Summary
이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.
Abstract
Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 포유류 고환 세균 세포의 풍부한 개체군을 분리하는 방법 중 하나였습니다. 현재, 그것은 높은 수율과 순도로 9 마리의 쥐과세 세포 집단의 차별을 허용합니다. 이 차별화와 정화의 고해상도는 정자 형성을 통한 염색질 구조와 양의 독특한 변화로 인해 가능합니다. 이러한 패턴은 Hoechst-33342 (Hoechst)와 같은 형광 DNA 결합 염색 물로 염색 된 수컷 생식 세포의 유동 세포 계측법으로 포착 할 수 있습니다. 포유류 고환 세균 세포를 분리하기 위해 최근 개발 된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 여기에있다. 간단히 말해, 단세포 현탁액은 기계적 해리에 의해 고환 조직으로부터 생성되고, 호 에스트 (Hoechst) 및 요오드화 프로피 듐 (PI)으로 이중 염색되고 유동 세포 계측법에 의해 처리된다. 상이한 DNA 함량 (Hoechst 강도)을 갖는 살아있는 세포 (PI 음성)의 선택을 포함한 일련의 게이팅 전략, 즉FACS 분류 과정에서 5 개의 배아 세포 유형을 구별하기 위해 사용됩니다. spermatogonia (66 %), primary (71 %) 및 secondary (85 %) spermatocytes 및 spermatids (90 %)를 포함하여 평균 순도 (현미경으로 평가) (87 %)의 하위 집단. 전체 워크 플로우를 실행하는 것은 간단하며 적절한 FACS 시스템으로 4 가지 세포 유형을 동시에 분리 할 수 있으며 2 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 처리 시간 단축은 생체 내 생체 의 생리학을 보존하는 데 중요 하므로이 방법은 남성 생식 세포 생물학에 대한 하류 고 처리량 연구에 이상적입니다. 또한, 포유류 배아 세포의 다중 종 (multispecies) 정화를위한 표준화 된 프로토콜은 방법 론적 변수의 출처를 제거하고 상이한 동물 모델에 대해 단일 세트의 시약을 사용할 수있게한다.
Introduction
spermatogenesis progression을 나타내는 in vitro system이 부족하고 testis에 세포 이종성이 존재한다는 점을 감안할 때 수컷 생식 세포 생물학에 대한 연구에서는 특정 세포 유형의 농축 된 개체군을 단리하기위한 강력한 기술이 필요합니다. Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 높은 수율과 순도를 제공하고 식별 할 수있는 배양 세포 유형의 수에서 다른 단리 방법을 능가하므로이 목적을 위해 1 , 2 , 3 , 4 , 5 로 널리 사용되었습니다. 6 , 7 , 8을 선택하십시오. 유세포 분석의 원리는 단일 세포의 레이저 빔 여기 이후의 차동 빛 패턴의 검출에 기초합니다. 세포가 레이저를 통과함에 따라 빛을 반사 / 산란시킵니다.모든 각도에서 세포 크기 (전방 산란; FSC) 및 세포 내 복잡성 (측방 산란; SSC)에 비례한다. 유동 세포 계측법에 대한 자세한 내용은 Ormerod 9 를 참조하십시오.
남성 생식 세포는 정자 형성의 여러 단계에 걸쳐 DNA 함량, 염색질 구조, 크기 및 모양에 특별한 변형을합니다. 따라서 뚜렷한 세포 집단은 형광 염료 10 , 11로 빛의 산란과 DNA 염색을 결합하여 확인하고 분리 할 수 있습니다. 몇몇 염료는 종종 10 지난 십 1, 2, 4 고환 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 이러한 목적 등의 Hoechst-33342 (헥스)로서, (Geisinger 그리고 로드리게스-Casuriaga 3에서 검토)에 사용될 수있다 , 12 . 우포UV- 빛을 이용한 여기 Hoechst는 세포 DNA의 내용에 비례하여 청색 형광을 방출하는 반면, 원적외선 형광은 염색질 구조 및 압축 1 , 13 , 14의 가변성을 반영합니다. 그 결과, 분화의 다양한 단계에서 남성 생식 세포는 훽스트 염색 단일 세포 현탁액 FACS 동안 특정 패턴을 나타낸다 (호 FACS-1, 12). 흥미롭게도, 정자 단계에서만 활성화되는 색소 유출의 메커니즘으로 인해, Hoechst blue 형광의 강도는이 세포의 염색질 함량에 비례하지 않으며, Ho-FACS 15 동안 부작용으로 분류됩니다. 또한 Hoechst 염색을 비 침투성 염료 propidium iodide (PI)와 결합하면 사용자가 FACS 1 < 1 일 때 죽은 (PI 양성) 세포와 생체 (PI 음성)를 구별 할 수 있습니다.2 , 10 , 12 이다. 이전 유세포에서 사용되고 이러한 전략은 고환 생식 세포의 분석 및 감수 I 1, 2, 4, 16의 4 가지 단계의 세포를 포함 9 개 생식 세포 유형까지 판별 마우스에서 광범위하게 최적화. 이 작품의 목적을 위해, Hoechst 염색법은 세 가지 주요 장점이 있습니다. 먼저, Ho-FACS는 마우스 모델 1 , 2 , 12 및 기타 쥐 (rat 및 쥐 돼지 17 , 18 , 19) 의 남성 생식 세포의 분리에 성공적으로 적용되었습니다. 둘째, Hoechst는 세포 투과성 염료이며 막 투과성을 필요로하지 않으므로 보존제가됩니다ves cell integrity. 마지막으로 Hoechst가 poly (d [AT]) DNA 서열 1 , 20 에 우선적으로 결합하기 때문에 RNase 처리가 필요하지 않다. RNA가 보존되고 DNA와 단백질 이외에 세균의 추가 하류 분자 연구에 사용될 수 있음을 의미한다 세포 분화.
포유류 종의 유동 세포 계측법 분석 (Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 에서 검토 됨)에서 관찰 된 DNA 배수성 및 / 또는 염색성의 유사성에도 불구하고, 유동 세포 계측법에 의한 수컷 배아 세포 분리에 대해 설명 된 프로토콜에는 상당한 다양성이있었습니다. 여러 연구에서 조직 해리에 대한 특정 프로토콜을 사용하고 주로 마우스, 쥐 및 기니피그 등 다양한 모델 유기체에서 별개의 DNA 결합 염료 (단독 또는 조합)와 FACS 게이팅 전략을 사용했습니다. 따라서 서로 다른 종에 대해 수집 된 자료를 직접 비교하는 것은 unacco의 영향을받을 수 있습니다방법론 사이의 다양성으로 인한 기술적 인 유물이 없습니다. 중요한 것은 포유류 정자 형성 (2N - 4N - 2N - 1N)에 걸쳐 염색질 동력학의 놀라운 보존은 표준화 된 프로토콜이 다양한 포유류 종에 횡 방향으로 적용될 수 있음을 시사합니다.
