंग के लिए गिनी पिग टेस्ट्स; और डॉ। माइकल टैलकोट ने धुआं सुअर वृषण के लिए वाशिंगटन में तुलनात्मक चिकित्सा विभाग में लेखक, सेंट लुईस, एमओ में वॉशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन और बार्न्स-यहूदी अस्पताल के एल्विन जे। साइमन कैंसर केंद्र को भी मानते हैं, जो साइटमैन फ्लो साइटोमेट्री कोर के उपयोग के लिए है, जो कर्मचारियों द्वारा संचालित सेल सॉर्टिंग सेवा प्रदान करता है। साइटमैप कैंसर केंद्र एनसीआई कैंसर केंद्र सहायता अनुदान # पी 30 सीए 9 1842 द्वारा भाग में समर्थित है।

इस शोध को एक एफसीटी डॉक्टरेट फेलोशिप [एसएफआरएच / बीडी / 51 9 5/2011 से एसीएल] के लिए वित्त पोषित किया गया था, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान [R01HD078641 और R01MH101810 से डीएफसी] और एक एफसीटी अनुसंधान अनुबंध [IF / 01262/2014 से एएमएल]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde VWR #15710 4% PFA, For fixing sorted cells
Medimachine BD Biosciences #340588; System for testis dissociation
1X Dulbecco modified Eagle medium Life Technologies #31053 DMEM, for testis dissociation
Medicon BD Biosciences #340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation
Fetal bovine serum Thermo Scientific #10082139 FBS, for FACS collection
Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining
40 µm cell strainer GREINER BIO-ONE #89508-342 For testis dissociation
100x 15 mm petri dish Falcon #351029 For testis dissection
5 mL polypropylene round-bottom tubes Falcon #352063 For FACS collection
1.5 mL Eppendorf tubes VWR #20170-650 For FACS collection
3 mL needless syringe BD Biosciences #309657 For testis dissociation
50 mL conical tube MIDSCI #C50R For testis dissociation 
Propidium Iodide Invitrogen #L7011 PI, For FACS staining
MoFlo Legacy cell sorter Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Summit Cell Sorting software Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Phosphate buffered saline Thermo Scientific #AM9625 PBS, For microscopy
Microscopic glass slide Fisher Scientific #12-544-4 For microscopy
Glass coverslip Fisher Scientific #12-548-87 For microscopy
Disposable transfer pipette (3 mL) Samco Scientific #225 For testis dissociation
DNase I Roche #10104159001 For testis dissociation
Carbon steel surgical blade Miltex #4-111 For testis dissection
Countess automated cell counter Invitrogen #C10227 For automatic cell counting
Trypan blue solution (0.4%) Sigma #T8154 For viability staining

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 125 तुलनात्मक प्रजनन प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल क्रमबद्ध (एफएसीएस) होच्स्ट -33342 नर जर्म सेल यांत्रिक विस्थापन शुक्राणुजनन वृषण,
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Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J.,… More

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J., Usmani, A., Lopes, A. M., Conrad, D. F. A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55913, doi:10.3791/55913 (2017).

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