Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55913
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

Abstract

פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) כבר אחת השיטות של בחירה לבודד אוכלוסיות מועשר של תאים נבטיים יונקים נבט. נכון לעכשיו, זה מאפשר את ההפליה של עד 9 אוכלוסיות Murine תא נבט עם תשואה גבוהה וטוהר. זה ברזולוציה גבוהה של אפליה וטיהור אפשרי בשל שינויים ייחודיים במבנה הכרומטין וכמות לאורך spermatogenesis. דפוסים אלה יכולים להיות שנתפסו על ידי cytometry הזרימה של תאים נבט גבריים מוכתמים פלואורסצנטי DNA מחייב צבעים כגון Hoechst-33342 (Hoechst). הנה תיאור מפורט של פרוטוקול שפותחה לאחרונה לבודד תאים נבטיות יונקים יונקים. בקצרה, השעיות תא בודד נוצרים רקמות האשכים על ידי דיסוציאציה מכנית, מוכתם פעמיים עם Hoechst ו propidium יודיד (PI) ומעובד על ידי cytometry הזרימה. אסטרטגיה gating טורי, כולל הבחירה של תאים חיים (PI שלילי) עם תוכן DNA שונים (עוצמת Hoechst), אניS בשימוש FACS מיון כדי להפלות עד 5 סוגי תאים נבט. אלה כוללים, עם ממוצע purities (נקבע על ידי הערכת מיקרוסקופיה): spermatogonia (66%), העיקרי (71%) ו משני (85%) spermatocytes, ו spermatids (90%), עוד מופרדים לתוך עגול (93%) ו הארכת (87%) subpopulations. ביצוע העבודה כולה הוא פשוט, מאפשר בידוד של 4 סוגי תאים בו זמנית עם מכונת FACS המתאים, והוא יכול להתבצע תוך פחות מ 2 שעות. כמו זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמר את הפיזיולוגיה של תאים vivo לשעבר , שיטה זו אידיאלית עבור מחקרים במורד הזרם גבוהה של ביולוגיה תא נבט הגברי. יתר על כן, פרוטוקול סטנדרטי עבור טיהור multispecies של תאים נבט יונקים מבטלת מקורות מתודולוגיים של משתנים ומאפשר קבוצה אחת של ריאגנטים לשמש מודלים בעלי חיים שונים.

Introduction

בהינתן היעדר של מערכת חוץ גופית נציג של התקדמות spermatogenesis, ואת הנוכחות של הטרוגניות הסלולר גדול testis, מחקרים של ביולוגיה תא נבט זכר דורשים טכניקות חזקות לבודד אוכלוסיות מועשר של סוגי תאים ספציפיים. פלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב למטרה זו 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , כפי שהוא מספק תשואה גבוהה טוהר, עולה על שיטות בידוד אחרים במספר סוגי נבט תאים כי הוא יכול לזהות ו בחר 6 , 7 , 8 . העיקרון של ניתוח זרימת cytometry מבוסס על זיהוי של דפוסי אור דיפרנציאלי בעקבות עירור קרן לייזר של תאים בודדים. כמו תא עובר דרך הלייזר הוא משקף / מפזר אורבכל זווית, פרופורציונלית לגודל התא (פיזור קדימה, FSC) ולמורכבות תאיים (פיזור צד, SSC). ראה Ormerod 9 לקבלת מידע מפורט על cytometry הזרימה.

תאי נבט זכריים עוברים שינויים ספציפיים בתכולת הדנ"א, מבנה הכרומטין, גודלו וצורתו לאורך שלבים שונים של הזרע. לפיכך, אוכלוסיות תאים שונים ניתן לזהות ולהפריד על ידי שילוב של פיזור אור מכתים דנ"א עם צבעי ניאון 10 , 11 . מספר צבעים יכולים לשמש למטרה זו (נסקרת ב Geisinger ו רודריגז-Casuriaga 3 ), כגון Hoechst-33342 (Hoechst) אשר שימש לעתים קרובות בניתוח cytometry זרימה של תאים האשכים בעשור האחרון 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . אפוN עירור עם אור UV, Hoechst פולט כחול פלואורסצנטי יחסי לתוכן ה- DNA הסלולר בעוד הקרינה אדום רחוק משקף השתנות במבנה הכרומטין דחיסה 1 , 13 , 14 . כתוצאה מכך, תאים נבט זכר בשלבים שונים של בידול התערוכה דפוסים ספציפיים במהלך FACS של השערות תא בודד מוכתם Hoechst (Ho-FACS, 1 , 12 ). מעניין, בשל מנגנון של זרימת צבע כי הוא פעיל רק בשלב spermatogonial, עוצמת הקרינה הכחולה Hoechst אינו פרופורציונלי לתוכן הכרומטין בתאים אלה, והם אשכול כאוכלוסיית צד במהלך Ho-FACS 15 . בנוסף, שילוב מכתים Hoechst עם יומין propidium יופיים לצבוע (PI) מאפשר למשתמשים להפלות לחיות (PI שלילי) מתאים (PI חיובי) תאים במהלך FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . אסטרטגיה זו שימשה בעבר בניתוח זרימת cytometric של תאים נבטיקולריים ו אופטימיזציה באופן נרחב העכבר להפלות עד 9 סוגי תאים נבט, כולל תאים 4 שלבים שונים של המיוזה אני 1 , 2 , 4 , 16 . לצורך עבודה זו, מכתים Hoechst יש שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, Ho-FACS יושמה בהצלחה על בידוד של תאים נבט זכר במודל העכבר 1 , 2 , 12 , ומכרסמים אחרים כגון חולדה ו חזיר 17 , 18 , 19 . שנית, Hoechst הוא צבע תא חדיר ואינו דורש permeabilization הממברנה, ולכן זה preserשלמות תאים Ves. לבסוף, אין צורך בטיפול ב- RNase מאחר שה- Hoechst נקשר באופן מועדף לרצפי DNA של פולי (d [AT]) 1 , 20 , מה שאומר ש- RNA נשמר, ובנוסף לדנ"א ולחלבונים, ניתן להשתמש בו למחקרים מולקולריים נוספים של הנבט התא הבידול.