이 연구의 목표는 결합하고, 20 이전에 출판 기술 (2)를 적용하여, 다른 포유 동물 종에 적용 할 수있는 하나의 워크 플로우를 개발하는 것이 었습니다. 조직 처리하기위한 방법의 표준화는 효소 분해에 필요한 5 종 특이 조정에 대한 필요성을 해결하기 위해 기계적 분해를 수행함으로써 달성되었다. 설치류 고환 조직의 기계적 해리가 두 가지 방법으로 생성 된 단일 세포 현탁액의 효소 조직 소화 20 및 Ho-FACS보다 우수한 것으로 나타났습니다그것과 비교 가능한 결과 5 . 원칙 증명으로이 프로토콜은 최대 5 개의 생식 세포 집단을 분리하는데 사용 된 설정을 기술합니다 : spermatogonia (SPG); 1 차 (SPC I) 및 2 차 spermatocytes (SPC II) 및 spermatids (SPD) - 라운드 (rSPD) 및 연장 (eSPD). 중요한 것은 조직 해부 및 UV 레이저가 장착 된 셀 분류기에 대한 액세스 시스템이 주요 요구 사항 인 실험실에서 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 이 작업 흐름 ( 그림 1 )은 빠르고 간단하며 2 시간 이내에 새로운 고환 조직에서 4 개의 배아 세포 집단을 동시에 격리 할 수 있습니다. 감소 된 처리 시간은 추가 다운 스트림 절차를 위해 셀룰러 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 더욱이 5 종의 다른 종에서의 성공적인 수행은 포유 동물의 clade 내에 광범위하게 적용될 수 있음을 시사하며 포유 동물의 남성 생식 기관의 비교 연구를 위해 생식 세포를 분리하는 이상적인 방법으로 만든다ogy.
이 프로토콜은 준비 단계를 제외하고 세 가지 주요 섹션으로 구성되어 있습니다 : (1) 고환 조직의 기계적 해리 및 (2) Hoechst 및 PI와의 고환 세포 염색, (3) 관련 정자 세포의 FACS 분류. 일단 포집되면, 다양한 포유류 고환 세균 세포의 이러한 풍부한 개체군은 광범위한 적용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 많은 다른 포유 동물 종에서 남성의 배아 세포를 정화하는 "모든 크기에 맞는"해리 방법을 설명합니다. 격리 된 생식 세포로 수행하고자하는 연구 유형에 따라 다른 배지 또는 완충액을 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜 단계는 하나의 전체 쥐의 정소에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 것입니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 절차는 세인트루이스의 워싱턴 대학 동물 실험위원회의 규정을 준수했습니다.
1. 기계적 해리 프로토콜 준비
- 전체 쥐의 고환의 해리를 위해 50 μm 일회용 티슈 분해 카트리지를 사전 습윤 처리하십시오.
참고 :이 일회용 조직 분해 카트리지에는 조직 절단 용으로 설계된 마이크로 블레이드와 약 100 개의 육각 구멍이있는 움직일 수없는 철재가 들어 있습니다. 조직 분해 카트리지를위한 다양한 크기의 메쉬를 사용하여 종 및 원하는 세포 유형에 따라이 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 이 종이에서 언급 된 모든 포유류 종에는 50 μm 카트리지가 사용되었습니다.- 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오.
참고 : 페놀 빨강은 적색 형광 감지를 방해 할 수 있습니다FACS 기간 중. - 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘이없는 주사기와 조직 해체 카트리지에서 1x DMEM를 대기음.
- 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오.
- "ON"버튼을 눌러 조직 분리 시스템을 켭니다. 이 시스템은 "워밍업"시간을 필요로하지 않습니다.
- 얼음처럼 차가운 1 x DMEM이있는 3 개의 40 μm 일회용 필터를 사전 적시십시오. 50 ML 원뿔 튜브에 각 40 μm의 일회용 필터를 놓습니다. 1X DMEM 1 mL를 피펫으로 통과 시키십시오.
- 고환 조직 수집을 위해 100mm x 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 배양 접시에 1x DMEM 500 μL를 피펫.
2. 기계적 해리 프로토콜을위한 고환 조직의 준비
- 외과 용 가위 및 집게로 신생 모든 고환 또는 고환 조각 (다른 포유류 종을 다루는 경우)을 조심스럽게 제거하기 위해 수컷 마우스를 해부합니다.
참고 : 조직에 지방과 괴사가 없어야합니다. Fr esh 고환 조직은 냉동 조직보다 우수한 단일 세포 현탁액 품질을 생성합니다.- 수집 한 고환 / 조각을 1x DMEM 500 μL가 들어있는 준비된 100 mm x 15 mm 페트리 접시에 옮긴다.
- 적혈구 (존재하는 경우)를 제거하기 위해 1x DMEM에서 조직을 부드럽게 헹구십시오.
- 조심스럽게 tunica albuginea를 제거하십시오. tunica albuginea의 두께는 다른 종에 따라 다릅니다.
- 포 셉스로 고환의 한쪽 끝을 잡으십시오.
- 이전 단계에서 포 셉를 가진 고환의 한쪽 끝을 여전히 잡고있는 동안 메스로 고환의 다른 끝을 찔러 라.
- 메스를 사용하여 정소의 한쪽 끝을 2.2.1 단계의 집게로 잡고 고환 세관을 긁습니다.
- 메스를 사용하여 고환 세뇨관을 ~ 2-3 mm 3의 조각으로 자르십시오.
3. 고환 조직의 기계적 해리에 의한 단일 세포 현탁액의 취득
ontent "> 참고 : 아래에 설명 된 해리 단계는 한 마리의 성숙한 마우스 고환에 대한 것이며, 어린 쥐 또는 비 쥐과 동물의 고환 조직의 양은 이에 따라 조정해야합니다. 정소 조직 구성은 번식기에 비 교배 계절과 비교하여 변화한다.- 포셉을 사용하여 미리 젖은 50 μm의 조직 분해 카트리지에 작은 고환 tubule 조각을 전송하고 1x DMEM의 1 ML을 추가합니다.
- 조직 해체 카트리지를 조직 분해 시스템에로드하고 손잡이를 "대기"모드에서 "실행"모드로 돌린 후 5 분 동안 처리하십시오.
