Summary
Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l'ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.
Abstract
La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata uno dei metodi di scelta per isolare popolazioni arricchite di cellule germinali testicolari mammiferi. Attualmente permette di discriminare fino a 9 popolazioni di cellule germinali ad alto rendimento e purezza. Questa alta risoluzione in discriminazione e purificazione è possibile grazie a cambiamenti unici nella struttura e quantità di cromatina durante la spermatogenesi. Questi schemi possono essere catturati mediante citometria a flusso di cellule germinali maschiate colorate fluorescenti di DNA come Hoechst-33342 (Hoechst). Ecco una descrizione dettagliata di un protocollo recentemente sviluppato per isolare cellule germinali testicolari mammiferi. In breve, sospensioni singole cellule sono generate dal tessuto testicolo mediante dissociazione meccanica, doppiate con Hoechst e ioduro di propidium (PI) e trattate mediante citometria a flusso. Una strategia di gateway seriale, compresa la selezione di cellule vive (PI negative) con diverso contenuto di DNA (intensità di Hoechst), iS utilizzato durante l'ordinamento FACS per discriminare fino a 5 tipi di cellule germinali. Queste includono, con corrispondenti purezza medie (determinate dalla valutazione microscopica): spermatogoni (66%), spermatosi primari (71%) e secondari (85%) e spermatidi (90%), ulteriormente separati in tondo (93%) e allungamento (87%) delle sottopopolazioni. L'esecuzione dell'intero flusso di lavoro è semplice, consente l'isolamento di 4 tipi di celle contemporaneamente con la macchina FACS appropriata e può essere eseguita in meno di 2 ore. Poiché il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per preservare la fisiologia delle cellule ex vivo , questo metodo è ideale per gli studi ad alta produttività a valle della biologia delle cellule germinali maschili. Inoltre, un protocollo standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali dei mammiferi elimina le fonti metodologiche di variabili e consente un singolo insieme di reagenti da utilizzare per diversi modelli animali.
Introduction
Data la mancanza di un sistema in vitro rappresentativo della progressione della spermatogenesi e la presenza di una grande eterogeneità cellulare nei testicoli, gli studi sulla biologia delle cellule germinali maschili richiedono tecniche robuste per isolare popolazioni arricchite di specifici tipi di cellule. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata ampiamente utilizzata per questo scopo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in quanto fornisce elevata resa e purezza e supera altri metodi di isolamento nel numero di cellule germinali che può identificare e Selezionare 6 , 7 , 8 . Il principio dell'analisi della citometria a flusso si basa sulla rilevazione di modelli di luce differenziale a seguito di eccitazione laser di fascio singolo. Quando una cellula passa attraverso il laser, riflette / scattere la luceA tutti gli angoli, proporzionali alla dimensione cellulare (forward scatter, FSC) e alla complessità intracellulare (side scatter; SSC). Vedere Ormerod 9 per informazioni dettagliate sulla citometria a flusso.
Le cellule germinali maschili subiscono modifiche specifiche nel contenuto del DNA, nella struttura cromatica, nella dimensione e nella forma in diverse fasi della spermatogenesi. Così, le popolazioni cellulari distinte possono essere identificate e separate separando la dispersione luminosa e la colorazione del DNA con coloranti fluorescenti 10 , 11 . Per questo scopo possono essere impiegati diversi coloranti (esaminati in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), come Hoechst-33342 (Hoechst), che è stato usato frequentemente nell'analisi di flusso cytometry delle cellule testicolari nell'ultimo decennio 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN eccitazione con luce UV, Hoechst emette una fluorescenza blu proporzionale al contenuto cellulare del DNA, mentre la fluorescenza molto lunga rispecchia la variabilità nella struttura cromatica e nella compattazione 1 , 13 , 14 . Di conseguenza, le cellule germinali maschili in differenti fasi di differenziazione mostrano modelli specifici durante la FACS di Hoechst-sospese singole cellule (Ho-FACS; 1 , 12 ). È interessante notare che, a causa di un meccanismo di efflusso di tinture che è attivo solo durante lo stadio spermatogoniale, l'intensità della fluorescenza blu di Hoechst non è proporzionale al contenuto di cromatina in queste cellule e si aggrappa come popolazione laterale durante la Ho-FACS 15 . Inoltre, combinando la colorazione Hoechst con il non-permeante propidio ioduro (PI) permette agli utenti di discriminare in tempo reale (PI negativo) da cellule morte (PI positive) durante FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Questa strategia è stata precedentemente utilizzata per analisi citometriche a flusso di cellule germinali testiche e ottimizzata in maniera estesa nel topo per discriminare fino a 9 tipi di cellule germinali, comprese le cellule in 4 diverse fasi della meiosi I 1 , 2 , 4 , 16 . Ai fini di questo lavoro, la colorazione Hoechst ha tre vantaggi principali. In primo luogo, Ho-FACS è stato applicato con successo all'isolamento di cellule germinali maschili nel modello del topo 1 , 2 , 12 e altri roditori come ratto e cavia 17 , 18 , 19 . In secondo luogo, Hoechst è un colorante permeante per cellule e non richiede permeabilizzazione della membrana, perciò prende in considerazioneIntegrità delle cellule ves. Infine, non è richiesto alcun trattamento di RNase in quanto Hoechst si lega preferibilmente alle sequenze 1 , 20 di poli (d [AT]), il che significa che l'RNA è conservato e, oltre al DNA e alle proteine, può essere utilizzato per ulteriori studi molecolari a valle di germi Differenziazione delle cellule.