למרות הדמיון ב- DNA ו / או stainability שנצפו בזרם cytometry ניתוח של מינים יונקים (הנסקרת ב Geisinger ו רודריגז, Casuriaga 3 ), יש כבר מידה רבה של השתנות בפרוטוקולים המתוארים בידוד תא נבט הגברי על ידי cytometry הזרימה. מחקרים שונים השתמשו בפרוטוקולים ספציפיים עבור דיסוציאציה של רקמות, והשתמשו בצבעים שונים של די-אן-אי (לבד או בשילוב) ו- FACS באסטרטגיות מודל שונות, בעיקר עכבר, חולדה וחזירי ים. לפיכך, השוואה ישירה של נתונים שנאספו עבור מינים שונים יכול להיות מושפע על ידי אוקומרכיבים טכניים שלא נוצרו כתוצאה משינויים בין מתודולוגיות. חשוב לציין, שימור מרשים של הדינמיקה הכרומטין לאורך spermatogenesis יונקים (2N-4N-2N-1N) עולה כי פרוטוקול סטנדרטי יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מינים יונקים.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח זרימת עבודה אחת כי הוא ישים מינים של יונקים שונים, על ידי שילוב והתאמה טכניקות שפורסמו בעבר 2, 20. סטנדרטיזציה של שיטה לעיבוד רקמות הושגה על ידי ביצוע דיסוציאציה מכנית כדי להתגבר על הצורך מינים ספציפיים התאמות הדרושות לעיכול אנזימטי 5 . ראוי לציין כי ניתוק מכני של רקמת האשכים המכרסמים הוכח לבצע טוב יותר מאשר עיכול רקמות אנזימטיות 20 ו הו FACS של השעיות תא בודד שנוצר על ידי שתי השיטות התערוכהזה תוצאות דומות 5 . כהוכחה עקרונית, פרוטוקול זה מתאר את ההגדרות המשמשים לבודד עד 5 אוכלוסיות תאים נבט: spermatogonia (SPG); ראשוני (SPC I) ו spermatocytes משני (SPC II), ו spermatids (SPD) - סיבוב (rSPD) ו מאריך (eSPD). חשוב לציין, קל ליישם במעבדה, עם הדרישות העיקריות להיות מערכת לרקמות דיסוציאציה וגישה סדרן התא מצויד לייזר UV. זרימת עבודה זו ( איור 1 ) הוא מהיר ופשוט ומאפשר בידוד סימולטני של 4 אוכלוסיות תאים נבט מרקמת האשכים טריים פחות מ 2 שעות. זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמור על שלמות הסלולר עבור נהלים נוספים במורד הזרם. יתר על כן, הביצועים המוצלחים שלה ב -5 מינים שונים מעידים על כך שניתן להחיל אותה באופן רחב בתוך הצלב היונקי, מה שהופך אותו לשיטה האידיאלית לבודד תאי נבט עבור מחקרים השוואתיים של ביו הרבייה של הרבייה הגבריתאוגי.

פרוטוקול זה מורכב משלושה חלקים עיקריים, מלבד שלבי הכנה: (1) ניתוק מכני של רקמת האשכים ו (2) מכתים של תאים באשכים עם Hoechst ו PI, ואחריו (3) FACS מיון של תאים רלוונטיים spermatogenic. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה מועשר של תאים שונים נבטיות יונקים תאים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים. פרוטוקול זה מתאר "גודל אחד מתאים לכל" שיטת דיסוציאציה לטהר תאים נבט זכר מינים יונקים שונים. בהתאם לסוג המשתמשים במחקר רוצה לנהל עם תאים נבט מבודד, מדיה אחרים או מאגרים ניתן להשתמש. השלבים הבאים פרוטוקול הם להפקת מתלים תא בודד מ testis Murine שלם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים המתוארים להלן עמדו בתקנות הוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.

1. ההכנות פרוטוקול דיסוציאציה מכנית

  1. טרום רטוב 50 מיקרומטר רקמות חד פעמיות המחסנית דיסוציאציה של testis Murine שלם.
    הערה: זה מחסנית חד פעמית מחסנית מכיל microblades המיועד חיתוך של רקמות רשת פלדה נייחים עם כ 100 חורים משושה. בגדלים שונים של רשת עבור מחסנית חלוקת רקמות זמינים להתאים את הפרוטוקול הזה מבוסס על מינים סוגי התא הרצוי. 50 מיקרומטר מחסניות שימשו עבור כל מינים יונקים המוזכרים במאמר זה.
    1. טען 1 מ"ל של פנול קר קרח אדום חינם 1x Dulbecco השתנה בינוני הנשר (DMEM) על 50 מיקרומטר רקמות חד פעמי מחסנית דיו.
      הערה: פנול אדום עלול להפריע לזיהוי של פלואורס אדוםCANC במהלך FACS.
    2. לשאוב 1x DMEM מן המחסנית רקמה מחסנית עם מזרק חד פעמיות 3 מ"ל מחט פחות מן הנמל מזרק.
  2. הפעל מערכת הפרדת רקמות על ידי לחיצה על כפתור "ON". מערכת זו אינה דורשת "להתחמם" זמן.
  3. טרום רטוב שלושה 40 מיקרומטר מסננים חד פעמיות עם DMEM קר 1x DMEM. מניחים כל 40 מיקרומטר מסנן חד פעמיות על צינור חרוטי 50 מ"ל. פיפטה 1 מ"ל של 1x DMEM ולאפשר לעבור דרך הנוזל.
  4. הכינו 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי לאוסף של רקמות האשכים. פיפטה 500 μL של DMEM 1x על צלחת פטרי.

2. הכנת רקמות האשכים עבור פרוטוקול דיסוציאציה מכנית

  1. לנתח עכבר זכר להסיר בקפידה כל האשכים טריים או שברי האשכים (אם להתמודד עם מינים יונקים אחרים) עם מספריים כירורגי ומלקחיים.
    הערה: ודא רקמות ללא שומן ונמק. 22 Esh רקמות אשכים לייצר מעולה ההשעיה תא בודד איכות מאשר רקמות קפוא.
    1. העברת שנאספו אשכים / שברי מוכן 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי המכיל 500 μL של DMEM 1x.
    2. בעדינות לשטוף את הרקמה 1x DMEM להסיר תאי דם אדומים (אם קיים).
  2. בזהירות להסיר tunica albuginea. עובי הטוניקה אלבוגינה ישתנה במינים שונים.
    1. לתפוס קצה אחד של testis עם מלקחיים.
    2. לנקב את הקצה השני של testis עם אזמל בעוד עדיין מחזיק את קצה אחד של testis עם מלקחיים משלב הקודם.
    3. לגרד tubules אשכים באמצעות אזמל בעוד עדיין מחזיק את קצה אחד של testis עם מלקחיים משלב 2.2.1.
  3. חותכים tubules האשכים לחתיכות של ~ 2-3 מ"מ 3 באמצעות אזמל.

3. קבלת השעיות תא בודד על ידי דיסוציאציה מכנית של רקמות האשכים

אונטנט "> הערה: שלבי הניתוק המתוארים להלן הם עבור בדיקת עכבר אחת למבוגרים.כרכים של רקמות האשכים של עכברים צעירים או מינים שאינם Murine צריך להיות מותאם בהתאם.בעלי חיים צעירים לא יכול להכיל את כל השלבים של תאים נבט.יש מינים יונקים יש הרכב רקמות האשכים משתנה במהלך עונת הרבייה בהשוואה לעונת ההזדווגות.

