Summary
这项工作描述了从不同哺乳动物物种的睾丸组织获得纯化的生殖细胞群体的方法的标准化。结合机械睾丸解离，染色与Hoechst-33342和碘化丙啶和FACS分选是一个简单的方案，广泛应用于男性生殖生物学的比较研究。
Abstract
荧光激活细胞分选（FACS）已经成为分离哺乳动物睾丸生殖细胞富集群体的首选方法之一。目前，它允许以高产率和纯度区分多达9种鼠生殖细胞群体。鉴别和纯化中的这种高分辨率是可能的，这是由于精子发生过程中染色质结构和数量的独特变化。这些模式可以通过用荧光DNA结合染料如Hoechst-33342（Hoechst）染色的雄性生殖细胞的流式细胞术来捕获。本文是最近开发的用于分离哺乳动物睾丸生殖细胞的方案的详细描述。简单地说，通过机械解离从睾丸组织产生单细胞悬浮液，用Hoechst和碘化丙啶（PI）双重染色，并通过流式细胞术进行处理。连续门控策略，包括选择不同DNA含量的活细胞（PI阴性）（Hoechst强度），i在FACS分选期间使用，以区分多达5种生殖细胞类型。这些包括相应的平均纯度（通过显微镜评估确定）：精原细胞（66％），原发性（71％）和次级（85％）精母细胞和精子细胞（90％），进一步分为圆形（93％）和延长（87％）亚群。整个工作流的执行是直接的，允许与适当的FACS机器同时隔离4个单元格类型，并且可以在不到2小时内执行。由于减少的处理时间对于保留离体细胞的生理学是至关重要的，所以该方法对于雄性生殖细胞生物学的下游高通量研究是理想的。此外，用于哺乳动物生殖细胞的多特异性纯化的标准化方案消除了变量的方法学来源，并且允许将单一试剂用于不同的动物模型。
Introduction
鉴于缺乏代表精子发生进展的体外系统，以及睾丸中存在巨大的细胞异质性，对雄性生殖细胞生物学的研究需要强大的技术来分离特定细胞类型的富集群体。荧光激活细胞分选（FACS）已被广泛地用于此目的1，2，3，4，5，因为它提供了高产率和纯度，并超过在生殖细胞类型，它可以识别并的数量的其他分离方法选择6个 ，7个 ，8。流式细胞仪分析的原理是基于单细胞激光束激发后差分光图案的检测。当细胞通过激光时，反射/散射光与细胞大小（前向散射; FSC）和细胞内复杂性（侧向散射; SSC）成比例。有关流式细胞术的详细信息，请参阅Ormerod 9 。
雄性生殖细胞在精子发生的不同阶段经历DNA含量，染色质结构，大小和形状的特异性修饰。因此，不同的细胞群可以被识别并且通过光散射和DNA染色组合用荧光染料10，11分离。几种染料可以用于此目的，如Hoechst的-33342（Hoechst公司）（以格伊辛格和罗德里格斯Casuriaga 3中综述），其在流动方面被频繁使用的流式细胞仪的睾丸细胞的分析在过去的十年1，2，4，10 ， 12 。牛浦Ñ激励用UV光，Hoechst的发射蓝色荧光正比于细胞DNA含量，而远红荧光反映在染色质结构和压实1，13，14可变性。其结果是，在不同分化阶段的雄性生殖细胞的Hoechst染色的单细胞悬浮液的FACS期间表现出特定模式（HO-FACS; 1，12）。有趣的是，由于染色体排出的机制仅在精原细胞阶段才有活性，Hoechst蓝色荧光的强度与这些细胞中的染色质含量成正比，并且在Ho-FACS 15期间它们作为侧群聚簇。另外，Hoechst染色与非渗透性染料碘化丙啶（PI）组合使用户可以在FACS 1期间区分活体（PI阴性）与死亡（PI阳性）细胞SUP>，2，10，12。睾丸生殖细胞已经在流式细胞以前使用这种策略分析和在小鼠广泛优化以区分多达9种生殖细胞类型，包括在减数分裂I 1，2，4，16的4个不同阶段的细胞。为了这项工作的目的，Hoechst染色有三个主要优点。首先，何-FACS已成功地应用于雄性生殖细胞在小鼠模型1，2，12，和其它啮齿动物，例如大鼠和豚鼠17，18，19的分离。第二，Hoechst是一种细胞渗透性染料，不需要膜透化，因此保留ves细胞完整性。最后，由于Hoechst的优先结合的聚（D [AT]）的DNA序列1，20，这意味着，RNA被保留并且，除了DNA和蛋白质不需要RNA酶处理，可用于细菌的进一步的下游分子研究细胞分化。