Nonostante la somiglianza nella ploidia e / o nella tangibilità del DNA osservata nelle analisi di flusso cytometry delle specie di mammiferi (riesaminata in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), vi è stata una buona variabilità nei protocolli descritti per l'isolamento delle cellule germinali maschili mediante citometria a flusso. Diversi studi hanno impiegato protocolli specifici per la dissociazione dei tessuti e hanno utilizzato differenti coloranti legati al DNA (da soli o in combinazione) e strategie di gocciolamento FACS in diversi organismi del modello, principalmente il topo, il ratto e la cavia. Di conseguenza, il confronto diretto dei dati raccolti per diverse specie può essere influenzato da unaccoManufatti tecnici non determinati derivanti dalla variabilità tra le metodologie. Importante, la notevole conservazione delle dinamiche di cromatina durante la spermatogenesi dei mammiferi (2N-4N-2N-1N) suggerisce che un protocollo standardizzato possa essere trasversalmente applicato ad una varietà di specie di mammiferi.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un singolo flusso di lavoro applicabile a diverse specie di mammiferi, combinando e adattando le tecniche precedentemente pubblicate 2 , 20 . La standardizzazione di un metodo per l'elaborazione dei tessuti è stata ottenuta eseguendo la dissociazione meccanica per superare la necessità di adeguamenti specifici delle specie necessari per la digestione enzimatica 5 . È degno di nota che la dissociazione meccanica del tessuto testicolare del roditore ha dimostrato di essere migliore della digestione del tessuto enzimatico 20 e Ho-FACS delle sospensioni di singole cellule generate da entrambi i metodiRisultati comparabili 5 . Come prova del principio, questo protocollo descrive le impostazioni utilizzate per isolare fino a 5 popolazioni di cellule germinali: spermatogoni (SPG); Primari (SPC I) e spermatociti secondari (SPC II) e spermatidi (SPD) - rotondi (rSPD) e allungamento (eSPD). Importante, è facile da implementare in laboratorio, con i requisiti principali che sono il sistema per la dissociazione tissutale e l'accesso a un cellulare dotato di un laser UV. Questo flusso di lavoro ( Figura 1 ) è veloce e semplice e consente l'isolamento simultaneo di 4 popolazioni di cellule germinali da tessuti testicolari freschi in meno di 2 ore. Il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per mantenere l'integrità cellulare per ulteriori procedure a valle. Inoltre, la sua performance di successo in 5 diverse specie suggerisce che potrebbe essere applicata ampiamente all'interno della cladi mammiferi, rendendolo il metodo ideale per isolare le cellule germinali per studi comparativi di biolo riproduttivo maschile mammiferogia.
Questo protocollo è composto da tre sezioni principali, a parte le fasi preparatorie: (1) la dissociazione meccanica del tessuto testicolo e (2) la colorazione delle cellule testicolari con Hoechst e PI, seguito da (3) ordinamento FACS di cellule spermatogeniche pertinenti. Una volta raccolte, queste popolazioni arricchite di differenti cellule germinali testicoli mammiferi possono essere utilizzate per un'ampia gamma di applicazioni. Questo protocollo descrive un metodo di dissociazione "di un solo formato" per purificare le cellule germinali maschili da molte specie di mammiferi differenti. A seconda del tipo di studio che gli utenti desiderano condurre con le cellule germinali isolate, possono essere utilizzati altri supporti o buffer. I seguenti passi del protocollo sono per generare sospensioni a cellule singole da un intero testicolo murino.
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Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state conformi alle norme del comitato di studio sugli animali presso l'Università di Washington a St. Louis.
1. Preparativi per il protocollo di dissociazione meccanica
- Pre-bagnare una cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso da 50 μm per la dissociazione di un testicolo murino completo.
NOTA: Questa cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso contiene micropiastre progettate per il taglio di tessuti e una maglia in acciaio immobile con circa 100 fori esagonali. Sono disponibili diverse dimensioni di maglie per la cartuccia di disaggregazione dei tessuti per adattare questo protocollo in base alla specie e ai tipi di cellule desiderati. Le cartucce da 50 μm sono state utilizzate per tutte le specie di mammiferi menzionate in questo documento.- Caricare 1 ml di colore rosso freddo di fenolo libero 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sulla cartuccia di disaggregazione dei tessuti usa e getta da 50 μm.
NOTA: Il fenolo rosso può interferire con la rilevazione di fluorescenti rossiDurante la FACS. - Aspirare 1x DMEM dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto con una siringa da 3 ml senza ago senza siringa dalla porta della siringa.
- Caricare 1 ml di colore rosso freddo di fenolo libero 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sulla cartuccia di disaggregazione dei tessuti usa e getta da 50 μm.
- Attivare il sistema di disaggregazione dei tessuti premendo il pulsante "ON". Questo sistema non richiede tempo di riscaldamento.
- Pre-bagnare tre filtri monouso da 40 μm con ghiaccio freddo 1x DMEM. Posizionare ogni filtro monouso da 40 μm su un tubo conico da 50 ml. Pipettare 1 ml di 1x DMEM e lasciare attraversare il liquido.
- Preparare un piatto di Petri da 100 mm x 15 mm per la raccolta di tessuti testicolari. Pipettare 500 μL di 1x DMEM sul piatto di Petri.
2. Preparazione del tessuto testicolo per il protocollo di dissociazione meccanica
- Disseccare un topo maschio per rimuovere accuratamente i testicoli interi freschi o frammenti testicoli (se si trattano con altre specie di mammiferi) con forbici e pinze chirurgiche.
NOTA: Assicurarsi che i tessuti siano privi di grassi e necrosi. fr I tessuti testicoli esh generano una qualità superiore di sospensione a singola cellula rispetto ai tessuti congelati.- Trasferire i testicoli / frammenti raccolti sul piatto di Petri da 100 mm x 15 mm preparato contenente 500 μL di 1x DMEM.
- Risciacquare delicatamente il tessuto in 1x DMEM per rimuovere le cellule del sangue rosso (se presente).
- Rimuovere con cautela la tunica albuginea. La spessore della tunica albuginea varia in diverse specie.
- Prendi una estremità del testicolo con le pinze.
- Puntare l'altra estremità del testicolo con un bisturi tenendo ancora l'estremità di testicolo con le pinze precedenti.
- Raschiare i tubuli testicolari usando un bisturi tenendo ancora l'estremità di testicolo con le pinze dalla fase 2.2.1.
- Tagliare tubuli testicolari in pezzi di 2-3 mm ~ 3 utilizzando un bisturi.
3. Ottenere le sospensioni delle cellule singole dalla dissociazione meccanica del tessuto testicolo
Ontent "> NOTA: Le fasi di dissociazione descritte di seguito sono fornite per un testis per adulti di un adulto, i volumi dei tessuti testicolari da topi giovanili o da specie non murine dovrebbero essere adeguati di conseguenza: gli animali giovanili non possono contenere tutte le fasi delle cellule germinali. La composizione del tessuto testicolo cambia durante le stagioni di allevamento rispetto alla stagione non accoppiata.- Trasferire i piccoli pezzi tubulari testicolari alla cartuccia di disaggregazione del tessuto 50 μm pre-bagnato utilizzando le pinze e aggiungere 1 mL di 1x DMEM.
- Caricare la cartuccia di disaggregazione del tessuto al sistema di disaggregazione dei tessuti e procedere per 5 minuti ruotando la manopola dalla modalità "standby" a "run".
- Rimuovere la cartuccia di disaggregazione dei tessuti dal sistema di disaggregazione dei tessuti e dalla siringa di aspirazione con una siringa da 3 ml senza ago senza siringa dalla porta della siringa.
- Aspirare poche volte per rimuovere tutto il liquido dalla cartuccia di disaggregazione dei tessuti. NonTutte le 1 mL possono essere recuperate dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto.
- Passare la sospensione cellulare attraverso due filtri preimpostati da 40 μm monouso. Filtra due volte per rimuovere gli aggregati di cellule.
- Posizionare un filtro pre-imbevuto di 40 μm in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere direttamente le cellule aspirate nella siringa sul filtro da 40 μm. Sospensione singola cella passante con pipetta con pipetta usa e getta.
- Rimuovere il filtro pre-imbottato utilizzato da 40 μm e inserire un altro filtro pre-imbottato da 40 μm nel tubo conico da 50 ml. Pipettare la sospensione a singola cellula raccolta sul filtro pulito da 40 μm.
- Raccogliere la sospensione a singola cellula filtrata con una pipetta pulita e usa e getta.
- Pipettare la sospensione delle cellule filtrate alla cartuccia di disaggregazione dei tessuti da 50 μm e procedere per altri 5 minuti in un sistema di disaggregazione dei tessuti.
- Recuperare tutto il liquido dai disaggregati dei tessutiSulla cartuccia.
4. Colorazione con Hoechst e Propidium Iodide (PI)
- Trasferire la sospensione cellulare recuperata dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto da 50 μm in un tubo pulito da 1,5 ml. Saranno recuperati circa 1-1,5 ml di sospensione a cellule singole.
- Dividere la sospensione singola cella recuperata in quattro tubi da 1,5 mL o 5 mL.
- Per i primi tre tubi, pipettare 150 μL di sospensione a singola cellula e resto di pipetta di sospensione a singola cellula nell'ultimo dei quattro tubi (circa 550 μL di sospensione a singola cellula).
NOTA: L'ammontare della sospensione a singola cellula nell'ultimo tubo può variare in base all'efficienza del recupero delle sospensioni cellulari al punto 3.6.
- Per i primi tre tubi, pipettare 150 μL di sospensione a singola cellula e resto di pipetta di sospensione a singola cellula nell'ultimo dei quattro tubi (circa 550 μL di sospensione a singola cellula).
- Impostare il primo tubo dei quattro tubi come un controllo non satinato per la sessione FACS.
- Preparare le sospensioni delle cellule colorate (PI o Hoechst) come controlli. Aggiungere 2,5 μL di Hoechst o 1 μL di PI a ciascun tubo (secondo e third).
- Preparare un tubo doppio macchiato. Questo sarà usato per raccogliere le sottopopolazioni delle cellule germinali. Aggiungere 2,5 μL di Hoechst e 1 μL di PI all'ultimo tubo.
NOTA: Hoechst ha una scadenza di 2-3 mesi. L'utilizzo di vecchie scorte di colorante provoca alterazioni significative durante la sessione FACS. - Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Posizionare campioni in un rotatore di tubi o invertire i tubi da 1,5 ml ogni 5-10 minuti.
- Sospendere la sospensione cellulare con un filtro pre-imbevuto di 40 μm e mantenere la soluzione filtrata sul ghiaccio e nel buio fino alla sessione FACS.
NOTA: la fase di filtrazione è necessaria per impedire i blocchi di cellule per FACS. Inoltre, è possibile utilizzare il trattamento con DNase (vedi figura 1 ) o sale di dipotassium acido 2-naftolo-6,8-disolfonico (NDA 20 ) per limitare il clumping cellulare. I periodi di attesa prolungati influenzeranno il segnale fluorescente rilevato durante il FACS e possono causare una maggiore morte cellulare.5. Sistema di selezione delle cellule attivate mediante fluorescenza (FACS) e depurazione delle cellule testiche
- Preparare tubi di raccolta FACS.
- Applicare 5 ml di tubi in polipropilene rotondo o tubi da 1,5 ml con 400 μl di FBS per la raccolta delle cellule. Decantare l'eccesso di FBS dopo il rivestimento.
- Aggiungere i campioni FACS (1x DMEM + 10% Fetal Bovine Serum, FBS) ai tubi: 1 mL per 5 mL tubi o 100 μL per tubi da 1,5 mL.
- Impostare le condizioni di ordinamento appropriate nel separatore di celle e nel software.
NOTA: altre macchine di smistamento delle celle e software di analisi possono essere utilizzati con le strategie di setup e gating simili descritte di seguito. Le condizioni qui descritte sono state adattate da Gaysinskaya e Bortvin 2 , Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 , e Getun, et al. 4- Caricare un laser ultravioletto con 463/2Filtro di passaggio a banda da 5 nm per rilevare il filtro di passaggio della banda LP di Hoechst blu e 680 nm per rilevare il rosso di Hoechst e per rilevare PI.
- Utilizzare uno specchio dicroico 555DLP per distinguere l'azzurro dalla fluorescenza rossa.
- Utilizzare un ugello di 70 μm e ordinare le celle ad una velocità di 1000-2000 celle / secondo.
NOTA: L'efficienza ordinante è influenzata direttamente dalla portata. Alti flussi (> 3500 eventi / s) aumentano la velocità di ordinamento, ma portano alla contaminazione delle popolazioni. Vedere il riferimento 12 per ulteriori informazioni.
- Impostare le porte utilizzando i campioni di controllo.
- Caricare ed eseguire campioni non colorati.
- Escludere i detriti di cellule in base al modello FSC vs SSC. I detriti cellulari si apriranno nel quadrante inferiore sinistro della trama. Impostare arbitrariamente la soglia per i detriti di cella da parte dell'utente o il tecnico del riutilizzatore di celle.
- Porta su singole celle regolando la soglia per FSC e la larghezza dell'impulso. I differenti ordinatori di celle hanno diversi modi per distinguereSingles guish. Poiché la larghezza dell'impulso riflette le celle di tempo che attraversano il laser, le singole cellule hanno valori inferiori rispetto agli aggregati multicellulari. La regolazione della soglia su una trama per la larghezza dell'impulso FSC può essere usata per selezionare singole.
- Impostare tensioni ottimali del tubo fotometrico (PMT).
- Utilizzare entrambe le cellule colorate non colorate e non colorate per stabilire la soglia del segnale di fluorescenza PI o Hoechst.
NOTA: è importante ottimizzare le tensioni PTM di base per le cellule di interesse per stabilire l'adeguata gamma di fluorescenza per ogni tintura. Ciò è fondamentale per la rilevazione ottimale del segnale e la sensibilità. Le cellule di controllo non macchiate e singole vengono utilizzate per stabilire una gamma di cellule colorate negativamente e positivamente con coloranti PI e / o Hoechst e minimizzare il rumore nei segnali. Per ulteriori spiegazioni sull'ottimizzazione della tensione PMT usando le celle di controllo, fare riferimento a Gaysinskaya e Bortvin 2 - Cancello sulla cella vivaS basata sulla colorazione PI (PI negative) e sulla trama FSC. Le cellule morte saranno positive per la fluorescenza di PI.
- Impostare la porta del contenuto DNA tracciando un istogramma dei conteggi delle cellule in base alla fluorescenza blu di Hoechst. Dovrebbero apparire 3 picchi con concentrazioni crescenti di fluorescenza blu di Hoechst, che rappresentano le cellule haploide (1C), diploide (2C) e tetraploide (4C). Impostare 3 cancelli, uno per ogni picco.
- Osservate almeno 500.000 eventi su FSC vs SSC, prima di procedere alla gating sulle popolazioni di cellule germinali.
- Porta diverse popolazioni di cellule germinali.
- Caricare il campione macinato Hoechst / PI.
- Impostare i primi 3 gate genitori comuni a tutte le popolazioni.
- Escludere i detriti di cellule in base alla trama FSC vs SSC. Seleziona singletti in base alla trama FSC vs larghezza di impulso. Selezionare le celle vive gingando le celle negative PI.
- Definire il cancello di spermatogoni.
- Piegare le cellule negative di PI basate sulla fluorescenza blu e rossa di Hoechstintensità. Spermatogonia appare come una popolazione laterale (vedi figura 1 ).
- Definire le porte per le altre popolazioni di cellule germinali. NOTA: Fare riferimento alla figura 1 e alla figura 2 supplementare per i dettagli visivi.
- Piegare le cellule negative di PI nella porta del contenuto del DNA.
- Per il cancello dei spermatidi il picco con la più bassa Hoechst fluorescenza (1C).
- Per gli spermatociti II, aprire il picco con fluorescenza intermedia Hoechst (2C).
- Per gli spermatociti I, porta il picco con la più alta fluorescenza di Hoechst (4C).
- Plot Hoechst intensità fluorescenza blu e rossa per raffinare gli spermatociti e le spermatidi popolazioni dai cancelli del contenuto del DNA.
- Raccogliere le porte di sottopopolazione selezionate nei tubi di raccolta precedentemente preparati. Ogni testicolo impiegherà una media di 45 minuti a 1,5 h per raccogliere circa 0,5-6,0 x 10 6 cellule per ciascuna sottopopolazione.
NOTA: esposizione a cellule prolungate a Hoechst maY spostare leggermente la posizione delle popolazioni nel tempo. Aggiorna le impostazioni dopo 20-30 minuti di FACS. Il rendimento massimo per ogni sottopopolazione sarà contingente all'efficienza della fase di dissociazione.
6. Valutazione microscopica delle cellule purificate
- Spin ha raccolto le cellule a 500-600 xg a 4 ° C per 10 min.
- Sospendere il pellet di cellula con 1 ml di soluzione fredda di fosfato 1x fosforo (PBS) o 1x DMEM.
NOTA: Il volume di ri-sospensione può essere regolato in base al numero di celle ordinate e alla concentrazione finale desiderata. - Pipettate 40 μL di cellule lavate su una lastra di vetro pulita e posizionate una copertura.
- Fissare le altre cellule con 4% di paraformaldeide (PFA) e memorizzare le celle fisse a 4 ° C in buio per un futuro riferimento.
- Pipettare 100 μl di 4% PFA direttamente nei tubi di raccolta.
- Brevemente vortex i tubi o pipetta poche volte per assicurare un buon mescolamento della sospensione cellulare.
- Visualizzare le diapositive preparate in un microscopio dotato di una lampada UV per rilevare la fluorescenza di Hoechst con un obiettivo 63X. Fare riferimento alla sezione Risultati - Valutazione morfologica delle popolazioni di cellule germinali ordinate - per ulteriori dettagli su come identificare specifici tipi di cellule germinali.
- Preparare tubi di raccolta FACS.
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Representative Results
Sospensioni singole cellule dalla dissociazione meccanica dei tessuti testicolari
La Figura 2 confronta le sospensioni di una singola cellula ottenute dalla dissociazione meccanica del tessuto testicolare del mouse in condizioni diverse. I campioni ottenuti mediante l'elaborazione di tessuti freschi, non colorati ( Figura 2A ) o colorati con Hoechst ( Figura 2B ), mostrano la presenza di singole cellule in varie fasi di differenziazione e, soprattutto, sembra essere conservata la struttura cellulare, compresa la flagella degli spermatozoi. Anche se alcuni campioni macchiati e deteriorati sono stati osservati, riducendo l'aggiunta di DNase dopo la dissociazione ( Figura 2D ), questi risultati indicano che la colorazione di Hoechst non altera significativamente la qualità delle sospensioni di una singola cellula. È interessante notare che la sola cellula sospPossono anche essere ottenute da tessuti congelati per il topo ( Figura 2C ) e altre specie di mammiferi - ratto, cane, cavie e mini-suino ( figura 1 supplementare ) mediante dissociazione meccanica. Vari tipi di cellule sono visibili e identificabili in quei campioni; Tuttavia, la trasformazione dei tessuti congelati sembra portare ad una maggiore morte cellulare e al clumping e un rendimento cellulare complessivamente inferiore. Come tale, è altamente raccomandato preparare sospensioni singole cellule da tessuti freschi per altre applicazioni a valle.
La qualità delle sospensioni di una singola cellula preparate da tessuti testicoli freschi di topo, ratto, cane, cavie e mini maiale è stata valutata durante Ho-FACS ( Tabella 1 ). Dopo l'esclusione dei detriti cellulari, 95,7-98,4% delle cellule sono singole e da quelle 86,5-93,8% sono vive, come dimostrato dalla quantificazione delle cellule negative di PI (vedi Protocollo ). Questi risultatiTs indicano che la dissociazione meccanica è un metodo affidabile per preparare sospensioni singole cellule per citometria a flusso da tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi.
Ho-FACS per isolare le cellule germinali dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi
Dopo la dissociazione meccanica, le sospensioni di una singola cellula vengono macchiate con Hoechst e PI e elaborate da FACS. Come accennato in precedenza, la colorazione di Hoechst permette la discriminazione delle cellule in differenti fasi di differenziazione basata sulla quantità e sulla struttura della cromatina, mentre la colorazione PI delle cellule non permeabilizzate si separa dal vivo dalle cellule morte. Quindi, dopo aver filtrato i detriti di cellule e gli aggregati multicellulari, la porta PI seleziona le cellule con membrane intatte (PI negative, Figura 1 ). Le cellule vive vengono quindi analizzate sulla base della fluorescenza di Hoechst: l'azzurro è proporzionale al contenuto del DNA e aumenta il rossoLa fluorescenza riflette meno cromatina condensata e variazioni strutturali. Come tale, le cellule germinali maschili di diverse fasi dovrebbero essere cluster in regioni specifiche di citogrammi che tracciano la funzione della fluorescenza blu / rossa Hoechst ( Figura 3A ).
Infatti, i diagrammi Ho-FACS generati per le diverse specie mostrano la presenza di popolazioni cellulari distinte basate sulla fluorescenza di Hoechst ( Figura 3B -3C ). Anche se queste trame sono sufficienti per discriminare le popolazioni di cellule germinali, è possibile definire una porta del contenuto di DNA (C) 2 per limitare la contaminazione incrociata. Questa porta è generata da un istogramma di conteggio delle cellule in funzione dell'intensità di fluorescenza blu di Hoechst. Per tutte le specie si possono rilevare tre picchi e rappresentare le cellule con 1C, 2C e 4C ( Figura 1 e Figura 2-5 supplementari ). In particolare, come previstoMenzionato in precedenza, la spermatogonia è una popolazione laterale e non può essere affidata in modo affidabile in base agli istogrammi del contenuto del DNA. Quindi questa popolazione è gated dopo l'esclusione di cellule morte, basate su diagrammi di fluorescenza blu / rosso di Hoechst ( Figura 1 ). Questa strategia è rappresentata nella Figura 1 per il ratto e nelle figure 2-5 supplementari per le restanti specie. È importante notare che poiché la fluorescenza di Hoechst da solo può discriminare i differenti tipi di cellule germinali, sia i cancelli di PI e DNA sono facoltativi. Sono stati inclusi in questa strategia per selezionare le cellule vive e ridurre rispettivamente la contaminazione incrociata. Come riassunto nella tabella 1 , la quantificazione delle cellule nel cancello del contenuto del DNA riflette la proporzione relativa delle cellule in differenti fasi della spermatogenesi. Come previsto, le cellule 1C sono le più abbondanti e rappresentano le popolazioni spermatiche, seguite da cellule 2C (SPC II) e cellule 4C (SPC I). ImportaNello stesso modo questo modello è conservato attraverso specie e le piccole differenze possono riflettere la variabilità interspecifica nelle cellule germinali e nei cicli dell'epitelio seminiferico 21 .
Dopo Ho-FACS, l'integrità cellulare può essere valutata utilizzando la colorazione Trypan blu. La percentuale di cellule vive dopo 1 h di FACS variava dal 27% (SCP I) al 67% (SPD) per il topo, indicando che la durata di ordinamento e l'esposizione a Hoechst aumenta la morte cellulare. Per gli utenti che desiderano coltivare le cellule ordinate, la concentrazione di Hoechst e la durata di Ho-FACS dovrebbero essere regolati per migliorare la sopravvivenza cellulare. Tuttavia, i dati di sequenza RNA sono stati generati per le singole cellule isolate usando questo metodo (Jung et al ., Inedito), indicando che queste cellule sono adatte a studi molecolari della biologia delle cellule germinali. Questo set di dati è stato utilizzato per rilevare la potenziale contaminazione delle popolazioni di cellule germinali con cellule somatiche ( Figura 6 supplementare
Valutazione morfologica delle popolazioni di cellule germinali ordinate
Poiché le cellule germinali subiscono drastici cambiamenti morfologici durante la spermatogenesi, è possibile stimare la purezza delle popolazioni isolate mediante microscopia. Come riferimento, la figura 4 illustra la morfologia generale di diversi tipi di cellule germinali maschili da 4 specie di mammiferi (da Lima, et al., 5 ). La distribuzione e la condensazione della cromatina, così come la dimensione e la forma delle cellule, mostrano modelli unici e ben caratterizzati in diversi tipi di cellule. SPG hanno eterocromatina pericentrica distinta, che si macchia brillantemente per Hoechst e sono piccole e rotonde (Spg nella figura 4B ). Spermatociti sono cellule granulari più grandi. I nuclei di SPC sono facilmente identificabili, con variazione di cromatinaNs caratteristica delle cellule meiotiche (Spc I nella Figura 4B ), mentre SPC II sono binucleate o in diakinesi (Spc II in Figura 4B ). Infine, SPD sono piccole cellule haploide con forma rotonda o allungata (Spd in Figura 4B ). In particolare, il rSPD è simile a SPG in dimensioni e forma, ma chiaramente distinto dalla presenza di cromocentri localizzati. Sulla base di queste caratteristiche, le popolazioni di cellule ordinate sono state valutate per l'arricchimento di specifici tipi di cellule ( Tabella 1 ). Le popolazioni SPD e SPC II sono state fortemente arricchite per il tipo di interesse cellulare, mentre SPC I e SPG hanno mostrato un certo grado di contaminazione con altri tipi di cellule, in particolare per i campioni di Guinea Pig e Mini Pig. È interessante notare che per la campione del cane la strategia di gating era sufficiente a discriminare intorno all'elongare gli spermatidi ( Figura 3C ; Figura 3 complementare ; Tabella 1
Figura 1: Flusso di lavoro di isolamento Ho-FACS di cellule germinali maschili di mammiferi. Questa immagine illustra il protocollo generale per l'isolamento delle cellule germinali delle cellule germinali dei mammiferi, con dati rappresentativi dell'applicazione di questo protocollo a testicoli ratti. Ho: Hoechst. Da Lima, et al. 5 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sospensioni singole cellule generate dalla dissociazione meccanica di Tessuto testicolo del topo. I campioni ottenuti da tessuti freschi ( AB ) mostrano una varietà di tipi di cellule germinali intatte e pochissimi detriti. Se confrontato con le cellule non colorate ( A ), è stato osservato un clumping di cellule per le sospensioni di cellule colorate Hoechst ( B ), che può essere ridotta aggiungendo DNase (concentrazione finale di 10 μg / mL) al campione immediatamente dopo la dissociazione ( D ). Il tessuto testicolare congelato può anche essere usato per ottenere sospensioni singole cellule per dissociazione meccanica ( C ). Tuttavia, sembra che il processo di congelamento e scongelamento flash prima della dissociazione dei tessuti provoca più detriti, morte cellulare e generalmente meno celle cellulari. Dopo la dissociazione (vedi Protocollo), i campioni sono stati filati per 10 minuti a 4 ° C e ri-sospesi in 1x DMEM prima di montare le diapositive. Barre nere = 50 μm. Immagini ottenute utilizzando un microscopio a luce bianca in verticale dotato di una lampada UV.Ove / files / ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ho-FACS di cellule germinali di mammiferi. Popolazioni specifiche presentano modelli univoche di Fluorescenza Hoechst durante la FACS ( A ). Poichè la fluorescenza blu di Hoechst riflette le variazioni nei cluster di cromatina di haploide ( C ); Le cellule diploide (2C) e tetraploide (4C) si trovano nelle aree della trama FACS con una crescente fluorescenza blu di Hoechst. I diagrammi generati in funzione della fluorescenza blu / rossa Hoechst mostrano grappoli di popolazioni cellulari distinte per le diverse specie mammiferi testate ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: spermatociti primari; Pre-Lep: spermatociti pre-leptotenici; Lep: spermatociti di Leptotene; Dip: spermatociti del diplotene; SPCII: spermatociti secondari; SPD: spermatidi; ESPD: allungamento degli spermatidi; RSPD: spermatidi rotondi. Adattato da Lima, et al. 5 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Morfologia delle cellule germinali in differenti fasi di sviluppo da quattro specie di mammiferi. Questa figura mostra le sezioni del tessuto testicolo macchiato con Hoechst (A) e l'aspetto generale di diversi tipi di cellule di germe maschili ordinati da Ho-FACS (B) da ratto, cavia, cane e mini suino. Poiché la dimensione, la forma e la conformazione della cromatina variano notevolmente durante la spermatogenesi, queste possono essere utilizzate per assegnare le cellule a differenti stadi di differenziazione. Spermatogonia (Spg) sono piccole e rotonde cElls con eterocromatina pericentrica distinta e presentano un'elevata intensità di fluorescenza di Hoechst. Spermatociti sono le più grandi cellule germinali e mostrano conformazioni variabili di cromatina. I nuclei degli spermatociti primari (Spc I) presentano variazioni di cromatina caratterizzate da cellule meiotiche, mentre gli spermatociti secondari (Spc II) sono binucleati o in diakinesi. Spermatidi (Spd) hanno forma rotonda o allungata, a seconda dello stadio della spermogenesi e sono piccole cellule aposloide. Sebbene spermatidi e spermatogoni rotondi siano simili in termini di dimensioni e forma, il primo può essere distinto dalla presenza di cromocentri localizzati. Le diapositive sono state preparate per ciascun tipo di cellule ordinate dopo Ho-FACS e sono state visualizzate in un microscopio confocale: lente di ingrandimento 63X, con (pannello inferiore) o senza (pannello superiore) trasmissione della luce bianca. Da Lima, et al. 5 con il permesso. per favoreClicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| % Di cellule nel cancello del contenuto del DNA | Purezza delle popolazioni di cellule germinali ordinate (%) | |||||||||||
| Specie | Singlette% | % Celle vive | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | rSpd | ESPD | |
| Topo | 98.4 | 92.5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| Ratto | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Porcellino d'India | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Cane | 97,9 | 86.5 | 16,4 | 3 | 0.5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Pig | 95,9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Ottenuto per dissociazione enzimatica e gatedBasata su parametri FSC e SSC (da Lima et al. 2016, con permesso) | ||||||||||||
Tabella 1: Statistiche di Ho-FACS delle sospensioni delle cellule germinali maschili ottenute per dissociazione meccanica.
Supplementare Figura 1: Sospensioni singole cellule ottenute per dissociazione meccanica dei tessuti testicolari congelati. La dissociazione meccanica consente la generazione di sospensioni singole di tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi senza la necessità di protocolli specifici per specie. Parecchi pannelli mostrano le sospensioni cellulari ottenute per 4 specie di mammiferi. I campioni sono stati ottenuti per dissociazione meccanica del tessuto testicolare congelato e macchiati con Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Spermatociti primari; SPC II: Spermatociti secondari; SPD: Spermatide; SPZ: Spermatozoi. Le diapositive sono state visualizzate in una confoca L microscopio con (pannello inferiore) o senza (pannello superiore) trasmissione della luce bianca. Barre di scala = 20 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare Figura 2: Strategia di gating per la separazione di cellule germinali maschili vive da Ho-FACS di sospensioni singole cellule testicole del topo. Le cellule vive (PI negative) sono ordinate secondo la fluorescenza di Hoechst. Spermatogonia (SPG) sono identificati tracciando direttamente intensità Hoechst-blu e rosso fluorescenti. Una porta di contenuto del DNA viene utilizzata per ordinare le cellule basate sulla fluorescenza blu di Hoechst: haploide (C); Diploidi (2C) e tetraploidi (4C). Le cellule in ogni picco dell'istogramma vengono quindi ordinate plottando la funzione della fluorescenza blu e rossa di Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPD: spermatidi; SPC II: spermatociti secondari; SPC I: spermatociti primari.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Fare clic qui per scaricare questo file.
Supplementare Figura 3: Strategia di gating per la separazione di cellule germinali di tipo vivo da Ho-FACS di sospensioni singole cellule testicole. Le cellule vive (PI negative) sono ordinate secondo la fluorescenza di Hoechst. Spermatogonia (SPG) sono identificati tracciando direttamente intensità Hoechst-blu e rosso fluorescenti. Una porta di contenuto del DNA viene utilizzata per ordinare le cellule basate sulla fluorescenza blu di Hoechst: haploide (C); Diploidi (2C) e tetraploidi (4C). Le cellule in ogni picco dell'istogramma vengono quindi ordinate plottando la funzione della fluorescenza blu e rossa di Hoechst. Il picco contenente le cellule haploide può essere suddiviso in base alla gamma dell'intensità blu di Hoechst e rappresenta due sottopopolazioni di spermatidi: allungamento degli spermatidi (porta C ') e spermatidi rotondi (cancello C' '). SPG: Spermatogonia; ESPD: allungamento degli spermatidi; RSPD: spermatidi rotondi; SPC II:Spermatociti secondari; SPC I: spermatociti primari. Clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare Figura 4: Strategia di gating per la separazione di cellule germinali maschili vive da Ho-FACS di sospensioni singole cellule testicole. Le cellule vive (PI negative) sono ordinate secondo la fluorescenza di Hoechst. Spermatogonia (SPG) sono identificati tracciando direttamente intensità Hoechst-blu e rosso fluorescenti. Una porta di contenuto del DNA viene utilizzata per ordinare le cellule basate sulla fluorescenza blu di Hoechst: haploide (C); Diploidi (2C) e tetraploidi (4C). Le cellule in ogni picco dell'istogramma vengono quindi ordinate plottando la funzione della fluorescenza blu e rossa di Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPD: spermatidi; SPC II: spermatociti secondari; SPC I: spermatociti primari. Fare clic qui per fareWnload questo file.
Supplementare Figura 5: Strategia di cancellazione per la separazione di cellule germinali di tipo vivo da Ho-FACS di mini sospensioni testicolari singole di maiale. Le cellule vive (PI negative) sono ordinate secondo la fluorescenza di Hoechst. Spermatogonia (SPG) sono identificati tracciando direttamente intensità Hoechst-blu e rosso fluorescenti. Una porta di contenuto del DNA viene utilizzata per ordinare le cellule basate sulla fluorescenza blu di Hoechst: haploide (C); Diploidi (2C) e tetraploidi (4C). Le cellule in ogni picco dell'istogramma vengono quindi ordinate plottando la funzione della fluorescenza blu e rossa di Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPD: spermatidi; SPC II: spermatociti secondari; SPC I: spermatociti primari. Clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare Figura 6: Esame della contaminazione delle cellule somaticheIone nelle popolazioni ordinate Ho-FACS. T-SNE) di circa 600 transcriptomi a singolo cella da tre porte di sottopopolazione FACS (AB). Nella trama t-SNE, ogni punto rappresenta la posizione univoca di una singola cella in uno spazio transcriptome e ogni cella è etichettata con la sua origine della porta di sottopopolazione FACS (A). Quantificazione visiva di marker specifici di tipo cellulare sulla trama t-SNE a cellule FACS (B). La contaminazione da cellule somatiche è stimata a meno del 5% e non è specifica per una porta di popolazione Ho-FACS. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Considerando le dinamiche cromatografiche altamente conservate durante la spermatogenesi nei mammiferi, l'obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo per isolare le cellule germinali maschili in differenti stadi di differenziazione dai diversi tessuti testicolari dei mammiferi ( Figura 1 ). Uno degli ostacoli principali nell'applicazione di un unico flusso di lavoro a modelli animali diversi è la necessità di adeguamenti specifici delle specie, in particolare per quanto riguarda i protocolli di dissociazione dei tessuti. I metodi attuali si basano principalmente sulla digestione dei tessuti enzimatici e i protocolli spesso variano anche all'interno delle specie 12 . Per ovviare a questo problema, il protocollo qui descritto mostra l'applicazione della dissociazione meccanica dei tessuti per ottenere sospensioni singole di cellule da campioni testicolari di diverse specie di mammiferi. I risultati indicano che la dissociazione meccanica del tessuto testicolare fresco con questo sistema si comporta bene ( Figura 2A -2B 20 . Importante, la colorazione di Hoechst non sembra influenzare in modo significativo la qualità delle sospensioni singole cellule. Sebbene sia più visibile il clumping di cellule nei campioni macchiati ( Figura 2B ), il trattamento con DNase ( Figura 2D ) o NDA 20 può aiutare a prevenire questo problema. I rapporti precedenti suggeriscono che la dissociazione meccanica del tessuto testicolo è migliore o efficace come la digestione del tessuto enzimatico 5 , 20 . In accordo, i dati qui presentati indicano che la dissociazione meccanica è un metodo affidabile per ottenere sospensioni di cellule singole dal tessuto testicolo per l'elaborazione di Ho-FACS.
L'incubazione con Hoechst è un passo cruciale in quanto influenza il segnale rilevato durante la citometria a flusso. I lunghi periodi di colorazione forniscono una migliore discriminazione dei tipi di cellule germinali, maPuò essere tossico, con conseguente morte cellulare e cambiamenti nella programmazione intracellulare 22 . Gli utenti che intendono creare colture di cellule germinali con questo metodo dovrebbero valutare l'effetto genotossico di un'esposizione a lungo termine a Hoechst 3 , 22 e determinare l'adeguata concentrazione e il tempo di colorazione. Qui, 30 min di colorazione era sufficiente a fornire una separazione affidabile delle popolazioni di cellule germinali ( Figura 3B -3C ). La durata della colorazione può essere potenzialmente ridotta a 10 min, come mostrato da Rodriguez-Casuriaga, et al. 20 e dovrebbe essere ulteriormente valutato dagli utenti per le specie di interesse.
Come ipotizzato, quattro gruppi di cellule germinali possono essere rilevate coerentemente - SPG, SPC I, SPC II e SPD - basate sulle variazioni di cromatina di cellule germinali provenienti dalle diverse specie esaminate ( Figura 3B -3C (Tabella 1), e supportano la strategia di gating adottata in questo flusso di lavoro (figura 1) per le diverse specie di mammiferi (figure complementari 2- 5 ). È tuttavia opportuno che gli utenti ottimizzino il gating in base alle specie e alle popolazioni di interesse per ridurre la contaminazione incrociata rilevata per alcune delle popolazioni (Tabella 1). Ciò può essere ottenuto da lunghi periodi di incubazione durante la colorazione18 , riduzione della portata 2 e dimensioni ridotte della porta. SPG sono più difficili da isolare in quanto sono il tipo di cellule più rari nel testicolo e anche a causa dell'efflusso di tintura nel tempo 1 , 15 . Anche se è possibile individuare distinte popolazioni SPG da Ho-FACS, come mostrato qui, studi che mirano esclusivamente alla biologia delle cellule staminali avrebbero beneficiato di una tecnica più rigorosa come la selezione delle cellule magnetiche attivate (MACS; 23 ). In particolare, le sottopopolazioni di SPD (eSPD e rSPD) potrebbero essere chiaramente distinte per il cane, ma non per altre specie ( Figura 3C e Figura 3 supplementare). Potenzialmente, queste sottopopolazioni possono essere risolte regolando le impostazioni di gating, come descritto dagli autori per il mouse 5 . Citogrammi generati per le dimensioni e la granularità delle cellule (FSC VS SSC), prima di plottare la funzione di Hoechst blue / red fluoresceNce, discriminano elonganti (bassi FSC + SSC), dalle subpopulazioni spermatiche rotonde (elevate FSC + SSC). La separazione delle sottopopolazioni spermatiche rotonde e allungate permetterebbe un'indagine più approfondita della spermogenesi, portando nuove intuizioni in eventi molecolari specifici che si verificano durante la differenziazione spermatica. Inoltre, come descritto per il mouse 1 , 2 , 12 , è possibile ottenere un'ulteriore risoluzione di fasi meiotiche, regolando le porte FACS. Tale approccio favorirebbe in gran parte studi comparativi sugli eventi meiotici. Sebbene l'integrità delle cellule sia disturbata durante Ho-FACS, i dati di sequenza RNA singoli ottenuti per le cellule ordinate con questo metodo (Jung et al. , Inedito , Figura 6 supplementare ) indica che si tratta di un approccio affidabile per ottenere le cellule per studi molecolari di cellule germinali biologia. Tuttavia, gli utenti che intendono eseguire test riproduttivi, come ad esempio rIniezione spermatida OUND (ROSI), utilizzando le cellule isolate da Ho-FACS, deve valutare la vitalità delle cellule ordinate e potrebbe voler esplorare metodi alternativi 24 , 25 .
In sintesi, questo lavoro descrive un metodo standardizzato per isolare le cellule germinali testicolari da mammiferi differenti, costruendo ed aggiungendo raffinamenti sulle tecniche precedentemente stabilite 2 , 12 , 20 . Tale standardizzazione consente l'utilizzo di una serie di reagenti e di un singolo flusso di lavoro su diverse specie di mammiferi, facilitando la generazione di dati per studi comparativi sulla biologia delle cellule germinali. Inoltre, la dissociazione meccanica dei tessuti supera l'ostacolo di regolazioni specifiche delle specie che possono introdurre variabilità metodologica che è quasi impossibile da spiegare. Inoltre, il tempo ridotto di esecuzione e la manipolazione restringono le perturbazioni del sistema ex vivoFisiologia laringa al minimo. A questo proposito, Ho-FACS è significativamente più veloce rispetto ad altri metodi di isolamento delle cellule germinali, come STA-PUT e elutriation 6 , 7 . Inoltre, la separazione simultanea di 4 popolazioni germinali nello stesso esperimento è possibile solo dalla FACS. Dato le proprietà del colorante Hoechst, la struttura delle cellule e le specie di RNA sono conservate e quindi le cellule possono essere utilizzate per ulteriori studi molecolari a valle. Importante, dal momento che Ho-FACS si basa sugli attributi di cromatina per discriminare i tipi di cellule germinali, la buona esecuzione di questo flusso di lavoro in 5 diverse specie sostiene fortemente la sua applicazione ad altri mammiferi. I risultati qui presentati suggeriscono che la spermatogenesi potrebbe essere un processo unico di differenziazione cellulare che potrebbe essere affrontato in molte specie di mammiferi utilizzando un unico protocollo. Come tale, nell'era delle "omiche" e sistemi biologiche, questa tecnologia fornisce i mezzi per un'applicazione evolutivaRoach sulle questioni della biologia delle cellule germinali maschili, compresi studi sull'epigenetica, sulla regolazione e sulla diversità proteica durante la spermatogenesi.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) per i testicoli del cane; Jason Arand e il laboratorio del Dott. Ted Cicero presso l'Università di Washington di St. Louis (WashU) per aver fornito i test di ratto e Brianne Tabers per assistere alla raccolta; Jared Hartsock e il laboratorio del Dr. Salt al WashU per i testicoli della cavia; E il Dott. Michael Talcott presso la Divisione di Medicina Comparativa a WashU per il testicolo di maiale in miniatura. Gli autori riconoscono inoltre il Centro di Cancer di Alvin J. Siteman presso la Scuola di Medicina di Washington e l'Ospedale Ebreo di Barnes a St. Louis, MO, per l'utilizzo del Siteman Flow Cytometry Core, che ha fornito un servizio di selezione delle cellule gestite dal personale. Il Centro Cancer Siteman è supportato in parte da NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di dottorato FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], sovvenzioni degli istituti nazionali di salute degli Stati Uniti [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e un contratto di ricerca FCT [IF / 01262/2014 a AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