  1. מעבירים את חתיכות קטנות אבובית האשכים על 50 מ"מ מראש הרטבה רקמה מחסנית באמצעות מלקחיים ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM 1x.
  2. טען את המחסנית רקמות רקמה מערכת רקמות ההפרדה תהליך 5 דקות על ידי סיבוב הכפתור ממצב המתנה למצב "הפעלה".
  3. הסר את המחסנית רקמה רקמה מן מערכת ההפרדה רקמות ההשעיה תא לשאוף עם מזרק חד פעמיות 3 מ"ל מחט פחות מן הנמל מזרק.
    1. לשאוב כמה פעמים כדי להסיר את כל הנוזל ממחסנית רקמות להפריד. לֹאכל 1 מ"ל עשוי להיות התאושש ממחסנית רקמות ההפרדה.
  4. לעבור את ההשעיה תא aspirated דרך שני חד פעמיות מראש הרטובות 40 מסננים מיקרומטר. מסנן פעמיים כדי להסיר כל אגרגט תאים.
    1. מניחים 1 מראש הרטוב מסנן 40 מיקרומטר בצינור חרוטי 50 מ"ל. להוסיף ישירות תאים aspirated במזרק על מסנן 40 מיקרומטר. פיפטה לעבור תנור יחיד ההשעיה עם פיפטה חד פעמיות.
    2. הסר את המסנן מראש הרטוב 40 מיקרומטר מסנן במקום אחר הרטוב מסנן 40 מיקרומטר בצינור 50 מ"ל חרוטי. פיפטה שנאספו ההשעיה תא בודד על מסנן נקי 40 מיקרומטר.
    3. איסוף ההשעיה מסוננים תא בודד עם פיפטה חד פעמיות נקי.
  5. פיפטה סינון ההשעיה התא בחזרה 50 מיקרומטר רקמה מחסנית התפלגות תהליך עוד 5 דקות במערכת רקמות ההפרדה.
  6. לשחזר את כל הנוזל מן dissgregati רקמותעל המחסנית.

4. מכתים עם Hoechst ו Propidium יודיד (PI)

  1. העברת ההשעיה התא התאושש מן 50 מיקרומטר רקמה מחסנית דיו צינור נקי 1.5 מ"ל. כ 1-1.5 מ"ל של ההשעיה תא בודד יהיה התאושש.
  2. מחלקים את ההשעיה התא התאושש יחיד לתוך ארבעה צינורות 1.5 מ"ל או 5 מ"ל.
    1. במשך שלוש צינורות הראשון, פיפטה 150 μL של ההשעיה תא בודד ושאר פיפטה ההשעיה תא בודד לתוך האחרון של ארבע צינורות (כ 550 μL של ההשעיה תא בודד).
      הערה: כמות ההשעיה תא בודד בצינור האחרון עשוי להשתנות בהתאם ליעילות התאוששות ההשעיה התא בשלב 3.6.
  3. הגדר את הצינור הראשון של ארבע צינורות כמו שליטה unstained עבור הפעלה FACS.
  4. הכן צבע יחיד מוכתם (PI או Hoechst) השעיות תא כמו שולטת. הוסף 2.5 μL של Hoechst או 1 μL של PI לכל צינור (השני thiמחקר ופיתוח).
  5. הכן צינור מוכתם פעמיים. זה ישמש לאיסוף subpopulations תא נבט. הוסף 2.5 μL של Hoechst ו 1 μL של PI לצינור האחרון.
    הערה: Hoechst יש חיי מדף של 2-3 חודשים. שימוש במלאי ישן של צבע יגרום שינויים משמעותיים במהלך הפעלה FACS.
  6. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. מקום דגימות בצינור או לסובב את צינורות 1.5 מ"ל כל 5-10 דקות.
  7. סנן ההשעיה התא עם מסננת מראש הרטוב 40 מיקרומטר ולשמור על פתרון מסונן על הקרח בחושך עד הפגישה FACS.
    הערה: שלב הסינון נחוץ למניעת גושי תאים עבור FACS. בנוסף, טיפול עם DNase (ראה איור 1 ) או 2-Naphthol-6,8-disulfonic חומצה dipotassium מלח (NDA 20 ) ניתן להשתמש כדי להגביל את התא clumping. תקופות המתנה ממושכות ישפיעו על האות ניאון זוהה במהלך FACS ועלול לגרום למוות התא גדל.

    5. פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) התקנה וטיהור של תאים האשכים