- 조직 분해 시스템에서 조직 분해 카트리지를 제거하고 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘없는 주사기로 세포 현탁액을 대기음.
- 조직 분해 카트리지에서 모든 액체를 제거하기 위해 몇 번 대기음을하십시오. 아니모든 1 mL는 조직 분해 카트리지로부터 회수 될 수있다.
- 흡인 된 세포 현탁액을 2 개의 일회용 사전 습윤 40 μm 필터에 통과시킵니다. 모든 셀 집계를 제거하려면 두 번 필터링하십시오.
- 40 mL 필터를 50 mL 원추형 튜브에 넣으십시오. 직접 40μm 필터에 주사기에 흡인 세포를 추가합니다. 일회용 피펫으로 피펫 통과 단일 세포 현탁액.
- 사용 된 pre-wetted 40 μm 필터를 제거하고 50 μm 원추형 튜브에 또 다른 pre-wetted 40 μm 필터를 놓습니다. 깨끗한 40 μm의 필터에 수집 된 단일 세포 현탁액을 피펫.
- 깨끗한 일회용 피펫으로 여과 된 단일 세포 현탁액을 수집하십시오.
- 피펫은 50 μm 조직 분해 카트리지에 세포 현탁액을 걸러 내고 조직 분해 시스템에서 또 다른 5 분 동안 처리합니다.
- 조직 disaggregati에서 모든 액체를 복구카트리지에.
4. Hoechst 및 Propidium Iodide (PI)로 염색
- 회수 된 세포 현탁액을 50 μm 조직 분해 카트리지에서 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 약 1-1.5 mL의 단일 세포 현탁액이 회수됩니다.
- 회수 된 단일 세포 현탁액을 4 개의 1.5 mL 또는 5 mL 튜브로 나누십시오.
- 처음 세 개의 튜브의 경우, 단일 세포 현탁액 150 μL과 4 개의 튜브 (단일 세포 현탁액의 약 550 μL)의 마지막에 단일 세포 현탁액의 피펫 나머지를 피펫.
참고 : 최종 튜브의 단일 세포 현탁액의 양은 단계 3.6에서 세포 현탁액의 회복 효율에 따라 달라질 수 있습니다.
- 처음 세 개의 튜브의 경우, 단일 세포 현탁액 150 μL과 4 개의 튜브 (단일 세포 현탁액의 약 550 μL)의 마지막에 단일 세포 현탁액의 피펫 나머지를 피펫.
- FACS 세션을위한 unstained 컨트롤로 네 튜브의 첫 번째 튜브를 설정합니다.
- 컨트롤로 단일 염료 스테인드 (PI 또는 Hoechst) 세포 현탁액을 준비합니다. 각 튜브에 2.5 ㎕의 Hoechst 또는 PI 1 μL를 넣으십시오 (두 번째와 third).
- 이중으로 염색 된 튜브를 준비하십시오. 이것은 배아 세포 집단을 모으는데 사용될 것입니다. Hoechst 2.5 μL와 PI 1 μL를 마지막 튜브에 첨가하십시오.
참고 : Hoechst의 유통 기한은 2 ~ 3 개월입니다. 염료의 오래된 주식을 사용하면 FACS 세션 동안 상당한 변경이 발생할 것입니다. - 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. 튜브 회 전자에 시료를 넣거나 5 ~ 10 분 간격으로 1.5 mL 튜브를 뒤집습니다.
- 미리 젖은 40 μm의 여과기로 세포 현탁액을 여과하고 여과 된 용액을 얼음과 어둠 속에서 FACS 세션까지 보관하십시오.
참고 : 여과 단계는 FACS의 세포 덩어리를 예방하는 데 필요합니다. 또한 DNase ( 그림 1 참조) 또는 2- Naphthol-6,8-disulfonic acid diotassium salt (NDA 20 )로 처리하면 세포 응집을 제한 할 수 있습니다. 연장 된 대기 기간은 FACS 동안 검출 된 형광 신호에 영향을 미치고 증가 된 세포 사멸을 초래할 수 있습니다.5. 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 고환 세포의 설정 및 정화
- FACS 수집 튜브를 준비하십시오.
- 세포 수집을위한 FBS 400 μL와 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 또는 1.5 ML 튜브를 코트. 코팅 후 과량의 FBS를 따라 내십시오.
- 튜브에 FACS 수집 매체 (1x DMEM + 10 % 태아 소 혈청, FBS)를 튜브에 추가하십시오 : 5mL 튜브의 경우 1mL 또는 1.5mL 튜브의 경우 100μL.
- 셀 분류기 및 소프트웨어에서 적절한 정렬 조건을 설정하십시오.
참고 : 아래에 설명 된 것과 유사한 설정 및 게이팅 전략을 사용하여 다른 셀 분류 기계 및 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조건은 Gaysinskaya와 Bortvin 2 , Geisinger와 Rodriguez-Casuriaga 3 , Getun, et al. 4- 463/2로 자외선 레이저로드Hoechst blue를 검출하기위한 5 nm band pass filter와 Hoechst red를 검출하고 PI를 검출하기위한 680 nm LP band pass filter.
- 555DLP 이색 성 거울을 사용하여 청색과 빨간색 형광을 구별합니다.
- 70 μm 노즐을 사용하고 1000-2000 세포 / 초 속도로 세포를 분류하십시오.
참고 : 정렬 효율은 유량에 의해 직접적으로 영향을받습니다. 높은 유속 (> 3500 events / s)은 분류의 속도를 증가 시키지만 인구의 오염을 초래합니다. 자세한 내용은 참조 12 를 참조하십시오.
- 대조 샘플을 사용하여 게이트를 설정하십시오.
- 염색되지 않은 샘플을로드하고 실행하십시오.
- FSC vs SSC 플롯 패턴에 따라 세포 파편을 제외합니다. 세포 잔해가 음모의 왼쪽 아래 사분면에 나타납니다. 사용자 또는 셀 분류기 기술자가 셀 파편에 대한 임계 값을 임의로 설정합니다.
- FSC 및 펄스 폭에 대한 임계 값을 조정하여 단일 셀의 게이트. 다른 세포 분류기는 서로 다른 방법으로 분배 할 수 있습니다.sing singles. 펄스 폭은 세포가 레이저를 가로 지르는 데 걸린 시간을 반영하기 때문에 단일 세포는 다세포 골재에 비해 더 낮은 값을 갖습니다. FSC 대 펄스 폭에 대한 플롯의 임계 값 조정은 싱글 렛을 선택하는 데 사용될 수 있습니다.
