Summary
Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.
Abstract
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) war eine der Methoden der Wahl, um angereicherte Populationen von Säugetier-Hoden-Keimzellen zu isolieren. Derzeit ermöglicht es die Unterscheidung von bis zu 9 murinen Keimzellpopulationen mit hoher Ausbeute und Reinheit. Diese hochauflösende Diskriminierung und Reinigung ist durch einzigartige Veränderungen der Chromatinstruktur und -menge in der gesamten Spermatogenese möglich. Diese Muster können durch Durchflusszytometrie von männlichen Keimzellen erfasst werden, die mit fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen wie Hoechst-33342 (Hoechst) gefärbt sind. Hierin ist eine detaillierte Beschreibung eines kürzlich entwickelten Protokolls zur Isolierung von Hodenzellen von Säugetieren. Kurz gesagt werden Einzelzellsuspensionen aus dem Hodengewebe durch mechanische Dissoziation erzeugt, mit Hoechst und Propidiumjodid (PI) doppelt gefärbt und durch Durchflusszytometrie verarbeitet. Eine serielle Gating-Strategie, einschließlich der Auswahl von lebenden Zellen (PI-negativ) mit unterschiedlichem DNA-Gehalt (Hoechst-Intensität), iS verwendet während der FACS-Sortierung, um bis zu 5 Keimzelltypen zu unterscheiden. Hierbei handelt es sich um entsprechende durchschnittliche Reinheiten (bestimmt durch mikroskopische Auswertung): Spermatogonien (66%), primäre (71%) und sekundäre (85%) Spermatozyten und Spermatiden (90%), weiter getrennt in runde (93%) und verlängert (87%) Subpopulationen. Die Ausführung des gesamten Workflows ist einfach, ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Zelltypen mit der entsprechenden FACS-Maschine und kann in weniger als 2 h durchgeführt werden. Da eine reduzierte Verarbeitungszeit entscheidend für die Erhaltung der Physiologie von ex vivo- Zellen ist, eignet sich diese Methode ideal für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Studien der männlichen Keimzellbiologie. Darüber hinaus eliminiert ein standardisiertes Protokoll für die Multispezies-Reinigung von Säugetierkeimzellen methodische Quellen von Variablen und ermöglicht es, einen einzelnen Satz von Reagenzien für verschiedene Tiermodelle zu verwenden.
Introduction
Angesichts des Mangels an In-vitro- System, das für die Spermatogenese-Progression repräsentativ ist, und die Anwesenheit einer großen zellulären Heterogenität im Hoden, erforschen die Studien der männlichen Keimzellbiologie robuste Techniken, um angereicherte Populationen spezifischer Zelltypen zu isolieren. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde zu diesem Zweck 1 , 2 , 3 , 4 , 5 weit verbreitet , da sie eine hohe Ausbeute und Reinheit liefert und andere Isolationsverfahren in der Anzahl der Keimzelltypen übertrifft, die sie identifizieren können Wählen Sie 6 , 7 , 8 . Das Prinzip der Durchflusszytometrieanalyse basiert auf der Erkennung von Differenzlichtmustern nach der Laserstrahlanregung einzelner Zellen. Als eine Zelle durch den Laser geht es reflektiert / streut LichtIn allen Winkeln, proportional zur Zellgröße (Vorwärtsstreuung, FSC) und zur intrazellulären Komplexität (Seitenstreuung, SSC). Siehe Ormerod 9 für detaillierte Informationen zur Durchflusszytometrie.
Männliche Keimzellen unterliegen spezifischen Modifikationen des DNA-Gehalts, der Chromatinstruktur, der Größe und der Form in verschiedenen Stadien der Spermatogenese. So können unterschiedliche Zellpopulationen identifiziert und durch Kombination von Lichtstreuung und DNA-Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen 10 , 11 getrennt werden . Hierzu können mehrere Farbstoffe verwendet werden (siehe Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 ), wie zB Hoechst-33342 (Hoechst), die häufig in der Durchflusszytometrieanalyse von Hodenzellen für die letzten zehn Jahre 1 , 2 , 4 , 10 verwendet wurde , 12 AufN Anregung mit UV-Licht, Hoechst emittiert blaue Fluoreszenz proportional zum zellulären DNA-Gehalt, während weit rote Fluoreszenz die Variabilität der Chromatinstruktur und der Verdichtung 1 , 13 , 14 widerspiegelt. Als Ergebnis zeigen männliche Keimzellen in verschiedenen Stufen der Differenzierung spezifische Muster während FACS von Hoechst-gefärbten Einzelzellsuspensionen (Ho-FACS, 1 , 12 ). Interessanterweise ist die Intensität der Hoechst-Blau-Fluoreszenz aufgrund eines Mechanismus des Farbstoff-Efflux, der nur während des Spermatogonialstadiums aktiv ist, nicht proportional zum Chromatingehalt in diesen Zellen, und sie gruppieren sich als Seitenpopulation während Ho-FACS 15 . Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von Hoechst-Färbung mit dem nicht-permeierenden Farbstoff Propidiumjodid (PI) den Anwendern, lebende (PI-negative) von toten (PI-positiven) Zellen während FACS 1 <zu unterscheidenSup>, 2 , 10 , 12 . Diese Strategie wurde bisher in Durchflusszytometrieanalysen von Hodenkeimzellen verwendet und weitgehend in der Maus optimiert, um bis zu 9 Keimzelltypen, einschließlich Zellen in 4 verschiedenen Stadien der Meiose I 1 , 2 , 4 , 16 zu unterscheiden . Für die Zwecke dieser Arbeit hat Hoechst Färbung drei Hauptvorteile. Zuerst wurde Ho-FACS erfolgreich auf die Isolierung von männlichen Keimzellen im Mausmodell 1 , 2 , 12 und anderen Nagetieren wie Ratte und Meerschweinchen 17 , 18 , 19 angewendet. Zweitens ist Hoechst ein Zell-Permeations-Farbstoff und erfordert keine Membran-Permeabilisierung, so dass es preserVes Zelle Integrität. Schließlich ist keine RNase-Behandlung erforderlich, da Hoechst bevorzugt Poly (d [AT]) DNA-Sequenzen 1 , 20 bindet, was bedeutet, dass RNA konserviert wird und zusätzlich zu DNA und Proteinen für weitere nachgeschaltete molekulare Studien von Keim verwendet werden kann Zelldifferenzierung.
Trotz der Ähnlichkeit der DNA-Ploidie und / oder der Färbbarkeit, die bei Durchflusszytometrie-Analysen von Säugetierarten beobachtet wurde (in Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 untersucht ), gab es in den für die männliche Keimzellisolation durch Durchflusszytometrie beschriebenen Protokolle viel Variabilität. Verschiedene Studien haben spezifische Protokolle für die Gewebe-Dissoziation verwendet und verwendeten unterschiedliche DNA-bindende Farbstoffe (allein oder in Kombination) und FACS-Gating-Strategien in verschiedenen Modellorganismen, hauptsächlich der Maus, Ratte und Meerschweinchen. Daher kann der direkte Vergleich der für verschiedene Arten gesammelten Daten durch Unacco beeinflusst werdenUnzureichende technische Artefakte, die sich aus der Variabilität zwischen den Methoden ergeben. Wichtig ist, dass die markante Konservierung der Chromatin-Dynamik während der Säugetier-Spermatogenese (2N-4N-2N-1N) darauf hindeutet, dass ein standardisiertes Protokoll quer auf eine Vielzahl von Säugetierarten angewendet werden könnte.
Das Ziel dieser Studie war es, einen einzigen Workflow zu entwickeln, der für verschiedene Säugetierarten anwendbar ist, indem er die bisher veröffentlichten Techniken 2 , 20 kombiniert und anpasst. Standardisierung eines Verfahren zur Gewebeverarbeitung wurde durch Durchführen mechanische Dissoziation zu überwinden , die Notwendigkeit für speziesspezifische Anpassungen erforderlich , für die enzymatische Verdauung 5 erreicht. Es ist bemerkenswert, dass eine mechanische Dissoziation von Nagetier-Hodengewebe gezeigt wurde, dass sie besser als die enzymatische Gewebsverdauung 20 und Ho-FACS von Einzelzell-Suspensionen, die durch beide Verfahren erzeugt wurden, ausführenEs vergleichbare Ergebnisse 5 . Als Beweis für das Prinzip beschreibt dieses Protokoll die Einstellungen, die verwendet werden, um bis zu 5 Keimzellpopulationen zu isolieren: Spermatogonie (SPG); Primäre (SPC I) und sekundäre Spermatozyten (SPC II) und Spermatiden (SPD) - rund (rSPD) und verlängert (eSPD). Wichtig ist, dass es einfach im Labor zu implementieren ist, wobei die Hauptanforderungen das System für die Gewebedissoziation und den Zugang zu einem Zellsortierer sind, der mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Dieser Workflow ( Abbildung 1 ) ist schnell und unkompliziert und ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Keimzellpopulationen aus frischem Hodengewebe in weniger als 2 h. Die reduzierte Verarbeitungszeit ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellularen Integrität für weitere nachgeschaltete Verfahren. Darüber hinaus deutet die erfolgreiche Aufführung in 5 verschiedenen Spezies darauf hin, dass es in der Säugetier-Clade weitgehend angewendet werden kann. Damit ist es die ideale Methode, um Keimzellen für Vergleichsstudien von männlichen männlichen Fortpflanzungsbiolen zu untersuchenOgy
Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptabschnitten, abgesehen von den vorbereitenden Schritten: (1) der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe und (2) Färbung von Hodenzellen mit Hoechst und PI, gefolgt von (3) FACS-Sortierung relevanter spermatogener Zellen. Sobald gesammelt, können diese angereicherten Populationen von verschiedenen Säugetier-Hoden-Keimzellen für eine breite Palette von Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt eine "one-size fits all" Dissoziationsmethode, um männliche Keimzellen aus vielen verschiedenen Säugetierarten zu reinigen. Abhängig von der Art der Studie, die die Benutzer mit den isolierten Keimzellen durchführen möchten, können andere Medien oder Puffer verwendet werden. Die folgenden Protokollschritte sind für die Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus einem ganzen Mäuse-Testis.
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Protocol
Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren entsprechen den Bestimmungen des Tierstudienausschusses an der Washington University in St. Louis.
1. Vorbereitungen für das Mechanische Dissoziations-Protokoll
- Vornässen einer 50-μm-Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche zur Dissoziation eines ganzen murinen Hodens.
ANMERKUNG: Diese Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche enthält Mikroklingen, die zum Schneiden von Geweben und einem unbeweglichen Stahlgitter mit etwa 100 sechseckigen Löchern ausgelegt sind. Verschiedene Größen von Mesh für Gewebe Disaggregation Patrone sind verfügbar, um dieses Protokoll auf der Grundlage von Arten und gewünschten Zelltypen anzupassen. 50 μm Patronen wurden für alle in diesem Papier erwähnten Säugetierarten verwendet.- Laden Sie 1 ml eiskaltes Phenol rot frei 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) auf die 50 μm Einweg-Gewebe-Disaggregationspatrone.
HINWEIS: Phenolrot kann die Erkennung von roten Fluoreszenen beeinträchtigenWährend der FACS. - Aspirieren Sie 1x DMEM aus der Gewebe-Disaggregations-Patrone mit einer Einweg-3-ml-Nadel-freien Spritze aus dem Spritzen-Port.
- Laden Sie 1 ml eiskaltes Phenol rot frei 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) auf die 50 μm Einweg-Gewebe-Disaggregationspatrone.
- Schalten Sie das Gewebe-Disaggregationssystem durch Drücken der Taste "ON" ein. Dieses System erfordert keine "Aufwärmzeit".
- Vornasse drei 40 μm Einwegfilter mit eiskaltem 1x DMEM. Legen Sie jeden 40 μm Einwegfilter auf ein 50 mL konisches Rohr. Pipette 1 ml 1x DMEM und Durchlauf der Flüssigkeit.
- Vorbereitung einer 100 mm x 15 mm Petrischale zur Sammlung von Hodengeweben. 500 μl 1x DMEM auf die Petrischale pipettieren.
2. Vorbereitung des Hodengewebes für das mechanische Dissoziations-Protokoll
- Disektion einer männlichen Maus, um vorsichtig frische ganze Hoden oder Hodenfragmente (bei Umgang mit anderen Säugetierarten) mit chirurgischen Scheren und Pinzetten zu entfernen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Gewebe frei von Fett und Nekrose sind. Fr Esh-Hodengewebe erzeugen eine überlegene Einzelzell-Suspensionsqualität als gefrorene Gewebe.- Transfer gesammelte Hoden / Fragmente auf die vorbereitete 100 mm x 15 mm Petrischale mit 500 μl 1x DMEM.
- Das Gewebe vorsichtig in 1x DMEM spülen, um rote Blutzellen zu entfernen (falls vorhanden).
- Entfernen Sie sorgfältig Tunica albuginea. Die Dicke von Tunica albuginea variiert in verschiedenen Arten.
- Ergreife ein Ende von Hoden mit Pinzette.
- Punktion das andere Ende der Hoden mit einem Skalpell, während immer noch das eine Ende von Hoden mit Pinzette aus früheren Schritt.
- Kratzen Sie Hodenröhrchen mit einem Skalpell, während immer noch das eine Ende von Hoden mit Pinzette aus Schritt 2.2.1.
- Schneiden Sie Hoden Tubuli in Stücke von ~ 2-3 mm 3 mit einem Skalpell.
3. Gewinnung von Einzelzell-Suspensionen durch mechanische Dissoziation von Hodengewebe
Ontent "> HINWEIS: Die unten beschriebenen Dissoziationsschritte beziehen sich auf einen erwachsenen Maus-Test. Die Mengen von Hodengeweben aus jugendlichen Mäusen oder nicht-murinen Spezies sollten entsprechend angepasst werden, jugendliche Tiere dürfen nicht alle Stadien von Keimzellen enthalten, einige Säugetierarten haben Hodengewebszusammensetzung ändert sich während der Zuchtperioden im Vergleich zur Nicht-Paarungszeit.- Übertragen Sie die kleinen Hoden-Tubulusstücke auf die vorbenetzte 50 μm-Gewebe-Disaggregationskartusche mit Pinzette und fügen Sie 1 ml 1x DMEM hinzu.
- Legen Sie die Gewebe-Disaggregations-Patrone auf das Gewebe-Disaggregationssystem und verarbeiten Sie für 5 min, indem Sie den Knopf von "Standby" in den "Run" -Modus drehen.
- Entfernen Sie die Gewebe-Disaggregations-Patrone aus dem Gewebe-Disaggregationssystem und saugen Sie die Zellsuspension mit einer wegwerfbaren 3-ml-Nadel-freien Spritze aus dem Spritzenanschluss.
- Aspirieren Sie ein paar Mal, um alle Flüssigkeit aus Gewebe Disaggregation Patrone zu entfernen. NichtAlle 1 ml können aus der Gewebe-Disaggregations-Patrone gewonnen werden.
- Führen Sie die aspirierte Zellsuspension durch zwei wegwerfbare, vorvernetzte 40 μm Filter. Filtern Sie zweimal, um alle Zellenaggregate zu entfernen.
- Legen Sie einen vorbenetzten 40 μm Filter in ein 50 mL konisches Rohr. Die aspirierten Zellen direkt in die Spritze auf das 40 μm Filter geben. Pipetten-Durchlauf-Einzelzellen-Aufhängung mit Einwegpipette.
- Entfernen Sie den gebrauchten, vorbenetzten 40 μm Filter und legen Sie einen weiteren vorberührten 40 μm Filter in das 50-mL konische Rohr. Die gesammelte Einzeller-Suspension auf den sauberen 40 μm-Filter pipettieren.
- Sammelt gefilterte Einzelzelle Suspension mit einer sauberen Einwegpipette.
- Pipettierte gefilterte Zellsuspension zurück zu der 50 μm Gewebe-Disaggregationskartusche und Verfahren für weitere 5 min in einem Gewebe-Disaggregationssystem.
- Erfahre alle Flüssigkeit aus dem Gewebe disaggregatiAuf Patrone
4. Färbung mit Hoechst und Propidiumiodid (PI)
- Die zurückgewonnene Zellsuspension aus der 50 μm Gewebe-Disaggregationskartusche auf ein sauberes 1,5 mL-Röhrchen übertragen. Etwa 1-1,5 ml Einzelzell Suspension werden gewonnen.
- Teilen Sie die gewonnene Einzelzell-Suspension in vier 1,5 ml- oder 5-ml-Röhrchen.
- Für die ersten drei Röhrchen pipettieren Sie 150 μl einzelzellige Suspension und Pipettenrest einzelzelliger Suspension in das letzte der vier Röhrchen (ca. 550 μl Einzelzell Suspension).
HINWEIS: Die Menge der Einzelzell-Suspension in der letzten Röhre kann je nach der Effizienz der Zellsuspensionsrückgewinnung in Schritt 3.6 variieren.
- Für die ersten drei Röhrchen pipettieren Sie 150 μl einzelzellige Suspension und Pipettenrest einzelzelliger Suspension in das letzte der vier Röhrchen (ca. 550 μl Einzelzell Suspension).
- Setzen Sie das erste Röhrchen der vier Röhren als ungefärbte Kontrolle für die FACS-Sitzung ein.
- Bereiten Sie einzelne Farbstoff gefärbte (PI oder Hoechst) Zellsuspensionen als Kontrollen vor. Zugabe von 2,5 μl Hoechst oder 1 μl PI zu jedem Röhrchen (zweiter und thiRd)
- Bereiten Sie ein doppelt gebeiztes Rohr vor. Dies wird zum Sammeln von Keimzell-Subpopulationen verwendet. Füge 2,5 μl Hoechst und 1 μl PI zum letzten Röhrchen hinzu.
HINWEIS: Hoechst hat eine Haltbarkeitsdauer von 2-3 Monaten. Die Verwendung älterer Farbstoffbestände führt zu erheblichen Veränderungen während der FACS-Sitzung. - Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Legen Sie die Proben in einen Röhrenrotator oder setzen Sie die 1,5 ml Röhrchen alle 5-10 Minuten ein.
- Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem vorberührten 40 μm Sieb und halten Sie die gefilterte Lösung auf Eis und im Dunkeln bis zur FACS-Sitzung.
HINWEIS: Der Filtrationsschritt ist notwendig, um Zellklumpen für FACS zu verhindern. Zusätzlich kann die Behandlung mit DNase (siehe Abbildung 1 ) oder 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure-dikalium-salz (NDA 20 ) zur Begrenzung der Zellverklumung verwendet werden. Verlängerte Wartezeiten beeinflussen das bei FACS detektierte Fluoreszenzsignal und können zu einem erhöhten Zelltod führen.5. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Aufbau und Reinigung von Hodenzellen
- FACS-Sammelrohre vorbereiten.
- 5 ml Polypropylen-Rundbodenrohre oder 1,5 ml Röhrchen mit 400 μl FBS zur Zellkollektion beschichten. Dekant überschüssiges FBS nach dem Beschichten.
- FACS-Sammelmedium (1x DMEM + 10% fetales Rinderserum, FBS) zu den Röhrchen hinzufügen: 1 ml für 5 ml Röhrchen oder 100 μl für 1,5 ml Röhrchen.
- Setzen Sie geeignete Sortierbedingungen in Zellsortierer und Software ein.
HINWEIS: Andere Zellsortiermaschinen und Analysesoftware können mit den unten beschriebenen ähnlichen Setup- und Gating-Strategien verwendet werden. Die hier beschriebenen Bedingungen wurden von Gaysinskaya und Bortvin 2 , Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 , und Getun et al. 4- Laden Sie einen Ultraviolettlaser mit 463/25-nm-Bandpaßfilter, um Hoechst-Blau und 680 nm LP-Bandpassfilter zu detektieren, um Hoechst rot zu detektieren und PI zu detektieren.
- Verwenden Sie einen 555DLP dichroitischen Spiegel, um Blau von roter Fluoreszenz zu unterscheiden.
- Verwenden Sie eine 70 μm Düse und sortieren Sie Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1000-2000 Zellen / Sekunde.
HINWEIS: Die Sortierleistung wird direkt durch den Durchfluss beeinflusst. Hohe Durchflussraten (> 3500 Ereignisse / s) erhöhen die Geschwindigkeit der Sortierung, führen aber zu einer Kontamination der Populationen. Siehe Referenz 12 für weitere Informationen.
- Stellen Sie die Tore mit Kontrollproben ein.
- Laden und führen Sie ungefärbte Probe.
- Ausschließen von Zelltrümmern auf der Grundlage von FSC vs SSC-Plot-Muster. Zelltrümmer werden im unteren linken Quadranten der Handlung auftauchen. Willkürlich die Schwelle für Zelltrümmer durch den Benutzer oder den Zellsortierer-Techniker einstellen.
- Gate auf einzelne Zellen durch Einstellen der Schwelle für FSC und Pulsbreite. Verschiedene Zellsortierer haben unterschiedliche Möglichkeiten, sich zu unterscheidenBeifall singlets Wenn die Pulsbreite die Zeitspiegel reflektiert, die der Laser überquert, haben einzelne Zellen im Vergleich zu mehrzelligen Aggregaten niedrigere Werte. Anpassen der Schwelle auf einem Plot für FSC vs Pulsbreite kann verwendet werden, um für Singlets zu wählen.
- Setzen Sie optimale Photomultiplier Röhre (PMT) Spannungen.
- Verwenden Sie sowohl ungefärbte als auch einfarbig gefärbte Zellen, um die Schwelle des PI- oder Hoechst-Fluoreszenzsignals festzulegen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Grundlinien-PTM-Spannungen für die interessierenden Zellen zu optimieren, um für jeden Farbstoff den richtigen Fluoreszenzbereich festzulegen. Dies ist entscheidend für eine optimale Signalerkennung und Empfindlichkeit. Die ungefärbten und einfachgefärbten Kontrollzellen werden verwendet, um eine Reihe von negativ und positiv gefärbten Zellen mit PI- und / oder Hoechst-Farbstoffen zu etablieren und Rauschen in Signalen zu minimieren. Weitere Erläuterungen zur Optimierung der PMT-Spannung mit Kontrollzellen finden Sie unter Gaysinskaya und Bortvin 2 - Tor auf lebende ZelleS basierend auf PI-Färbung (PI-negativ) und FSC-Plot. Tote Zellen sind positiv für PI-Fluoreszenz.
- Stellen Sie das DNA-Inhalts-Gate ein, indem Sie ein Histogramm von Zellzahlen auf der Grundlage von Hoechst-Blau-Fluoreszenz aufzeichnen. Es sollten 3 Peaks mit zunehmenden Konzentrationen von Hoechst blauer Fluoreszenz auftreten, die haploide (1C), diploide (2C) und tetraploide (4C) Zellen darstellen. Set 3 Tore, eine für jeden Peak.
- Beachten Sie mindestens 500.000 Ereignisse auf FSC vs SSC-Plot, bevor Sie auf die Keimzellpopulationen gehen.
- Gate verschiedene Keimzellpopulationen.
- Load Hoechst / PI gefärbte Probe.
- Setzen Sie die ersten 3 Eltern-Tore, die allen Populationen gemeinsam sind.
- Ausschließen von Zelltrümmern auf der Basis des FSC vs SSC-Plots. Wähle Einzelstücke basierend auf dem FSC vs Pulsbreiten-Plot. Wähle lebende Zellen, indem du PI-negative Zellen schlägst.
- Definieren spermatogonia tor
- Plot PI negative Zellen auf der Grundlage von Hoechst blau und rote FluoreszenzIntensitäten. Spermatogonie erscheint als Seitenpopulation (siehe Abbildung 1 ).
- Definiere Tore für die verbleibenden Keimzellpopulationen. HINWEIS: Siehe Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2 für visuelle Details.
- Plot PI-negativen Zellen in DNA-Content-Gate.
- Für Spermatiden Tor der Spitze mit niedrigster Hoechst Fluoreszenz (1C).
- Für Spermatozyten II, Tor der Peak mit Zwischen-Hoechst-Fluoreszenz (2C).
- Für die Spermatozyten I, Tor der Spitze mit der höchsten Hoechst Fluoreszenz (4C).
- Plot Hoechst blaue und rote Fluoreszenzintensität zur Verfeinerung von Spermatozyten und Spermatiden Populationen aus DNA-Content-Toren.
- Sammeln Sie die ausgewählten Subpopulationstore in die zuvor vorbereiteten Sammelröhrchen. Jeder Hoden wird durchschnittlich 45 min bis 1,5 h dauern, um etwa 0,5-6,0 x 10 6 Zellen für jede Subpopulation zu sammeln.
ANMERKUNG: Verlängerte Zell-Exposition gegenüber Hoechst maIch verschiebe die Lage der Populationen mit der Zeit. Aktualisieren Sie die Einstellungen nach 20-30 min FACS. Die maximale Ausbeute für jede Subpopulation wird abhängig von der Effizienz des Dissoziationsschrittes sein.
6. Mikroskopische Bewertung von gereinigten Zellen
- Spin gesammelte Zellen bei 500-600 xg bei 4 ° C für 10 min.
- Zellenpellet mit 1 ml eiskalter 1x Phosphatpufferlösung (PBS) oder 1x DMEM erneut suspendieren.
HINWEIS: Das Re-Suspensionsvolumen kann entsprechend der Anzahl der sortierten Zellen und der gewünschten Endkonzentration eingestellt werden. - 4 & mgr; l gewaschene Zellen auf einen sauberen Glasschieber pipettieren und ein Deckglas legen.
- Fixieren Sie die verbleibenden Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und speichern Sie feste Zellen bei 4 ° C in Dunkel für zukünftige Referenz.
- 100 μl 4% PFA direkt in die Sammelröhrchen pipettieren.
- Die Röhrchen oder Pipetten kurzzeitig vortexen, um eine gute Vermischung der Zellsuspension zu gewährleisten.
- Visualisieren Sie die vorbereiteten Folien in einem Mikroskop mit einer UV-Lampe ausgestattet, um Hoechst Fluoreszenz unter einem 63X Ziel zu erkennen. Beziehen Sie sich auf den Ergebnisbereich - Morphologische Auswertung der sortierten Keimzellpopulationen - für weitere Details zur Identifizierung bestimmter Keimzelltypen.
- FACS-Sammelrohre vorbereiten.
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Representative Results
Einzelzelle Suspensionen aus der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe
Fig. 2 vergleicht Einzelzellsuspensionen, die durch mechanische Dissoziation von Maus-Hodengewebe unter verschiedenen Bedingungen erhalten werden. Proben, die durch Verarbeiten von frischem Gewebe, ungefärbt ( Fig. 2A ) oder mit Hoechst gefärbt wurden ( Fig. 2B ), zeigen die Anwesenheit von einzelnen Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung, und im wesentlichen scheint die zelluläre Struktur, einschließlich Flagella von Spermatozoen, zu erhalten. Obwohl in den gefärbten Proben, die durch die Zugabe von DNase nach der Dissoziation ( Abb. 2D ) reduziert wurden, einige Verklumpen und Ablagerungen beobachtet wurden, zeigen diese Ergebnisse, dass die Hoechst-Färbung die Qualität der Einzelzellsuspensionen nicht signifikant verändert. Interessanterweise ist Single Cell SuspEnsionen können auch aus gefrorenem Gewebe für die Maus ( Abbildung 2C ) und anderen Säugetierarten - Ratte, Hund, Meerschweinchen und Minischlamm ( ergänzende Abbildung 1 ) durch mechanische Dissoziation erhalten werden. In diesen Proben sind verschiedene Zelltypen sichtbar und identifizierbar; Die Verarbeitung von gefrorenem Gewebe scheint jedoch zu einem erhöhten Zelltod und Verklumpen und einer insgesamt niedrigeren zellulären Ausbeute zu führen. Als solches empfiehlt es sich, Einzelzellsuspensionen aus frischem Gewebe für weitere nachgeschaltete Anwendungen herzustellen.
Die Qualität der Einzelzellsuspensionen, die aus frischem Hodengewebe von Maus, Ratte, Hund, Meerschweinchen und Minigrot hergestellt wurden, wurde bei Ho-FACS ( Tabelle 1 ) beurteilt. Nach Ausschluss von Zelltrümmern sind 95,7-98,4% der Zellen Einzelstücke, und von diesen 86,5-93,8% sind lebendig, wie durch Quantifizierung von PI-negativen Zellen (siehe Protokoll ) gezeigt. Diese entschuldigenTs zeigen an, dass die mechanische Dissoziation eine zuverlässige Methode zur Herstellung von Einzelzell-Suspensionen für die Durchflusszytometrie aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten ist.
Ho-FACS, um Keimzellen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu isolieren
Nach der mechanischen Dissoziation werden Einzelzellsuspensionen mit Hoechst und PI gefärbt und von FACS verarbeitet. Wie oben erwähnt, erlaubt die Hoechst-Färbung die Diskriminierung von Zellen in verschiedenen Stufen der Differenzierung auf der Basis von Chromatin-Menge und -Struktur, während PI-Färbung von nicht-permeabilisierten Zellen leben von toten Zellen trennt. Daher wählt das PI-Gate nach dem Ausfiltern von Zelltrümmern und multizellulären Aggregaten Zellen mit intakten Membranen aus (PI-negativ, Fig. 1 ). Die lebenden Zellen werden dann auf der Grundlage der Hoechst-Fluoreszenz analysiert: Blau ist proportional zum DNA-Gehalt und erhöht das RotFluoreszenz spiegelt weniger kondensierte Chromatin- und Strukturvariationen wider. Als solche werden männliche Keimzellen von verschiedenen Stadien erwartet, um in bestimmten Regionen von Zytogrammen, die die Funktion der blauen / roten Hoechst-Fluoreszenz darstellen, zu gruppieren ( Fig. 3A ).
Tatsächlich zeigen die für die verschiedenen Spezies erzeugten Ho-FACS-Plots die Anwesenheit von verschiedenen Zellpopulationen auf der Grundlage der Hoechst-Fluoreszenz ( Abbildung 3B- 3C ). Obwohl diese Plots ausreichen, um Keimzellpopulationen zu unterscheiden, kann ein DNA-Gehalt (C) -Gat 2 definiert werden, um die Kreuzkontamination zu begrenzen. Dieses Tor wird durch ein Histogramm von Zellzahlen in Funktion der Hoechst blauen Fluoreszenzintensität erzeugt. Für alle Spezies können drei Peaks detektiert werden und stellen Zellen mit 1C, 2C und 4C dar ( Abbildung 1 und Ergänzende Figuren 2-5 ). Bemerkenswert, wie vorherOperly erwähnt, sind die Spermatogonien eine Seitenpopulation und können nicht zuverlässig auf der Grundlage von Histogrammen des DNA-Gehalts vergeben werden. Daher wird diese Population nach Ausschluss von toten Zellen, basierend auf Hoechst blauen / roten Fluoreszenzplots ( Abbildung 1 ), gated. Diese Strategie ist in Abbildung 1 für die Ratte und die ergänzenden Figuren 2-5 für die verbleibenden Spezies dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass, da die Hoechst-Fluoreszenz alleine die verschiedenen Keimzelltypen unterscheiden kann, sowohl die PI- als auch die DNA-Inhalts-Gates optional sind. Sie wurden in diese Strategie aufgenommen, um lebende Zellen auszuwählen und die Kreuzkontamination zu reduzieren. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst , reflektiert die Quantifizierung von Zellen in dem DNA-Inhalts-Gate den relativen Anteil der Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese. Wie erwartet sind 1C-Zellen am häufigsten und stellen spermatidische Populationen dar, gefolgt von 2C-Zellen (SPC II) und 4C-Zellen (SPC I). Importantly wird dieses Muster über die Arten hinweg konserviert und kleine Unterschiede inter Variabilität in Keimzellen und die Zyklen des Samenepithels 21 widerspiegeln.
Nach Ho-FACS kann die Zellintegrität mit Trypan-Blau-Färbung beurteilt werden. Der Anteil der lebenden Zellen nach 1 h FACS reichte von 27% (SCP I) bis 67% (SPD) für die Maus, was darauf hinweist, dass die Dauer der Sortierung und die Exposition gegenüber Hoechst den Zelltod erhöht Für Benutzer, die die sortierten Zellen kultivieren, sollten Hoechst Konzentration und Dauer von Ho-FACS angepasst werden, um das Zellüberleben zu verbessern. Nichtsdestoweniger wurden RNA-Sequenzierungsdaten für einzelne Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, erzeugt (Jung et al ., Unveröffentlicht), was darauf hinweist, dass diese Zellen für molekulare Studien der Keimzellbiologie geeignet sind. Dieser Datensatz wurde verwendet, um eine potentielle Kontamination von Keimzellpopulationen mit somatischen Zellen zu detektieren ( Ergänzende Abbildung 6
Morphologische Auswertung der sortierten Keimzellpopulationen
Da Keimzellen während der Spermatogenese drastische morphologische Veränderungen erfahren, ist es möglich, die Reinheit isolierter Populationen durch Mikroskopie abzuschätzen. Als Bezugnahme veranschaulicht Fig. 4 die allgemeine Morphologie von verschiedenen männlichen Keimzelltypen von 4 Säugetierarten (von Lima et al., 5 ). Chromatinverteilung und -kondensation sowie Zellgröße und -form zeigen einzigartige und gut charakterisierte Muster in verschiedenen Zelltypen. SPG haben ein unterschiedliches perikentrisches Heterochromatin, das für Hoechst hell ist und klein und rund in Form ist (Spg in Abbildung 4B ). Spermatocyten sind größere granulierte Zellen. Nuclei von SPC I sind leicht identifizierbar, mit chromatin variatioNs charakteristisch für meiotische Zellen (Spc I in Fig. 4B ), während SPC II binkukleiert oder in Diakinese (Spc II in Fig. 4B ) sind. Schließlich sind SPD kleine haploide Zellen mit runder oder langgestreckter Form (Spd in Abbildung 4B ). Bemerkenswert ist, dass rSPD ähnlich wie SPG in Größe und Form ist, aber deutlich durch das Vorhandensein lokalisierter Chromocenters unterschieden wird. Basierend auf diesen Merkmalen wurden sortierte Zellpopulationen für die Anreicherung spezifischer Zelltypen ausgewertet ( Tabelle 1 ). SPD- und SPC-II-Populationen waren für den Zelltyp von Interesse stark angereichert, während SPC I und SPG einen gewissen Grad an Kontamination mit anderen Zelltypen zeigten, insbesondere für die Guinea-Pig- und Mini-Pig-Proben. Interessanterweise war für die Hundeprobe die Gating-Strategie ausreichend, um sich von verlängernden Spermatiden zu unterscheiden ( Abbildung 3C , Ergänzende Abbildung 3 , Tabelle 1
Abbildung 1: Arbeitsablauf der Ho-FACS-Isolierung von männlichen Keimzellen von Säugetieren Dieses Bild veranschaulicht das allgemeine Protokoll für die Keimzellisolierung von Säugetierkeimzellen mit repräsentativen Daten von der Anwendung dieses Protokolls auf Ratten-Testis. Ho: Hoechst Von Lima et al. 5 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Einzelzelle Suspensionen durch mechanische Dissoziation von Maus-Hodengewebe Proben aus frischem Gewebe ( AB ) zeigen eine Vielzahl von intakten Keimzelltypen und sehr wenig Trümmer. Im Vergleich zu ungefärbten Zellen ( A ) wurde für die Hoechst-gefärbten Zellsuspensionen ( B ) ein gewisses Zellklumpen beobachtet, das durch Zugabe von DNase (Endkonzentration von 10 μg / ml) sofort nach der Dissoziation ( D ) reduziert werden kann. Gefrorenes Hodengewebe kann auch verwendet werden, um Einzelzellsuspensionen durch mechanische Dissoziation ( C ) zu erhalten. Es scheint jedoch, dass der Prozess des Flash-Gefrierens und Auftauens vor der Gewebe-Dissoziation zu mehr Schutt, Zelltod und insgesamt weniger zelluläre Ausbeute führt. Nach der Dissoziation (siehe Protokoll) wurden die Proben 10 min bei 4 ° C versponnen und in 1x DMEM vor der Montage der Folien wieder aufgehängt. Schwarze Balken = 50 μm. Bilder erhalten mit einem aufrechten weißen Lichtmikroskop mit einer UV-Lampe ausgestattet.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Ho-FACS von Säugetierkeimzellen. Spezifische Populationen präsentieren einzigartige Muster der Hoechst Fluoreszenz während FACS ( A ). Da Hoechst blaue Fluoreszenz die Variationen der Chromatingehalt-Cluster von haploid ( C ) widerspiegelt; Diploide (2C) und tetraploide (4C) Zellen befinden sich in Bereichen des FACS-Plots mit zunehmender hoechst blauer Fluoreszenz. Plots, die als Funktion von Hoechst blau / roter Fluoreszenz erzeugt werden, zeigen Cluster unterschiedlicher Zellpopulationen für die verschiedenen untersuchten Säugetierarten ( BC ). SPG: Spermatogonie; SPC I: Primäre Spermatozyten; Pre-Lep: Pre-Leptotene-Spermatozyten; Lep: Leptotin-Spermatozyten; Dip: Diploten-Spermatozyten; SPCII: sekundäre Spermatozyten; SPD: Spermatiden; ESPD: verlängernde Spermatiden; RSPD: runde spermatiden Angepasst von Lima, et al. 5 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Morphologie von Keimzellen in verschiedenen Entwicklungsstadien von vier Säugetierarten. Diese Figur zeigt Abschnitte des mit Hoechst (A) gefärbten Hodengewebes und den allgemeinen Aspekt der verschiedenen männlichen Keimzelltypen, sortiert nach Ho-FACS (B) von Ratte, Meerschweinchen, Hund und Minigrot. Als Zellgröße, Form und Chromatin-Konformation variiert drastisch während der Spermatogenese, können diese verwendet werden, um Zellen zu verschiedenen Stufen der Differenzierung zuzuordnen. Spermatogonia (Spg) sind klein und rund cElls mit ausgeprägtem pericentrischem Heterochromatin und weisen eine hohe Intensität der Hoechst-Fluoreszenz auf. Spermatocyten sind die größten Keimzellen und zeigen variable Chromatinkonformationen. Nuklei primärer Spermatozyten (Spc I) zeigen Chromatinvariationen, die für meiotische Zellen charakteristisch sind, während sekundäre Spermatozyten (Spc II) binkukleiert oder in Diakinese sind. Spermatiden (Spd) haben eine runde oder längliche Form, je nach dem Stadium der Spermiogenese und sind kleine haploide Zellen. Obwohl runde Spermatiden und Spermatogonien in Größe und Form ähnlich sind, kann das erstere durch die Anwesenheit lokalisierter Chromocenters unterschieden werden. Folien wurden für jeden sortierten Zelltyp nach Ho-FACS vorbereitet und wurden in einem konfokalen Mikroskop visualisiert: 63fache Vergrößerungslinse, mit (unterer Tafel) oder ohne (obere) weiße Lichtübertragung. Von Lima et al. 5 mit Erlaubnis. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| % Zellen im DNA-Inhalt-Gate | Reinheit der sortierten Keimzellpopulationen (%) | |||||||||||
| Spezies | % Einzelstücke | % Lebende Zellen | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | RSpd | ESpd | |
| Maus | 98.4 | 92,5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87,5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| Ratte | 95,7 | 93,8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Meerschweinchen | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Hund | 97,9 | 86,5 | 16.4 | 3 | 0,5 | 78 | . | 87 | . | 91. | 81 | |
| Mini Schwein | 95,9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Erlangt durch enzymatische Dissoziation und gatedBasierend auf FSC- und SSC-Parametern (von Lima et al., 2016, mit Genehmigung) | ||||||||||||
Tabelle 1: Statistik von Ho-FACS von männlichen Keimzellsuspensionen, die durch mechanische Dissoziation erhalten wurden.
Ergänzend Abbildung 1: Einzelzelle Suspensionen durch mechanische Dissoziation von gefrorenem Hodengewebe erhalten. Die mechanische Dissoziation ermöglicht die Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten ohne die Notwendigkeit von Spezies-spezifischen Protokollen. Verschiedene Tafeln zeigen die Zellsuspensionen, die für 4 Säugetierarten erhalten wurden. Proben wurden durch mechanische Dissoziation von gefrorenem Hodengewebe erhalten und mit Hoechst gefärbt. SPG: Spermatogonie; SPC I: Primäre Spermatocyte; SPC II: Sekundäre Spermatocyte; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoen. Folien wurden in einem Konfoka visualisiert L Mikroskop mit (unterer Tafel) oder ohne (obere Tafel) weiße Lichtdurchlässigkeit. Maßstäbe = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 2: Gating-Strategie für die Trennung von lebenden männlichen Keimzellen durch Ho-FACS von Maus-Hoden-Einzelzell-Suspensionen. Lebendzellen (PI negativ) werden nach Hoechst Fluoreszenz sortiert. Spermatogonia (SPG) werden identifiziert, indem man direkt Hoechst-blaue und rote Fluoreszenzintensitäten aufzeichnet. Ein DNA-Content-Gate wird verwendet, um Zellen auf der Grundlage von Hoechst blaue Fluoreszenz zu sortieren: haploid (C); Diploid (2C) und tetraploid (4C). Die Zellen in jedem Peak des Histogramms werden dann sortiert, indem man die Funktion von Hoechst blau und roter Fluoreszenz zeichnet. SPG: Spermatogonie; SPD: Spermatiden; SPC II: Sekundäre Spermatozyten; SPC I: Primäre SpermatozytenD / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 3: Gating-Strategie für die Trennung von lebenden männlichen Keimzellen durch Ho-FACS von Hoden-Hoden-Hammelfleisch-Suspensionen. Lebendzellen (PI negativ) werden nach Hoechst Fluoreszenz sortiert. Spermatogonia (SPG) werden identifiziert, indem man direkt Hoechst-blaue und rote Fluoreszenzintensitäten aufzeichnet. Ein DNA-Content-Gate wird verwendet, um Zellen auf der Grundlage von Hoechst blaue Fluoreszenz zu sortieren: haploid (C); Diploid (2C) und tetraploid (4C). Die Zellen in jedem Peak des Histogramms werden dann sortiert, indem man die Funktion von Hoechst blau und roter Fluoreszenz zeichnet. Der Peak, der haploide Zellen enthält, kann nach dem Bereich der Hoechst-Blau-Intensität unterteilt werden und stellt zwei Subpopulationen von Spermatiden dar: verlängernde Spermatiden (Gate C ') und runde Spermatiden (Gate C' '). SPG: Spermatogonie; ESPD: verlängernde Spermatiden; RSPD: runde spermatiden; SPC II:Sekundäre Spermatozyten; SPC I: Primäre Spermatozyten Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 4: Gating-Strategie zur Trennung von lebenden männlichen Keimzellen durch Ho-FACS von Meerschweinchen-Hoden-Hoden-Säure-Suspensionen. Lebendzellen (PI negativ) werden nach Hoechst Fluoreszenz sortiert. Spermatogonia (SPG) werden identifiziert, indem man direkt Hoechst-blaue und rote Fluoreszenzintensitäten aufzeichnet. Ein DNA-Content-Gate wird verwendet, um Zellen auf der Grundlage von Hoechst blaue Fluoreszenz zu sortieren: haploid (C); Diploid (2C) und tetraploid (4C). Die Zellen in jedem Peak des Histogramms werden dann sortiert, indem man die Funktion von Hoechst blau und roter Fluoreszenz zeichnet. SPG: Spermatogonie; SPD: Spermatiden; SPC II: Sekundäre Spermatozyten; SPC I: Primäre Spermatozyten Bitte klicken Sie hierWnload diese Datei.
Ergänzend Abbildung 5: Gating-Strategie für die Trennung von lebenden männlichen Keimzellen durch Ho-FACS von Mini-Schweine-Hoden-Einzelzell-Suspensionen. Lebendzellen (PI negativ) werden nach Hoechst Fluoreszenz sortiert. Spermatogonia (SPG) werden identifiziert, indem man direkt Hoechst-blaue und rote Fluoreszenzintensitäten aufzeichnet. Ein DNA-Content-Gate wird verwendet, um Zellen auf der Grundlage von Hoechst blaue Fluoreszenz zu sortieren: haploid (C); Diploid (2C) und tetraploid (4C). Die Zellen in jedem Peak des Histogramms werden dann sortiert, indem man die Funktion von Hoechst blau und roter Fluoreszenz zeichnet. SPG: Spermatogonie; SPD: Spermatiden; SPC II: Sekundäre Spermatozyten; SPC I: Primäre Spermatozyten Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 6: Untersuchung der somatischen Zelle KontaminatIonen in Ho-FACS sortierten Populationen. T-verteilte stochastische Nachbareinbettung (t-SNE) von etwa 600 Einzelzelltranskriptom aus drei FACS-Subpopulationstoren (AB). Auf dem t-SNE-Plot repräsentiert jeder Punkt die eindeutige Position einer einzelnen Zelle in einem Transkriptomraum und jede Zelle ist mit ihrem FACS-Subpopulationstor-Ursprung (A) markiert. Visuelle Quantifizierung von zelltypspezifischen Markern auf dem FACS-Einzelzell-t-SNE-Plot (B). Die Kontamination von somatischen Zellen wird auf weniger als 5% geschätzt und ist nicht spezifisch für ein Ho-FACS-Populations-Tor. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In Anbetracht der hochkonservierten Chromatin-Dynamik bei der Spermatogenese bei Säugetieren war das Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zu entwickeln, um männliche Keimzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung von verschiedenen Säugetier-Hodengeweben zu isolieren ( Abbildung 1 ). Eines der größten Hindernisse bei der Anwendung eines einzelnen Workflows auf verschiedene Tiermodelle ist die Notwendigkeit von Spezies-spezifischen Anpassungen, insbesondere in Bezug auf Gewebe-Dissoziations-Protokolle. Gegenwärtige Methoden beruhen meistens auf enzymatischer Gewebeverdauung und Protokolle variieren oft sogar innerhalb der Spezies 12 . Um dieses Problem zu überwinden, zeigt das hier beschriebene Protokoll die Anwendung der mechanischen Gewebe-Dissoziation, um Einzelzell-Suspensionen aus Hodenproben verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass die mechanische Dissoziation von frischem Hodengewebe mit diesem System gut abläuft ( Abbildung 2A- 2B 20 . Wichtig ist, dass die Hoechst-Färbung die Qualität der Einzelzell-Suspensionen nicht signifikant beeinflusst. Obwohl mehr Zellverklumpen in gefärbten Proben sichtbar ist ( Abbildung 2B ), kann die Behandlung mit DNase ( Abbildung 2D ) oder NDA 20 dazu beitragen, dieses Problem zu vermeiden. Frühere Berichte deuten darauf hin, dass die mechanische Dissoziation von Hodengewebe besser als oder so effizient ist wie die enzymatische Gewebsverdauung 5 , 20 . Entsprechend zeigen die hier dargestellten Daten, dass die mechanische Dissoziation eine zuverlässige Methode ist, um Einzelzell-Suspensionen aus Hodengewebe für die Ho-FACS-Verarbeitung zu erhalten.
Die Inkubation mit Hoechst ist ein entscheidender Schritt, da sie das bei der Durchflusszytometrie detektierte Signal beeinflusst. Lange Perioden der Färbung sorgen für eine bessere Diskriminierung von Keimzelltypen, abergiftig sein kann, was zu Zelltod und Veränderungen der intrazellulären Programmierung 22. Anwender, die mit dieser Methode Keimzellkulturen herstellen wollen, sollten die genotoxische Wirkung der Langzeitbelastung von Hoechst 3 , 22 bewerten und die angemessene Konzentration und Zeit der Färbung bestimmen. Hier genügten 30 min Färbung, um eine zuverlässige Trennung der Keimzellpopulationen zu ermöglichen ( Abbildung 3B- 3C ). Die Dauer der Färbung kann möglicherweise auf 10 min reduziert werden, wie von Rodriguez-Casuriaga et al. 20 , und sollte weiter von den Nutzern für die Arten von Interesse bewertet werden.
Wie bereits erwähnt, können vier Keimzellpopulationen konsequent nachgewiesen werden - SPG, SPC I, SPC II und SPD - basierend auf Chromatin-Variationen von Keimzellen aus den verschiedenen getesteten Spezies ( Abbildung 3B- 3C Tabelle 1 ) und unterstützen die in diesem Workflow ( Abbildung 1 ) angewandte Gating-Strategie für verschiedene Säugetierarten ( Ergänzende Figuren 2- 5 ). Es ist dennoch ratsam, dass die Benutzer das Gating entsprechend der Art und Populationen von Interesse optimieren, um die Kreuzverunreinigung für einige Populationen zu reduzieren (Tabelle 1). Dies kann durch längere Inkubationszeiten während der Färbung erreicht werden18 , reduzierte Durchflussmenge 2 und reduzierte Torgrößen. SPG sind anspruchsvoller zu isolieren, da sie der seltenste Zelltyp im Hoden sind und auch aufgrund des Farbstoffausflusses über die Zeit 1 , 15 . Obwohl es möglich ist, unterschiedliche SPG-Populationen von Ho-FACS zu erkennen, wie hier gezeigt, würden Studien, die sich ausschließlich auf die Stammzellbiologie konzentrieren, von einer strengeren Technik wie der magnetisch-aktivierten Zellsortierung (MACS; 23 ) profitieren. Bemerkenswerterweise konnten Subpopulationen von SPD (eSPD und rSPD) eindeutig für den Hund, aber nicht für andere Arten unterschieden werden ( Abbildung 3C und ergänzende Abbildung 3). Potenziell können diese Subpopulationen durch Anpassen der Gating-Einstellungen gelöst werden, wie von den Autoren für die Maus beschrieben 5 . Zytogramme, die für die Zellgröße und Granularität (FSC VS SSC) erzeugt wurden, bevor sie die Funktion von Hoechst blau / rot fluoreszierenNr, unterscheidet langgestreckte (niedrige FSC + SSC), von runden (hohen FSC + SSC) spermatiden Subpopulationen. Die Trennung von runden und langgestreckten Spermatiden-Subpopulationen würde eine eingehendere Untersuchung der Spermiogenese ermöglichen und neue Einsichten in spezifische molekulare Ereignisse, die während der Spermien-Differenzierung auftreten, bringen. Auch ist es, wie für die Maus 1 , 2 , 12 beschrieben , möglich, eine weitere Auflösung von meiotischen Stufen durch Einstellen von FACS-Toren zu erhalten. Ein solcher Ansatz würde weitgehend vergleichende Untersuchungen von meiotischen Ereignissen ermöglichen. Obwohl die Zellenintegrität während des Ho-FACS gestört wird, zeigen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten, die für Zellen erhalten wurden, die mit dieser Methode sortiert wurden (Jung et al. , Unveröffentlichte , ergänzende Abbildung 6 ), dass dies ein zuverlässiger Ansatz ist, um Zellen für molekulare Studien der Keimzelle zu erhalten Biologie. Dennoch wollen Benutzer, die beabsichtigen, Fortpflanzungsassays durchzuführen, wie z. B. rOs-spermatid-Injektion (ROSI) unter Verwendung von Zellen, die von Ho-FACS isoliert wurden, muss die Lebensfähigkeit von sortierten Zellen beurteilen und vielleicht alternative Methoden 24 , 25 untersuchen .
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit ein standardisiertes Verfahren zur Isolierung von Hodenkeimzellen aus verschiedenen Säugetieren, Aufbau und Hinzufügen von Verfeinerungen auf zuvor etablierten Techniken 2 , 12 , 20 . Eine solche Standardisierung ermöglicht die Verwendung eines Satzes von Reagenzien und eines einzigen Arbeitsablaufs auf verschiedenen Säugetierarten, was die Datenerzeugung für Vergleichsstudien der Keimzellbiologie erleichtert. Auch die mechanische Gewebedissoziation überwindet die Hürde von speziesspezifischen Anpassungen, die eine methodische Variabilität einführen können, die fast unmöglich ist. Darüber hinaus beschränkt die reduzierte Ausführungszeit und Manipulation Störungen von ex vivo celSpät Physiologie auf ein Minimum. In dieser Hinsicht ist Ho-FACS im Vergleich zu anderen Methoden der Keimzell-Isolation, wie STA-PUT und Elutriation 6 , 7, deutlich schneller. Darüber hinaus ist die gleichzeitige Trennung von 4 Keimpopulationen im selben Experiment nur durch FACS möglich. Angesichts der Eigenschaften des Hoechst-Farbstoffs sind Zellstruktur und RNA-Spezies erhalten, und daher können Zellen für weitere nachgeschaltete molekulare Studien verwendet werden. Wichtig ist, dass Ho-FACS auf Chromatin-Attribute zur Diskriminierung von Keimzelltypen beruht, die erfolgreiche Durchführung dieses Workflows in 5 verschiedenen Spezies stark unterstützt seine Anwendung auf andere Säugetiere. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spermatogenese ein einzigartiger Prozess der Zelldifferenzierung sein könnte, der in vielen Säugetierarten mit einem einzigen Protokoll angegangen werden könnte. Als solche, in der "omics" und Systembiologie Ära, bietet diese Technologie die Mittel für eine evolutionäre AppRoach auf Fragen der männlichen Keimzellbiologie, einschließlich Studien der Epigenetik, Regulierung und Proteinvielfalt während der Spermatogenese.
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Disclosures
Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) für Hundehunde; Jason Arand und Dr. Ted Cicero's Labor an der Washington University in St. Louis (WashU) für die Bereitstellung von Ratten-Testes und Brianne Tabers für die Unterstützung der Sammlung; Jared Hartsock und Dr. Salt's Lab bei WashU für die Meerschweinchen-Hoden; Und Dr. Michael Talcott in der Abteilung für Vergleichende Medizin bei WashU für die Mini-Schweine-Hoden. Die Autoren bestätigen auch das Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine und dem Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz des Siteman Flow Cytometry Core, der mit dem Personal betriebenen Zellsortierdienst ausgestattet war. Das Siteman Cancer Center wird teilweise unterstützt von NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Diese Forschung wurde von einem FCT-Doktorandenstipendium [SFRH / BD / 51695/2011 an ACL] finanziert, gewährt von den United States National Institutes of Health [R01HD078641 und R01MH101810 bis DFC] und einem FCT-Forschungsvertrag [IF / 01262/2014 bis AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
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