    1. הכן FACS איסוף צינורות.
      1. מעיל 5 מ"ל פוליפרופילן צינורות התחתונה התחתונה או צינורות 1.5 מ"ל עם μL 400 של FBS עבור אוסף תאים. עודף עודף FBS לאחר ציפוי.
      2. הוסף FACS איסוף בינוני (1x DMEM + 10% בסרום עוברי בסרום, FBS) כדי צינורות: 1 מ"ל עבור 5 צינורות מ"ל או 100 μL עבור צינורות 1.5 מ"ל.
    2. הגדרת תנאי מיון מתאימים של סדרן תאים ותוכנה.
      הערה: תאים אחרים תא מיון ותוכנות הניתוח ניתן להשתמש עם ההתקנה דומה gating אסטרטגיות שתוארו להלן. התנאים המתוארים כאן הותאמו מ- Gaysinskaya ו- Bortvin 2 , Geisinger ו- Rodriguez-Casuriaga 3 , ו- Getun, et al. 4
      1. טען לייזר אולטרה סגול עם 463/25 nm הלהקה לעבור מסנן לזהות Hoechst כחול 680 ננומטר הלהקה לעבור הלהקה כדי לזהות Hoechst אדום כדי לזהות PI.
      2. השתמש במראה dichroic 555DLP להבחין כחול מן הקרינה האדומה.
      3. השתמש זרבובית 70 מיקרומטר תאים מיון בשיעור של 1000-2000 תאים / השני.
        הערה: יעילות המיון מושפעת ישירות משיעור הזרימה. שיעורי זרימה גבוהים (> 3500 אירועים / ים) מגדילים את מהירות המיון אך גורמים לזיהום אוכלוסיות. למידע נוסף, ראה התייחסות 12 .
    3. הגדר שערים באמצעות דגימות בקרה.
      1. לטעון ולהפעיל מדגם unstained.
      2. לא לכלול פסולת התא מבוסס על FSC לעומת דפוס העלילה SSC. פסולת סלולרית יצוץ ברביע השמאלי התחתון של העלילה. באופן שרירותי להגדיר את סף פסולת התא על ידי המשתמש או טכנאי סדרן התא.
      3. שער על תאים בודדים על ידי התאמת סף רוחב FSC ודופק. תאים שונים cellers יש דרכים שונות כדי distinג 'ינג. כמו רוחב הפולס משקף את התאים הזמן לקחת לחצות את הלייזר, תאים בודדים יש ערכים נמוכים יותר בהשוואה אגרגטים multicellular. התאמת סף על מגרש עבור FSC לעומת רוחב הדופק ניתן להשתמש כדי לבחור עבור singlets.
      4. הגדר אופטימלי צינור מכני (PMT) מתח.
      5. השתמש בשני כתמי צבע מוכתם כתם יחיד כדי לקבוע את סף האות PI או Hoechst הקרינה.
        הערה: חשוב לייעל את המתח הבסיסי PTM עבור התאים של עניין על מנת לקבוע את טווח הקרינה הנכון עבור כל צבע. זה קריטי עבור זיהוי אותות אופטימלי ורגישות. תאי הבקרה הלא מוכתמים והמוכתמים משמשים לבניית מגוון של תאים מוכתמים שלילית וחיובית עם צבעי PI ו / או Hoechst ומזעור הרעש באותות. לקבלת הסברים נוספים על אופטימיזציה של מתח PMT באמצעות תאי בקרה, עיין Gaysinskaya ו Bortvin 2
      6. שער על תא חיS מבוסס על מכתים PI (PI שלילי) ו FSC העלילה. תאים מתים יהיה חיובי עבור פלואורסצנטי PI.
      7. הגדר שער תוכן ה- DNA על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים על בסיס פלואורסצנטי כחול Hoechst. 3 פסגות עם ריכוז הולך וגדל של הקרינה הכחולה Hoechst אמור להופיע, המייצג הפלואידים (1C), דיפלואידי (2C), ו tetraploid (4C) תאים. הגדר 3 שערים, אחד לכל שיא.
      8. שימו לב לפחות 500,000 אירועים על FSC לעומת העלילה SSC לפני שתמשיך gating על אוכלוסיות תאים נבט.
    4. שער שונים אוכלוסיות תאים נבט.
      1. טען Hoechst / PI מדגם מוכתם.
      2. הגדר את 3 שערי האב הראשונים המשותפים לכל האוכלוסיות.
        1. לא לכלול פסולת התא מבוסס על FSC לעומת ה- SSC העלילה. בחר singlets מבוסס על FSC לעומת דופק רוחב העלילה. בחר תאים חיים על ידי gating תאים שליליים PI.
      3. הגדר שער spermatogonia.
      4. חלקות PI תאים שליליים המבוססים על Hoechst כחול ואדום הקרינהעוצמות. Spermatogonia מופיעים כאוכלוסיית צד (ראה איור 1 ).
      5. הגדר שערים עבור אוכלוסיות תאים נבט הנותרים. הערה: ראה איור 1 ואיור משלים 2 לפרטים חזותיים.
      6. מגרש PI תאים שליליים בשער התוכן DNA.
        1. עבור שער spermatids השיא עם פלואורסצנטי Hoechst הנמוך ביותר (1C).
        2. עבור spermatocytes II, השער את השיא עם בינוני הקרינה Hoechst (2C).
        3. עבור spermatocytes אני, השער את השיא עם הקרינה הגבוהה ביותר Hoechst (4C).
      7. מגרש Hoechst כחול ואדום עוצמת הקרינה לחדד spermatocytes ו spermatids אוכלוסיות משערי תוכן ה- DNA.
    5. לאסוף את השערים subpopulation שנבחרו לתוך צינורות איסוף שהוכן בעבר. כל testis ייקח בממוצע 45 דקות עד 1.5 שעות לאסוף כ 0.5-6.0 x 10 6 תאים עבור כל subpopulation.
      הערה: חשיפה ממושכת לתא ל- Hoechst maY מעט לשנות את המיקום של אוכלוסיות עם הזמן. רענן את ההגדרות לאחר 20-30 דקות של FACS. התשואה המקסימלית לכל תת-אוכלוסייה תהיה מותנית ביעילות של שלב ניתוק.

    6. הערכה מיקרוסקופית של תאים מטוהרים

    1. ספין תאים שנאספו ב XG 500-600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. Re- להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של פתרון קר 1x פוספט חיץ (PBS) או 1x DMEM.
      הערה: ניתן לשנות את עוצמת ההשעיה מחדש בהתאם למספר התאים הממוינים ולריכוז הסופי הרצוי.
    3. פיפטה 40 μL של תאים שטפו על גבי שקופית זכוכית נקייה במקום coverslip.
    4. תקן את התאים הנותרים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ו חנות תאים קבועה ב 4 ° C בחושך לעיון בעתיד.
      1. פיפטה 100 μL 4% PFA ישירות צינורות איסוף.
      2. בקצרה מערבולת צינורות או פיפטה כמה פעמים כדי להבטיח היטב ערבוב ההשעיה התא.
    5. דמיינו את שקופיות מוכן במיקרוסקופ מצויד מנורת UV כדי לזהות Hoechst הקרינה תחת המטרה 63X. עיין בסעיף תוצאות - הערכה מורפולוגית של אוכלוסיות תאים נבטיות ממוינות - לפרטים נוספים על אופן זיהוי סוגי תאי נבט ספציפיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תא בודד השעיות מ ניתוק מכני של רקמות האשכים

איור 2 משווה השעיות תא בודד המתקבל על ידי דיסוציאציה מכנית של רקמת האשכים העכבר בתנאים שונים. דוגמאות שהתקבלו על ידי עיבוד רקמות טריות, ללא כתם ( איור 2 א ) או מוכתם Hoechst ( איור 2 ב ), להראות נוכחות של תאים בודדים בשלבים שונים של בידול, וחשוב, המבנה הסלולר נראה להישמר, כולל flagella של זרע. למרות כמה clumping ופסולת נצפתה דגימות מוכתמות, אשר הופחת על ידי הוספת DNase לאחר ניתוק ( איור 2 ), תוצאות אלה מצביעים כי מכתים Hoechst אינו משנה באופן משמעותי את איכות השעיות תא בודד. מעניין, תא בודד לתלותאנסונים ניתן לקבל גם רקמה קפואה של העכבר ( איור 2 ג ) ומינים יונקים אחרים - חולדה, כלב, גיניאה חזיר מיני חזיר ( איור משלים 1 ) על ידי ניתוק מכני. סוגי תאים שונים גלויים וניתנים לזיהוי באותם דגימות; עם זאת, עיבוד של רקמה קפואה נראה להוביל למוות התא הגדילה clumping, ואת התשואה הסלולרית הכוללת הכוללת. ככזה, מומלץ מאוד להכין מתלים תא בודד מ רקמות טריות עבור יישומים נוספים במורד הזרם.

איכות השעיות תא בודד שהוכנו מ רקמת האשכים טריים של עכבר, עכברוש, כלב, חזיר ים וחזיר מיני, הוערך במהלך Ho-FACS ( טבלה 1 ). לאחר הרחקה של פסולת סלולרית, 95.7-98.4% מהתאים הם סינגלים, ומאותם 86.5-93.8% חיים, כפי שמוצג על ידי כימות של תאים שליליים PI (ראה פרוטוקול ). אלה resulTs עולה כי ניתוק מכני היא שיטה אמינה להכין מתלים תא בודד עבור cytometry הזרימה מ רקמת האשכים של מינים שונים יונקים.