- 최적의 광전자 증 배관 (PMT) 전압을 설정하십시오.
- PI 또는 Hoechst 형광 신호의 임계 값을 확립하기 위해 염색되지 않은 염색 세포와 단일 염료 염색 세포를 사용하십시오.
참고 : 각 염료에 적절한 형광 범위를 설정하려면 관심있는 세포에 대한 기본 PTM 전압을 최적화하는 것이 중요합니다. 이는 최적의 신호 탐지 및 민감성을 위해 중요합니다. 염색되지 않은 단일 염색 대조 세포는 PI 및 / 또는 Hoechst 염료를 사용하여 음성 및 양성 염색 세포의 범위를 확립하고 신호의 잡음을 최소화하는 데 사용됩니다. 제어 셀을 사용하여 PMT 전압을 최적화하는 방법에 대한 자세한 설명은 Gaysinskaya 및 Bortvin 2 를 참조하십시오. - 살아있는 세포의 문PI 염색 (PI 음성) 및 FSC 플롯을 기반으로 하였다. 죽은 세포는 PI 형광에 대해 양성 반응을 보일 것입니다.
- Hoechst blue 형광에 근거한 세포 수의 막대 그래프를 플로팅하여 DNA 내용 게이트를 설정하십시오. haploid (1C), 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C) 세포를 나타내는 Hoechst blue 형광 농도가 증가하는 3 개의 피크가 나타납니다. 3 개의 게이트를 설정합니다 (각 피크 당 하나씩).
- 세균 세포 집단에 대한 게이팅을 진행하기 전에 적어도 50 만 건의 FSC 대 SSC 계획을 관찰하십시오.
- 게이트 다른 생식 세포 인구.
- Hoechst / PI 스테인드 시료를 넣습니다.
- 모든 모집단에 공통적 인 처음 3 개의 모기지 게이트를 설정하십시오.
- FSC vs SSC 플롯을 기준으로 세포 파편을 제외합니다. FSC와 펄스 폭 플롯을 기준으로 싱글 렛을 선택하십시오. PI 음성 세포를 게이팅하여 살아있는 세포를 선택하십시오.
- spermatogonia 게이트를 정의하십시오.
- Hoechst 청색 및 적색 형광에 근거한 PI 음성 세포강도. Spermatogonia는 부작용으로 나타납니다 ( 그림 1 참조).
- 나머지 생식 세포 집단에 대한 문을 정의하십시오. 참고 : 자세한 내용은 그림 1과 보조 그림 2를 참조하십시오.
- DNA 콘텐츠 게이트에 PI 부정적인 세포를 플롯하십시오.
- spermatids 들어 가장 낮은 Hoechst 형광 (1C)와 피크를 문.
- spermatocytes II 들어, 중간 Hoechst 형광 (2C)와 피크를 게이트.
- spermatocytes 들어, 가장 높은 Hoechst 형광 (4C)와 피크를 문.
- DNA 콘텐츠 게이트에서 spermatocytes 및 spermatids 집단을 정제하기 위해 Hoechst 청색 및 적색 형광 강도를 플롯합니다.
- 이전에 준비된 수집 튜브에 선택한 subpopulation 게이트를 수집합니다. 각 정소 각 모집단 약 0.5-6.0 × 106 세포를 수집하고, 1.5 시간에 45 분의 평균을 취한다.
참고 : Hoechst mA에 장기간 세포 노출y는 시간이 지남에 따라 인구의 위치를 약간 이동시킵니다. FACS의 20-30 분 후 설정을 새로 고칩니다. 각 하위 집단에 대한 최대 수율은 해리 단계의 효율성에 달려있다.
6. 정제 된 세포의 미세한 평가
- 4 ° C에서 10 분 동안 500-600 xg에서 세포를 스핀.
- 얼음 감기 1X 인산 버퍼 솔루션 (PBS) 또는 1X DMEM의 1 ML로 세포 펠렛을 다시 중단하십시오.
참고 : 재현 현탁액은 분류 된 세포의 수와 원하는 최종 농도에 따라 조정할 수 있습니다. - 깨끗한 유리 슬라이드에 세차 세포 40 μL 피펫과 coverslip을 놓으십시오.
- 4 % paraformaldehyde (PFA)로 남아있는 세포를 고정시키고 4 ℃에서 고정 된 세포를 저장하여 나중에 참조 할 수있게한다.
- 수집 튜브에 100 μL 4 % PFA를 직접 피펫에 넣습니다.
- 세포 현탁액의 잘 혼합되도록 튜브 또는 피펫을 간단히 와동시킨다.
- 준비된 슬라이드를 자외선 램프가 장착 된 현미경으로 시각화하여 63X 대물 렌즈에서 Hoechst 형광을 검출합니다. 특정 배아 세포 유형을 식별하는 방법에 대한 자세한 내용은 결과 섹션 - 분류 된 배아 세포 집단의 형태 학적 평가를 참조하십시오.
- FACS 수집 튜브를 준비하십시오.
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Representative Results
고환 조직의 기계적 해리로 인한 단일 세포 현탁액
도 2 는 상이한 조건 하에서 마우스 고환 조직의 기계적 해리에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액을 비교한다. ( 그림 2A ) 또는 Hoechst ( 그림 2B )로 얼룩진 신선한 조직을 처리하여 얻은 샘플은 다양한 분화 단계에서 단일 세포의 존재를 보여 주며, 중요하게는 세포 구조가 정자의 편모를 포함하여 보존 된 것으로 보입니다. 해동 후 DNase를 첨가함으로써 감소 된 염색 된 샘플에서 약간의 응집 및 파편이 관찰되었지만 ( 도 2D ), 이러한 결과는 Hoechst 염색이 단일 세포 현탁액의 품질을 현저하게 변화시키지 않음을 나타낸다. 흥미롭게도, 단일 세포 현탁액쥐, 개, 기니아 돼지 및 미니 돼지 ( 보충 그림 1 )와 같은 다른 포유 동물 종의 기계적 해리에 의해 동결 된 조직 ( 그림 2C ) 및 포유류 종에서 얻을 수있다. 다양한 세포 유형이 보이고 식별 가능합니다. 그러나, 냉동 된 조직의 처리는 증가 된 세포 사멸 및 응집 및 전체적으로 낮은 세포 수율을 유도하는 것으로 보인다. 따라서 더 많은 다운 스트림 적용을 위해 신선한 조직에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 것이 좋습니다.
쥐, 쥐, 개, 기니아 피그 및 미니 돼지의 고환 조직으로부터 제조 된 단일 세포 현탁액의 품질을 Ho-FACS 동안 평가 하였다 ( 표 1 ). 세포 파편을 제거한 후, PI 림 세포의 정량화 ( Protocol )에서 볼 수 있듯이 95.7-98.4 %의 세포가 단일 렛이고 86.5-93.8 %가 살아있다. 이 사람들ts는 기계적 해리가 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 유세포 분석을위한 단일 세포 현탁액을 제조하는 신뢰할 수있는 방법임을 나타낸다.
다른 포유류 종의 고환 조직으로부터 생식 세포를 분리하는 Ho-FACS
기계적 해리 후 단일 세포 현탁액을 Hoechst 및 PI로 염색하고 FACS로 처리한다. 위에서 언급했듯이, Hoechst 염색법은 염색질 양과 구조에 따라 분화의 다른 단계에서 세포의 차별을 허용하는 반면, 비 투과성 세포의 PI 염색은 사균과 생존을 분리합니다. 따라서 세포 찌꺼기와 다세포 응집체를 필터링 한 후 PI 게이트는 손상이없는 세포막 (PI 음성; 그림 1 )으로 세포를 선택합니다. 라이브 세포는 Hoechst 형광에 기초하여 분석됩니다 : 파란색은 DNA 함량에 비례하고 증가하는 적색형광은 응축 된 염색질 및 구조 변화를 덜 반영합니다. 이와 같이, 여러 단계의 남성 생식 세포는 청색 / 적색 Hoechst 형광 ( 그림 3A )의 기능을 플로팅하는 cytogram의 특정 지역에서 클러스터 될 것으로 예상됩니다.
실제로, 다른 종에 대해 생성 된 Ho-FACS 플롯은 Hoechst 형광 ( 그림 3B -3C )에 기반한 별개의 세포 집단의 존재를 보여줍니다. 이 플롯은 배아 세포 집단을 구별하기에 충분하지만 교차 오염을 제한하기 위해 DNA 함량 (C) 게이트를 정의 할 수 있습니다 2 . 이 게이트는 Hoechst blue 형광 강도의 함수에서 세포 수의 히스토그램에 의해 생성됩니다. 모든 종에 대해 3 개의 피크가 검출 될 수 있으며 1C, 2C 및 4C가있는 세포를 나타냅니다 ( 그림 1 및 추가 그림 2-5 ). 주목할 만하게, previ로ously 언급, spermatogonia 측면 인구 및 신뢰할 수있는 DNA 콘텐츠의 히스토그램을 기반으로 문을 열 수 없습니다. 따라서,이 집단은 Hoechst 청색 / 적색 형광 플롯 ( 그림 1 )을 기반으로 죽은 세포를 배제한 후에 게이팅됩니다. 이 전략은 쥐에 대해서는 그림 1 에, 나머지 종에 대해서는 그림 2-5 를 보완하여 나타내었다. Hoechst 형광만으로는 서로 다른 생식 세포 유형을 구별 할 수 있기 때문에 PI 및 DNA 내용 게이트는 선택 사항입니다. 이들은 살아있는 세포를 선택하고 교차 오염을 줄이기 위해이 전략에 포함되었습니다. 표 1에 요약 된 바와 같이, DNA 함량 게이트에서 세포의 정량화는 정자 형성의 여러 단계에서 세포의 상대적인 비율을 반영합니다. 예상대로, 1C 세포가 가장 풍부하고 2C 세포 (SPC II)와 4C 세포 (SPC I)가 뒤 따르는 spermatid 집단을 나타낸다. 임파ntly,이 패턴은 종 전체에 걸쳐 보존되며 작은 차이는 생식 세포의 종간 변이성과 정관 상피의주기를 반영 할 수 있습니다 21 .
Ho-FACS 후 Trypan blue 염색을 사용하여 세포의 완전성을 평가할 수 있습니다. FACS 1 시간 후 살아있는 세포의 비율은 마우스의 경우 27 % (SCP I)에서 67 % (SPD)까지 분포하여 Hoechst에 대한 분류 및 노출 기간이 세포 죽음을 증가 시킨다는 것을 나타냅니다. 분류 된 세포를 배양하고자하는 사용자의 경우 Ho-FACS의 Hoechst 농도와 지속 기간을 조정하여 세포 생존율을 향상시켜야합니다. 그럼에도 불구하고 RNA 시퀀싱 데이터는이 방법을 사용하여 단리 된 세포 (Jung et al ., 미 출판)를 위해 생성되었으며, 이는 이들 세포가 생식 세포 생물학의 분자 연구에 적합하다는 것을 나타낸다. 이 데이터 세트는 체세포에 의한 생식 세포 집단의 잠재적 인 오염을 검출하는 데 사용되었습니다 ( 보충 그림 6
분류 된 배아 세포 집단의 형태 학적 평가
생식 세포가 정자 형성 과정을 통해 급격한 형태 학적 변화를 겪으므로 현미경으로 고립 개체군의 순도를 추정 할 수 있습니다. 참고로, 그림 4 는 4 포유 동물 종 (Lima, et al. 5 )의 다양한 남성 생식 세포 유형의 일반적인 형태를 보여줍니다. 염색질 분포와 응축뿐만 아니라 세포 크기와 모양, 다른 셀 유형의 독특하고 잘 특성 패턴을 보여줍니다. SPG는 Hoechst에 대해 밝게 얼룩이지며 작고 둥글다 ( 그림 4B의 Spg) 별개의 원심성 헤테로 염색질을 가지고있다. Spermatocytes는 더 큰 알갱이로 만들어진 세포입니다. SPC의 핵은 쉽게 식별 할 수 있습니다. 염색질의 다양성( 그림 4B의 Spc I), SPC II는 이핵 성 (binucleated) 또는 diakinesis ( 그림 4B의 Spc II)의 특성을 나타낸다. 마지막으로, SPD는 둥근 모양 또는 길쭉한 모양을 가진 작은 반수체 세포이다 ( 그림 4B의 Spd). 특히, rSPD는 SPG와 크기 및 모양이 비슷하지만 국부적 인 chromocenters의 존재를 명확히 구분합니다. 이러한 특성을 바탕으로 분류 된 세포 집단을 특정 세포 유형의 농축으로 평가했습니다 ( 표 1 ). SPD 및 SPC II 집단은 다른 세포 유형, 특히 기니아 돼지 및 미니 돼지 시료에 대해 어느 정도의 오염을 보인 반면, SPC II 및 SPC II 집단은 관심 대상 세포 유형에 대해 고도로 농축되었다. 흥미롭게도 개 샘플의 경우 게이팅 전략은 연장하는 정자에서 라운드를 구별하기에 충분했다 ( 그림 3C , 보충 그림 3 ; 표 1
그림 1 : 포유류 수컷 배아 세포의 Ho-FACS 분리 워크 플로. 이 이미지는이 프로토콜을 쥐의 고환에 적용한 대표적인 데이터가있는 포유류 배아 세포의 배아 세포 분리에 대한 일반적인 프로토콜을 보여줍니다. Ho : 헉스트. Lima, et al. 5 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 기계적 해리에 의해 생성 된 단일 세포 현탁액 마우스 고환 조직. 신선한 조직 ( AB )에서 얻은 샘플은 다양한 손상되지 않은 세균 세포 유형과 매우 적은 부스러기를 보여줍니다. 비 염색 세포 ( A )와 비교했을 때, Hoechst 염색 세포 현탁액 ( B )의 일부 세포 덩어리가 관찰되었으며, 해리 직후 샘플에 DNase (최종 농도 10 μg / mL)를 첨가하여 감소시킬 수 있습니다 ( D ). 냉동 고환 조직은 또한 기계적 해리 ( C )에 의해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 조직 해리 이전에 플래시 동결 및 해동 과정은 파편, 세포 사멸 및 전반적인 세포 수율 감소를 초래하는 것으로 보인다. 해리 (프로토콜 참조) 후 샘플을 4 ℃에서 10 분간 회전시키고 슬라이드를 장착하기 전에 1x DMEM에 재현 탁했다. 검은 색 막대 = 50 μm. UV 램프가 장착 된 직립 백색광 현미경을 사용하여 얻은 이미지.ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 포유류 배아 세포의 Ho-FACS. 특정 개체군은 FACS ( A ) 동안 독특한 힉 스트 형광 패턴을 나타낸다. Hoechst blue 형광은 반수체 ( C )의 염색질 함량 클러스터의 변화를 반영하기 때문에; 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C) 세포는 증가하는 홉 스트 블루 형광으로 FACS 플롯의 영역에 위치한다. Hoechst 청색 / 적색 형광의 함수로서 생성 된 플롯은 시험 된 상이한 포유류 종 ( BC )에 대해 별개의 세포 집단의 클러스터를 나타낸다. SPG : Spermatogonia; SPC I : 일차 spermatocytes; Pre-Lep : Pre-Leptotene spermatocytes; Lep : Leptotene spermatocytes; Dip : Diplotene spermatocytes; SPCII : 이차성 spermatocytes; SPD : Spermatids; eSPD : 연장하는 spermatids; rSPD : 둥근 spermatids. Lima, et al. 5 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 4 개의 포유 동물 종에서 발달 단계가 다른 생식 세포의 형태. 이 그림은 Hoechst (A)로 염색 된 고환 조직의 섹션과 쥐, 기니아 피그, 개와 미니 돼지에서 Ho-FACS (B)로 분류 된 다양한 남성 생식 세포 유형의 일반적인 모습을 보여줍니다. 세포 크기, 모양 및 염색체 형태가 정자 형성 과정 전반에 걸쳐 극적으로 변함에 따라 세포를 분화의 다른 단계에 할당하는 데 사용할 수 있습니다. Spermatogonia (Spg)는 작고 둥글며독특한 원심성 헤테로 크로마 틴이 나타나고 높은 강도의 Hoechst 형광을 나타낸다. Spermatocytes는 가장 큰 배아 세포이며 다양한 염색질 형태를 보여줍니다. 1 차 spermatocytes (Spc I)의 nuclei는 감수 분열 세포의 특징 인 염색질 변이를 나타내지 만 2 차 spermatocytes (Spc II)는 이핵 또는 diakinesis에 있습니다. Spermatids (Spd)는 정자 형성 단계에 따라 둥근 모양 또는 길쭉한 모양을 가지며 작은 반수성 세포입니다. 둥근 spermatids 및 spermatogonia 크기와 모양이 비슷하지만, 전자는 국부적 인 chromocenters의 존재에 의해 구별하실 수 있습니다. Ho-FACS 후 정렬 된 각 세포 유형에 대한 슬라이드를 준비하고 공 촛점 현미경 (63X 배율 렌즈)에서 시각화했습니다 (위쪽 패널 또는 아래 패널). 흰색 리미티드 (Lima, et al. 5 허가. 부디이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| DNA 함유 문에서 % 세포 | 분류 된 배아 세포 집단의 순도 (%) | |||||||||||
| 종 | Singlets % | 라이브 셀 % | 1C | 2C | 4C | Spg | SPC 난 | SPC II | Spd | rSpd | eSpd | |
| 쥐 | 98.4 | 92.5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| 쥐 | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| 기니피그 | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68.7 | 85 | 87 | . | . | |
| 개 | 97.9 | 86.5 | 16.4 | 삼 | 0.5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| 미니 돼지 | 95.9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * 효소 해리 및 게이팅에 의해 얻어 짐.FSC 및 SSC 매개 변수 (Lima 외 2016 년 허가) | ||||||||||||
표 1 : 기계적 해리에 의해 얻어진 수컷 배아 세포 현탁액의 Ho-FACS 통계.
보충 그림 1 : 냉동 고환 조직의 기계적 해리로 얻은 단일 세포 현탁액. 기계적 해리는 종 특이 적 프로토콜의 필요없이 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터의 단일 세포 현탁액의 생성을 허용한다. 다른 패널은 포유류 4 종에 대해 얻은 세포 현탁액을 보여줍니다. 샘플은 냉동 고환 조직의 기계적 해리에 의해 얻어지며 Hoechst로 염색되었다. SPG : Spermatogonia; SPC I : 1 차 Spermatocyte; SPC II : 이차성 Spermatocyte; SPD : Spermatid; SPZ : Spermatozoa. 슬라이드는 공 촛점에서 시각화되었습니다. (아래 패널) 또는없는 (위 패널) 백색 광 투과성 현미경. 스케일 바 = 20 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 : 마우스 고환 단일 세포 현탁액의 Ho-FACS에 의한 생식기 생식 세포 분리를위한 게이팅 전략. 살아있는 세포 (PI 음성)는 Hoechst 형광에 따라 분류됩니다. Spermatogonia (SPG)는 Hoechst-blue 및 red 형광 강도를 직접 플로팅하여 확인합니다. DNA content gate는 Hoechst blue 형광을 기반으로 세포를 분류하는 데 사용됩니다 : haploid (C); 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C). 히스토그램의 각 피크에있는 세포는 Hoechst 청색 및 적색 형광의 기능을 플로팅하여 분류됩니다. SPG : Spermatogonia; SPD : Spermatids; SPC II : 이차성 spermatocytes; SPC I : 일차 spermatocytes.d / 55913 / Supp_fig.2.tif ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 3 : 개 고환 단일 세포 현탁액의 Ho-FACS에 의하여 살아있는 남성 생식 세포의 분리를위한 게이팅 전략. 살아있는 세포 (PI 음성)는 Hoechst 형광에 따라 분류됩니다. Spermatogonia (SPG)는 Hoechst-blue 및 red 형광 강도를 직접 플로팅하여 확인합니다. DNA content gate는 Hoechst blue 형광을 기반으로 세포를 분류하는 데 사용됩니다 : haploid (C); 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C). 히스토그램의 각 피크에있는 세포는 Hoechst 청색 및 적색 형광의 기능을 플로팅하여 분류됩니다. haploid 세포를 함유하는 피크는 Hoechst blue intensity의 범위에 따라 세분화 될 수 있고 연장 된 spermatids (게이트 C ')와 둥근 spermatids (게이트 C ")의 두 가지 subperopulation을 나타냅니다. SPG : Spermatogonia; eSPD : 연장하는 spermatids; rSPD : 둥근 spermatids; SPC II :이차성 spermatocytes; SPC I : 일차 spermatocytes. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 4 : 기니피그 고환 단일 세포 현탁액의 Ho-FACS에 의하여 살아있는 남성의 생식 세포를 분리하기위한 게이팅 전략. 살아있는 세포 (PI 음성)는 Hoechst 형광에 따라 분류됩니다. Spermatogonia (SPG)는 Hoechst-blue 및 red 형광 강도를 직접 플로팅하여 확인합니다. DNA content gate는 Hoechst blue 형광을 기반으로 세포를 분류하는 데 사용됩니다 : haploid (C); 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C). 히스토그램의 각 피크에있는 세포는 Hoechst 청색 및 적색 형광의 기능을 플로팅하여 분류됩니다. SPG : Spermatogonia; SPD : Spermatids; SPC II : 이차성 spermatocytes; SPC I : 일차 spermatocytes. 여기를 클릭하십시오.이 파일을 wnload하십시오.
보충 도표 5 : 소형 돼지 고환 단일 세포 현탁액의 Ho-FACS에 의하여 살아있는 남성 생식 세포의 분리를위한 게이팅 전략. 살아있는 세포 (PI 음성)는 Hoechst 형광에 따라 분류됩니다. Spermatogonia (SPG)는 Hoechst-blue 및 red 형광 강도를 직접 플로팅하여 확인합니다. DNA content gate는 Hoechst blue 형광을 기반으로 세포를 분류하는 데 사용됩니다 : haploid (C); 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C). 히스토그램의 각 피크에있는 세포는 Hoechst 청색 및 적색 형광의 기능을 플로팅하여 분류됩니다. SPG : Spermatogonia; SPD : Spermatids; SPC II : 이차성 spermatocytes; SPC I : 일차 spermatocytes. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6 : 체세포 오염 물질 검사Ho-FACS 분류 된 집단의 이온. 3 개의 FACS subpopulation gate (AB)에서 약 600 개의 단일 세포 transcriptome의 t- 분포 확률 적 이웃 삽입 (t-SNE) 도표. t-SNE 플롯에서 각 점은 전 사체 공간에서 단일 셀의 고유 한 위치를 나타내며 각 셀은 FACS 부분 모집단 게이트 원점 (A)으로 표시됩니다. FACS 단일 세포 t-SNE 플롯 (B)의 세포 유형 특이 마커의 시각적 정량화. 체세포에서의 오염은 5 % 미만으로 추정되며 Ho-FACS 인구 게이트에 특이하지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
포유 동물의 정자 형성 과정에서 고도로 보존 된 염색질 동역학을 고려할 때,이 연구의 목적은 다른 포유류 고환 조직과는 다른 분화 단계에서 남성 생식 세포를 분리하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다 ( 그림 1 ). 다른 동물 모델에 단일 작업 흐름을 적용하는 데있어 주요 장애물 중 하나는 특히 조직 해리 프로토콜과 관련하여 종별 조정이 필요하다는 것입니다. 현재의 방법은 대부분 효소 조직 소화에 의존하며 프로토콜은 종내 에서조차 다양합니다 12 . 이 문제를 극복하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 포유류 종의 고환 샘플에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 기계적 조직 해리를 적용하는 방법을 보여줍니다. 결과는이 시스템과 함께 새로운 고환 조직의 기계적 해리가 잘 수행됨을 나타냅니다 ( 그림 2A -2B 20 의 이전 응용 프로그램과 유사합니다. 중요하게, Hoechst 염색은 단일 세포 현탁액의 품질에 유의 한 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 더 많은 세포 덩어리가 염색 된 샘플 ( 그림 2B )에서 볼 수 있지만, DNase ( 그림 2D ) 또는 NDA 20으로 치료하면이 문제를 예방할 수 있습니다. 이전 보고서는 고환 조직의 기계적 해리가 효소 조직 소화보다 좋거나 효율적이라고 제안합니다 5 , 20 . 따라서, 여기에 제시된 데이터는 기계적 해리가 Ho-FACS 처리를위한 고환 조직으로부터의 단일 세포 현탁액을 얻는 신뢰할 수있는 방법임을 나타낸다.
Hoechst와의 인큐베이션은 유동 세포 계측법에서 검출 된 신호에 영향을 미치기 때문에 중요한 단계입니다. 장기간의 염색은 배아 세포 유형의 더 나은 차별을 제공하지만세포 죽음과 세포 내 프로그래밍 22의 변화의 결과로 유독 할 수 있습니다. 이 방법으로 배양 세포 배양을 시도하는 사용자는 Hoechst 3 , 22 에 장시간 노출되었을 때의 유전 독성 효과를 평가하고 염색의 적절한 농도와 시간을 결정해야합니다. 30 분의 염색으로 배아 세포 집단을 안정적으로 분리 할 수 있었다 ( 그림 3B -3C ). 염색의 지속 시간은 Rodriguez-Casuriaga, et al.에 의해 보여지는 것처럼 잠재적으로 10 분으로 감소 될 수있다 . 20 , 관심 대상 종에 대한 사용자의 평가가 필요합니다.
가정 된 바와 같이, 4 가지의 배아 세포 집단을 일관되게 검출 할 수있다 - SPG, SPC I, SPC II 및 SPD - 시험 된 다른 종의 생식 세포의 염색질 변화에 기초 함 ( 그림 3B -3C 표 1 )에 대해 얻은 높은 순도를 가진 표적 세포 유형의 전체 농축을 보여주고 다른 포유류 종에 대한이 작업 흐름 ( 그림 1 )에서 채택 된 게이팅 전략을 지원합니다 ( 보충 그림 2- 5 ). 그럼에도 불구하고 사용자가 일부 개체군에서 검출 된 교차 오염을 줄이기 위해 관심있는 종 및 개체군에 따라 게이팅을 최적화하는 것이 좋습니다 (표 1). 이것은 염색 중 더 긴 배양 기간에 의해 달성 될 수있다.18 , 감소 된 유속 2 및 감소 된 게이트 크기. 시간은 또한 (1) 15 염료 유출로 인한 고환에서 희귀 세포 유형 이후 SPG는 분리하는 것이 더 어려운하다. Ho-FACS에 의해 SPG 집단을 탐지하는 것이 가능하지만, 줄기 세포 생물학에만 초점을 맞춘 연구는 Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS; 23 )과 같은보다 엄격한 기술의 이점을 누릴 수 있습니다. 주목할 만하게, SPD (eSPD와 rSPD)의 subpopulations은 개를 위해 명확하게 구별 될 수 있었다 그러나 다른 종 ( 그림 3C 및 보충 숫자 3)를 위해 아닙니다. 잠재적으로 이러한 하위 집단은 마우스 5 의 작성자가 설명한대로 게이팅 설정을 조정하여 해결할 수 있습니다. Hoechst 청색 / 적색 형광의 기능을 플로팅하기 전에 세포 크기 및 입도 (FSC VS SSC)에 대해 생성 된 Cytogramnce는 둥근 (높은 FSC + SSC) spermatid subpopulation에서 연신 (낮은 FSC + SSC)을 구별합니다. 원형 및 연장하는 spermatid subpopulations의 분리는 정자 분화 동안 발생 특정 분자 이벤트에 새로운 통찰력을 가져다 spermiogenesis의 깊이 조사를 허용합니다. 또한, 마우스 1 , 2 , 12에 대해 설명한 바와 같이, FACS 게이트를 조정하여 감수 분열 단계의 추가 해상도를 얻을 수 있습니다. 그러한 접근은 감수성 사건에 대한 비교 연구에 큰 도움이 될 것이다. Ho-FACS 동안 세포의 완전성이 방해 되긴하지만,이 방법으로 분류 된 세포에 대해 얻은 단일 세포 RNA 서열 분석 데이터 (Jung et al. , 미 출판 , 보충 그림 6 )는 이것이 생식 세포의 분자 연구를위한 세포를 얻기위한 신뢰할 수있는 접근법임을 나타낸다 생물학. 그럼에도 불구하고, r과 같은 생식 분석을 수행하려는 사용자Ho-FACS에 의해 분리 된 세포를 사용하여 ound spermatid injection (ROSI)을 실시하면 정렬 된 세포의 생존력을 평가해야하며 대체 방법 24 , 25 를 탐구 해 볼 수 있습니다.
요약하면,이 연구는 다른 포유류에서 고환 세균 세포를 분리하고 이전에 확립 된 기술 2 , 12 , 20 에 상세 검색을 추가하고 추가하는 표준화 된 방법을 설명합니다. 이러한 표준화는 서로 다른 포유 동물 종에 대해 한 세트의 시약과 단일 작업 흐름을 사용할 수있게하여 생식 세포 생물학에 대한 비교 연구를위한 데이터 생성을 용이하게합니다. 또한, 기계적 조직 해리는 설명하기가 거의 불가능한 방법 론적 가변성을 도입 할 수있는 종 특정 조정의 장벽을 극복합니다. 또한, 실행 시간과 조작을 줄이면 ex vivo에서의 섭씨를 제한 할 수 있습니다.최소 생리학. 이와 관련하여, Ho-FACS는 STA-PUT 및 elutriation 6 , 7 과 같은 다른 배아 세포 분리 방법과 비교할 때 상당히 빠릅니다. 또한 동일한 실험에서 4 개의 세균 집단을 동시에 분리하는 것은 FACS에 의해서만 가능합니다. Hoechst 염료의 특성을 감안할 때, 세포 구조와 RNA 종은 보존되며, 따라서 세포는 더 많은 하류 분자 연구에 사용될 수 있습니다. 중요한 것은, Ho-FACS가 세균 세포 유형을 구별하기 위해 염색질 특성에 의존하기 때문에, 5 종의 다른 종에서이 워크 플로우의 성공적인 수행은 다른 포유류에 대한 적용을 강력히지지한다. 결과는 정자 형성이 단일 프로토콜을 사용하여 많은 포유류 종에서 처리 될 수있는 세포 분화의 독특한 과정 일 수 있음을 제시한다. 이와 같이, "omics"및 시스템 생물학 시대에서,이 기술은 진화론 적 응용을위한 수단을 제공합니다정자 형성 과정 전반에 걸친 후성 유전학, 규제 및 단백질 다양성에 대한 연구를 포함하여 남성 생식 세포 생물학에 관한 질문을 던집니다.
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Disclosures
모든 저자는 경쟁적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자들은 개 고환에 대한 Hillside Animal 병원 (St. Louis, MO)에 감사드립니다. 제이슨 아 랜드 (Jason Arand)와 테드 시세로 (Ted Cicero) 박사는 워싱턴 대학 (세인트 루이스 워싱톤 대학)에서 쥐의 고환 및 Brianne Tabers에게 수집을 돕기위한 실험실을 제공했습니다. Jared Hartsock과 WashU의 Dr. Salt 's Lab (기니 피그 고환 검사); 소형 돼지 고환에 대한 WashU의 비교 의학 부문의 Michael Talcott 박사. 저자들은 또한 직원이 운영하는 세포 분류 서비스를 제공하는 Siteman Flow Cytometry Core의 사용을 위해 워싱턴 주립대 학교의 Alvin J. Siteman Cancer Center와 St. Louis의 Barnes-Jewish Hospital을 인정했다. Siteman Cancer Center는 부분적으로 NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842에서 지원됩니다.
이 연구는 미국 국립 보건원 (R01HD078641 및 R01MH101810 ~ D)의 보조금으로 FCT 박사 과정 (SFRH / BD / 51695 / 2011 to ACL)FC] 및 FCT 연구 계약서 [IF / 01262 / 2014 to AML]가 포함됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
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- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
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