Summary
Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.
Abstract
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een van de methoden van keuze om verrijkte populaties van zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Momenteel staat het voor de discriminatie van maximaal 9 muizenkiemcelpopulaties met een hoge opbrengst en zuiverheid. Deze hoge resolutie in discriminatie en zuivering is mogelijk door unieke veranderingen in de chromatinstructuur en de hoeveelheid door middel van spermatogenese. Deze patronen kunnen worden gevangen door stromingscytometrie van mannelijke kiemcellen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen, zoals Hoechst-33342 (Hoechst). Hierin is een gedetailleerde beschrijving van een recent ontwikkeld protocol om zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Kortom, enkelvoudige cel suspensies worden gegenereerd uit testiculair weefsel door mechanische dissociatie, dubbel gekleurd met Hoechst en propidiumjodide (PI) en verwerkt door flowcytometrie. Een seriële gate strategie, inclusief de selectie van levende cellen (PI negatief) met verschillende DNA-inhoud (Hoechst intensiteit), iS gebruikt tijdens het sorteren van FACS om maximaal 5 soorten kiemcel te onderscheiden. Deze omvatten, met bijbehorende gemiddelde zuiverheden (bepaald door microscopie-evaluatie): spermatogonia (66%), primaire (71%) en secundaire (85%) spermatocyten, en spermatiden (90%), verder gescheiden in ronde (93%) en verlenging (87%) subpopulaties. Uitvoering van de gehele workflow is eenvoudig, het is mogelijk om tegelijkertijd 4 cellen te isoleren met de betreffende FACS-machine en kan binnen 2 uur uitgevoerd worden. Aangezien verminderde verwerkingstijd cruciaal is om de fysiologie van ex vivo cellen te behouden, is deze methode ideaal voor downstream high-throughput studies van mannelijke kiemcelbiologie. Bovendien elimineert een gestandaardiseerd protocol voor het zuiveren van zoogdierkiemcellen door middel van multispecies methodologische bronnen van variabelen en maakt het mogelijk om een enkele reeks reagentia te gebruiken voor verschillende diermodellen.
Introduction
Gezien het gebrek aan een in vitro systeem dat representatief is voor de progressie van spermatogenese en de aanwezigheid van grote cellulaire heterogeniteit in testis, vereist studies van mannelijke kiemcelbiologie robuuste technieken om verrijkte populaties van specifieke celsoorten te isoleren. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is algemeen gebruikt voor dit doel 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , omdat het hoge opbrengst en zuiverheid levert en andere isolatiemethoden overschrijdt in het aantal soorten kiemcellen die het kan identificeren en Selecteer 6 , 7 , 8 . Het principe van flow cytometry analyse is gebaseerd op de detectie van differentiële lichtpatronen na laserstraal excitatie van enkele cellen. Als een cel door de laser gaat, weerspiegelt / verspreidt het lichtIn alle hoeken, evenredig met de celgrootte (forward scatter; FSC) en intracellulaire complexiteit (side scatter; SSC). Zie Ormerod 9 voor gedetailleerde informatie over flowcytometrie.
Mannelijke kiemcellen ondergaan specifieke modificaties in DNA-inhoud, chromatinstructuur, grootte en vorm gedurende verschillende fases van spermatogenese. Dergelijke afzonderlijke celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd en gescheiden door het combineren van lichtverstrooiing en DNA-kleuring met fluorescerende kleurstoffen 10 , 11 . Verschillende kleurstoffen kunnen hiervoor worden gebruikt (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), zoals Hoechst-33342 (Hoechst), die in de loop van het decennium 1 , 2 , 4 , 10 vaak gebruikt is in de flowcytometrie analyse van testiculaire cellen. , 12 . upoN excitatie met UV-licht, geeft Hoechst blauwe fluorescentie die evenredig is aan het cellulaire DNA-gehalte, terwijl de verre rode fluorescentie de variabiliteit in chromatinstructuur en verdichting 1 , 13 , 14 weerspiegelt. Als gevolg hiervan vertoont mannelijke kiemcellen in verschillende stadia van differentiatie specifieke patronen tijdens FACS van Hoechst-gekleurde enkele cel suspensies (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant is dat de intensiteit van Hoechst-blauwe fluorescentie niet in verhouding staat tot het chromatinegehalte in deze cellen, doordat het een effectieve kleurstofuitvloeisel is die alleen actief is tijdens het spermatogonale stadium, en ze clusteren als zijpopulatie tijdens Ho-FACS 15 . Bovendien combineert het combineren van Hoechst-kleuring met het niet-permeante kleurstofpropidiumjodide (PI) gebruikers de mogelijkheid om live (PI-negatief) te onderscheiden van dode (PI positieve) cellen tijdens FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Deze strategie is eerder gebruikt in flowcytometrische analyses van testische kiemcellen en is uitgebreid geoptimaliseerd in de muis om maximaal 9 kiemcellen te onderscheiden, waaronder cellen in 4 verschillende stadia van meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Voor dit werk heeft Hoechst-kleuring drie voornaamste voordelen. Ten eerste is Ho-FACS succesvol toegepast op de isolatie van mannelijke kiemcellen in het muismodel 1 , 2 , 12 en andere knaagdieren zoals rat en cavia 17 , 18 , 19 . Ten tweede, Hoechst is een celdoorlatende kleurstof en vereist geen membraanpermeabilisatie, zodat het zich voordoetVes celintegriteit. Tenslotte is geen RNase-behandeling nodig, aangezien Hoechst bij voorkeur aan poly (d [AT]) DNA-sequenties 1 , 20 bindt, wat betekent dat RNA bewaard blijft en naast DNA en eiwitten kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse moleculaire studies van kiem Celdifferentiatie.