Ho-FACS לבודד תאי נבט מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים

לאחר ניתוק מכני, השעיות תא בודד מוכתמים Hoechst ו PI ומעובדים על ידי FACS. כאמור, מכתים Hoechst מאפשר אפליה של תאים בשלבים שונים של בידול מבוסס על כמות הכרומטין והמבנה, ואילו מכתים PI של תאים שאינם permeabilized מפריד לחיות מתים מתים. לפיכך, לאחר סינון פסולת התא אגרגטים multicellular, שער PI בוחר תאים עם ממברנות שלם (PI שלילי, איור 1 ). תאים חיים ניתח לאחר מכן על בסיס הקרינה Hoechst: כחול הוא פרופורציונלי לתוכן ה- DNA והגדלת אדוםפלואורסצנטי משקף פחות כרומטין מרוכז וריאציות מבניות. ככזה, תאים נבט זכר שלבים שונים צפויים אשכול באזורים ספציפיים של cytograms מתכננים את הפונקציה של כחול / אדום Hoechst הקרינה ( איור 3 א ).

ואכן, מגרשים Ho-FACS שנוצר עבור מינים שונים להראות נוכחות של אוכלוסיות תאים שונים על בסיס הקרינה Hoechst ( איור 3B -3C ). למרות מגרשים אלה מספיק כדי להפלות אוכלוסיות תאים נבט, תוכן DNA (ג) השער ניתן להגדיר 2 להגביל זיהום לחצות. שער זה נוצר על ידי היסטוגרמה של ספירת תאים פונקציה של Hoechst כחול עוצמת הקרינה. עבור כל המינים, שלושה פסגות ניתן לזהות לייצג תאים עם 1C, 2C ו 4C ( איור 1 ו דמויות משלימות 2-5 ). יש לציין, כמו previמוזכר לעיל, spermatogonia הם אוכלוסייה בצד ולא ניתן נשלטים אמין מבוסס על היסטוגרמות של תוכן ה- DNA. לפיכך, אוכלוסייה זו הוא מגודרים לאחר הרחקה של תאים מתים, על בסיס Hoechst כחול / אדום פלואורסצנטי מגרשים ( איור 1 ). אסטרטגיה זו מיוצגת בתרשים 1 עבור החולדה ואת דמויות משלימות 2-5 עבור המינים הנותרים. חשוב לציין כי מאז Hoechst פלואורסצנציה לבד יכול להפלות את סוגי תאים שונים הנבט, הן PI ו- DNA תוכן השערים הם אופציונליים. הם נכללו באסטרטגיה זו כדי לבחור תאים חיים ולהפחית זיהום צולבות, בהתאמה. כפי שמוסכם בטבלה 1 , כימות התאים בשער התוכן של הדנ"א משקפת את היחס היחסי בין תאים בשלבים שונים של הזרע. כצפוי, תאים 1C הם השכיחים ביותר המייצגים אוכלוסיות זרע, ואחריו 2C תאים (SPC II) ותאי 4C (SPC I). ייבואNtly, דפוס זה נשמר על פני מינים הבדלים קטנים עשויים לשקף השתנות interspecific בתאי הנבט ואת מחזורים של אפיתל seminiferous 21 .

לאחר Ho-FACS, שלמות התא ניתן להעריך באמצעות מכתים כחול Trypan. חלקם של תאים חיים לאחר 1 שעות של FACS נע בין 27% (SCP I) ל 67% (SPD) עבור העכבר, המעיד על כך משך הזמן של מיון וחשיפה Hoechst מגביר את המוות התא. עבור משתמשים המחפשים לתאי מיון, ריכוז Hoechst ומשך Ho-FACS צריך להיות מותאם כדי לשפר את הישרדות התא. עם זאת, נתונים RNA רצף נוצרה עבור תאים בודדים מבודדים באמצעות שיטה זו (Jung et al ., לא פורסם), המעידים על כך תאים אלה מתאימים למחקרים מולקולריים של ביולוגיה של תא נבט. מערך נתונים זה שימש כדי לזהות זיהום פוטנציאלי של אוכלוסיות תאים נבט עם תאים סומטיים ( איור משלים 6)

הערכה מורפולוגית של אוכלוסיות תאים נבט

כמו תאים נבט לעבור שינויים מורפולוגיים דרסטי לאורך spermatogenesis, ניתן להעריך את הטוהר של אוכלוסיות מבודדות על ידי מיקרוסקופ. כנקודת התייחסות, איור 4 ממחיש את המורפולוגיה הכללית של סוגים שונים של תאים נבט גברי מ 4 מינים יונקים (מ לימה, וכו ' 5 ). התפלגות ועיבוי הכרומטין, כמו גם גודל התא וצורתו, מראים דפוסים ייחודיים ומאופיינים היטב בסוגי תאים שונים. SPG יש heterochromatin pericentric מובהק, אשר כתמים בהירים עבור Hoechst, והם קטנים עגולים בצורת (SPG באיור 4B ). Spermatocytes הם תאים granulated גדול. גרעיני SPC אני מזוהים בקלות, עם וריאציות הכרומטין(SPC I באיור 4B ), בעוד SPC II הם biucleated או diakinesis (Spc II בתרשים 4B ). לבסוף, SPD הם תאים הפלואידים קטנים עם צורה עגולה או מוארכת (SPD באיור 4B ). יש לציין, RSPD דומים SPG בגודל ובצורה, אבל הבחין בבירור על ידי נוכחות של chromocenters מקומי. בהתבסס על מאפיינים אלה, אוכלוסיות תאים ממוינות הוערכו להעשרת סוגי תאים ספציפיים ( טבלה 1 ). אוכלוסיות SPD ו- SPC II הועשרו במידה רבה לסוג התא של ההתעניינות, בעוד ש- SPC I ו- SPG הראו מידה מסוימת של זיהום עם סוגי תאים אחרים, במיוחד עבור דגי החזיר והמיני חזיר. מעניין, עבור הכלב מדגם אסטרטגיית gating היה מספיק כדי להפלות עגול מן spperidsids מאריך ( איור 3 ג , איור משלים 3 , טבלה 1

