Summary
Detta arbete beskriver standardiseringen av en metod för att erhålla renade bakteriecellspopulationer från testikelvävnad hos olika däggdjursarter. Det är ett enkelt protokoll som kombinerar mekanisk testdissociation, färgning med Hoechst-33342 och propidiumjodid och FACS-sortering, med breda tillämpningar i jämförande studier av manlig reproduktiv biologi.
Abstract
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har varit en av de metoder som valts för att isolera berikade populationer av däggdjurs testikulära bakterieceller. För närvarande tillåter det diskriminering av upp till 9 murina bakteriecellspopulationer med högt utbyte och renhet. Denna högupplösning i diskriminering och rening är möjlig på grund av unika förändringar i kromatinstruktur och kvantitet genom spermatogenes. Dessa mönster kan fångas genom flödescytometri hos manliga bakterieceller färgade med fluorescerande DNA-bindande färgämnen, såsom Hoechst-33342 (Hoechst). Här är en detaljerad beskrivning av ett nyligen utvecklat protokoll för att isolera däggdjurs testikulära bakterieceller. I korthet alstras enkelcellssuspensioner från testikelvävnad genom mekanisk dissociation, dubbelfärgad med Hoechst och propidiumjodid (PI) och behandlad genom flödescytometri. En seriell gatingstrategi, inklusive valet av levande celler (PI-negativa) med olika DNA-innehåll (Hoechst-intensitet), jagS som används vid FACS-sortering för att diskriminera upp till 5 bakteriecellstyper. Dessa ingår, med motsvarande genomsnittliga renheter (bestämda genom mikroskopi-utvärdering): spermatogoni (66%), primära (71%) och sekundära (85%) spermatocyter och spermatider (90%), ytterligare separerade till rund (93%) och förlängande (87%) subpopulationer. Utförandet av hela arbetsflödet är enkelt, möjliggör isolering av 4 celltyper samtidigt med lämplig FACS-maskin och kan utföras på mindre än 2 timmar. Eftersom reducerad bearbetningstid är avgörande för att bevara fysiologin hos ex vivo- celler, är denna metod ideell för nedströms hög genomströmningsstudier av manlig bakteriebiologi. Vidare eliminerar ett standardiserat protokoll för multispecies-rening av däggdjurscellenceller metodkällor för variabler och tillåter att en enda uppsättning reagenser används för olika djurmodeller.
Introduction
Med tanke på bristen på ett in vitro- system som är representativt för spermatogenesprogression och närvaron av stor cell heterogenitet i testis, kräver studier av manlig bakteriefelbiologi robusta tekniker för att isolera berikade populationer av specifika celltyper. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har använts i stor utsträckning för detta ändamål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 eftersom det ger hög utbyte och renhet och överträffar andra isoleringsmetoder i antalet bakteriecellstyper som den kan identifiera och Välj 6 , 7 , 8 . Principen för flödescytometrianalys är baserad på detektering av differentialljusmönster efter laserstrålens excitation av enskilda celler. När en cell passerar genom lasern speglar den / sprider ljusetVid alla vinklar, proportionell mot cellstorlek (framåtriktad scatter; FSC) och till intracellulär komplexitet (sidospridning; SSC). Se Ormerod 9 för detaljerad information om flödescytometri.
Manliga bakterieceller genomgår specifika modifieringar i DNA-innehåll, kromatinstruktur, storlek och form under olika steg av spermatogenes. Sålunda kan separata cellpopulationer identifieras och separeras genom att kombinera ljusspridning och DNA-färgning med fluorescerande färgämnen 10 , 11 . Flera färgämnen kan användas för detta ändamål (översynen i Geisinger och Rodriguez-Casuriaga 3 ), såsom Hoechst-33342 (Hoechst) som har använts ofta i flödescytometrianalys av testikelceller under det senaste decenniet 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitation med UV-ljus, emitterar Hoechst blå fluorescens proportionell mot cell-DNA-innehållet medan långt röd fluorescens återspeglar variation i kromatinstruktur och komprimering 1 , 13 , 14 . Som ett resultat uppvisar manliga könsceller i olika steg av differentiering specifika mönster under FACS av Hoechst-färgade enkelcellsuspensioner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Intressant är att intensiteten hos Hoechst-blå fluorescens inte är proportionell mot kromatinhalten i dessa celler på grund av en mekanism för färgutsläpp som endast är aktiv under spermatogonalt stadium, och de kluster som en sidopopulation under Ho-FACS 15 . Dessutom tillåter kombinering av Hoechst-färgning med det icke-permeanta färgämnet propidiumjodid (PI) användarna att diskriminera levande (PI-negativa) från döda (PI-positiva) celler under FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Denna strategi har tidigare använts i flödescytometriska analyser av testikulära bakterieceller och optimeras extensivt i musen för att diskriminera upp till 9 bakterie celltyper, inklusive celler i 4 olika steg av meiosi I 1 , 2 , 4 , 16 . För detta arbete har Hoechstfärgning tre huvudfördelar. Först har Ho-FACS framgångsrikt applicerats på isoleringen av manliga könsceller i musmodellen 1 , 2 , 12 och andra gnagare såsom råtta och marsvin 17 , 18 , 19 . För det andra är Hoechst ett cellgenomsläppligt färgämne och kräver inte membranpermeabilisering, så det förbehållsVes cellintegritet. Slutligen krävs ingen RNase-behandling eftersom Hoechst binder företrädesvis till poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 vilket innebär att RNA bevaras och förutom DNA och proteiner kan användas för ytterligare nedströms molekylära studier av bakterie Celldifferentiering.
Trots likheten i DNA-ploidi och / eller fläckbarhet observerad i flödescytometrianalyser av däggdjursarter (granskad i Geisinger och Rodriguez-Casuriaga 3 ) har det skett en stor variation i protokollen som beskrivits för manlig bakteriecells isolering genom flödescytometri. Olika studier har använt specifika protokoll för vävnadsdissociation och använde separata DNA-bindande färgämnen (ensamma eller i kombination) och FACS-gatingstrategier i olika modellorganismer, huvudsakligen mus, råtta och marsvin. Följaktligen kan direkt jämförelse av data som samlas in för olika arter påverkas av unaccoUnted tekniska artefakter som härrör från variationer mellan metoder. Viktigt är att den slående bevarande av kromatindynamiken genom hela spermatogenesen hos däggdjur (2N-4N-2N-1N) antyder att ett standardiserat protokoll kan tillämpas tvärs över en mängd olika däggdjursarter.
Målet med denna studie var att utveckla ett enda arbetsflöde som är tillämpligt på olika däggdjursarter genom att kombinera och anpassa tidigare publicerade tekniker 2 , 20 . Standardisering av en metod för vävnadsbehandling uppnåddes genom att man utför mekanisk dissociation för att övervinna behovet av artspecifika justeringar som krävs för enzymatisk digestion 5 . Det är anmärkningsvärt att mekanisk dissociation av gnagare testikulär vävnad har visat sig fungera bättre än enzymatisk vävnadsdigestion 20 och Ho-FACS av enkelcellssuspensioner som alstras med båda metoderna uppvisarDet jämförbara resultatet 5 . Som principiellt bevis beskriver detta protokoll de inställningar som används för att isolera upp till 5 bakteriecellspopulationer: spermatogonia (SPG); Primär (SPC I) och sekundära spermatocyter (SPC II) och spermatider (SPD) - round (rSPD) och elongating (eSPD). Viktigt är att det är lätt att genomföra i labbet, där huvudkraven är systemet för vävnadsdissociation och tillgång till en cell sorterare utrustad med en UV-laser. Detta arbetsflöde ( Figur 1 ) är snabb och okomplicerad och möjliggör samtidig isolering av 4 bakteriecellspopulationer från frisk testikelvävnad på mindre än 2 timmar. Den reducerade bearbetningstiden är avgörande för att upprätthålla cellulär integritet för ytterligare nedströms procedurer. Dessutom föreslår dess framgångsrika prestanda i 5 olika arter att den i stor utsträckning kan appliceras inom däggdjursskivan, vilket gör den till en idealisk metod för att isolera bakterieceller för jämförande studier av däggdjursframkallande biology.
Detta protokoll består av tre huvuddelar, bortsett från förberedande steg: (1) den mekaniska dissociationen av testikelvävnad och (2) färgning av testikelceller med Hoechst och PI, följt av (3) FACS-sortering av relevanta spermatogena celler. När de är uppsamlade kan dessa berikade populationer av olika testceller från däggdjursceller användas för ett brett användningsområde. Detta protokoll beskriver en dissociationsmetod för "enstorlek som passar alla" för att rena manliga bakterieceller från många olika däggdjursarter. Beroende på vilken typ av studie användarna vill genomföra med de isolerade bakteriecellerna kan andra medier eller buffertar användas. Följande protokollsteg är för att generera enkelcellsuspensioner från en hel murint testis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs nedan överensstämde med bestämmelserna i Animal Studies Committee vid Washington University i St. Louis.
1. Förberedelser för mekanisk dissociation protokoll
- Förvätska en 50 μm disponibel vävnadsdisaggeringspatron för dissociering av en hel murint testis.
ANMÄRKNING: Denna disponibla vävnadsdisagreringspatron innehåller mikrobladen avsedda för skärning av vävnader och ett immobilt stålnät med cirka 100 hexagonala hål. Olika storlekar av nät för vävnadsuppdelningskassett är tillgängliga för att anpassa detta protokoll baserat på art och önskade celltyper. 50 μm patroner användes för alla däggdjursarter som nämns i detta papper.- Ladda 1 ml iskallt fenolröd fri 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) på 50 μm engångssjukdomsuppdelningskassetten.
OBS: Fenolröd kan störa detektering av röda fluorerCens under FACS. - Aspirera 1x DMEM från vävnadsuppdelningspatronen med en engångsfri spruta från 3 ml av sprutans öppning.
- Ladda 1 ml iskallt fenolröd fri 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) på 50 μm engångssjukdomsuppdelningskassetten.
- Slå på vävnadsuppdelningen genom att trycka på "ON" -knappen. Detta system kräver inte "uppvärmning" tid.
- Pre-våt tre 40 μm engångsfilter med iskall 1x DMEM. Placera varje 40 μm engångsfilter på ett 50 ml koniskt rör. Pipettera 1 ml 1x DMEM och låt passera genom vätskan.
- Förbered en 100 mm x 15 mm petriskål för insamling av testikelvävnader. Pipettera 500 μl 1x DMEM på petriskålen.
2. Framställning av testikulär vävnad för mekanisk dissociationsprotokoll
- Dissektera en manlig mus för att försiktigt avlägsna friska hela testiklar eller testikelfragment (om de hanterar andra däggdjursarter) med kirurgiska saxar och tångar.
OBS! Se till att vävnaderna är fria från fett och nekros. Fr Esh testikulära vävnader genererar överlägsen encells suspensionskvalitet än frusna vävnader.- Överför uppsamlade testiklar / fragment till den beredda petriskålen 100 mm x 15 mm innehållande 500 | il 1x DMEM.
- Skölj väskan försiktigt i 1x DMEM för att ta bort röda blodkroppar (om det finns närvarande).
- Ta försiktigt bort tunica albuginea. Tjockleken på tunica albuginea kommer att variera i olika arter.
- Ta den ena änden av testis med pincett.
- Punktera den andra änden av testis med en skalpell medan du fortfarande håller den ena änden av testis med tångar från föregående steg.
- Skrapa testikulära tubuler med en skalpell medan du fortfarande håller den ena änden av testis med tångar från steg 2.2.1.
- Skär testikelrör i bitar på 2-3 mm 3 med en skalpell.
3. ErhåUande enkelcellssuspensioner genom mekanisk dissociation av testikelvävnad
Ontent "> ANMÄRKNING: De dissociationsteg som beskrivs nedan är för en vuxen mus testis. Volymer av testikelvävnader från ungdomsmus eller icke-murina arter bör justeras i enlighet därmed. Juvenildjur får inte innehålla alla stadier av bakterieceller. Vissa däggdjursarter har Testikelvävnadskompositionen förändras under uppfödningsperioden i jämförelse med icke-parningstid.- Överför de små testikelrörstyckena till den förfuktade 50 μm vävnadsuppdelningspatronen med hjälp av tångar och tillsätt 1 ml 1x DMEM.
- Ladda vävnadsuppdelningspatronen till vävnadsdisaggregeringssystemet och bearbeta i 5 minuter genom att vrida vredet från "standby" till "run" -läge.
- Ta bort vävnadsdisagreringspatronen från vävnadsdisaggregeringssystemet och aspirera cellsuspension med en engångsfri sprut från 3 ml från sprutporten.
- Aspirera några gånger för att avlägsna all vätska från vävnadsdisagreringspatronen. InteAlla 1 ml kan utvinnas från vävnadsdisaggregeringspatronen.
- Passera den aspirerade cellsuspensionen genom två engångsbehandlade 40 μm filter. Filtrera två gånger för att ta bort eventuella cellaggregat.
- Placera ett förvättat 40 μm filter i ett 50 ml koniskt rör. Lägg direkt i aspirerade celler i sprutan på 40 μm filtret. Pipett genomgående encells suspension med en engångspipett.
- Ta bort det använda förvättade 40 μm filtret och placera ett annat förvättat 40 μm filter i det 50 ml koniska röret. Pipettera den uppsamlade encellsuspensionen på det rena 40 μm filtret.
- Samla filtrerad enkelcells suspension med en ren engångspipett.
- Pipettfiltrerad cellsuspension tillbaka till 50 μm vävnadsuppdelningspatronen och bearbeta under ytterligare 5 min i ett vävnadsdisegregationssystem.
- Återvinna all vätska från vävnadsdispergeringenPå patronen.
4. Färgning med Hoechst och Propidiumjodid (PI)
- Överför återställd cellsuspension från 50 μm vävnadsdisaggeringspatronen till ett rent 1,5 ml rör. Cirka 1-1,5 ml suspension med en cellscell kommer att återvinnas.
- Uppdela den återvunna single-cellsuspensionen i fyra 1,5 ml eller 5 ml rör.
- För de första tre rören, pipett 150 μL av encells suspension och pipett vila av encells suspension i den sista av de fyra rören (ca 550 μL enkelcells suspension).
ANMÄRKNING: Mängden av encellsuspension i det sista röret kan variera baserat på effektiviteten av cellupphängningsåtervinning vid steg 3.6.
- För de första tre rören, pipett 150 μL av encells suspension och pipett vila av encells suspension i den sista av de fyra rören (ca 550 μL enkelcells suspension).
- Ställ in första röret i de fyra rören som en obestämd kontroll för FACS-sessionen.
- Förbered enkla färgämnesfärgade (PI eller Hoechst) cell suspensioner som kontroller. Tillsätt 2,5 μL Hoechst eller 1 μl PI till varje rör (andra och andrard).
- Förbered ett dubbelfärgat rör. Detta kommer att användas för insamling av bakteriecellspopulationer. Tillsätt 2,5 μL Hoechst och 1 μl PI till det sista röret.
OBS! Hoechst har en hållbarhetstid på 2-3 månader. Användning av äldre bestånd av färgämne medför betydande förändringar under FACS-sessionen. - Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörkret. Placera prov i en rörrotator eller vänd 1,5 ml rören var 5-10 minuter.
- Filtercellsuspension med en förfuktad 40 μm sil och håll den filtrerade lösningen på is och i mörkret tills FACS-sessionen.
OBS: Filtreringsteget är nödvändigt för att förhindra cellklumpar för FACS. Dessutom kan behandling med DNas (se figur 1 ) eller 2-naftol-6,8-disulfonsyra dikaliumsalt (NDA 20 ) användas för att begränsa cellklumpning. Förlängda väntetider påverkar den fluorescerande signalen som detekteras under FACS och kan resultera i ökad celldöd.5. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) uppställning och rening av testikulära celler
- Förbered FACS-samlingsrör.
- Belägga 5 ml polypropylenrundbottenrör eller 1,5 ml rör med 400 | il FBS för celluppsamling. Dekantera överskott FBS efter beläggning.
- Lägg till FACS-samlingsmedium (1x DMEM + 10% fetalt bovint serum, FBS) till rören: 1 ml för 5 ml rör eller 100 | il för 1,5 ml rör.
- Ställ in lämpliga sorteringsförhållanden i cell sorterare och programvara.
OBS: Andra cellsorteringsmaskiner och analysprogram kan användas med de liknande installations- och gatingstrategierna nedan. Villkoren som beskrivs här var anpassade från Gaysinskaya och Bortvin 2 , Geisinger och Rodriguez-Casuriaga 3 och Getun et al. 4- Ladda en ultraviolett laser med 463/25 nm bandpassfilter för att detektera Hoechst Blue och 680 nm LP bandpassfilter för att detektera Hoechst Red och att detektera PI.
- Använd en 555DLP dikroisk spegel för att skilja blå från röd fluorescens.
- Använd ett 70 μm munstycke och sortera celler med en hastighet av 1000-2000 celler / sekund.
OBS! Sorteringseffektivitet påverkas direkt av flödeshastigheten. Höga flödeshastigheter (> 3500 händelser / s) ökar sorteringshastigheten men resulterar i förorening av populationer. Se referens 12 för ytterligare information.
- Ställ in grindar med hjälp av kontrollprover.
- Ladda och springa ostämplat prov.
- Exkludera cellskräp baserat på FSC vs SSC-plotmönster. Cellavfall kommer att dyka upp i nedre vänstra kvadranten av tomten. Godtyckligt sätt tröskeln för cellavfall av användaren eller cell sorterings tekniker.
- Gate på enskilda celler genom att justera tröskeln för FSC och pulsbredden. Olika cellsorterare har olika sätt att skiljaGuish singlets. Eftersom pulsbredden återspeglar tidcellerna att ta över lasern, har enskilda celler lägre värden jämfört med multicellulära aggregat. Justering av tröskelvärdet på en plot för FSC vs pulsbredd kan användas för att välja för singlar.
- Ställ optimala fotomultiplikatorrör (PMT) spänningar.
- Använd både ostärkta och enkelfärgade färgade celler för att fastställa tröskeln för PI eller Hoechst fluorescenssignalen.
OBS! Det är viktigt att optimera baslinjens PTM-spänning för celler av intresse för att fastställa det korrekta fluorescensområdet för varje färgämne. Detta är kritiskt för optimal signaldetektering och känslighet. De obestämda och enda färgade kontrollcellerna används för att upprätta en rad negativt och positivt färgade celler med PI och / eller Hoechstfärger och minimera brus i signaler. För ytterligare förklaringar om optimering av PMT-spänning med kontrollceller, se Gaysinskaya och Bortvin 2 - Gate på levande cellS baserat på PI-färgning (PI-negativ) och FSC-plot. Döda celler kommer att vara positiva för PI-fluorescens.
- Ställ in DNA-innehållsgrinden genom att rita ett histogram av celltal baserat på Hoechst-blå fluorescens. 3 toppar med ökande koncentrationer av Hoechst blå fluorescens ska uppträda som representerar haploid (1C), diploid (2C) och tetraploid (4C) celler. Ange 3 grindar, en för varje topp.
- Observera minst 500 000 händelser på FSC vs SSC-plot innan du fortsätter att gata på bakteriepopulationer.
- Gate olika bakteriecellspopulationer.
- Ladda Hoechst / PI-färgat prov.
- Ange de första 3 föräldrarnas portar som är gemensamma för alla populationer.
- Exkludera cellskräp baserat på FSC vs SSC-plot. Välj singlets baserat på FSC vs pulsbreddsplot. Välj levande celler genom att ge PI-negativa celler.
- Definiera spermatogonia gate.
- Plot PI-negativa celler baserade på Hoechst blå och röd fluorescensintensiteter. Spermatogonia verkar som en sidopopulation (se figur 1 ).
- Definiera grindar för återstående bakteriepopulationer. OBS! Se figur 1 och kompletterande bild 2 för visuella detaljer.
- Plot PI-negativa celler i DNA-innehållsporten.
- För spermatider gräver toppen med lägst Hoechst fluorescens (1C).
- För spermatocyter II, grinden toppen med mellanhöga fluorescens (2C).
- För spermatocyter grindar jag toppen med högsta Hoechst fluorescens (4C).
- Plot Hoechst blå och röd fluorescensintensitet för att förfina spermatocyter och spermatidspopulationer från DNA-innehållsportar.
- Samla de valda subpopulationsgrindarna i de tidigare framställda uppsamlingsrören. Varje testis tar i genomsnitt 45 min till 1,5 h för att samla approximativt 0,5-6,0 x 10 6 celler för varje subpopulation.
OBS: Förlängd cellexponering för Hoechst maY skiftar lätt lokaliseringen av populationer med tiden. Uppdatera inställningarna efter 20-30 min FACS. Maximal utbyte för varje delpopulation kommer att vara beroende av effektiviteten i dissociationsteget.
6. Mikroskopisk utvärdering av renade celler
- Spin uppsamlade celler vid 500-600 xg vid 4 ° C i 10 min.
- Re-suspendera cellpellet med 1 ml iskall 1x fosfatbuffertlösning (PBS) eller 1x DMEM.
OBS: Återupptagningsvolymen kan justeras enligt antalet sorterade celler och önskad slutkoncentration. - Pipettera 40 μl tvättade celler på en ren glasskiva och placera en täckglas.
- Fixa de återstående cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) och lagra fasta celler vid 4 ° C i mörkret för framtida referens.
- Pipettera 100 μL 4% PFA direkt i uppsamlingsrören.
- Vortexera rören eller pipetten kort några gånger för att säkerställa en bra blandning av cellsuspensionen.
- Visualisera de förberedda objektglasen i ett mikroskop utrustat med en UV-lampa för att detektera Hoechst fluorescens under ett 63X objektiv. Se avsnittet Resultat - Morfologisk utvärdering av sorterade könscellspopulationer - för ytterligare information om hur man identifierar specifika bakteriecellstyper.
- Förbered FACS-samlingsrör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkeltcellssuspensioner från mekanisk dissociation av testikelvävnad
I figur 2 jämförs enkelcellsuspensioner erhållna genom mekanisk dissociation av mus-testikelvävnad under olika betingelser. Prover erhållna genom behandling av färsk vävnad, ostainad ( Figur 2A ) eller färgad med Hoechst ( Figur 2B ) visar närvaron av enskilda celler i olika steg av differentiering, och viktigare synes cellstruktur att bevaras, inklusive flagg av spermatozoa. Fastän viss klumpning och skräp observerades i de färgade proverna, vilket reducerades genom tillsats av DNas efter dissociation ( Figur 2D ), indikerar dessa resultat att Hoechst-färgning inte signifikant förändrar kvaliteten hos enkelcellssuspensionerna. Intressant är suspensions av en cellscellEnsioner kan också erhållas från frusen vävnad för musen ( Figur 2C ) och andra däggdjursarter - råtta, hund, marsvin och minisvin ( tilläggs figur 1 ) genom mekanisk dissociation. Olika celltyper är synliga och identifierbara i dessa prover; Bearbetning av frusen vävnad tycks emellertid leda till ökad celldöd och klumpning och ett totalt lägre cellutbyte. Som sådan rekommenderas det starkt att bereda enkelcellssuspensioner från färsk vävnad för ytterligare nedströmsapplikationer.
Kvaliteten av enkelcellssuspensioner framställda av färsk testikelvävnad av mus, råtta, hund, marsvin och mingris utvärderades under Ho-FACS ( Tabell 1 ). Efter uteslutning av cellulär skräp är 95,7-98,4% av cellerna singlar och från dessa 86,5-93,8% lever, såsom visas genom kvantifiering av PI-negativa celler (se protokoll ). Dessa resultatTs indikerar att mekanisk dissociation är en tillförlitlig metod för att framställa enkelcellssuspensioner för flödescytometri från testikelvävnad hos olika däggdjursarter.
Ho-FACS för att isolera bakterieceller från testikelvävnad från olika däggdjursarter
Efter mekanisk dissociation färgas enkelcellsuspensioner med Hoechst och PI och bearbetas av FACS. Som nämnts ovan tillåter Hoechst-färgning diskriminering av celler i olika steg av differentiering baserat på kromatinkvantitet och struktur, medan PI-färgning av icke-permeabiliserade celler separerar levande från döda celler. Efter filtrering av cellavfall och multicellulära aggregat väljer PI-porten celler med intakta membran (PI-negativ; Figur 1 ). Levande celler analyseras sedan baserat på Hoechst fluorescens: Blått är proportionellt mot DNA-innehåll och ökar röttFluorescens återspeglar mindre kondenserad kromatin och strukturella variationer. Som sådan förväntas manliga könsceller från olika steg kluster i specifika regioner av cytogram som kartlägger funktionen av blå / röd Hoechst-fluorescens ( Figur 3A ).
Faktum är att Ho-FACS-tomterna som alstras för olika arter visar närvaron av distinkta cellpopulationer baserat på Hoechst fluorescens ( Figur 3B -3C ). Även om dessa tomter är tillräckliga för att diskriminera bakteriepopulationer, kan en DNA-hål (C) -grind definieras 2 för att begränsa korsförorening. Denna grind genereras av ett histogram av cellantal i funktion av Hoechst blå fluorescensintensitet. För alla arter kan tre toppar detekteras och representerar celler med 1C, 2C och 4C ( Figur 1 och kompletterande figurer 2-5 ). I synnerhet, som previOckså nämnda, spermatogonia är en sidopopulation och kan inte betryggas gated baserat på histogram av DNA-innehåll. Följaktligen är denna population gated efter uteslutning av döda celler, baserat på Hoechst blå / röd fluorescens tomter ( Figur 1 ). Denna strategi representeras i Figur 1 för råttan och tilläggsskikten 2-5 för de återstående arterna. Det är viktigt att notera att eftersom Hoechst fluorescens ensam kan diskriminera de olika bakteriecellstyperna är både PI- och DNA-innehållsportarna valfria. De inkluderades i denna strategi för att välja levande celler och minska kors-kontaminering. Som sammanfattat i tabell 1 återspeglar kvantifiering av celler i DNA-innehållsgrinden den relativa andelen celler i olika steg av spermatogenes. Som förväntat är 1C-celler de vanligaste och representerar spermatida populationer, följt av 2C-celler (SPC II) och 4C-celler (SPC I). importaNtly bevaras detta mönster över arter och små skillnader kan återspegla interspecifika variationer i bakterieceller och cyklerna i det seminifera epitelet 21 .
Efter Ho-FACS kan cellintegritet bedömas med användning av Trypan-blåfärgning. Andelen levande celler efter 1 h FACS varierade från 27% (SCP I) till 67% (SPD) för musen, vilket indikerar att varaktigheten av sortering och exponering för Hoechst ökar celldöd. För användare som vill kultivera de sorterade cellerna bör Hoechst-koncentrationen och varaktigheten av Ho-FACS justeras för att förbättra cellöverlevnad. Icke desto mindre har RNA-sekvenseringsdata genererats för enskilda celler isolerade med användning av denna metod (Jung et al ., Opublicerad), vilket indikerar att dessa celler är lämpliga för molekylära studier av bakteriebiologi. Denna dataset användes för att detektera potentiell kontaminering av bakteriecellspopulationer med somatiska celler ( kompletterande figur 6
Morfologisk utvärdering av sorterade bakteriepopulationer
Eftersom bakterieceller genomgår drastiska morfologiska förändringar genom spermatogenes är det möjligt att uppskatta renheten hos isolerade populationer genom mikroskopi. Som en referens illustrerar Figur 4 den allmänna morfologin hos olika manliga könsceller från 4 däggdjursarter (från Lima et al. 5 ). Kromatinfördelning och kondensation, liksom cellstorlek och form, visar unika och väl karakteriserade mönster i olika celltyper. SPG har distinkt pericentrisk heterochromatin, som fläckar skarpt för Hoechst, och är små och runda i form (Spg i Figur 4B ). Spermatocyter är större granulerade celler. Kärnor av SPC I är lätt identifierbara, med kromatinvariationNs karakteristiska för meiotiska celler (Spc I i Figur 4B ), medan SPC II är binukle-rade eller i diakinesis (Spc II i Figur 4B ). Slutligen är SPD små haploida celler med rund eller långsträckt form (Spd i Figur 4B ). I synnerhet motsvarar rSPD SPG i storlek och form, men klart distinkt av närvaron av lokaliserade kromocentrar. Baserat på dessa egenskaper utvärderades sorterade cellpopulationer för anrikning av specifika celltyper ( tabell 1 ). SPD- och SPC II-populationer var starkt berikade för celltypen av intresse, medan SPC I och SPG visade viss grad av kontaminering med andra celltyper, speciellt för prov från Guinea Pig och Mini Pig. Intressant för hundprovet var gatingstrategin tillräcklig för att diskriminera runda från långsträckta spermatider ( figur 3C ; kompletterande figur 3 ; tabell 1
Figur 1: Arbetsflöde av Ho-FACS-isolering av manliga könsceller från däggdjur. Denna bild illustrerar det allmänna protokollet för bakteriecelleisolering av däggdjurscellenceller, med representativa data från tillämpningen av detta protokoll till rotte testis. Ho: Hoechst. Från Lima, et al. 5 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Singelcellsuspensioner genererade genom mekanisk dissociation av Mus testikelvävnad. Prover erhållna från färsk vävnad ( AB ) visar en mängd intakta bakteriecellstyper och mycket litet skräp. När man jämförde med obestämda celler ( A ) observerades en viss cellklumpning för Hoechst-färgade cellssuspensioner ( B ), som kan reduceras genom tillsats av DNas (slutkoncentration av 10 | ig / ml) till provet omedelbart efter dissociation ( D ). Fryst testikelvävnad kan också användas för att erhålla enkelcellssuspensioner genom mekanisk dissociation ( C ). Det verkar dock som om processen med blixtfrysning och upptining före vävnadsdissociation resulterar i mer skräp, celldöd och generellt mindre cellulärt utbyte. Efter dissociation (se protokoll) spolades proverna i 10 minuter vid 4 ° C och suspenderades i 1x DMEM innan montering av glidglasen. Svarta stänger = 50 μm. Bilder som erhållits med ett upprätt vitt ljusmikroskop utrustad med UV-lampa.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ho-FACS av däggdjurscellenceller. Specifika populationer presenterar unika mönster av Hoechst fluorescens under FACS ( A ). Som Hoechst blå fluorescens återspeglar variationer i kromatininnehållskluster av haploid ( C ); Diploid (2C) och tetraploid (4C) celler ligger i områden av FACS-plot med ökande Hoechst-blå fluorescens. Plottar genererade som en funktion av Hoechst blå / röd fluorescens visar kluster av olika cellpopulationer för de olika däggdjursarter som testats ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: Primära spermatocyter; Pre-Lep: Pre-Leptoten Spermatocyter; Lep: Leptotenspermatocyter; Dip: Diplotene spermatocyter; SPCII: Sekundära spermatocyter; SPD: Spermatider; ESPD: förlängande spermatider; RSPD: runda spermatider. Anpassad från Lima et al. 5 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Morfologi av bakterieceller i olika utvecklingsstadier från fyra däggdjursarter. Denna figur visar delar av testikelvävnad färgad med Hoechst (A) och den allmänna aspekten av olika manliga bakteriecelltyper sorterade av Ho-FACS (B) från råtta, marsvin, hund och mingris. Eftersom cellstorlek, form och kromatinkonformation varierar dramatiskt genom spermatogenesen, kan dessa användas för att tilldela celler till olika steg av differentiering. Spermatogonia (Spg) är liten och rund cElls med distinkt pericentrisk heterochromatin och uppvisar en hög intensitet av Hoechst fluorescens. Spermatocyter är de största bakteriecellerna och visar variabla kromatinkonfigurationer. Kärnor av primära spermatocyter (Spc I) uppvisar kromatinvariationer som är karakteristiska för meotiska celler, medan sekundära spermatocyter (Spc II) är binukle-rade eller i diakinesis. Spermatider (Spd) har rund eller långsträckt form, beroende på spermiogenesens stadium och är små haploida celler. Även om runda spermatider och spermatogonia är likartade i storlek och form, kan den tidigare särskiljas genom närvaron av lokaliserade kromocentrar. Skivor framställdes för varje sorterad celltyp efter Ho-FACS och visualiserades i ett konfokalt mikroskop: 63X förstoringslins, med (nedre panel) eller utan (övre panel) vit ljusöverföring. Från Lima et al. 5 med tillstånd. Snälla duKlicka här för att se en större version av denna figur.
| % Celler i DNA-innehållsporten | Renhet hos sorterade könscellspopulationer (%) | |||||||||||
| Arter | % Singlets | % Live-celler | 1C | 2C | 4C | SPG | Spc I | Spc II | spd | rSpd | ESPD | |
| Mus | 98,4 | 92,5 | 34,7 | 3,9 | 3,72 | 74 | 82 | 87,5 | 95,2 | 95 * | 92 * | |
| Råtta | 95,7 | 93,8 | 37,7 | 5,3 | 5,4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Marsvin | 96,2 | 92,1 | 39,3 | 7,6 | 5,8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Hund | 97,9 | 86,5 | 16,4 | 3 | 0,5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Pig | 95,9 | 93,2 | 26,9 | 6,4 | 3,5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Erhållen genom enzymatisk dissociation och gatedBaserad på FSC & SSC parametrar (från Lima et al. 2016 med tillstånd) | ||||||||||||
Tabell 1: Statistik för Ho-FACS av manliga cellcellsuspensioner erhållna genom mekanisk dissociation.
Kompletterande Figur 1: Suspensioner med en enda cell erhållen genom mekanisk dissociation av fryst testikelvävnad. Mekanisk dissociation möjliggör generering av enkelcellssuspensioner från testikelvävnad från olika däggdjursarter utan behov av artsspecifika protokoll. Olika paneler visar cellsuspensionerna erhållna för 4 däggdjursarter. Prover erhölls genom mekanisk dissociation av fryst testikelvävnad och färgades med Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Primära spermatocyt; SPC II: Sekundär spermatocyt; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Bildspel visualiserades i en konfokal L-mikroskop med (nedre panel) eller utan (överpanel) vit ljusöverföring. Skalstänger = 20 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande Figur 2: Gatingstrategi för separation av levande manliga könsceller av Ho-FACS från suspektioner av mus-testikulär enkelcell. Levande celler (PI-negativa) sorteras enligt Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) identifieras genom att plotta direkt Hoechst-blå och röd fluorescensintensiteter. En DNA-innehållsgrind används för att sortera celler baserade på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) och tetraploid (4C). Cellerna i varje topp i histogrammet sorteras sedan genom att plotta funktionen av Hoechst-blå och röd fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundära spermatocyter; SPC I: Primärspermatocyter.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande Figur 3: Gatingstrategi för separation av levande manliga könsceller av Ho-FACS av suspensioner av enstaka testiklar med enstaka celler. Levande celler (PI-negativa) sorteras enligt Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) identifieras genom att plotta direkt Hoechst-blå och röd fluorescensintensiteter. En DNA-innehållsgrind används för att sortera celler baserade på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) och tetraploid (4C). Cellerna i varje topp i histogrammet sorteras sedan genom att plotta funktionen av Hoechst-blå och röd fluorescens. Toppet innehållande haploida celler kan delas upp i enlighet med intervallet Hoechst blåintensitet och representerar två subpopulationer av spermatider: långsträckta spermatider (grind C ') och runda spermatider (grind C' '). SPG: Spermatogonia; ESPD: förlängande spermatider; RSPD: runda spermatider; SPC II:Sekundära spermatocyter; SPC I: Primärspermatocyter. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande Figur 4: Gatingstrategi för separation av levande manliga könsceller av Ho-FACS av suspensioner med marsvin-testikulär enkelcell. Levande celler (PI-negativa) sorteras enligt Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) identifieras genom att plotta direkt Hoechst-blå och röd fluorescensintensiteter. En DNA-innehållsgrind används för att sortera celler baserade på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) och tetraploid (4C). Cellerna i varje topp i histogrammet sorteras sedan genom att plotta funktionen av Hoechst-blå och röd fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundära spermatocyter; SPC I: Primärspermatocyter. Vänligen klicka här för att göraWnload den här filen.
Kompletterande Figur 5: Gatingstrategi för separation av levande manliga könsceller av Ho-FACS av suspensioner av enkelkropp med smågris testikulär. Levande celler (PI-negativa) sorteras enligt Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) identifieras genom att plotta direkt Hoechst-blå och röd fluorescensintensiteter. En DNA-innehållsgrind används för att sortera celler baserade på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) och tetraploid (4C). Cellerna i varje topp i histogrammet sorteras sedan genom att plotta funktionen av Hoechst-blå och röd fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundära spermatocyter; SPC I: Primärspermatocyter. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande Figur 6: Undersökning av somatisk cellföroreningJon i Ho-FACS-sorterade populationer. T-distribuerad stokastisk granninbäddning (t-SNE) -plot av ca 600 enkelcellstransskriptom från tre FACS-subpopulationsgrindar (AB). På t-SNE-tomten representerar varje punkt den unika positionen för en enda cell i ett transkriptomrymme och varje cell är märkt med dess FACS-subpopulationsgrind-ursprung (A). Visuell kvantifiering av specifika markörer av celltyp på FACS-encells-TNE-plot (B). Föroreningar från somatiska celler uppskattas vara mindre än 5% och är inte specifika för en Ho-FACS-populationens grind. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på den högt konserverade kromatindynamiken under spermatogenesen hos däggdjur var målet med detta arbete att utveckla ett protokoll för att isolera manliga könsceller i olika steg av differentiering från olika däggdjursvätskor i testiklar ( Figur 1 ). Ett av de största hindren i tillämpningen av ett enda arbetsflöde på olika djurmodeller är behovet av artsspecifika anpassningar, speciellt vad gäller vävnadsdissociationsprotokoll. Nuvarande metoder förlitar sig huvudsakligen på enzymatisk vävnadsdigestion och protokoll varierar ofta även inom art 12 . För att övervinna denna fråga visar protokollet som beskrivs här tillämpningen av mekanisk vävnadsdissociation för att erhålla enkelcellssuspensioner från testikulära prover av olika däggdjursarter. Resultaten indikerar att mekanisk dissociation av färsk testikelvävnad med detta system fungerar bra ( Figur 2A -2B 20 . Viktigt är att Hoechst-färgning inte tycks påverka signifikant kvaliteten på enkelcellsuspensioner. Även om mer cellklumpning är synlig i färgade prov ( Figur 2B ) kan behandling med DNase ( Figur 2D ) eller NDA 20 hjälpa till att förhindra detta problem. Tidigare rapporter tyder på att mekanisk dissociation av testikelvävnad är bättre än eller lika effektiv som enzymatisk vävnadsmältning 5 , 20 . I enlighet härmed indikerar data som presenteras här att mekanisk dissociation är en tillförlitlig metod för att erhålla enkelcellssuspensioner från testikelvävnad för Ho-FACS-bearbetning.
Inkubation med Hoechst är ett viktigt steg eftersom det påverkar signalen som detekteras vid flödescytometri. Långa perioder med färgning ger bättre diskriminering av bakterietyper menKan vara giftigt, vilket resulterar i celldöd och förändringar i intracellulär programmering 22 . Användare som avser att upprätta bakterieceller med denna metod bör utvärdera den genotoxiska effekten av exponering för långtid för Hoechst 3 , 22 och bestämma tillräcklig koncentration och tid för färgning. Här var 30 min färgning tillräcklig för att åstadkomma tillförlitlig separation av bakteriepopulationer ( Figur 3B -3C ). Varaktigheten av färgning kan potentiellt reduceras till 10 minuter, såsom visas av Rodriguez-Casuriaga, et al. 20 , och bör utvärderas ytterligare av användarna för arten av intresse.
Som hypoteser kan fyra bakteriecellspopulationer detekteras konsekvent - SPG, SPC I, SPC II och SPD - baserat på kromatinvariationer av bakterieceller från de olika arterna som testats ( Figur 3B -3C Tabell 1 ) och stödja grindstrategin antagen i detta arbetsflöde ( Figur 1 ) för olika däggdjursarter ( Kompletterande figurer 2- 5 ). Det är dock lämpligt att användarna optimerar gaten enligt de aktuella arterna och populationerna för att minska korsföroreningen som detekterats för vissa populationer (tabell 1). Detta kan uppnås genom längre inkubationsperioder under färgning18 , reducerad flödeshastighet 2 och reducerade grindstorlekar. SPG är mer utmanande att isolera eftersom de är den sällsynta celltypen i testen och också på grund av färgutsläpp över tiden 1 , 15 . Även om det är möjligt att detektera distinkta SPG-populationer av Ho-FACS, skulle studier som fokuserar enbart på stamcellerbiologi dra nytta av en strängare teknik, såsom magnetisk aktiverad cellsortering (MACS; 23 ). Speciellt kan subpopuleringar av SPD (eSPD och rSPD) tydligt särskiljas för Hunden men inte för andra arter ( Figur 3C och kompletterande Figur 3). Potentiellt kan dessa subpopuleringar lösas genom att justera gatinginställningarna, som beskrivits av författarna för musen 5 . Cytogram genererade för cellstorlek och granularitet (FSC VS SSC), före planering av funktionen av Hoechst blå / röd fluorescerandeNce, diskriminerar förlängning (låg FSC + SSC), från runda (höga FSC + SSC) spermatida subpopulationer. Separering av runda och långsträckta spermatida subpopulationer skulle möjliggöra en mer djupgående utredning av spermiogenes, vilket ger nya insikter i specifika molekylära händelser som uppträder under spermiedifferentiering. Såsom beskrivits för musen 1 , 2 , 12 är det också möjligt att erhålla ytterligare upplösning av meotiska steg, genom att justera FACS-grindar. Sådan tillvägagångssätt skulle i stor utsträckning gynna jämförande studier av meiotiska händelser. Fastän cellintegriteten störs under Ho-FACS indikeras encells RNA-sekvenseringsdata erhållen för celler sorterade med denna metod (Jung et al. , Ej publicerad , Tilläggs Figur 6 ) att detta är ett tillförlitligt sätt att erhålla celler för molekylära studier av bakteriecell biologi. Ändå har användarna för avsikt att utföra reproduktionsanalyser, såsom rOstspermatidinjektion (ROSI), med användning av celler som isolerats av Ho-FACS måste utvärdera livskraften hos sorterade celler och kanske vill utforska alternativa metoder 24 , 25 .
Sammanfattningsvis beskriver detta arbete en standardiserad metod för att isolera testikelkimceller från olika däggdjur, bygga och lägga till förfiningar på tidigare etablerade tekniker 2 , 12 , 20 . Sådan standardisering möjliggör användningen av en uppsättning reagenser och ett enda arbetsflöde på olika däggdjursarter, vilket underlättar datagenerering för jämförande studier av bakteriebiologi. Dessutom övervinner mekanisk vävnadsdissociation hur snabbt arterspecifika anpassningar kan komma att introducera metodisk variation, vilket nästan inte är möjligt att redogöra för. Dessutom begränsar den reducerade exekveringstiden och manipuleringen störningar av ex vivo- cellenLular fysiologi till ett minimum. I detta avseende är Ho-FACS signifikant snabbare jämfört med andra metoder för bakteriecelleisolering, såsom STA-PUT och elutriation 6 , 7 . Vidare är samtidig separation av 4 bakteriepopulationer i samma experiment endast möjlig av FACS. Med tanke på egenskaperna hos Hoechst-färgämnet bevaras cellstrukturen och RNA-arterna, och därför kan celler användas för vidare molekylärstudier nedströms. Eftersom Ho-FACS är beroende av kromatinattribut för att diskriminera bakterietyper, är det viktigt att den framgångsrika utförandet av detta arbetsflöde i 5 olika arter stärker sin tillämpning på andra däggdjur. Resultaten som presenteras här tyder på att spermatogenes kan vara en unik process av celldifferentiering som kan hanteras i många däggdjursarter med ett enda protokoll. Som sådan, i "omics" och systembiologitiden, ger denna teknik medel för en evolutionär appRoach på frågor om manlig bakteriebiologi, inklusive studier av epigenetik, reglering och proteinskillnad genom spermatogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) för hund testes; Jason Arand och Dr. Ted Cicero's lab vid Washington University i St. Louis (WashU) för att tillhandahålla råttesteser och Brianne Tabers för att hjälpa till med samlingen; Jared Hartsock och Dr. Salt Lab på WashU för marsvin testes; Och Dr. Michael Talcott vid Division of Comparative Medicine vid WashU för miniatyrgris testis. Författarna erkänner också Alvin J. Siteman Cancer Center vid Washington University School of Medicine och Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, för användning av Siteman Flow Cytometry Core, som tillhandahöll personalstyrd cellsorteringstjänst. Siteman Cancer Center stöds delvis av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Denna forskning finansierades av ett FCT-stipendium [SFRH / BD / 51695/2011 till ACL], bidrag från Förenta staternas nationella institut för hälsa [R01HD078641 och R01MH101810 till DFC] och ett FCT-forskningskontrakt [IF / 01262/2014 till AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