尽管在哺乳动物物种的流式细胞术分析中观察到的DNA倍体和/或可染色性有相似性（在Geisinger和Rodriguez-Casuriaga 3中综述），但通过流式细胞术对雄性生殖细胞分离描述的方案存在很大的变异性。不同的研究已经使用组织解离的具体方案，并且在不同的模型生物体，主要是小鼠，大鼠和豚鼠中使用不同的DNA结合染料（单独或组合）和FACS门控策略。因此，对不同物种收集的数据的直接比较可能会受到不确定性的影响由方法之间的差异导致的未技术工件。重要的是，整个哺乳动物精子发生（2N-4N-2N-1N）中染色质动力学的显着保护表明，标准化方案可以横向应用于各种哺乳动物物种。
这项研究的目的是建立一个单一的工作流程，适用于不同的哺乳动物物种，通过组合和调整此前公布的技术2,20。通过进行机械解离以克服酶消化所需的物种特异性调节的需要来实现组织处理方法的标准化5 。值得注意的是，啮齿动物睾丸组织的机械解离已被证明比两种方法产生的单细胞悬浮液的酶组织消化20和Ho-FACS表现更好可比的结果5 。作为原理证明，该协议描述了用于隔离多达5个生殖细胞群体的设置：精原细胞（SPG）;原发性（SPC I）和次级精母细胞（SPC II）和精子细胞（SPD） - 圆形（rSPD）和伸长（eSPD）。重要的是，它在实验室中易于实施，主要要求是用于组织解离和进入配备有UV激光的细胞分选器的系统。该工作流程（ 图1 ）是快速和直接的，允许在不到2小时内从新鲜睾丸组织中同时分离4个生殖细胞群体。缩短的处理时间对于维持进一步下游程序的细胞完整性至关重要。此外，其在5种不同物种中的成功表现可以广泛地应用于哺乳动物进化枝内，使其成为分离生殖细胞的理想方法，用于哺乳动物雄性生殖生物的比较研究奥日。
该方案由三个主要部分组成，除了准备步骤外：（1）睾丸组织的机械解离和（2）用Hoechst和PI染色睾丸细胞，然后（3）对相关的精原细胞进行FACS分选。一旦收集，这些丰富的不同哺乳动物睾丸生殖细胞的群体可以用于广泛的应用。该协议描述了一种“一刀切”的解离方法，以从许多不同的哺乳动物物种中纯化雄性生殖细胞。根据用户希望用分离的生殖细胞进行的研究类型，可以使用其他介质或缓冲液。以下方案步骤用于从一个完整的鼠睾丸产生单细胞悬浮液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下所述的所有程序符合圣路易斯华盛顿大学动物研究委员会的规定。
机械解离协议的准备工作
- 预湿50μm一次性组织解聚筒，用于解离整个鼠睾丸。
注意：这种一次性组织解聚筒包含设计用于切割组织的微刀片和具有大约100个六角形孔的不动钢网。用于组织解聚筒的不同尺寸的网可用于基于物种和期望的细胞类型来适应该方案。本文中提到的所有哺乳动物物种都使用了50微米的药筒。- 将1mL冰冷酚醛游离1x Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）加到50μm的一次性组织解聚筒上。
注意：苯酚红可能会干扰红色荧光的检测在FACS期间。 - 从组织解聚筒吸取1x DMEM，使用一次性3毫升无针注射器从注射器端口。
- 将1mL冰冷酚醛游离1x Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）加到50μm的一次性组织解聚筒上。
- 按“ON”按钮打开组织分解系统。该系统不需要“预热”时间。
- 预湿三个40μm一次性过滤器，冰冷1×DMEM。将每个40μm一次性过滤器放在50mL锥形管上。移取1 mL 1x DMEM，并允许液体通过。
- 准备一个100毫米x 15毫米培养皿收集睾丸组织。移取500μL的1x DMEM到培养皿上。
2.用于机械解离方案的睾丸组织的制备
- 解剖雄性小鼠，用手术剪刀和镊子小心地清除新鲜的整个睾丸或睾丸碎片（如果与其他哺乳动物物种处理）。
注意：确保组织没有脂肪和坏死。神父 esh睾丸组织比冷冻组织产生优异的单细胞悬浮质量。- 将收集的睾丸/片段转移到制备的含有500μL1x DMEM的100mm×15mm培养皿中。
- 轻轻冲洗1x DMEM中的组织以除去红细胞（如果存在）。
- 仔细清除白喉白蛉的厚度在不同的物种中会有差异。
- 用镊子抓住睾丸的一端。
- 用手术刀刺穿睾丸的另一端，同时用上一步骤的镊子夹住睾丸的一端。
- 使用手术刀擦拭睾丸小管，同时用镊子将睾丸的一端固定在步骤2.2.1中。
- 使用手术刀将睾丸小管切割成〜2-3 mm 3 。
3.通过睾丸组织的机械解离获得单细胞悬液
注意：下面描述的解离步骤是针对一只成年小鼠睾丸，来自幼体小鼠或非鼠类的睾丸组织的体积应相应调整，少年动物可能不包含生殖细胞的所有阶段，一些哺乳动物物种与非交配季节相比，繁殖季节睾丸组织组成发生变化。- 使用镊子将小睾丸小管块转移到预先润湿的50μm的组织解聚筒，并加入1mL的1mM DMEM。
- 将组织解聚筒装载到组织解聚系统，并通过将旋钮从“待机”转到“运行”模式，处理5分钟。
- 从组织解聚系统中取出组织解聚筒，并用注射器端口的一次性3毫升无针注射器吸出细胞悬液。
- 吸出数次以从组织解聚筒中除去所有液体。不所有的1mL可以从组织解聚筒回收。
- 将抽吸的细胞悬浮液通过两个一次性预先润湿的40μm过滤器。过滤两次以除去任何细胞聚集体。
- 将一个预先润湿的40μm过滤器放在50mL锥形管中。将注射器中的吸入细胞直接添加到40μm过滤器上。用一次性移液管吸取直通单细胞悬液。
- 取出使用的预先润湿的40μm过滤器，并将另一个预先润湿的40μm过滤器放入50mL锥形管中。将收集的单细胞悬液移至干净的40μm过滤器上。
- 用干净的一次性移液管收集过滤的单细胞悬液。
- 将经过滤的细胞悬浮液移回到50μm的组织解聚筒中，并在组织解聚系统中再处理5分钟。
- 从组织分解中恢复所有液体在墨盒上。
4.用Hoechst和碘化丙啶染色（PI）
- 将回收的细胞悬浮液从50μm的组织解聚筒转移到干净的1.5mL管中。将回收大约1-1.5mL的单细胞悬浮液。
- 将回收的单细胞悬浮液分成四个1.5 mL或5 mL管。
- 对于前三个管，将150μL单细胞悬浮液和移液管的单细胞悬浮液移至最后四个管中（约550μL的单细胞悬液）。
注意：最后一个管中单细胞悬浮液的量可能会根据步骤3.6中细胞悬浮液恢复的效率而变化。
- 对于前三个管，将150μL单细胞悬浮液和移液管的单细胞悬浮液移至最后四个管中（约550μL的单细胞悬液）。
- 将四管的第一管作为FACS会话的未染色控制。
- 准备单染染色（PI或Hoechst）细胞悬浮液作为对照。向每个管中加入2.5μLHoechst或1μLPI（第二次和第RD）。
- 准备一个双重染色的管。这将用于收集生殖细胞亚群。向最后一个管中加入2.5μLHoechst和1μLPI。
注意：Hoechst的保质期为2-3个月。使用较老的染料会在FACS会议期间引起重大改变。 - 在黑暗中室温孵育30分钟。将样品置于管旋转器中，或每5-10分钟倒置1.5 mL管。
- 用预先润湿的40微米过滤器过滤细胞悬浮液，并将过滤的溶液保持在冰上并在黑暗中直到FACS会话。
注意：过滤步骤对于防止FACS的细胞团是必要的。另外，可以使用DNase（ 见图1 ）或2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐（NDA 20 ）进行处理以限制细胞团聚。延长的等待期将影响在FACS期间检测到的荧光信号，并可能导致细胞死亡。5.荧光活化细胞分选（FACS）设置和纯化睾丸细胞
- 准备FACS收集管。
- 涂5毫升聚丙烯圆底管或1.5毫升管，400μLFBS用于细胞收集。涂层后含量超过FBS。
- 将FACS收集培养基（1×DMEM + 10％胎牛血清，FBS）加入管中：1mL用于5mL试管或100μL用于1.5mL试管。
- 在细胞分选器和软件中设置适当的排序条件。
注意：其他细胞分选机和分析软件可以与下面描述的类似设置和门控策略一起使用。这里描述的条件改编自Gaysinskaya和Bortvin 2 ，Geisinger和Rodriguez-Casuriaga 3以及Getun 等人。 4- 加载463/2的紫外线激光5 nm带通滤波器检测Hoechst蓝色和680 nm LP带通滤波器，以检测Hoechst红色并检测PI。
- 使用555DLP分色镜将蓝色与红色荧光区分开来。
- 使用70微米的喷嘴，并以1000-2000个/秒的速度对细胞进行分类。
注意：排序效率直接受流量的影响。高流量（> 3500事件/ s）会提高排序速度，但会导致人口污染。有关详细信息，请参阅参考12 。
- 使用控制样品设置门。
- 加载并运行未染色样品。
- 排除基于FSC与SSC图谱的细胞碎片。细胞碎片将弹出阴谋的左下象限。任意设定用户或细胞分选技术员对细胞碎片的阈值。
- 通过调整FSC和脉冲宽度的阈值对单个单元进行门控。不同的细胞分选机有不同的区分方式贵族单身随着脉冲宽度反映细胞穿过激光的时间，当与多细胞聚集体相比时，单细胞具有较低的值。可以使用FSC与脉冲宽度的曲线图上的调整阈值来选择单体。
- 设置最佳的光电倍增管（PMT）电压。
- 使用未染色和单染染色细胞来建立PI或Hoechst荧光信号的阈值。
注意：为了确定每种染料的适当荧光范围，优化感兴趣的细胞的基线PTM电压是很重要的。这对于最佳信号检测和灵敏度至关重要。未染色和单染色的对照细胞用于利用PI和/或Hoechst染料建立一系列负性和阳性染色的细胞，并使信号中的噪声最小化。有关使用控制电池优化PMT电压的进一步说明，请参阅Gaysinskaya和Bortvin 2 - 活细胞门基于PI染色（PI阴性）和FSC图。死细胞对于PI荧光将是阳性的。
- 通过绘制基于Hoechst蓝色荧光的细胞计数直方图来设置DNA含量门。应出现Hoechst蓝色荧光浓度增加的3个峰，表示单倍体（1C），二倍体（2C）和四倍体（4C）细胞。设置3个门，每个峰值一个。
- 在进行门控生殖细胞群体之前，先观察FSC至SSC图上至少50万次事件。
- 门不同的生殖细胞群体。
- 负载Hoechst / PI染色样品。
- 设置所有种群共同的前3个父门。
- 根据FSC vs SSC图来排除细胞碎片。根据FSC和脉冲宽度图选择单片。通过选择PI阴性细胞选择活细胞。
- 定义精原细胞门。
- 绘制基于Hoechst蓝色和红色荧光的PI阴性细胞强度。精原细胞看起来像侧面群体（ 见图1 ）。
- 为剩下的生殖细胞群定义门。注意：有关可视化细节，请参见图1和补充图2。
- 在DNA含量门中绘制PI阴性细胞。
- 对于精子细胞，以Hoechst最低荧光（1C）为最高峰。
- 对于精母细胞II，使用中间Hoechst荧光（2C）门极化。
- 对于精母细胞I，以最高Hoechst荧光（4C）门极化。
- 绘制Hoechst蓝色和红色荧光强度，以从DNA含量门精细胞精子细胞和精子细胞群体。
- 将选定的亚群门收集到预先准备的收集管中。每个睾丸平均需要45分钟至1.5小时才能收集每个亚群约0.5-6.0×10 6个细胞。
注意：长时间的细胞暴露于Hoechst ma随着时间的推移，人口的位置略微移动。在FACS 20-30分钟后刷新设置。每个亚群的最大产量将取决于解离步骤的效率。
纯化细胞的显微镜评估
- 在4℃下以500-600xg旋转收集细胞10分钟。
- 用1mL冰冷的1x磷酸盐缓冲溶液（PBS）或1×DMEM再悬浮细胞沉淀。
注意：可以根据分选的细胞数量和所需的最终浓度调整再悬浮体积。 - 将40μL经洗涤的细胞移至干净的玻璃载玻片上并放置盖玻片。
- 用4％多聚甲醛（PFA）固定剩余的细胞，并将固定的细胞在4℃下保存在黑暗中，以备将来参考。
- 在收集管中直接吸取100μL4％PFA。
- 简单地涡旋管或移液管几次以确保细胞悬液的充分混合。
- 在装有紫外灯的显微镜的显微镜下可视化制备的载玻片，以在63X物镜下检测Hoechst荧光。参考结果部分 - 分类生殖细胞群体的形态学评估 - 有关如何鉴定特定生殖细胞类型的更多细节。
- 准备FACS收集管。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
单细胞悬液从睾丸组织的机械解离
图2比较了在不同条件下通过小鼠睾丸组织的机械解离获得的单细胞悬浮液。通过加工新鲜组织，未染色（ 图2A ）或用Hoechst染色（ 图2B ）获得的样品显示在不同分化阶段存在单细胞，重要的是，细胞结构似乎被保留，包括精子鞭毛。虽然在染色的样品中观察到一些结块和碎片，其通过在解离后添加DNase而减少（ 图2D ），但是这些结果表明Hoechst染色不显着改变单细胞悬浮液的质量。有趣的是，单细胞悬挂也可以通过机械解离从小鼠的冷冻组织（ 图2C ）和其他哺乳动物物种 - 大鼠，狗，豚鼠和小型猪（ 补充图1 ）中获得。各种细胞类型在这些样品中是可见的和可识别的;然而，冷冻组织的处理似乎导致增加的细胞死亡和结块，并且总体上较低的细胞产量。因此，强烈建议从新鲜组织制备单细胞悬浮液用于进一步的下游应用。
在Ho-FACS（ 表1 ）中评估了由小鼠，大鼠，狗，豚鼠和小型猪的新鲜睾丸组织制备的单细胞悬浮液的质量。排除细胞碎片后，95.7-98.4％的细胞是单体，从那些86.5-93.8％的细胞是活的，如通过PI阴性细胞的定量所示（参见方案 ）。这些恢复ts表明机械解离是制备来自不同哺乳动物物种的睾丸组织的流式细胞术的单细胞悬液的可靠方法。
Ho-FACS从不同哺乳动物物种的睾丸组织中分离生殖细胞
机械解离后，用Hoechst和PI染色单细胞悬液，并用FACS处理。如上所述，Hoechst染色允许基于染色质量和结构来鉴别不同分化阶段的细胞，而非透化细胞的PI染色将活细胞与死细胞分离。因此，在筛选细胞碎片和多细胞聚集体后，PI门选择具有完整膜的细胞（PI阴性; 图1 ）。然后根据Hoechst荧光分析活细胞：蓝色与DNA含量成比例并增加红色荧光反应较少的染色质和结构变异。因此，预期不同阶段的雄性生殖细胞聚集在细胞图的特定区域，绘制蓝/红Hoechst荧光的功能（ 图3A ）。
实际上，为不同物种产生的Ho-FACS图显示了基于Hoechst荧光的不同细胞群的存在（ 图3B- 3C ）。尽管这些图足以区分生殖细胞群体，但是可以限定DNA含量（C）门2以限制交叉污染。该门由Hoechst蓝色荧光强度函数的细胞计数直方图生成。对于所有物种，可以检测三个峰，并用1C，2C和4C表示细胞（ 图1和补充图2-5 ）。值得注意的是，上面提到的，精原细胞是一个侧面群体，不能够基于DNA含量的直方图可靠地门控。因此，根据Hoechst蓝色/红色荧光图，排除死细胞后，该群体门控（ 图1 ）。 图1中针对剩余物种的大鼠和补充图2-5表示了该策略。重要的是要注意，因为单独的Hoechst荧光可以区分不同的生殖细胞类型，PI和DNA含量门都是可选的。这些策略被纳入选择活细胞并减少交叉污染。如表1所示 ，DNA含量门中的细胞定量反映细胞在精子发生不同阶段的相对比例。如预期的那样，1C细胞是最丰富的，代表精子细胞群体，其次是2C细胞（SPC II）和4C细胞（SPC I）。 IMPORTAntly，这种模式是保存在物种之间，小的差异可能反映生殖细胞的种间变异性和生精上皮的周期21 。
在Ho-FACS之后，可以使用台盼蓝染色来评估细胞完整性。 FACS 1小时后活细胞的比例范围为小鼠的27％（SCP I）至67％（SPD），表明分选和暴露于Hoechst的持续时间增加了细胞死亡。对于寻求培养分选细胞的用户，应调整Hoechst浓度和Ho-FACS持续时间以改善细胞存活。尽管如此，已经使用这种方法（Jung 等人 ，未发表）分离的单细胞产生了RNA测序数据，表明这些细胞适用于生殖细胞生物学的分子研究。该数据集用于检测生殖细胞群体与体细胞的潜在污染（ 补充图6
分选的生殖细胞群体的形态学评估
由于生殖细胞在精子发生过程中发生严重的形态变化，因此可以通过显微镜估算分离群体的纯度。作为参考， 图4示出了来自4种哺乳动物物种的不同雄性生殖细胞类型的一般形态（来自Lima 等人 5 ）。染色质分布和凝结，以及细胞大小和形状，显示出不同细胞类型中独特且精细表征的模式。 SPG具有明显的中心异染色质，其对于Hoechst是明亮的，并且呈小而圆形（ 图4B中的 Spg）。精母细胞是较大的颗粒细胞。 SPC的细胞核易于识别，具有染色质变异ns的特征（ 图4B中的 Spc I），而SPC II是双核的或者是diakinesis（ 图4B中的 Spc II）。最后，SPD是具有圆形或细长形状的小单倍体细胞（ 图4B中的 Spd）。值得注意的是，rSPD在尺寸和形状方面与SPG类似，但明显区别于局部发色体的存在。基于这些特征，评估了分选的细胞群体的特异性细胞类型的富集（ 表1 ）。 SPD和SPC II群体对于感兴趣的细胞类型是高度富集的，而SPC I和SPG显示出与其他细胞类型的某些程度的污染，特别是对于豚鼠和迷你猪样品。有趣的是，对于狗样本，门控策略足以区分延长的精子细胞（ 图3C ; 补充图3 ; 表1
图1：哺乳动物雄性生殖细胞Ho-FACS分离的工作流程。该图像说明了哺乳动物生殖细胞的生殖细胞分离的一般方案，具有从本方案应用于大鼠睾丸的代表性数据。何：Hoechst来自Lima， et al。 5许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：通过机械解离产生的单细胞悬浮液小鼠睾丸组织。从新鲜组织（ AB ）获得的样品显示各种完整的生殖细胞类型和非常少的碎片。与未染色的细胞（ A ）相比，Hoechst染色细胞悬浮液（ B ）观察到一些细胞结块，可以通过在解离后立即加入DNA酶（终浓度为10μg/ mL）来减少（ D ）。冷冻睾丸组织也可用于通过机械解离获得单细胞悬液（ C ）。然而，似乎在组织解离之前的快速冷冻和解冻过程导致更多的碎片，细胞死亡和总体较少的细胞产量。解离后（见方案），将样品在4℃下旋转10分钟，并在安装载玻片之前重悬浮于1×DMEM中。黑条=50μm。使用装有紫外灯的直立式白光显微镜获得的图像。ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图3：哺乳动物生殖细胞的Ho-FACS。特定人群在FACS（ A ）期间呈现Hoechst荧光的独特模式。由于Hoechst蓝色荧光反映单倍体（ C ）的染色质含量簇的变化;二倍体（2C）和四倍体（4C）细胞位于FACS图谱的区域，Hoechst蓝色荧光增加。作为Hoechst蓝色/红色荧光的函数产生的图显示了不同哺乳动物物种（ BC ）的不同细胞群的簇。精神分裂症：精原细胞; SPC I：原代精母细胞; Pre-Lep：前Leptotene精母细胞; Lep：Leptotene精母细胞浸液：Diplotene精母细胞; SPCII：次级精母细胞; SPD：精子细胞eSPD：延长精子细胞; rSPD：圆精子细胞。摘自利马等人 5许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：来自四种哺乳动物物种的不同发育阶段的生殖细胞的形态学。该图显示了Hoechst（A）染色的睾丸组织切片以及由Ho-FACS（B）从大鼠，豚鼠，狗和迷你猪中分选的不同雄性生殖细胞类型的一般方面。由于细胞大小，形态和染色质构象在精子发生过程中会发生显着变化，因此可用于将细胞分配到不同的分化阶段。精原细胞（Spg）小而圆c具有不同的中心异染色质并具有高强度的Hoechst荧光。精母细胞是最大的生殖细胞，显示出可变的染色质构象。原代精母细胞核（Spc I）表现出减数分裂细胞特征的染色质变异，而次级精母细胞（Spc II）是双核的，或者是二次分化的。精子细胞（Spd）具有圆形或细长形状，取决于精子发生的阶段，是小单倍体细胞。虽然圆形精子细胞和精原细胞的大小和形状相似，但前者可以通过局部染色体的存在来区分。在Ho-FACS后为每种分选的细胞类型制备幻灯片，并在共聚焦显微镜下观察：63X放大镜片，具有（下图）或无（上图）白光透射。从Lima 等人 5许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
| DNA含量门中的％细胞 | 分选的生殖细胞群的纯度（％） | |||||||||||
| 种类 | ％单身 | ％活细胞 | 1C | 2C | 4C | SPG | Spc我 | Spc II | SPD | RSPD | ESPD | |
| 老鼠 | 98.4 | 92.5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| 鼠 | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | 。 | 。 | |
| 豚鼠 | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68.7 | 85 | 87 | 。 | 。 | |
| 狗 | 97.9 | 86.5 | 16.4 | 3 | 0.5 | 78 | 。 | 87 | 。 | 91 | 81 | |
| 迷你猪 | 95.9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | 。 | 。 | |
| 通过酶解和门控获得基于FSC和SSC参数（来自Lima et al。2016，经许可） | ||||||||||||
表1：通过机械解离获得的雄性生殖细胞悬浮液的Ho-FACS的统计学。
补充图1：通过冷冻睾丸组织的机械解离获得的单细胞悬浮液。机械解离允许从不同哺乳动物物种的睾丸组织产生单细胞悬浮液，而不需要物种特异性的方案。不同的小组显示了4种哺乳动物物种获得的细胞悬浮液。通过冷冻睾丸组织的机械解离获得样品，并用Hoechst染色。精神分裂症：精原细胞; SPC I：主要精母细胞; SPC II：次级精母细胞; SPD：精子细胞SPZ：精子。幻灯片在confoca中可视化 l显微镜带（下图）或无（上图）白光透射。刻度棒=20μm。 请点击这里下载此文件。
补充图2：通过小鼠睾丸单细胞悬液的Ho-FACS分离活雄性生殖细胞的门控策略。活细胞（PI阴性）根据Hoechst荧光进行分类。通过绘制直接Hoechst-蓝色和红色荧光强度来鉴定精原细胞（SPG）。使用DNA含量门根据Hoechst蓝色荧光分类细胞：单倍体（C）;二倍体（2C）和四倍体（4C）。然后通过绘制Hoechst蓝色和红色荧光的功能对直方图的每个峰中的细胞进行排序。精神分裂症：精原细胞; SPD：精子细胞SPC II：次级精母细胞; SPC I：原代精母细胞。d / 55913 / Supp_fig.2.tif“>请点击此处下载此文件。
补充图3：狗睾丸单细胞悬液的Ho-FACS分离活雄性生殖细胞的门控策略。活细胞（PI阴性）根据Hoechst荧光进行分类。通过绘制直接Hoechst-蓝色和红色荧光强度来鉴定精原细胞（SPG）。使用DNA含量门根据Hoechst蓝色荧光分类细胞：单倍体（C）;二倍体（2C）和四倍体（4C）。然后通过绘制Hoechst蓝色和红色荧光的功能对直方图的每个峰中的细胞进行排序。包含单倍体细胞的峰可以根据Hoechst蓝色强度的范围细分，并代表精子细胞的两个亚群：延伸的精子细胞（门C'）和圆形精子细胞（门C“）。精神分裂症：精原细胞; eSPD：延长精子细胞; rSPD：圆精子细胞; SPC II：次级精母细胞SPC I：原代精母细胞。 请点击这里下载此文件。
补充图4：豚鼠睾丸单细胞悬液的Ho-FACS分离活雄性生殖细胞的门控策略。活细胞（PI阴性）根据Hoechst荧光进行分类。通过绘制直接Hoechst-蓝色和红色荧光强度来鉴定精原细胞（SPG）。使用DNA含量门根据Hoechst蓝色荧光分类细胞：单倍体（C）;二倍体（2C）和四倍体（4C）。然后通过绘制Hoechst蓝色和红色荧光的功能对直方图的每个峰中的细胞进行排序。精神分裂症：精原细胞; SPD：精子细胞SPC II：次级精母细胞; SPC I：原代精母细胞。 请点击这里做wnload这个文件。
补充图5：迷你猪睾丸单细胞悬液的Ho-FACS分离活雄性生殖细胞的门控策略。活细胞（PI阴性）根据Hoechst荧光进行分类。通过绘制直接Hoechst-蓝色和红色荧光强度来鉴定精原细胞（SPG）。使用DNA含量门根据Hoechst蓝色荧光分类细胞：单倍体（C）;二倍体（2C）和四倍体（4C）。然后通过绘制Hoechst蓝色和红色荧光的功能对直方图的每个峰中的细胞进行排序。精神分裂症：精原细胞; SPD：精子细胞SPC II：次级精母细胞; SPC I：原代精母细胞。 请点击这里下载此文件。
补充图6：检查体细胞污染物Ho-FACS分选群体中的离子。来自三个FACS子群门（AB）的约600个单细胞转录组的t-分布随机相邻嵌入（t-SNE）图。在t-SNE图上，每个点表示转录组空间中单细胞的独特位置，每个细胞用其FACS亚群门起源（A）标记。在FACS单细胞t-SNE图（B）上视觉定量细胞型特异性标记物。估计体细胞的污染小于5％，而不是一个Ho-FACS种群门的特异性。 请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
考虑到在哺乳动物精子发生过程中高度保守的染色质动力学，这项工作的目的是制定一个方案来分离不同哺乳动物睾丸组织分化阶段的雄性生殖细胞（ 图1 ）。将单一工作流程应用于不同动物模型的主要障碍之一是需要物种特异性调整，特别是在组织解离方案方面。目前的方法主要依赖于酶组织消化，甚至在物种12内也有协议。为了克服这个问题，本文描述的方案显示机械组织解离的应用，以从不同哺乳动物物种的睾丸样品获得单细胞悬浮液。结果表明，该系统新鲜睾丸组织的机械解离性能良好（ 图2A- 2B） 20中的应用。重要的是，Hoechst染色似乎没有显着影响单细胞悬浮液的质量。虽然在染色样品中可见更多的细胞团聚（ 图2B ），但用DNase（ 图2D ）或NDA 20处理可以帮助防止这一问题。以前的报道表明，睾丸组织的机械解离优于或那样有效酶促组织消化5，20。根据本文提供的数据表明，机械解离是从Ho-FACS处理的睾丸组织获得单细胞悬浮液的可靠方法。
与Hoechst孵化是影响流式细胞术检测信号的关键步骤。长时间的染色可以更好地区分生殖细胞类型可能是有毒的，导致细胞死亡和细胞内编程的变化22 。打算建立生殖细胞培养物用这种方法用户应该评估长时间曝光的基因毒性作用给Hoechst 3,22并确定适当的浓度和染色时间。在这里，30分钟的染色足以提供生殖细胞群体的可靠分离（ 图3B- 3C ）。染色持续时间可能会降低到10分钟，如Rodriguez-Casuriaga 等人所示。 20 ，应由用户进一步评估感兴趣的物种。
根据假设，可以根据所测试的不同物种的生殖细胞的染色质变异，一致地检测四种生殖细胞群体 - SPG，SPC I，SPC II和SPD-（ 图3B- 3C 表1 ），并支持了该工作流程（ 图1 ）对不同哺乳动物物种采用的选通策略（ 附图2- 5 ）。然而，用户可以根据感兴趣的种类和种群优化门控，以减少一些群体检测到的交叉污染（表1）。这可以通过染色期间更长的孵育时间来实现18 ，减少流量2和减小栅极尺寸。 SPG更具挑战以分离，因为它们是在睾丸最稀有的细胞类型，也由于随着时间的推移1,15染料流出。虽然可以通过Ho-FACS检测不同的SPG群体，如本文所示，仅专注于干细胞生物学的研究将受益于更严格的技术，例如磁激活细胞分选（MACS; 23 ）。值得注意的是，SPD（eSPD和rSPD）的亚群可以明显地被区分为狗但不是其他物种（ 图3C和补充图3）。潜在地，这些亚群可以通过调整门控设置来解决，如作者对于鼠标5所述 。在绘制Hoechst蓝色/红色荧光素的功能之前，为细胞大小和粒度（FSC VS SSC）生成的Cytogram确定从圆形（高FSC + SSC）精子细胞亚群中区分延长（低FSC + SSC）。圆形和延长的精子细胞亚群的分离将允许更深入地研究精子发生，为精子分化期间发生的特定分子事件带来新的见解。另外，作为鼠标1，2，12所描述的，它有可能获得减数分裂阶段的进一步的分辨率，通过调整FACS栅极。这种方法在很大程度上有利于减数分裂事件的比较研究。虽然在Ho-FACS期间细胞完整性受到干扰，但是用该方法分选的细胞获得的单细胞RNA测序数据（Jung 等人 ， 未发表 ; 补充图6 ）表明，这是获得用于生殖细胞分子研究的细胞的可靠方法生物学。尽管如此，有意进行生殖检测的用户，如round精子注射（ROSI），使用由豪FACS分离的细胞必须评估分选的细胞生存力和可能要探索可供选择的方法24,25。
总之，这项工作描述了一种标准化方法分离来自不同哺乳动物睾丸生殖细胞，建立并加入先前建立的技术2，12，20精炼。这种标准化允许在不同哺乳动物物种上使用一套试剂和单一工作流程，便于生物细胞生物学比较研究的数据生成。此外，机械组织解离克服了物种特异性调整的障碍，这可能引入几乎不可能解决的方法学变异性。此外，减少的执行时间和操作限制离体细胞的扰动细胞生理至少。在这方面，何-FACS相比生殖细胞分离的其他方法，诸如STA-PUT和淘洗6,7时显著更快。此外，在同一个实验中同时分离4个胚芽群只能通过FACS进行分离。鉴于Hoechst染料的性质，保留细胞结构和RNA物种，因此细胞可用于进一步的下游分子研究。重要的是，由于Ho-FACS依赖于染色质属性来区分生殖细胞类型，所以在5种不同的物种中成功地实现了这一工作流程，这强烈地支持其应用于其他哺乳动物。这里提出的结果表明，精子发生可能是一种独特的细胞分化过程，可以使用单一方案在许多哺乳动物物种中解决。因此，在“omics”和系统生物学时代，这种技术为进化应用程序提供了手段嘲笑男性生殖细胞生物学的问题，包括在整个精子发生过程中对表观遗传学，调节和蛋白质多样性的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
所有作者声明没有竞争的兴趣。
Acknowledgments
作者感谢山坡动物医院（圣路易市，MO）进行狗睾丸; Jason Arand和Ted Cicero博士在圣路易斯华盛顿大学（WashU）的实验室提供大鼠睾丸和Brianne Tabers来协助收集;洗手间的Jared Hartsock和Salt实验室为豚鼠睾丸;和迈克尔·塔尔科特博士在WashU的比较医学科为微型猪睾丸。作者还承认华盛顿大学医学院的Alvin J. Siteman癌症中心和密苏里州圣路易斯的Barnes-Jewish医院，使用Siteman流式细胞术核心，该核心提供了人员操作的细胞分选服务。 Siteman癌症中心由NCI癌症中心支持拨款＃P30 CA91842部分支持。
该研究由FCT博士研究生资助[SFRH / BD / 51695/2011至ACL]，美国国家卫生研究院的赠款[R01HD078641和R01MH101810至DFC]和FCT研究合同[IF / 01262/2014 to AML]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