איור 1
איור 1: זרימת עבודה של בידוד H-FACS של תאים נבט יונקים זכר. תמונה זו ממחישה את הפרוטוקול הכללי לבידוד תא נבט של תאים נבט יונקים, עם נתונים נציג מהיישום של פרוטוקול זה כדי testis חולדה. Ho: Hoechst. מ לימה, et al. 5 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מתלים תא בודד שנוצר על ידי ניתוק מכני של עכבר רקמת האשכים. דוגמאות המתקבלות רקמות טריות ( AB ) להראות מגוון של סוגי תאים נבט שלם ופסולת קטנה מאוד. כאשר לעומת תאים unstained ( A ), כמה clumping התא נצפתה עבור Hoechst השעיות תא מוכתמות ( B ), אשר יכול להיות מופחת על ידי הוספת DNase (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל) למדגם מיד לאחר ניתוק ( D ). רקמת האשכים קפוא יכול לשמש גם כדי להשיג השעיות תא בודד על ידי ניתוק מכני ( C ). עם זאת, נראה כי תהליך הקפאה פלאש והפשרה לפני דיסוציאציה רקמת תוצאות יותר פסולת, מוות התא ואת התשואה הכוללת פחות הסלולר. לאחר ניתוק (ראה פרוטוקול), דגימות היו הסתובב במשך 10 דקות ב 4 ° C ו מושעה מחדש ב 1x DMEM לפני הרכבה שקופיות. ברים שחורים = 50 מיקרומטר. תמונות שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ אור לבן זקוף מצויד מנורת UV.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3: Ho-FACS של תאים נבט יונקים. אוכלוסיות ספציפיות להציג דפוסים ייחודיים של פלואורסצנציה Hoechst במהלך FACS ( A ). כמו פלואורסצנטי כחול Hoechst משקף וריאציות של אשכולות תוכן הכרומטין של הפלואידים ( C ); דיפלואידי (2C) ו tetraploid (4C) תאים ממוקמים באזורים של מזימה FACS עם הגדלת הקרינה הכחולה Hoechst. מגרשים שנוצר כפונקציה של Hoechst כחול / אדום פלואורסצנטי להראות אשכולות של אוכלוסיות תאים שונים עבור מינים שונים יונקים נבדק ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC אני: spermatocytes הראשי; טרום-עקבות: טרום-לפטו-זרעיים; Lep: leperotene spermatocytes; טובלים: דיפרלנים; SPCII: זרעונים משניים; SPD: Spermatids; ESPD: מאריך spermatids; RSPD: sppermatids עגולים. מותאם לימה, et al. 5 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מורפולוגיה של תאים נבט בשלבים התפתחותיים שונים של ארבעה מינים יונקים. נתון זה מראה קטעים של רקמת האשכים מוכתמים Hoechst (A) ואת ההיבט הכללי של סוגים שונים של תאים נבט הגברי מיון על ידי הו FACS (B) מ חולדה, חזיר ים, כלב חזיר מיני. כמו גודל התא, צורה וקונפורמציה הכרומטין משתנה באופן דרמטי לאורך spermatogenesis, אלה יכולים לשמש כדי להקצות תאים בשלבים שונים של בידול. Spermatogonia (Spg) הם קטנים עגולים גElls עם heterochromatin pericentric מובהק להפגין עוצמה גבוהה של הקרינה Hoechst. Spermatocytes הם תאי הנבט הגדול ביותר ולהראות משתנים הכרומטין משתנה. גרעינים של זרעונים ראשוניים (Spc I) מציגים וריאציות הכרומטין האופייניות לתאים מיוטיים, בעוד שספירמוציטים משני (Spc II) הם דו-חמצניים או בדיאקיניזים. Spermatids (Spd) יש צורה עגולה או מוארכת, בהתאם לשלב של spermiogenesis והם תאים הפלואידים קטנים. למרות sppermatids עגול spermatogonia דומים בגודל ובצורה, לשעבר ניתן להבחין על ידי נוכחות של chromocenters מקומי. שקופיות הוכנו עבור כל סוג תא ממוין לאחר Ho-FACS ו היו דמיינו מיקרוסקופ confocal: עדשת הגדלה 63X, עם (הלוח התחתון) או ללא (הלוח העליון) שידור אור לבן. מאת Lima, et al. 5 ברשות. אנאלחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

% תאים בשער תוכן ה- DNA טוהר מיון אוכלוסיות תאים נבט (%)
מִין סינגלים תאים חיים 1C 2 ג 4 ג Spg Spc I Spc II Spd Rspd ESPd
עכבר 98.4 92.5 34.7 3.9 3.72 74 82 87.5 95.2 95 * 92 *
עכברוש 95.7 93.8 37.7 5.3 5.4 83 81 82 87 . .
חֲזִיר יָם 96.2 92.1 39.3 7.6 5.8 48 68.7 85 87 . .
כֶּלֶב 97.9 86.5 16.4 3 0.5 78 . 87 . 91 81
מיני חזיר 95.9 93.2 26.9 6.4 3.5 49 52 82 92 . .
* שהושגו על ידי דיסוציאציה אנזימטית ונשלטיםבהתבסס על פרמטרים FSC & SSC (מ Lima et al 2016, ברשות)

טבלה 1: סטטיסטיקה של Ho-FACS של השערות תא נבט הגברי המתקבל על ידי ניתוק מכני.

איור משלים 1: מתלים תא יחיד המתקבל על ידי ניתוק מכני של רקמת האשכים קפוא. דיסוציאציה מכנית מאפשרת לדור של מתלים תא בודד מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים ללא צורך בפרוטוקולים ספציפיים למין. לוחות שונים מראים את המתלים התא שהתקבלו עבור 4 מינים יונקים. דוגמאות התקבלו על ידי ניתוק מכני של רקמת האשכים קפוא ומוכתמת Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Spermatocyte ראשוני; SPC II: Spermatocyte משנית; SPD: Spermatid; SPZ: זרעונים. שקופיות היו דמיינו קונפוקה L מיקרוסקופ עם (הלוח התחתון) או בלי (הלוח העליון) שידור אור לבן. סולם ברים = 20 מיקרומטר. לחץ כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 2: Gating אסטרטגיה הפרדה של תאים נבט זכר חי על ידי Ho-FACS של השעיות תא בודד התא בודד. תאים חיים (PI שלילי) ממויינים לפי הקרינה Hoechst. Spermatogonia (SPG) מזוהים על ידי מתכננים ישירות Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. שער תוכן ה- DNA משמש למיון תאים המבוססים על פלואורסצנטי כחול Hoechst: הפלואיד (C); דיפלואידי (2C) ו tetraploid (4C). תאים בכל שיא של היסטוגרמה ממוינים אז על ידי מתכננים את הפונקציה של Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatids; SPC II: תאי הזרע המשניים; SPC אני: spermatocytes הראשי.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

משלים איור 3: Gating אסטרטגיה הפרדה של תאים נבט זכר חי על ידי Ho-FACS של כלבים בודד השעיות תא יחיד. תאים חיים (PI שלילי) מסודרים לפי Hoechst הקרינה. Spermatogonia (SPG) מזוהים על ידי התוויית ישירות Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. שער תוכן ה- DNA משמש למיון תאים המבוססים על פלואורסצנציה כחול Hoechst: הפלואיד (C); דיפלואידי (2C) ו tetraploid (4C). תאים בכל שיא של היסטוגרמה ממוינים אז על ידי מתכננים את הפונקציה של Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. השיא המכיל תאים הפלואידים יכול להיות מחולק על פי טווח העוצמה הכחולה Hochchst ו מייצגות שתי תת אוכלוסיות של spermatids: הארכת sppermatids (שער C) ו spermatids עגול (שער C ''). SPG: Spermatogonia; ESPD: מאריך spermatids; Rspd: sppermatids עגול; SPC II:תאי זרע משניים; SPC אני: spermatocytes הראשי. לחץ כאן להורדת הקובץ.