Ondanks de gelijkenis in DNA-ploïdie en / of vlekkelijkheid waargenomen in flowcytometrie-analyses van zoogdiersoorten (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), is er een grote mate van variabiliteit in de protocollen beschreven voor mannelijke kiemcelisolatie door flowcytometrie. Verschillende studies hebben specifieke protocols toegepast voor weefseldissociatie, en gebruikten afzonderlijke DNA-bindende kleurstoffen (alleen of in combinatie) en FACS-gatingstrategieën in verschillende modelorganismen, vooral de muis, de rat en de cavia. Bijgevolg kan directe vergelijking van gegevens verzameld voor verschillende soorten worden beïnvloed door unaccoUnted technische artefacten die voortvloeien uit variabiliteit tussen methodologieën. Belangrijk is dat het opvallende behoud van chromatin dynamiek door middel van zoogdierspermatogenese (2N-4N-2N-1N) suggereert dat een gestandaardiseerd protocol transversaal toegepast kan worden op een verscheidenheid aan zoogdieren.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een enkele workflow die van toepassing is op verschillende zoogdieren, door het combineren en aanpassen van eerder gepubliceerde technieken 2 , 20 . Standaardisatie van een werkwijze voor weefselverwerking werd bereikt door mechanische dissociatie te verrichten om de behoefte aan speciesspecifieke aanpassingen die nodig zijn voor enzymatische vertering 5 te overwinnen. Het is opmerkelijk dat mechanische dissociatie van knaagdiertesticulaire weefsels is aangetoond dat ze beter presteren dan enzymatisch weefselvertering 20 en Ho-FACS van enkelcelsuspensies die worden gegenereerd door beide methodenHet vergelijkbare resultaat 5 . Als principieel bewijs beschrijft dit protocol de instellingen die worden gebruikt om tot 5 kiemcelpopulaties te isoleren: spermatogonia (SPG); Primaire (SPC I) en secundaire spermatocyten (SPC II) en spermatiden (SPD) - ronde (rSPD) en verlenging (eSPD). Belangrijk is dat het gemakkelijk in het laboratorium kan worden geïmplementeerd, waarbij de belangrijkste vereisten het systeem zijn voor weefseldissociatie en toegang tot een celsoort uitgerust met een UV-laser. Deze workflow ( Figuur 1 ) is snel en eenvoudig en maakt het mogelijk dat 4 kiemcellenpopulaties tegelijkertijd uit vers testikelweefsel in minder dan 2 uur worden verwijderd. De verminderde verwerkingstijd is van cruciaal belang om de cellulaire integriteit te behouden voor verdere downstream procedures. Bovendien suggereert de succesvolle prestatie in 5 verschillende soorten dat het in het zoogdierklauw in grote mate kan worden toegepast, waardoor het de ideale methode is om kiemcellen te isoleren voor vergelijkende studies van zoogdieren mannelijke voortplantingsbiolgie.
Dit protocol bestaat uit drie hoofdafdelingen, afgezien van voorbereidende stappen: (1) de mechanische dissociatie van testicularweefsel en (2) kleuring van testiculaire cellen met Hoechst en PI, gevolgd door (3) FACS-sortering van relevante spermatogene cellen. Eenmaal verzameld, kunnen deze verrijkte bevolkingen van verschillende zoogdier testulaire kiemcellen gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen. Dit protocol beschrijft een dissociatiemethode met een grootte van één maat, om mannelijke kiemcellen van veel verschillende zoogdieren te zuiveren. Afhankelijk van het type studie dat gebruikers met de geïsoleerde kiemcellen willen uitvoeren, kunnen andere media of buffers worden gebruikt. De volgende protocol stappen zijn voor het opwekken van enkel-cel suspensies van één hele murine testis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hieronder beschreven zijn, zijn in overeenstemming met de voorschriften van het Comité voor dierstudies aan de Universiteit van Washington in St. Louis.
1. Voorbereidingen voor mechanisch dissociatieprotocol
- Pre-nat een 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge voor dissociatie van een hele muizen testis.
OPMERKING: Deze disposable weefsel disaggregatie cartridge bevat microbladen ontworpen voor het snijden van weefsels en een onbeweeglijk staal gaas met ongeveer 100 zeshoekige gaten. Verschillende maten van mesh voor weefsel disaggregatie cartridge zijn beschikbaar om dit protocol aan te passen op basis van soorten en gewenste celtypes. 50 μm cartridges werden gebruikt voor alle zoogdieren die in dit document genoemd worden.- Laad 1 ml ijskoude fenol roodvrij 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) op de 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge.
OPMERKING: Fenol rood kan interfereren met detectie van rode fluorenCence tijdens FACS. - Aspireren 1x DMEM uit de weefsel disaggregatie cartridge met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort.
- Laad 1 ml ijskoude fenol roodvrij 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) op de 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge.
- Schakel het weefselafscheidingssysteem in door op "ON" te drukken. Dit systeem vereist geen "opwarmen" tijd.
- Voor-nat drie 40 μm wegwerpfilters met ijskoud 1x DMEM. Plaats elk 40 μm wegwerpfilter op een 50 ml conische buis. Pipetteer 1 ml 1x DMEM en laat de vloeistof doorgaan.
- Bereid een 100 mm x 15 mm Petri schotel voor het verzamelen van testicularweefsels. Pipet 500 μL van 1x DMEM op de Petri-schotel.
2. Bereiding van testicularweefsel voor mechanisch dissociatieprotocol
- Dissecteer een mannelijke muis om verse gehele testes of testikelfragmenten voorzichtig te verwijderen (bij het omgaan met andere zoogdieren) met chirurgische scharen en pincetjes.
OPMERKING: Zorg ervoor dat weefsels vrij zijn van vet en necrose. fr Esh testiculaire weefsels produceren superieure single-cell suspensie kwaliteit dan bevroren weefsels.- Verzamel verzamelde testes / fragmenten naar de voorbereide 100 mm x 15 mm Petri schotel die 500 μL 1x DMEM bevat.
- Spoel het weefsel voorzichtig in 1x DMEM om rode bloedcellen te verwijderen (indien aanwezig).
- Trek de tunica albuginea voorzichtig uit. De dikte van tunica albuginea zal variëren in verschillende soorten.
- Pak een uiteinde van testis met tang.
- Puncteer het andere uiteinde van testis met een scalpel terwijl u het ene uiteinde van de testis nog steeds vasthoudt met een tang van de vorige stap.
- Scrape testicular tubules met behulp van een scalpel terwijl nog het ene uiteinde van testis met tang van stap 2.2.1.
- Knip testicularbuisjes in stukken van 2-3 mm 3 met een scalpel.
3. Verkrijgen van eencelsuspensies door mechanische dissociatie van testicularweefsel
Ontent "> OPMERKING: De dissociatiestappen die hieronder worden beschreven, zijn voor een volwassen muis testis. Volumes testicularweefsels van jonge muizen of niet-muizen soorten moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Juveniele dieren mogen niet alle stadia van kiemcellen bevatten. Sommige zoogdiersoorten hebben Testiculaire weefselsamenstelling verandert tijdens de broeizoenen in vergelijking met het niet-parende seizoen.- Breng de kleine testikelbuisjes over naar de voorvervette 50 μm weefselafbraakpatroon met behulp van tang en voeg 1 ml 1x DMEM toe.
- Laad de weefselafbraakpatroon in weefselafscheidingssysteem en verwerk deze gedurende 5 minuten door de knop van stand-by naar de "run" -modus te draaien.
- Verwijder de weefselafbraakpatroon uit het weefselsistaggregatiesysteem en aspireer de cel suspensie met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort.
- Aspireer een paar keer om alle vloeistof te verwijderen uit weefsel disaggregatie cartridge. NietAlle 1 ml kan worden hersteld uit de weefsel disaggregatie cartridge.
- Pass de gesuspendeerde cel suspensie door twee wegwerpvaste 40 μm filters. Filter tweemaal om eventuele celaggregaten te verwijderen.
- Plaats een voorverstoken 40 μm filter in een 50 ml conische buis. Voeg aspirated cellen direct in de spuit op het 40 μm filter. Pipet-door-eenzijdige suspensie met een wegwerppipet.
- Verwijder het gebruikte voorgelaste 40 μm filter en plaats een ander voorverstoken 40 μm filter in de 50 ml conische buis. Pipet de verzamelde enkelcelsuspensie op het schone 40 μm filter.
- Verzamel gefilterde enkelcelsuspensie met een schone wegwerppipet.
- Pipette gefilterde cel suspensie terug naar de 50 μm weefsel disaggregatie patroon en proces gedurende nog eens 5 minuten in een weefsel disaggregatie systeem.
- Herstel alle vloeistof uit de weefsel disaggregatieOp de cartridge.
4. Verven met Hoechst en Propidiumjodide (PI)
- Overdracht herstelde cel suspensie van de 50 μm weefsel disaggregatie cartridge naar een schone 1,5 ml buis. Ongeveer 1-1,5 ml single-cell suspensie wordt hersteld.
- Verdeel de herstelde enkelcelsuspensie in vier 1,5 ml of 5 ml buizen.
- Voor de eerste drie buizen, pipette 150 μL single-cell suspensie en pipette rest van een-cel suspensie in de laatste van de vier buizen (ongeveer 550 μL single-cell suspensie).
OPMERKING: Het bedrag van eencelsuspensie in de laatste buis kan variëren op basis van de efficiëntie van celsuspensieherstel bij stap 3.6.
- Voor de eerste drie buizen, pipette 150 μL single-cell suspensie en pipette rest van een-cel suspensie in de laatste van de vier buizen (ongeveer 550 μL single-cell suspensie).
- Zet de eerste buis van de vier buizen als een onbedekte controle voor de FACS-sessie.
- Bereid enkele kleurstofkleuren (PI of Hoechst) cel suspensies als controles op. Voeg 2,5 μL Hoechst of 1 μl PI aan elke buis toe (tweede en third).
- Maak een dubbelkleurige buis klaar. Dit wordt gebruikt voor het verzamelen van kiezelcel subpopulaties. Voeg 2,5 μL Hoechst en 1 μl PI toe aan de laatste buis.
OPMERKING: Hoechst heeft een houdbaarheid van 2-3 maanden. Het gebruik van oudere voorraden kleurstof zorgt voor significante veranderingen tijdens de FACS-sessie. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Plaats monsters in een buisrotator of draai de 1,5 ml buizen om om de 5-10 minuten.
- Filtercelsuspensie met een voorvochtige 40 μm filter en hou de gefilterde oplossing op ijs en in het donker tot de FACS sessie.
OPMERKING: De filtratiestap is nodig om celcellen voor FACS te voorkomen. Daarnaast kan de behandeling met DNase (zie Figuur 1 ) of 2-Naphthol-6,8-disulfonzuur-dikaliumzout (NDA 20 ) worden gebruikt om celklontering te beperken. Langdurige wachttijden zullen invloed hebben op het fluorescerende signaal dat gedetecteerd wordt tijdens FACS en kan leiden tot een verhoogde celdood.5. Fluorescentie Geactiveerde Cell Sorting (FACS) Setup en Zuivering van Testiculaire Cellen
- Bereid FACS-buizen op.
- Bedek 5 ml polypropyleen ronde bodembuizen of 1,5 ml buizen met 400 μL FBS voor celverzameling. Decant overtollig FBS na coating.
- Voeg FACS verzamelmedium (1x DMEM + 10% Fetale Bovine Serum, FBS) toe aan de buizen: 1 ml voor 5 ml buizen of 100 μl voor 1,5 ml buizen.
- Stel de juiste sorteringsomstandigheden in cel sorteren en software op.
OPMERKING: Andere celsorteringsmachines en analysesoftware kunnen worden gebruikt bij de hieronder beschreven vergelijkbare setup- en gateway-strategieën. De hier beschreven omstandigheden werden aangepast uit Gaysinskaya en Bortvin 2 , Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 en Getun, et al. 4- Laad een ultraviolette laser met 463/25 nm bandpasfilter om Hoechst blauw en 680 nm LP-bandfilter te detecteren om Hoechst rood te detecteren en PI te detecteren.
- Gebruik een 555DLP dichroische spiegel om blauw te onderscheiden van rode fluorescentie.
- Gebruik een 70 μm spuitmond en sorteer cellen met een snelheid van 1000-2000 cellen / seconde.
OPMERKING: Sorteringsefficiëntie wordt direct beïnvloed door de stromingssnelheid. Hoge stromingssnelheden (> 3500 gebeurtenissen / s) verhogen de snelheid van sorteren, maar resulteren in vervuiling van populaties. Zie referentie 12 voor verdere informatie.
- Zet poorten met controle monsters.
- Laad en run onbeschadigd monster.
- Exclusief celresten op basis van FSC vs SSC plot patroon. Cell puin komt in het linker linker kwadrant van het plot op. Stel de drempel voor celresten willekeurig door de gebruiker of de cel sorteren technicus.
- Poort op enkele cellen door de drempel voor FSC en pulsbreedte aan te passen. Verschillende celsorterers hebben verschillende manieren om te onderscheidenGuish singlets. Aangezien de pulsbreedte de tijdscellen weerspiegelt om de laser over te gaan, hebben enkele cellen lagere waarden in vergelijking met multicellulaire aggregaten. Het instellen van drempel op een plot voor FSC versus pulsbreedte kan gebruikt worden voor singlets.
- Stel optimale fotomultiplierbuis (PMT) spanningen in.
- Gebruik zowel onbeschadigde als enkelkleuren gekleurde cellen om de drempel van PI of Hoechst fluorescentiesignaal vast te stellen.
OPMERKING: Het is belangrijk om de basislijn PTM spanningen te optimaliseren voor de cellen van belang om het juiste fluorescentiebereik voor elke kleurstof te bepalen. Dit is cruciaal voor optimale signaaldetectie en gevoeligheid. De onbeschadigde en enkelgekleurde controlecellen worden gebruikt om een reeks van negatief en positief gekleurde cellen te bepalen met PI- en / of Hoechst-kleurstoffen en minimaliseert ruis in signalen. Voor nadere uitleg over de optimalisatie van PMT-spanning met behulp van controlecellen, verwijzen wij u naar Gaysinskaya en Bortvin 2 - Poort op levende celS gebaseerd op PI-kleuring (PI-negatief) en FSC-plot. Dode cellen zullen positief zijn voor PI-fluorescentie.
- Stel de DNA-inhoudshek in door een histogram van celtellingen te berekenen op basis van Hoechst Blue Fluorescence. 3 pieken met toenemende concentraties Hoechst blauwe fluorescentie zouden moeten verschijnen, die haploïde (1C), diploïde (2C) en tetraploïde (4C) cellen vertegenwoordigen. Stel 3 poorten in, één voor elke piek.
- Let op minstens 500.000 gebeurtenissen op FSC vs SSC plot voordat u verder gaat naar de kiemcelpopulaties.
- Poort verschillende kiemcel populaties.
- Laad Hoechst / PI bevlekte monster.
- Stel de eerste 3 ouderpoorten vast die gemeenschappelijk zijn voor alle populaties.
- Exclusief celresten op basis van de FSC vs SSC plot. Selecteer singlets op basis van de FSC vs pulsbreedte plot. Selecteer levende cellen door PI negatieve cellen te geven.
- Definieer spermatogonia gate.
- Plot PI negatieve cellen op basis van Hoechst blauwe en rode fluorescentieintensiteiten. Spermatogonia verschijnt als een zijpopulatie (zie figuur 1 ).
- Definieer poorten voor de overgebleven kiemcelpopulaties. OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor visuele details.
- Plot PI negatieve cellen in de DNA-inhoudshek.
- Voor spermatiden poort de piek met de laagste Hoechst fluorescentie (1C).
- Voor spermatocyten II, poort de piek met intermediaire Hoechst fluorescentie (2C).
- Voor spermatocyten ga ik de piek met hoogste Hoechst fluorescentie (4C).
- Plot Hoechst blauwe en rode fluorescentie-intensiteit om spermatocyten en spermatidenpopulaties uit DNA-inhoudshekken te verfijnen.
- Verzamel de geselecteerde subpopulatie poorten in de eerder verzamelde collectiebuizen. Elke testis zal gemiddeld 45 minuten tot 1,5 uur nemen om ongeveer 0,5-6,0 x 10 6 cellen te verzamelen voor elke subpopulatie.
OPMERKING: Langdurige celblootstelling bij Hoechst maY verplaats de locatie van de populaties met de tijd iets. Vernieuw de instellingen na 20-30 minuten FACS. Maximale opbrengst voor elke subpopulatie zal afhankelijk zijn van de efficiëntie van dissociatiestap.
6. Microscopische evaluatie van gezuiverde cellen
- Spin verzamelde cellen bij 500-600 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Cel-pellet opnieuw opschorten met 1 ml ijskoude 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) of 1x DMEM.
OPMERKING: Het re-suspension volume kan worden aangepast aan het aantal gesorteerd cellen en de gewenste eindconcentratie. - Pipetteer 40 μl gewassen cellen op een schone glijschuif en plaats een deksel.
- Bevestig de resterende cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) en zet vast cellen bij 4 ° C in het donker voor toekomstige verwijzing.
- Pipet 100 μL 4% PFA direct in de verzamelbuizen.
- Vortex de buizen of pipet kortstondig om ervoor te zorgen dat de cel suspensie goed gemengd wordt.
- Visualiseer de voorbereide dia's in een microscoop uitgerust met een UV-lamp om Hoechst-fluorescentie te detecteren onder een 63X-doelstelling. Raadpleeg de sectie Resultaten - Morfologische evaluatie van gesorteerde kiemcellenpopulaties - voor meer informatie over het identificeren van specifieke kiemceltypes.
- Bereid FACS-buizen op.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkelvoudige cel suspensies van mechanische dissociatie van testiculair weefsel
Figuur 2 vergelijkt enkele cel suspensies verkregen door mechanische dissociatie van muis testicular weefsel onder verschillende omstandigheden. Monsters verkregen door het verwerken van vers weefsel, onbeschadigd ( Figuur 2A ) of gekleurd met Hoechst ( Figuur 2B ), tonen de aanwezigheid van enkele cellen in verschillende stadia van differentiatie, en belangrijker blijkt de cellulaire structuur te worden bewaard, waaronder flagella van spermatozoa. Hoewel er in de gekleurde monsters een aantal clumping en puin werd waargenomen, die werd verminderd door DNase na dissociatie toe te voegen ( Figuur 2D ), duiden deze resultaten aan dat Hoechst-kleuring de kwaliteit van de enkele cel suspensies niet significant verandert. Interessant genoeg, enkelvoudige cel suspensieEnsionen kunnen ook worden verkregen uit bevroren weefsel voor de muis ( figuur 2C ) en andere zoogdieren - rat, hond, cavia en mini-varken ( aanvullend figuur 1 ) door mechanische dissociatie. Verschillende celtypes zijn zichtbaar en herkenbaar in die monsters; De verwerking van bevroren weefsel lijkt echter te leiden tot een verhoogde celdood en clumping en een algehele lagere cellulaire opbrengst. Als zodanig wordt het sterk aanbevolen om enkelcelsuspensies uit vers weefsel voor verdere downstream toepassingen te bereiden.
De kwaliteit van enkelcelsuspensies, bereid uit vers testicularweefsel van muis, rat, hond, cavia en mini-varken, werd beoordeeld tijdens Ho-FACS ( Tabel 1 ). Na uitsluiting van cellulaire rommel zijn 95,7-98,4% van de cellen singleten, en van die 86,5-93,8% leven, zoals getoond door kwantificering van PI-negatieve cellen (zie protocol ). Deze resultatenTs geven aan dat mechanische dissociatie een betrouwbare methode is voor het bereiden van enkele cel suspensies voor stromingscytometrie uit testiculair weefsel van verschillende zoogdieren.
Ho-FACS om kiemcellen te isoleren uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren
Na mechanische dissociatie worden single-cell suspensies gemengd met Hoechst en PI en verwerkt door FACS. Zoals hierboven vermeld, laat Hoechst-kleuring discriminatie van cellen in verschillende stadia van differentiatie toe op basis van chromatinhoeveelheid en structuur, terwijl PI-kleuring van niet-permeabiliseerde cellen levend van dode cellen scheidt. Daarom, na het filteren van celresten en multicellulaire aggregaten, selecteert de PI-cel cellen met intacte membranen (PI negatief; Figuur 1 ). Levende cellen worden dan geanalyseerd op basis van Hoechst fluorescentie: blauw is evenredig aan DNA-inhoud en stijgt roodFluorescentie weerspiegelt minder gecondenseerde chromatine en structurele variaties. Als zodanig wordt verwacht dat mannelijke kiemcellen van verschillende stadia clusteren in specifieke gebieden van cytogrammen die de functie van blauwe / rode Hoechst-fluorescentie plotten ( Figuur 3A ).
Inderdaad tonen de Ho-FACS-percelen die voor de verschillende soorten worden gegenereerd de aanwezigheid van afzonderlijke celpopulaties op basis van Hoechst-fluorescentie ( Figuur 3B -3C ). Hoewel deze percelen voldoende om kiemcel populaties onderscheiden, kan een DNA-inhoud (C) poort definiëren 2 kruisbesmetting te beperken. Deze poort wordt gegenereerd door een histogram van celtellingen in functie van Hoechst Blue Fluorescence Intensity. Voor alle soorten kunnen drie pieken gedetecteerd worden en cellen vertegenwoordigen met 1C, 2C en 4C ( Figuur 1 en aanvullende figuren 2-5 ). Opmerkelijk, zoals previOnafhankelijk genoemd, spermatogonia is een zijpopulatie en kan niet betrouwbaar gated zijn op basis van histogrammen van DNA-inhoud. Vandaar dat deze populatie is afgesloten na uitsluiting van dode cellen, gebaseerd op Hoechst blauw / rood fluorescentie plots ( Figuur 1 ). Deze strategie is weergegeven in Figuur 1 voor de rat en aanvullende figuren 2-5 voor de resterende soorten. Het is belangrijk om op te merken dat, aangezien Hoechst fluorescentie alleen de verschillende soorten kiemcellen kan onderscheiden, zijn beide PI- en DNA-inhoudshekken optioneel. Ze werden opgenomen in deze strategie om livecellen te selecteren en respectievelijk te verminderen. Zoals in Tabel 1 samengevat, weerspiegelt kwantificering van cellen in de DNA-inhoudspoort het relatieve aandeel van cellen in verschillende stadia van spermatogenese. Zoals verwacht zijn 1C cellen de meest voorkomende en vertegenwoordigen spermatide populaties, gevolgd door 2C cellen (SPC II) en 4C cellen (SPC I). ImportaNtly wordt dit patroon over soorten behouden en kleine verschillen kunnen de interspecifieke variabiliteit in kiemcellen en de cycli van het semifinale epithelium 21 weerspiegelen.
Na Ho-FACS kan de celintegriteit worden beoordeeld met behulp van Trypan blue staining. Het aandeel van de levende cellen na 1 uur van FACS varieerde van 27% (SCP I) tot 67% (SPD) voor de muis, wat aangeeft dat de duur van sortering en blootstelling aan Hoechst de dood van de cel vergroot. Voor gebruikers die naar de gekweekte cellen kijken, moet de Hoechst-concentratie en de duur van Ho-FACS worden aangepast om de overleving van de cellen te verbeteren. Niettemin is RNA sequencing data gegenereerd voor afzonderlijke cellen die zijn geïsoleerd met behulp van deze methode (Jung et al ., Ongepubliceerd), wat aangeeft dat deze cellen geschikt zijn voor moleculaire studies van kiemcelbiologie. Deze dataset werd gebruikt om mogelijke verontreiniging van kiemcelpopulaties met somatische cellen te detecteren ( Aanvullend Figuur 6
Morfologische evaluatie van gesorteerde kiemcellenpopulaties
Aangezien kiemcellen drastische morfologische veranderingen ondergaan tijdens de spermatogenese, is het mogelijk om de zuiverheid van geïsoleerde populaties door microscopie te schatten. Als referentie illustreert Figuur 4 de algemene morfologie van verschillende mannelijke kiemcellen soorten van 4 zoogdier soorten (uit Lima, et al. 5 ). Chromatinverdeling en condensatie, evenals celgrootte en vorm, tonen unieke en goed gekenmerkte patronen in verschillende celsoorten. SPG hebben duidelijke pericentrische heterochromatine, die helder voor Hoechst vallen, en zijn klein en rond in vorm (Spg in Figuur 4B ). Spermatocyten zijn grotere gegranuleerde cellen. Nucleus van SPC I is gemakkelijk te identificeren, met chromatin variatieNs karakteristiek voor meiotische cellen (Spc I in Figuur 4B ), terwijl SPC II geblokkeerd of in diakinesis (Spc II in Figuur 4B ) is. Tenslotte zijn SPD kleine haploïde cellen met ronde of langwerpige vorm (Spd in Figuur 4B ). Met name, rSPD zijn vergelijkbaar met SPG in grootte en vorm, maar duidelijk onderscheiden door de aanwezigheid van gelokaliseerde chromocenters. Op basis van deze kenmerken werden gesorteerd celpopulaties geëvalueerd voor de verrijking van specifieke celsoorten ( Tabel 1 ). SPD- en SPC II-populaties waren sterk verrijkt voor het celtype van belang, terwijl SPC I en SPG enige mate van verontreiniging met andere celtypen vertoonden, met name voor de proefjes van Guinea Pig en Mini Pig. Interessant genoeg was voor de hondenmonster de gatstrategie voldoende om ronde van langwerpige spermatiden te onderscheiden ( Figuur 3C ; Aanvullend Figuur 3 ; Tabel 1
Figuur 1: Werkstroom van Ho-FACS isolatie van zoogdier mannelijke kiemcellen. Deze afbeelding illustreert het algemene protocol voor kiemcelisolatie van zoogdierkiemcellen, met representatieve gegevens van de toepassing van dit protocol op rattestis. Ho: Hoechst. Uit Lima, et al. 5 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Enkele cel suspensies gegenereerd door mechanische dissociatie van Muis testicular weefsel. Monsters verkregen uit vers weefsel ( AB ) tonen een verscheidenheid aan intacte kiemceltypes en zeer weinig puin. In vergelijking met onbeschadigde cellen ( A ) werd een aantal celklonking waargenomen voor Hoechst-gebleekte cel suspensies ( B ), die kan worden verminderd door DNase (eindconcentratie van 10 μg / ml) onmiddellijk na dissociatie ( D ) toe te voegen aan het monster. Bevroren testiculaire weefsel kan ook gebruikt worden om enkele cel suspensies te verkrijgen door middel van mechanische dissociatie ( C ). Het blijkt echter dat het proces van flashvriesen en ontdooien voorafgaand aan weefseldissociatie resulteert in meer puin, cellood en algehele minder cellulaire opbrengst. Na dissociatie (zie protocol) werden monsters gedurende 10 minuten bij 4 ° C gespoeld en opnieuw gesuspendeerd in 1x DMEM alvorens de dia's te monteren. Zwarte staven = 50 μm. Beelden verkregen met behulp van een rechtop witte lichtmicroscoop uitgerust met een UV-lamp.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Ho-FACS van zoogdierkiemcellen. Specifieke populaties presenteren unieke patronen van Hoechst fluorescentie tijdens FACS ( A ). Als Hoechst blauwe fluorescentie weerspiegelt variaties in chromatininhoudclusters van haploïde ( C ); Diploïde (2C) en tetraploïde (4C) cellen bevinden zich in gebieden van het FACS plot met toenemende Hoechst blauwe fluorescentie. Plots gegenereerd als functie van Hoechst blauw / rood fluorescentie tonen clusters van verschillende celpopulaties voor de verschillende getestte zoogdierensoorten ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: Primaire spermatocyten; Pre-Lep: Pre-Leptotene Spermatocyten; Lep: Leptotene spermatocyten; Dip: Diplotene Spermatocyten; SPCII: Secundaire spermatocyten; SPD: Spermatiden; ESPD: verlenging van spermatiden; RSPD: ronde spermatiden. Aangepast uit Lima, et al. 5 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Morfologie van kiemcellen in verschillende ontwikkelingsstadia van vier zoogdieren. Deze figuur toont delen van testicularweefsel, gekleurd met Hoechst (A) en het algemene aspect van verschillende mannelijke kiemcel typen, gesorteerd door Ho-FACS (B) van rat, cavia, hond en mini-varken. Aangezien de celgrootte, vorm en chromatinconformatie dramatisch variëren tijdens spermatogenese, kunnen deze worden gebruikt om cellen toe te wijzen aan verschillende stadia van differentiatie. Spermatogonia (Spg) zijn klein en rond cElls met duidelijk pericentrisch heterochromatine en vertoont een hoge intensiteit van Hoechst fluorescentie. Spermatocyten zijn de grootste kiemcellen en tonen variabele chromatineconformaties. Nucleus van primaire spermatocyten (Spc I) vertoont chromatinvariaties die kenmerkend zijn voor meiotische cellen, terwijl secundaire spermatocyten (Spc II) gebukclear zijn of in diakinesis zijn. Spermatiden (Spd) hebben ronde of langwerpige vorm, afhankelijk van het stadium van spermiogenese en zijn kleine haploïde cellen. Hoewel ronde spermatiden en spermatogonia dezelfde grootte en vorm hebben, kan de voormalige onderscheiden worden door aanwezigheid van gelokaliseerde chromocenters. Slides werden voorbereid voor elk gesorteerd celtype na Ho-FACS en werden in een confocale microscoop weergegeven: 63X vergrotingslens, met (onderste paneel) of zonder (bovenste paneel) witte lichtoverdracht. Van Lima, et al. 5 met toestemming. alsjeblieftKlik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| % Cellen in de DNA-inhoud poort | Zuiverheid van gesorteerde kiemcelpopulaties (%) | |||||||||||
| Soorten | % Singlets | % Live cellen | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | spd | rSpd | EVDB | |
| Muis | 98.4 | 92.5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| Rat | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Cavia | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68.7 | 85 | 87 | . | . | |
| Hond | 97.9 | 86.5 | 16.4 | 3 | 0.5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Pig | 95.9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Verkregen door enzymatische dissociatie en gatedGebaseerd op FSC & SSC parameters (van Lima et al., 2016, met toestemming) | ||||||||||||
Tabel 1: Statistieken van Ho-FACS van mannelijke kiemcel suspensies verkregen door mechanische dissociatie.
Aanvullend Figuur 1: Enkele cel suspensies verkregen door mechanische dissociatie van bevroren testicularweefsel. Mechanische dissociatie maakt het mogelijk de opwekking van enkelcelsuspensies uit testiculair weefsel van verschillende zoogdierensoorten zonder de noodzaak van soortspecifieke protocollen. Verschillende panelen tonen de celsuspensies die zijn verkregen voor 4 zoogdieren. Monsters werden verkregen door mechanische dissociatie van bevroren testicularweefsel en gekleurd met Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Primaire Spermatocyten; SPC II: Secundaire Spermatocyten; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Dia's werden in een confoca weergegeven L microscoop met (onderste paneel) of zonder (bovenste paneel) witte licht transmissie. Schaalstaven = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend Figuur 2: Gaatstrategie voor het scheiden van levende mannelijke kiemcellen door Ho-FACS van muizen testulaire enkele cel suspensies. Levende cellen (PI negatief) worden gesorteerd volgens Hoechst fluorescentie. Spermatogonia (SPG) worden geïdentificeerd door rechtstreekse Hoechst-blauwe en rode fluorescentie-intensiteiten te plotten. Een DNA-poort wordt gebruikt om cellen op basis van Hoechst blauwe fluorescentie te sorteren: haploïde (C); Diploïde (2C) en tetraploïde (4C). Cellen in elke piek van het histogram worden dan gesorteerd door de functie van Hoechst blue en rode fluorescentie te plotten. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatiden; SPC II: Secundaire spermatocyten; SPC I: Primaire spermatocyten.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend Figuur 3: Gatingstrategie voor het scheiden van levende mannelijke kiemcellen door Ho-FACS van honden testiculaire enkele cel suspensies. Levende cellen (PI negatief) worden gesorteerd volgens Hoechst fluorescentie. Spermatogonia (SPG) worden geïdentificeerd door rechtstreekse Hoechst-blauwe en rode fluorescentie-intensiteiten te plotten. Een DNA-poort wordt gebruikt om cellen op basis van Hoechst blauwe fluorescentie te sorteren: haploïde (C); Diploïde (2C) en tetraploïde (4C). Cellen in elke piek van het histogram worden dan gesorteerd door de functie van Hoechst blue en rode fluorescentie te plotten. De piek bevattende haploïde cellen kunnen onderverdeeld worden volgens het bereik van Hoechst blauwe intensiteit en vertegenwoordigen twee subpopulaties van spermatiden: verlengende spermatiden (poort C ') en ronde spermatiden (poort C' '). SPG: Spermatogonia; ESPD: verlenging van spermatiden; RSPD: ronde spermatiden; SPC II:Secundaire spermatocyten; SPC I: Primaire spermatocyten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend Figuur 4: Gatingstrategie voor het scheiden van levende mannelijke kiemcellen door Ho-FACS van suspensies van cavia testiculaire cellen. Levende cellen (PI negatief) worden gesorteerd volgens Hoechst fluorescentie. Spermatogonia (SPG) worden geïdentificeerd door rechtstreekse Hoechst-blauwe en rode fluorescentie-intensiteiten te plotten. Een DNA-poort wordt gebruikt om cellen op basis van Hoechst blauwe fluorescentie te sorteren: haploïde (C); Diploïde (2C) en tetraploïde (4C). Cellen in elke piek van het histogram worden dan gesorteerd door de functie van Hoechst blue en rode fluorescentie te plotten. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatiden; SPC II: Secundaire spermatocyten; SPC I: Primaire spermatocyten. Klik hier om hier te doenWnload dit bestand.
Aanvullend Figuur 5: Gatingstrategie voor het scheiden van levende mannelijke kiemcellen door Ho-FACS van kleine varkens testulaire enkele cel suspensies. Levende cellen (PI negatief) worden gesorteerd volgens Hoechst fluorescentie. Spermatogonia (SPG) worden geïdentificeerd door rechtstreekse Hoechst-blauwe en rode fluorescentie-intensiteiten te plotten. Een DNA-poort wordt gebruikt om cellen op basis van Hoechst blauwe fluorescentie te sorteren: haploïde (C); Diploïde (2C) en tetraploïde (4C). Cellen in elke piek van het histogram worden dan gesorteerd door de functie van Hoechst blue en rode fluorescentie te plotten. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatiden; SPC II: Secundaire spermatocyten; SPC I: Primaire spermatocyten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend Figuur 6: Onderzoek van somatische celverontreinigingIonen in Ho-FACS gesorteerd populaties. T-gedistribueerde stochastische buurman-inbedding (t-SNE) grafiek van ongeveer 600 single-cell transcriptome uit drie FACS subpopulatie poorten (AB). Op het t-SNE-plot vertegenwoordigt elk punt de unieke positie van een enkele cel in een transcriptoomruimte en elke cel is gemarkeerd met zijn FACS subpopulatiepoort oorsprong (A). Visuele kwantificering van cell-type specifieke markers op het FACS single-cell T-SNE plot (B). Contaminatie van somatische cellen wordt geraamd op minder dan 5% en is niet specifiek voor één Ho-FACS populatie poort. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de sterk geconserveerde chromatin dynamiek tijdens spermatogenese bij zoogdieren, was het doel van dit werk een protocol te ontwikkelen om mannelijke kiemcellen in afzonderlijke stadia van differentiatie van verschillende zoogdier testulaire weefsels te isoleren ( Figuur 1 ). Een van de belangrijkste obstakels bij het toepassen van een enkele workflow op verschillende diermodellen is de behoefte aan soortspecifieke aanpassingen, met name wat betreft weefseldissociatieprotocollen. Huidige methoden vertrouwen meestal op enzymatische weefselvertering en protocollen variëren vaak zelfs binnen species 12 . Om dit probleem te overwinnen toont het hier beschreven protocol de toepassing van mechanische weefseldissociatie om enkelcelsuspensies van testiculaire monsters van verschillende zoogdiersoorten te verkrijgen. De resultaten wijzen erop dat mechanische dissociatie van vers testicularweefsel met dit systeem goed presteert ( Figuur 2A -2B 20 . Wat belangrijk is, hoechst-kleuring niet lijkt te hebben op de kwaliteit van enkele cel suspensies. Hoewel meer celklontering zichtbaar is in gekleurde monsters ( Figuur 2B ), kan behandeling met DNase ( Figuur 2D ) of NDA 20 dit probleem voorkomen. Vorige rapporten suggereren dat de mechanische dissociatie van het testikelweefsel beter dan of zo efficiënt is als enzymatische weefselvertering 5 , 20 . Overeenkomstig geeft de hier gegeven data aan dat mechanische dissociatie een betrouwbare methode is voor het verkrijgen van enkelcelsuspensies van testikelweefsel voor Ho-FACS-verwerking.
Incubatie met Hoechst is een cruciale stap, omdat het het signaal dat tijdens flowcytometrie wordt gedetecteerd, beïnvloedt. Lange perioden van kleuring zorgen voor een betere discriminatie van kiemcellen, maarKan giftig zijn, resulterend in de dood van de cel en veranderingen in de intracellulaire programmering 22 . Gebruikers die van plan zijn om kiemcelculturen te ontwikkelen met deze methode, moeten het genotoxische effect van blootstelling aan langdurige blootstelling aan Hoechst 3 , 22 evalueren en de adequate concentratie en tijd van het vullen bepalen. Hier was 30 minuten kleuring voldoende om betrouwbare scheiding van kiemcelpopulaties te verschaffen ( Figuur 3B -3C ). De duur van kleuring kan mogelijk worden verminderd tot 10 minuten, zoals getoond door Rodriguez-Casuriaga, et al. 20 , en moet verder worden beoordeeld door gebruikers voor de soorten van belang.
Zoals verondersteld, kunnen vier kiemcelpopulaties consequent worden gedetecteerd - SPG, SPC I, SPC II en SPD- gebaseerd op chromatinvariaties van kiemcellen uit de verschillende geteste soorten ( Figuur 3B -3C Tabel 1 ) en ondersteunen de pootstrategie die in deze workflow is aangenomen ( Figuur 1 ) voor verschillende zoogdierspecies ( Aanvullende figuren 2- 5 ). Het is echter raadzaam dat gebruikers de poort optimaliseren volgens de soorten en populaties die van belang zijn om de kruisbesmetting die voor sommige populaties is gedetecteerd te verminderen (tabel 1). Dit kan bereikt worden door langere incubatieperioden tijdens het vullen18 , verminderde stromingssnelheid 2 en verminderde poortformaten. SPG zijn meer uitdagend om te isoleren, aangezien zij het zeldzaamste celtype in de testis zijn en ook als gevolg van kleuruitstoot over de tijd 1 , 15 . Hoewel het mogelijk is om specifieke SPG-populaties door Ho-FACS te detecteren, zoals hier getoond, zouden studies die uitsluitend op stamcelbiologie gericht zijn, profiteren van een strengere techniek, zoals magnetische-geactiveerde cellortering (MACS; 23 ). In het bijzonder kunnen subpopulaties van SPD (eSPD en rSPD) duidelijk onderscheiden worden voor de Hond, maar niet voor andere soorten ( Figuur 3C en Aanvullend Figuur 3). Eventueel kunnen deze subpopulaties worden opgelost door de gating instellingen aan te passen, zoals beschreven door de auteurs voor de muis 5 . Cytogrammen gegenereerd voor celgrootte en granulariteit (FSC VS SSC), voorafgaand aan het plotten van de functie van Hoechst blauw / rood fluorescerendNce, onderscheidt verlenging (laag FSC + SSC), uit ronde (hoge FSC + SSC) spermatide subpopulaties. Scheiding van ronde en langdurige spermatide subpopulaties zou een diepgaander onderzoek van spermiogenese mogelijk maken, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in specifieke moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de sperma-differentiatie. Ook, zoals beschreven voor de muis 1 , 2 , 12 , is het mogelijk om verdere resolutie van meiotische stadia te verkrijgen door FACS-poorten aan te passen. Een dergelijke aanpak zou grotendeels baat hebben bij vergelijkende studies van meiotische gebeurtenissen. Hoewel de celintegriteit tijdens Ho-FACS wordt verstoord, worden de cellen van één enkele cel, verkregen door cellen met deze methode, gesorteerd op deze methode (Jung et al. , Ongepubliceerd ; Aanvullende Figuur 6 ) aangetoond dat dit een betrouwbare benadering is om cellen te verkrijgen voor moleculaire studies van kiemcel biologie. Desondanks zijn gebruikers van plan om reproductieve analyses uit te voeren, zoals rOvenspermatide-injectie (ROSI), waarbij gebruik wordt gemaakt van cellen die door Ho-FACS zijn geïsoleerde, moeten de levensvatbaarheid van gesorteerde cellen beoordelen en kunnen alternatieve methoden 24 , 25 verkennen.
Samenvattend beschrijft dit werk een gestandaardiseerde methode om testulaire kiemcellen van verschillende zoogdieren te isoleren, het opbouwen en toevoegen van verfijningen op de eerder opgestelde technieken 2 , 12 , 20 . Dergelijke standaardisatie maakt het mogelijk om één set reagentia en een enkele workflow op verschillende zoogdiersoorten te gebruiken, waardoor data-generatie wordt vergemakkelijkt voor vergelijkende studies van kiemcelbiologie. Ook de mechanische weefseldissociatie overwint de hindernis van soortspecifieke aanpassingen die de methodologische variabiliteit kunnen introduceren, die bijna onmogelijk is om te verantwoorden. Bovendien beperkt de verminderde uitvoeringstijd en manipulatie verstoringen van ex vivo celLuli fysiologie tot een minimum. In dit opzicht is Ho-FACS significant sneller in vergelijking met andere methoden van kiemcelisolatie, zoals STA-PUT en elutriatie 6 , 7 . Bovendien is gelijktijdige scheiding van 4 kiembevolkingen in hetzelfde experiment alleen mogelijk door FACS. Gezien de eigenschappen van de Hoechst-kleurstof worden de celstructuur en RNA-soorten bewaard, en daarom kunnen cellen worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse moleculaire studies. Belangrijk is, aangezien Ho-FACS afhankelijk is van chromatinattributen om kiemceltypen te onderscheiden, ondersteunt de succesvolle uitvoering van deze workflow in 5 verschillende soorten de toepassing ervan voor andere zoogdieren. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat spermatogenese een uniek proces van celdifferentiatie kan zijn die in veel zoogdiersoorten kan worden aangepakt met een enkel protocol. Als zodanig, in de omics- en systeembiologie-tijd, biedt deze technologie de middelen voor een evolutionaire appRoach op vragen over mannelijke kiemcelbiologie, inclusief studies van epigenetica, regulatie en eiwit diversiteit door middel van spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken het Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) voor hondentestes; Jason Arand en Dr. Ted Cicero's lab aan de Washington University in St. Louis (WashU) voor het leveren van rat testes en Brianne Tabers voor het assisteren van de collectie; Jared Hartsock en Dr. Salt's Lab bij WashU voor de proefkonijnen; En Dr. Michael Talcott bij de afdeling Comparatieve Geneeskunde bij WashU voor de miniatuur varkens testis. De auteurs erkennen ook het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine en Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, voor het gebruik van de Siteman Flow Cytometry Core, die een door de personeelsleden georganiseerde celsorteringsdienst leverde. Het Siteman Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Dit onderzoek werd gefinancierd door een FCT-doctorale gemeenschap [SFRH / BD / 51695/2011 naar ACL], subsidies van de Verenigde Staten National Institutes of Health [R01HD078641 en R01MH101810 naar DFC] en een FCT onderzoeksovereenkomst [IF / 01262/2014 naar AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