משלים איור 4: Gating אסטרטגיה הפרדה של תאים נבט זכר חי על ידי Ho-FACS של השעיר שפן השערות תא בודד יחיד. תאים חיים (PI שלילי) ממויינים לפי הקרינה Hoechst. Spermatogonia (SPG) מזוהים על ידי מתכננים ישירות Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. שער תוכן ה- DNA משמש למיון תאים המבוססים על פלואורסצנטי כחול Hoechst: הפלואיד (C); דיפלואידי (2C) ו tetraploid (4C). תאים בכל שיא של היסטוגרמה ממוינים אז על ידי מתכננים את הפונקציה של Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatids; SPC II: תאי הזרע המשניים; SPC אני: spermatocytes הראשי. לחץ כאן כדי לעשות זאתWnload את הקובץ הזה.

משלים איור 5: Gating אסטרטגיה הפרדה של תאים נבט זכר חי על ידי Ho-FACS של מיני חזיר באשכים בודדים השעיות תא. תאים חיים (PI שלילי) ממויינים לפי הקרינה Hoechst. Spermatogonia (SPG) מזוהים על ידי מתכננים ישירות Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. שער תוכן ה- DNA משמש למיון תאים המבוססים על פלואורסצנטי כחול Hoechst: הפלואיד (C); דיפלואידי (2C) ו tetraploid (4C). תאים בכל שיא של היסטוגרמה ממוינים אז על ידי מתכננים את הפונקציה של Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatids; SPC II: תאי הזרע המשניים; SPC אני: spermatocytes הראשי. לחץ כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 6: בחינה של contaminat תא סומטייון ב Ho-FACS מיון אוכלוסיות. (T-SNE) של כ -600 תעתיק חד-תאתי משלושה שערים תת-קרקעיים FACS (AB). על חלקה t-SNE, כל נקודה מייצגת את המיקום הייחודי של תא בודד בחלל transcriptome וכל תא מסומן עם FACS שלה subpopulation מקור השער (A). כימות חזותית של סמנים ספציפיים מסוג תא על מגרש FACS חד תא-SNE (B). זיהום תאים סומטיים מוערך להיות פחות מ 5% והוא אינו ספציפי לשער אחד הו - FACS האוכלוסייה. לחץ כאן להורדת הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהתחשב בדינמיקה הכרומטית המשופרת ביותר במהלך spermatogenesis אצל יונקים, המטרה של עבודה זו היתה לפתח פרוטוקול לבודד תאי נבט גברי בשלבים שונים של בידול מ רקמות שונות של יונקים ( איור 1 ). אחד המכשולים העיקריים ביישום של זרימת עבודה אחת למודלים שונים של בעלי חיים הוא הצורך בהתאמות ספציפיות למין, במיוחד בכל הנוגע לפרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות. שיטות הנוכחי בעיקר להסתמך על עיכול רקמות אנזימטיות ופרוטוקולים לעתים קרובות להשתנות גם בתוך מינים 12 . כדי להתגבר על בעיה זו, פרוטוקול המתואר כאן מראה את היישום של דיסוציאציה מכנית רקמות כדי להשיג השעיות תא בודד מדגימות האשכים של מינים יונקים שונים. התוצאות מראות כי ניתוק מכני של רקמת האשכים טריים עם מערכת זו מבצעת היטב ( איור 2 א -2 ב 20 . חשוב לציין, מכתים Hoechst לא נראה להשפיע באופן משמעותי על איכות השעיות תא בודד. למרות clumping תא יותר גלוי בדגימות מוכתמות ( איור 2 ב ), טיפול עם DNase ( איור 2 ד ) או NDA 20 יכול לעזור במניעת בעיה זו. דיווחים קודמים מציעים כי ניתוק מכני של רקמת האשכים הוא טוב יותר או יעיל כמו עיכול רקמות אנזימטיות 5 , 20 . בהתאם, הנתונים המוצגים כאן עולה כי דיסוציאציה מכנית היא שיטה אמינה להשיג השעיות תא בודד מרקמת האשכים עבור עיבוד Ho-FACS.

הדגירה עם Hoechst הוא צעד מכריע כפי שהוא משפיע על האות זוהה במהלך cytometry זרימה. תקופות ארוכות של מכתים לספק אפליה טובה יותר של סוגי תאים נבט, אבליכול להיות רעיל, וכתוצאה מכך מוות של תאים ושינויים בתכנות תאיים 22 . משתמשים מתכוונים להקים תרבויות תאים נבט בשיטה זו צריך להעריך את ההשפעה genotoxic של חשיפה זמן רב Hoechst 3 , 22 ולקבוע את הריכוז ואת הזמן הנכון של מכתים. הנה, 30 דקות של מכתים היה מספיק כדי לספק הפרדה אמינה של אוכלוסיות תאים נבט ( איור 3B -3C ). משך מכתים יכול להיות מופחת ל 10 דקות, כפי שמוצג על ידי רודריגז, Casuriaga, et al. 20 , ויש להעריך עוד על ידי משתמשים עבור מינים של עניין.

כמו משוער, ארבע אוכלוסיות תאים נבט יכול להיות מזוהה באופן קבוע - SPG, SPC I, SPC II ו SPD- מבוסס על וריאציות הכרומטין של תאים נבט מן המינים השונים נבדק ( איור 3 ב -3 ג טבלה 1 ), ותומכת באסטרטגיית gating שאומצה בזרימת עבודה זו ( איור 1 ) עבור מינים שונים של יונקים ( מספרים משלימים 2- 5 ). עם זאת, מומלץ שהמשתמשים יבצעו אופטימיזציה של ההזדהות בהתאם למינים ולאוכלוסיות המעוניינות, על מנת לצמצם את זיהום הצולבות עבור חלק מהאוכלוסיות (טבלה 1). זה יכול להיות מושגת על ידי תקופות הדגירה יותר במהלך מכתים18 , קצב הזרימה מופחת 2 וגדלים שער מופחת. SPG הם מאתגרים יותר לבודד שכן הם סוג התא הנדיר ביותר של testis וגם בשל הצטברות צבע לאורך זמן 1 , 15 . למרות שניתן לזהות אוכלוסיות SPG נפרדות על ידי הו-פאק, כפי שמוצג כאן, מחקרים המתמקדים אך ורק בביולוגיה של תאי גזע ייהנו מטכניקה מחמירה יותר כגון מיון מגנטי המופעל על ידי תאים ( 23 ). יש לציין בבירור כי תת-אוכלוסיות של SPD (eSPD ו- rSPD) יכולות להיות מובחנות היטב עבור הכלב, אך לא עבור מינים אחרים ( איור 3 ג 'ואיור משלים 3). פוטנציאל, subpopulations אלה ניתן לפתור על ידי התאמת הגדרות gating, כפי שתואר על ידי המחברים של העכבר 5 . Cytograms שנוצר עבור גודל התא ופרטיות (FSC VS SSC), לפני מתכננים את הפונקציה של Hoechst כחול / אדום fluoresceNCE, מפלה מאריך (נמוך FSC + SSC), מ בסיבוב (גבוה FSC + SSC) subperopid spermatid. ההפרדה בין תת אוכלוסיות זרעיות מאורכות וארוכות תאפשר חקירה מעמיקה יותר של הזרע, שיביא תובנות חדשות לאירועים מולקולריים ספציפיים המתרחשים במהלך בידול הזרע. כמו כן, כמתואר עבור העכבר 1 , 2 , 12 , ניתן להשיג רזולוציה נוספת של שלבים המיוטיים, על ידי התאמת השערים FACS. גישה כזו תועיל במידה רבה למחקרים השוואתיים של אירועים מיוטיים. למרות שלמות התאים מופרעת במהלך ה - Ho-FACS, התא בודד RNA התא נתונים שהושגו עבור תאים מיון עם שיטה זו (יונג ואח ' , לא פורסם , איור משלים 6 ) עולה כי זוהי גישה אמינה להשיג תאים למחקרים מולקולריים של תא נבט ביולוגיה. עם זאת, משתמשים מתכוונים לבצע מבחני הרבייה, כגון rOund spermatid הזרקת (ROSI), באמצעות תאים מבודדים על ידי Ho-FACS חייב להעריך את הכדאיות של תאים מיון עשויים לרצות לחקור שיטות חלופיות 24 , 25 .

לסיכום, עבודה זו מתארת ​​שיטה סטנדרטית לבודד תאי נבטיקולריים של יונקים שונים, בנייה והוספה חידודים על טכניקות שהוקמו בעבר 2 , 12 , 20 . סטנדרטיזציה כזו מאפשרת שימוש במערך אחד של ריאגנטים וזרימת עבודה אחת על מינים שונים של יונקים, דבר המקל על יצירת נתונים עבור מחקרים השוואתיים של ביולוגיה של תאי נבט. כמו כן, ניתוק רקמות מכני מתגבר על המשוכה של התאמות ספציפיות למין שיכולות להציג שונות מתודולוגית אשר כמעט בלתי אפשרי להסביר. בנוסף, זמן ביצוע מופחת מניפולציה מגבילה הפרעות של vivo cel לשעברפיזיולוגיה Lular עד למינימום. בהקשר זה, Ho-FACS הוא מהיר יותר באופן משמעותי בהשוואה לשיטות אחרות של בידוד תאי נבט, כגון STA-PUT ו elutriation 6 , 7 . יתר על כן, ההפרדה בו זמנית של 4 אוכלוסיות נבט באותו ניסוי אפשרי רק על ידי FACS. בהתחשב במאפיינים של צבע Hoechst, מבנה התא ומינים RNA נשמרים, ולכן תאים יכולים לשמש למחקרים נוספים במורד המולקולרי. חשוב לציין, כי Ho-FACS מסתמך על תכונות הכרומטין להפלות סוגים של תאים נבט, את הביצועים המוצלחים של זרימת עבודה זו ב 5 מינים שונים תומכת חזק היישום שלה יונקים אחרים. התוצאות המוצגות כאן מראות כי spermatogenesis עשוי להיות תהליך ייחודי של התמיינות תאים כי ניתן להתמודד עם מינים יונקים רבים באמצעות פרוטוקול יחיד. ככזה, בעידן "אומיקס" ומערכת הביולוגיה, טכנולוגיה זו מספקת את האמצעים לאפליקציה אבולוציוניתעל שאלות של ביולוגיה של תא נבט הגברי, כולל מחקרים על אפיגנטיקה, רגולציה ומגוון חלבון לאורך כליות הזרע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לבית החולים לבעלי חיים של הילסייד (סנט לואיס, מישיגן) לבדיקות כלבים; ג 'ייסון ארנד ואת המעבדה ד"ר טד Cicero באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (WashU) על מתן מבחני חולדה בריאן Tabers לסיוע עם האוסף; ג'ארד הרצוק וד"ר סאלט מעבדה בוואשאו לבחינות חזיר השפן; וד"ר מייקל טלקוט בחוג לרפואה השוואתית ב- WashU עבור מבחן החזירים המיניאטורי. החוקרים גם מכירים במרכז הסרטן אלווין ג 'סיטמן בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ובית החולים בארנס-יהודי בסנט לואיס, מישיגן, לצורך שימוש ב- Cyman Flow Cytometry Core, שסיפק שירות מיון תא ממוחשב. מרכז הסרטן Siteman נתמך בחלקו על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט # P30 CA91842.

מחקר זה מומן על ידי מלגה דוקטורט FCT [SFRH / BD / 51695/2011 ל ACL], מענקים של המכון הלאומי לבריאות [R01HD078641 ו R01MH101810 DFC] וחוזה מחקר FCT [IF / 01262/2014 ל- AML].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde VWR #15710 4% PFA, For fixing sorted cells
Medimachine BD Biosciences #340588; System for testis dissociation
1X Dulbecco modified Eagle medium Life Technologies #31053 DMEM, for testis dissociation
Medicon BD Biosciences #340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation
Fetal bovine serum Thermo Scientific #10082139 FBS, for FACS collection
Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining
40 µm cell strainer GREINER BIO-ONE #89508-342 For testis dissociation
100x 15 mm petri dish Falcon #351029 For testis dissection
5 mL polypropylene round-bottom tubes Falcon #352063 For FACS collection
1.5 mL Eppendorf tubes VWR #20170-650 For FACS collection
3 mL needless syringe BD Biosciences #309657 For testis dissociation
50 mL conical tube MIDSCI #C50R For testis dissociation 
Propidium Iodide Invitrogen #L7011 PI, For FACS staining
MoFlo Legacy cell sorter Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Summit Cell Sorting software Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Phosphate buffered saline Thermo Scientific #AM9625 PBS, For microscopy
Microscopic glass slide Fisher Scientific #12-544-4 For microscopy
Glass coverslip Fisher Scientific #12-548-87 For microscopy
Disposable transfer pipette (3 mL) Samco Scientific #225 For testis dissociation
DNase I Roche #10104159001 For testis dissociation
Carbon steel surgical blade Miltex #4-111 For testis dissection
Countess automated cell counter Invitrogen #C10227 For automatic cell counting
Trypan blue solution (0.4%) Sigma #T8154 For viability staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 125 השוואה השוואתית מינון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) Hoechst-33342 תאי נבט זכריים ניתוק מכני spermatogenesis testis,
גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J.,… More

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J., Usmani, A., Lopes, A. M., Conrad, D. F. A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55913, doi:10.3791/55913 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter