Summary
Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.
Abstract
Floresanla aktive hücre ayırma (FACS), memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi için tercih edilen yöntemlerden biridir. Şu anda, yüksek verim ve saflık ile 9 murin germ hücresi popülasyonuna kadar ayrım yapılmasına izin vermektedir. Ayrımcılık ve saflaştırma konusundaki bu yüksek çözünürlük, spermatogenez boyunca kromatin yapısındaki ve miktarındaki benzersiz değişiklikler nedeniyle mümkündür. Bu modeller, Hoechst-33342 (Hoechst) gibi flüoresan DNA bağlama boyaları ile boyanan erkek germ hücrelerinin akış sitometrisi ile yakalanabilir. Burada, memeli testiküler germ hücrelerini izole etmek için yakın geçmişte geliştirilmiş bir protokolün ayrıntılı bir tarifi. Kısaca, tek hücreli süspansiyonlar, testis dokusundan mekanik ayrışma ile, Hoechst ve propidyum iyodür (PI) ile çift boyalı ve akış sitometrisi ile işlenerek üretilir. Farklı DNA içeriğine (Hoechst yoğunluğu) sahip canlı hücrelerin seçimi (PI negatif) de dahil olmak üzere seri geçitlendirme stratejisi, iFACS sıralama sırasında 5 germ hücresi türünü ayırt etmek için kullanılır. Buna spermatogonia (% 66), primer (% 71) ve sekonder (% 85) spermatosit ve spermatidler (% 90), ayrıca yuvarlak (% 93) olarak ayrılmış ve uzatma (% 87) alt popülasyonlar. Tüm iş akışının yürütülmesi basittir, 4 hücre türünün aynı anda uygun FACS makinesi ile izolasyonuna izin verir ve 2 saatten daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Azaltılmış işlem süresi, ex vivo hücrelerin fizyolojisini korumak için çok önemlidir; bu yöntem, erkek germ hücresi biyolojisinin aşağı akışlı yüksek verimli çalışma için idealdir. Dahası, memelilerin germ hücrelerinin çoklu spesifik arındırılması için standartlaştırılmış bir protokol, değişkenlerin metodolojik kaynaklarını ortadan kaldırır ve farklı hayvan modelleri için tek bir reaktif kümesinin kullanılmasına izin verir.
Introduction
Spermatogenezis progresyonunu temsil eden bir in vitro sistem eksikliği ve testiste büyük hücresel heterojenlik varlığı göz önüne alındığında, erkek germ hücresi biyolojisi çalışmaları, zenginleştirilmiş belirli hücre tip popülasyonlarını izole etmek için sağlam teknikler gerektirir. Fluoresansla aktive hücre ayırma (FACS), yüksek verim ve saflık sağladığı ve tanımlayabileceği germ hücresi türlerinin sayısındaki diğer izolasyon yöntemlerini aştığı için bu amaçla 1 , 2 , 3 , 4 , 5 yaygın olarak kullanılmıştır ve 6 , 7 , 8'i seçin . Akış sitometrisi analizi ilkesi, tekli hücrelerin lazer ışını uyarılmasından sonra diferansiyel ışık örüntülerinin saptanmasına dayanır. Bir hücre lazerden geçerken ışığı yansıtır / saçar(Ileriye saçılma; FSC) ve hücre içi karmaşıklığa (yan saçılım; SSC) orantılı olarak her açıdan. Akış sitometrisi hakkında ayrıntılı bilgi için Ormerod 9'a bakın.
Erkek germ hücreleri, spermatogenezin farklı aşamalarında DNA içeriğinde, kromatin yapısında, boyutta ve şekle özgü modifikasyonlara maruz kalırlar. Böylece, farklı hücre popülasyonları, ışık saçılması ve DNA boyama ile flüoresan boyalar 10 , 11 ile birleştirilerek tanımlanabilir ve ayrılabilir. Son 10 yılda testis hücrelerinin akım sitometrisi analizinde sıklıkla kullanılan Hoechst-33342 (Hoechst) gibi bu amaçla birkaç boyayı (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te inceledik) 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoUV uyarısıyla n uyarma, Hoechst, hücresel DNA içeriğiyle orantılı olarak mavi flüoresan yayar; far kırmızı floresans ise kromatin yapısında ve sıkıştırmada değişkenliği yansıtmaktadır 1 , 13 , 14 . Sonuç olarak, farklı aşamalardaki erkek germ hücreleri, Hoechst lekeli tek hücre süspansiyonlarının FACS sırasında özel desenler sergilerler (Ho-FACS; 1 , 12 ). İlginç bir şekilde, spermatogonial evrede sadece aktif olan bir boya akışı mekanizması nedeniyle, Hoechst mavisi flüoresansının yoğunluğu, bu hücrelerdeki kromatin içeriğiyle orantılı değildir ve Ho-FACS 15 sırasında bir yan popülasyon olarak kümelenir. Ek olarak, Hoechst boyamayı geçirgen olmayan boya propidyum iyodür (PI) ile birleştirmek, kullanıcıların canlı (PI negatif) ile ölü (PI pozitif) hücrelerden FACS 1 sırasında ayırt etmelerini sağlarSup>, 2 , 10 , 12 . Bu strateji, testis germ hücrelerinin akış sitometrik analizlerinde daha önce kullanılmış ve mayoozun 4 farklı evresi I 1 , 2 , 4 , 16'da bulunan hücreler de dahil olmak üzere, 9 germ hücresi türünü ayırt etmek için farede geniş kapsamlı olarak optimize edilmiştir. Bu çalışmanın amacı için Hoechst boyamanın üç ana avantajı vardır. Birincisi, Ho-FACS, fare modeli 1 , 2 , 12'de erkek germ hücrelerinin izolasyonuna ve fare ve kobay 17 , 18 , 19 gibi diğer kemiricilere başarılı bir şekilde uygulanmıştır. İkincisi, Hoechst, hücreye nüfuz eden bir boya olup membran permeabilizasyonu gerektirmez, bu nedenle prezervatifHücre bütünlüğünü sağlar. Son olarak, Hoechst öncelikle poli (d [AT]) DNA dizileri 1 , 20'ye bağlandığından RNase tedavisine gerek yoktur; bu, RNA'nın korunması anlamına gelir ve DNA ve proteinlerin yanı sıra mikropların daha aşağı moleküler çalışmaları için de kullanılabilir Hücre farklılaşması.
Memeli türlerin akış sitometrisi analizlerinde gözlenen DNA ploidi ve / veya lekelenme özelliklerine benzerlik göstermesine rağmen (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te gözden geçirilmiştir ), akış sitometrisiyle erkek germ hücresi izolasyonu için tarif edilen protokollerde iyi değişkenlik mevcuttur. Farklı çalışmalar, doku ayrışması için spesifik protokolleri kullandı ve başta fare, sıçan ve kobay olmak üzere farklı model organizmalardaki farklı DNA bağlama boyalarını (tek başına veya kombinasyon halinde) ve FACS geçiş stratejilerini kullandı. Dolayısıyla, farklı türler için toplanan verilerin doğrudan kıyaslanması sigara içiminden etkilenebilirMetodolojiler arasındaki değişkenlikten kaynaklanan teknik olmayan eserler. Önemli olarak, memelilerin spermatogenezi (2N-4N-2N-1N) boyunca kromatin dinamikleri çarpıcı korunması, standartlaştırılmış bir protokolün çeşitli memeli türlerine çapraz olarak uygulanabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmanın amacı, daha önce yayınlanmış teknikler 2 , 20'yi birleştirip uyarlayarak, farklı memeli türlerine uygulanabilen tek bir iş akışı geliştirmekti. Doku işleme için bir yöntem Standardizasyon enzimatik sindirim 5 için gerekli olan türe özgü düzeltme gereksinimini ortadan mekanik ayrışmayı gerçekleştirerek elde edilmiştir. Kemirgen hayvan testis dokunun mekanik ayrışma enzimatik Doku sindirimi 20 ve her iki yöntem de Sergi Sergi tarafından üretilen tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS daha iyi bir performans gösterilmiştir dikkat çekicidirKarşılaştırılabilir sonuçlar 5 . Prensip olarak, bu protokol, 5 germ hücresi popülasyonunu izole etmek için kullanılan ayarları açıklamaktadır: spermatogonia (SPG); Primer (SPC I) ve sekonder spermatositler (SPC II) ve spermatidler (SPD) - yuvarlak (rSPD) ve uzatma (eSPD). En önemlisi, ana gereksinimler doku ayrışması ve bir UV lazer ile donatılmış bir hücre sıralayıcıya erişim için olan, laboratuarda uygulanması kolaydır. Bu iş akışı ( Şekil 1 ) hızlı ve basittir ve 4 germ hücresi popülasyonunun taze testis dokusundan 2 saatten daha kısa sürede aynı anda izolasyonuna izin verir. İndirgenmiş işlem süresi, daha ileri prosedürler için hücresel bütünlüğü korumak için çok önemlidir. Ayrıca, 5 farklı türün başarılı bir performans göstermesi, memelilerde yaygın olarak uygulanabileceğini ve memeli erkek üreme biyolü karşılaştırmalı çalışmalar için germ hücrelerini izole etmek için ideal bir yöntem haline getirdiğini göstermektedirlenmiştir.
Bu protokol, hazırlık adımlarının yanı sıra (1) testiküler dokunun mekanik ayrışması ve (2) testiküler hücrelerin Hoechst ve PI ile boyanması ve ardından (3) ilgili spermatogenik hücrelerin FACS sınıflandırılması olmak üzere üç ana bölümden oluşur. Bir kez toplandığında, farklı memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonları çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu protokol, birçok farklı memeli türünden erkek germ hücrelerini saflaştırmak için "bir boyut uyuyor" ayrışma yöntemini açıklıyor. Kullanıcıların izole edilmiş germ hücreleri ile yürütmek istedikleri türüne bağlı olarak, diğer medya veya tamponlar kullanılabilir. Aşağıdaki protokol adımları, bir tam murin testisinden tek hücre süspansiyonu üretmek içindir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, St. Louis'deki Washington Üniversitesi'ndeki Hayvan Çalışmaları Komitesinin düzenlemelerine uymaktadır.
1. Mekanik Ayrışma Protokolü Hazırlıkları
- Tüm murin testisin ayrılması için önceden ıslak 50 μm'lik bir atılabilir doku ayrıştırma kartuşu.
NOT: Bu tek kullanımlık kağıt parçalanma kartuşu dokuların kesilmesi için tasarlanmış mikrobladları ve yaklaşık olarak altıgen altı delikli, hareketsiz bir çelik hasır içerir. Bu protokolü türlere ve istenen hücre tiplerine göre uyarlamak için doku ayrıştırma kartuşu için farklı boyutlarda örgü mevcuttur. Bu makalede adı geçen tüm memeli türleri için 50 μm kartuşlar kullanılmıştır.- 50 ml tek kullanımlık doku ayrıştırma kartuşu üzerine 1 mL buz soğuk fenol kırmızısı serbest 1x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yükleyin.
NOT: Fenol kırmızısı, kırmızı fluoresan tespitini etkileyebilirFACS sırasında. - Şırınga portundan tek kullanımlık 3 mL iğnesiz şırınga ile doku ayrıştırma kartuşundan 1x DMEM'yi aspire edin.
- 50 ml tek kullanımlık doku ayrıştırma kartuşu üzerine 1 mL buz soğuk fenol kırmızısı serbest 1x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yükleyin.
- "ON" düğmesine basarak doku ayrıştırma sistemini açın. Bu sistem "ısınma" zamanı gerektirmez.
- Buzla soğutulmuş 1x DMEM ile önceden ıslak üç 40 μm'lik atılabilir filtre. Her bir 40 μm'lik atılabilir filtreyi 50 mL konik tüp üzerine yerleştirin. Pipet 1 mL 1x DMEM ve sıvıdan geçmesine izin verin.
- Testiküler dokuların toplanması için 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Petri kabına 1x DMEM 500 mcL pipetleyin.
2. Mekanik Ayrılma Protokolü için Testiküler Doku Hazırlanması
- Cerrahi makas ve forseps ile taze tüm testisleri veya testiküler fragmanları (diğer memeli türleri ile ilgileniyorsanız) dikkatlice çıkarmak için bir erkek fare ayırın.
NOT: Dokuda yağ ve nekroz bulunmadığından emin olun. Cu Esh testis dokuları dondurulmuş dokulara kıyasla üstün tek hücreli süspansiyon kalitesi üretir.- Toplanan testisleri / fragmanları 500 mcL 1x DMEM ihtiva eden hazırlanmış 100 mm x 15 mm Petri kabına aktarın.
- Kırmızı kan hücrelerini (varsa) çıkarmak için dokuyu 1x DMEM içinde hafifçe durulayın.
- Tunica albugineayı dikkatlice çıkarın. Tunika albuginea kalınlığı farklı türlerde farklılık gösterecektir.
- Testislerin bir ucunu forsepsle tutun.
- Testisin bir ucunu önceki adımdaki forsepslerle tutarken testisin diğer ucunu bir neşterle delin.
- Adım 2.2.1 'deki forsepsle hala testisin bir ucunu tutan bir neşter kullanarak testis tübelerini kazıyın.
- Bir neşter kullanılarak ~ 2-3 mm3 parçalar halinde testis tübüller kesilir.
3. Testiküler Dokuların Mekanik Ayrılmasıyla Tek Hücreli Süspansiyonların Elde Edilmesi
Ontent "> NOT: Aşağıda açıklanan ayrışma adımları, yetişkin bir fare testisidir. Juvenile farelerden veya fare olmayan türlerden testiküler dokuların hacimleri buna göre ayarlanmalıdır.Çocuk hayvanlar germ hücrelerinin tüm aşamalarını içermeyebilir Bazı memeli türleri Testis dokusu kompozisyonu, çiftleşme mevsiminde çiftleşme yapmayan mevsime göre değişir.- Forseps kullanarak önceden ıslatılmış 50 μm doku ayrıştırma kartuşuna küçük testis tübü parçalarını aktarın ve 1 mL DMF 1 mL ekleyin.
- Doku ayrıştırma kartuşunu doku ayrıştırma sistemine yükleyin ve düğmeyi "bekleme" durumundan "çalıştır" moduna çevirerek 5 dakika işlem yapın.
- Doku ayrıştırma sisteminden doku ayrıştırma kartuşunu çıkarın ve şırınga limanından bir kez atılabilen 3 mL iğnesiz şırınga ile hücre süspansiyonunu aspire edin.
- Doku ayrıştırma kartuşundaki tüm sıvıyı çıkarmak için birkaç kez aspire edin. Değil1 mL'nin hepsi doku ayrıştırma kartuşundan geri kazanılabilir.
- Aspire edilen hücre süspansiyonunu, iki kez atılabilen 40 μm'lik filtrelerden geçirin. Herhangi bir hücre agregasını kaldırmak için iki kez filtreleyin.
- 50 ml lik konik bir tüpe önceden ıslatılmış 40 μm filtre yerleştirin. Doğrudan şırınga 40μm filtre üzerine aspire hücreleri ekleyin. Tek kullanımlık pipetle geçirilen tek hücreli pipetle pipetle alın.
- Kullanılmış önceden ıslanmış 40 μm filtreyi çıkarın ve 50 mL'lik konik tüp içinde önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir filtre yerleştirin. Toplanan tek hücreli süspansiyonu temiz 40 μm filtreye pipetleyin.
- Filtreli tek hücreli süspansiyonu, tek kullanımlık bir pipetle toplayın.
- 50 μm'lik doku ayrıştırma kartuşuna geri pipetle filtrelenen hücre süspansiyonu ve bir doku ayrıştırma sisteminde 5 dakika daha işleme tabi tutulur.
- Doku ayrıştıran tüm sıvıyı geri kazanınKartuş üzerinde.
4. Hoechst ve Propidium Iodide (PI) ile boyama
- 50 um'lik doku ayrıştırma kartuşundan temiz bir 1.5 mL tüp içine toplanan hücre süspansiyonunu aktarın. Yaklaşık olarak 1-1.5 mL tek hücre süspansiyonu geri kazanılır.
- Geri kazanılan tekli hücre süspansiyonunu dört adet 1.5 mL veya 5 mL tüpe bölün.
- İlk üç tüp için, dört tüpün sonuna tek hücreli süspansiyon pipetleyin ve 150 μL pipetleyin (tek hücre süspansiyonunun yaklaşık 550 μL).
NOT: Son tüpteki tek hücreli süspansiyonun miktarı, adım 3.6'daki hücre süspansiyonunun toparlanma verimliliğine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
- İlk üç tüp için, dört tüpün sonuna tek hücreli süspansiyon pipetleyin ve 150 μL pipetleyin (tek hücre süspansiyonunun yaklaşık 550 μL).
- Dört tüpün ilk tüpünü FACS oturumu için lekeleyici olmayan bir kontrol olarak ayarlayın.
- Tek boya boyalı (PI veya Hoechst) hücre süspansiyonlarını kontrol olarak hazırlayın. Her boruya 2.5 μL Hoechst veya 1 μL PI ekleyin (ikinci ve third).
- Çift lekeli bir tüp hazırlayın. Bu, germ hücresi alt popülasyonlarının toplanması için kullanılacaktır. Son tüpe 2.5 μL Hoechst ve 1 μL PI ekleyin.
NOT: Hoechst'in raf ömrü 2-3 aydır. Daha eski boya stoklarını kullanmak FACS oturumu sırasında önemli değişiklikler yapacaktır. - Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Örnekleri bir tüp döndürücü içine yerleştirin veya 1,5 mL tüpleri 5-10 dakikada bir ters çevirin.
- Hücre süspansiyonunu önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir süzgeçle filtreleyin ve filtrelenmiş çözeltiyi buz ve karanlıkta FACS oturumuna kadar koruyun.
NOT: FACS için hücre yığınlarını önlemek için filtrasyon adımı gereklidir. Ek olarak, DNase (bakınız Şekil 1 ) veya 2-Naftol-6,8-disülfonik asit dipotasyum tuzu (NDA 20 ) ile muamele, hücre yığılmayı sınırlamak için kullanılabilir. Uzun bekleme süreleri, FACS sırasında tespit edilen flüoresan sinyalini etkileyecek ve hücre ölümünde artışa neden olabilir.5. Testis Hücrelerinin Flüoresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Kurulumu ve Saflaştırılması
- FACS toplama tüpleri hazırlayın.
- Hücre toplama için 5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler veya 400 ml FBS ile 1.5 mL tüpleri kaplayın. Boya sonrası dekant fazlalığı FBS.
- Tüplere FACS toplama ortamı (1x DMEM +% 10 Fetal Sığır Serumu, FBS) ekleyin: 5 mL tüpler için 1 mL, 1.5 mL tüpler için 100 μL.
- Hücre sıralayıcı ve yazılımında uygun sıralama koşullarını ayarlayın.
NOT: Aşağıda açıklanan benzer kurulum ve geçiş stratejileri ile diğer hücre ayırma makineleri ve analiz yazılımı kullanılabilir. Burada açıklanan koşullar, Gaysinskaya ve Bortvin 2 , Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3 ve Getun ve diğerleri tarafından uyarlanmıştır . 4- 463/2 ile ultraviyole bir lazer yükleyinHoechst mavisini algılamak için 5 nm bant geçiren filtre ve Hoechst kırmızısını algılamak ve PI tespit etmek için 680 nm LP bant geçiren filtre.
- Mavi ile kırmızı floresan arasında ayrım yapmak için 555DLP dikroik ayna kullanın.
- 70 μm'lik bir meme kullanın ve 1000-2000 hücre / saniye hızında hücreleri sıralayın.
NOT: Sıralama etkinliği doğrudan akış hızından etkilenir. Yüksek akış hızları (> 3500 olay / sn) sıralama hızını artırır, ancak popülasyonların kontamine olmasına neden olur. Daha fazla bilgi için referans 12'ye bakınız.
- Kontrol örnekleri kullanarak kapıları ayarlayın.
- Boyanmamış numune yükleyin ve çalıştırın.
- FSC vs SSC arsa desenine dayalı hücre öplerini hariç tutun. Artığın sol alt kadranda hücre döküntüsü çıkar. Kullanıcı veya hücre sıralayıcısı teknisyeni tarafından hücre öpleri eşiğini keyfi olarak ayarlayın.
- FSC ve darbe genişliği için eşik değeri ayarlayarak tek hücrelere giriş. Farklı hücre ayırıcıların farklı yöntemler vardır.Şort singlet. Darbenin genişliği, hücrelerin lazer çaprazlanması için gereken süreyi yansıtıldığından, tek hücreli hücreler, çok hücreli agregalara kıyasla daha düşük değerlere sahiptir. FSC'ye karşı darbe genişliği için bir arsa üzerinde eşik değeri ayarlamak, tekli seçmek için kullanılabilir.
- Optimum fotomültiför tüpü (PMT) voltajlarını ayarlayın.
- PI veya Hoechst floresan sinyali eşiğini oluşturmak için hem lekelenmemiş hem de tek boyalı lekelenmiş hücreleri kullanın.
NOT: Her bir boya için uygun floresan aralığını oluşturmak için ilgili hücreler için temel PTM voltajlarını optimize etmek önemlidir. Bu, optimum sinyal algılama ve hassasiyet için kritik öneme sahiptir. Renklendirilmemiş ve tek boyalı kontrol hücreleri, PI ve / veya Hoechst boyaları ile negatif ve pozitif boyalı hücreler aralığı oluşturmak ve sinyaldeki gürültüyü en aza indirmek için kullanılır. Kontrol hücreleri kullanılarak PMT geriliminin optimizasyonu hakkında daha fazla açıklama için lütfen Gaysinskaya ve Bortvin 2'ye başvurun. - Canlı hücredeki kapıPI boyama (PI negatif) ve FSC arsa dayalı. Ölü hücreler PI floresan için pozitif olacaktır.
- DNA içeriği kapısını Hoechst mavisi flüoresanına dayanan bir hücre sayımı histogramı çizerek ayarlayın. Haploidi (1C), diploid (2C) ve tetraploid (4C) hücreleri temsil eden Hoechst mavisi flüoresansının artan konsantrasyonları olan 3 zirveleri görünmelidir. Her pik için bir tane olmak üzere 3 kapı ayarlayın.
- Germ hücrelerinin popülasyonlarına geçmeden önce FSC vs SSC arsa üzerinde en az 500.000 olayı izleyin.
- Farklı germ hücre popülasyonlarını kapayın.
- Hoechst / PI boyalı örnek yükleyin.
- Tüm popülasyonlarda ortak olan ilk 3 ana kapıyı ayarlayın.
- FSC vs SSC arsa temelinde hücre döküntülerini hariç tutun. FSC vs darbe genişliği arsa dayalı singlets seçin. PI negatif hücreleri geçitleyerek canlı hücreleri seçin.
- Spermatogonia kapısını tanımlayın.
- Hoechst mavisine ve kırmızı flüoresansı temel alan PI negatif hücreleri çizmeşiddetler. Spermatogonia yan nüfus olarak görünür (Bkz. Şekil 1 ).
- Kalan germ hücresi popülasyonları için kapıları tanımlayın. NOT: Görsel ayrıntılar için şekil 1 ve ek şekli 2'ye bakın.
- DNA içeriği kapısında PI negatif hücreleri çizin.
- Spermatidler için zirveyi en düşük Hoechst flüoresansıyla (1C) kaplayın.
- II spermatositleri için, tepeyi ara Hoechst flüoresansı (2C) ile kaplayın.
- Spermatosit I için zirveyi en yüksek Hoechst flüoresansıyla (4 ° C) kaplayın.
- DNA içeriği kapılarından spermatositleri ve spermatid popülasyonlarını rafine etmek için Hoechst mavisi ve kırmızı floresan yoğunluğunu çizin.
- Seçilen alt toplama kapılarını önceden hazırlanmış toplama tüplerine topla. Her testis, her bir alt popülasyonu yaklaşık olarak 0,5-6,0 x 10 6 hücreleri toplamak için 1.5 saat için 45 dakikalık bir ortalama alacaktır.
NOT: Hoechst ma'ya uzun süreli hücre maruziyetiY popülasyonlarının yerini biraz zamanla değiştirirsiniz. 20-30 dakika FACS sonrasında ayarları yenileyin. Her alt popülasyon için maksimum verim, ayrışma aşamasının verimliliğine bağlı olacaktır.
6. Saflaştırılmış Hücrelerin Mikroskopik Değerlendirilmesi
- Toplanan hücreleri 500-600 xg'de 4 ° C'de 10 dakika döndürün.
- 1 mL buz soğukluğunda 1x fosfat tampon çözeltisi (PBS) veya 1x DMEM ile hücre topağını yeniden süspansiyon haline getirin.
NOT: Yeniden süspansiyon hacmi, sıralanan hücrelerin sayısına ve arzulanan nihai konsantrasyona göre ayarlanabilir. - Temiz cam slayt üzerine yıkanmış hücrelerin 40 μL'ini pipetleyin ve lamel yerleştirin.
- Geri kalan hücreleri% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve ileride başvurmak üzere sabit hücreleri 4 ° C'de karanlıkta saklayın.
- Doğrudan toplama tüplerinde 100 μL% 4 PFA pipetleyin.
- Hücre süspansiyonunun iyi karıştırılmasını sağlamak için tüpleri veya pipeti birkaç kez vorteksleyin.
- Hazırlanan slaytları, 63X'lik bir hedefin altında Hoechst flüoresanını algılamak için bir UV lamba ile donatılmış bir mikroskopta görselleştirin. Spesifik germ hücre türünün nasıl belirleneceği ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Sonuçlar bölümüne bakın - Sınıflandırılmış germ hücresi popülasyonlarının morfolojik değerlendirmesi -.
- FACS toplama tüpleri hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Testiküler dokunun mekanik ayrışmasından gelen tek hücre süspansiyonları
Şekil 2 , farklı koşullar altında fare testis dokusunun mekanik ayrışmasıyla elde edilen tek hücre süspansiyonlarını karşılaştırmaktadır. Taze dokuları, lekeleyici olmayan ( Şekil 2A ) veya Hoechst ile lekelenmiş ( Şekil 2B ) numuneler, farklılaşan aşamalardaki farklı hücrelere ait tekli hücrelerin varlığını gösterir ve önemli bir şekilde sperm hücresi sarmalını içeren hücre yapısının korunmuş olduğu görülmektedir. Çözündükten sonra DNaz eklenerek azaltılmış lekeli örneklerde ( Şekil 2D ) bazı topaklanma ve döküntüler gözlemlenmesine rağmen, bu sonuçlar Hoechst boyamanın tek hücre süspansiyonlarının kalitesini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. İlginçtir, tek hücreli şüpheliFare ( Şekil 2C ) ve diğer memeli türleri - sıçan, köpek, kobay ve mini domuz ( Ek Şekil 1 ) için donmuş dokudan mekanik ayrışma ile elde edilebilir. Bu örneklerde çeşitli hücre türleri görülebilir ve tanımlanabilir; Bununla birlikte, donmuş dokunun işlenmesi hücre ölümünün artmasına ve yığılmaya ve genel olarak daha düşük hücre verimine yol açar gibi görünür. Bu nedenle, daha ileri uygulamalar için taze dokudan tek hücre süspansiyonları hazırlamanız şiddetle önerilir.
Fare, sıçan, köpek, kobay ve mini domuzun taze testiküler dokusundan hazırlanan tek hücre süspansiyonlarının kalitesi Ho-FACS sırasında değerlendirildi ( Tablo 1 ). Hücresel enkazın dışında tutulduktan sonra, hücrelerin% 95.7-98.4'ü tekli ve% 86.5-93.8'inden ise canlı PI negatif hücrelerin miktarının belirlenmesi (Bkz. Protokol ). Bu resulMekanik ayrışmanın, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan akış sitometrisi için tek hücre süspansiyonları hazırlamak için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Farklı mikroorganizmaların testiküler dokusundan germ hücrelerini izole etmek için Ho-FACS
Mekanik çözülmeden sonra tek hücre süspansiyonları Hoechst ve PI ile boyanır ve FACS ile işlenir. Yukarıda belirtildiği gibi, Hoechst boyaması, kromatin miktarı ve yapısına dayanan farklı aşamalardaki hücrelerin ayrımcılığa izin verirken, permeabilize edilmemiş hücrelerin PI boyaması canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırır. Bu nedenle hücre döküntülerini ve çok hücreli agregaları filtreledikten sonra, PI kapısı sağlam zarlar içeren hücreleri seçer (PI negatif; Şekil 1 ). Canlı hücreler daha sonra Hoechst flüoresanına göre analiz edilir: mavi DNA içeriğine orantılıdır ve artan kırmızıFloresan daha az yoğunlaşmış kromatin ve yapısal değişimleri yansıtır. Bu nedenle, farklı aşamalardaki erkek germ hücrelerinin, mavi / kırmızı Hoechst floresansının fonksiyonunu gösteren sitogramların spesifik bölgelerinde kümelenmesi beklenir ( Şekil 3A ).
Nitekim, farklı türler için üretilen Ho-FACS parselleri, Hoechst floresansına dayalı farklı hücre popülasyonlarının varlığını göstermektedir ( Şekil 3B -3C ). Bu grafikler, germ hücresi popülasyonlarının ayırmak için yeterli olmasına rağmen, bir DNA içeriği, (C), kapı çapraz kirlenme için 2 tanımlanabilir. Bu geçit, Hoechst mavisi floresan yoğunluğunun fonksiyonundaki hücre sayımlarının bir histogramı ile oluşturulur. Tüm türler için, üç doruk tespit edilebilir ve 1C, 2C ve 4C hücrelerini temsil eder ( Şekil 1 ve İlave Şekiller 2-5 ). Özellikle, önceki gibiSon zamanlarda belirttiğimiz gibi, spermatogonia yan popülasyondur ve DNA içeriğinin histogramlarına dayalı olarak güvenilir bir şekilde kapatılamaz. Dolayısıyla, bu popülasyon, Hoechst mavi / kırmızı floresan grafiklerine dayanarak ölü hücrelerin hariç tutulmasıyla kapalıdır ( Şekil 1 ). Bu strateji, Şekil 1'de sıçan ve tamamlanan Şekiller 2-5'de kalan türler için gösterilir. Tek başına Hoechst flüoresansının farklı germ hücresi tiplerini ayırt edebildiğinden, hem PI hem de DNA içerik kapısı isteğe bağlıdır. Sırasıyla canlı hücreleri seçmek ve çapraz kontaminasyonu azaltmak için bu stratejiye dahil edildi. Tablo 1'de özetlendiği gibi, DNA içeriği kapısındaki hücrelerin miktarının belirlenmesi, spermatogenezin farklı evrelerindeki hücrelerin göreli oranını yansıtır. Beklendiği gibi, en çok 1C hücrelerdir ve spermatid popülasyonlarını temsil eder, bunu 2C hücreleri (SPC II) ve 4C hücreleri (SPC I) izler. importaHiç kuşkusuz, bu modeller türler arasında korunur ve küçük farklılıklar, germ hücrelerindeki spesifik değişkenliği ve seminifer epitelin 21 sikluslarını yansıtabilir.
Ho-FACS'den sonra, hücre bütünlüğü, Tripan mavisi boyaması kullanılarak değerlendirilebilir. 1 saatlik FACS sonrasında canlı hücrelerin oranı, fare için% 27 (SCP I) ila% 67 (SPD) arasında değişmekte olup sıralama ve Hoechst'e maruz kalmanın hücre ölümünü arttırdığını gösteriyor. Sıralanan hücreleri kültürle arayan kullanıcılar için Hoechst konsantrasyonu ve Ho-FACS süresi hücre sağkalımını artırmak için ayarlanmalıdır. Bununla birlikte, RNA dizilimi verileri, bu yöntemi kullanarak izole edilen tek hücreler için üretilmiştir (Jung ve diğerleri , yayınlanmamıştır) ve bu hücrelerin germ hücresi biyolojisinin moleküler araştırmaları için uygun olduğunu göstermektedir. Bu veri seti, somatik hücrelerle germ hücre popülasyonlarının potansiyel kontaminasyonunu tespit etmek için kullanılmıştır ( Ek Şekil 6
Sıralanmış germ hücresi popülasyonlarının morfolojik olarak değerlendirilmesi
Germ hücreler, spermatogenez boyunca şiddetli morfolojik değişiklikler geçirdiğinden, izole edilmiş popülasyonların saflığını mikroskopik olarak tahmin etmek mümkündür. Bir referans olarak, Şekil 4, 4 memeli türünden farklı germ hücre türlerinin genel morfolojisini göstermektedir (Lima ve diğerleri. 5). Kromatin dağılımı ve yoğuşma, aynı zamanda hücre büyüklüğü ve şekli, farklı hücre tiplerinde benzersiz ve iyi tanımlanmış kalıpları gösterir. SPG, Hoechst için parlak bir şekilde leke oluşturan ve şekilleri küçük ve yuvarlak olan farklı perikentrik heterokromatine sahiptir ( Şekil 4B'de Spg). Spermatositler daha büyük tanecikli hücrelerdir. SPC'nin çekirdekleri, kolaylıkla kromatin varyasyonuyla tanımlanabilir( Şekil 4B'deki Spc I), buna karşın SPC II, binucleated veya diakinez'tir ( Şekil 4B'de Spc II). Son olarak, SPD, yuvarlak veya uzunlamasına şekle sahip küçük haploid hücrelerdir ( Şekil 4B'de Spd). Özellikle, rSPD, boyut ve şekildeki SPG'ye benzer ancak lokalize chromosentörlerin varlığı ile açık bir şekilde ayırt edilir. Bu özelliklere dayanarak, sıralı hücre popülasyonları spesifik hücre tiplerinin zenginleşmesi için değerlendirildi ( Tablo 1 ). SPD ve SPC II popülasyonları, ilgi konusu hücre türü için oldukça zenginleştirilmişken, SPC I ve SPG, özellikle Gine Domuzu ve Mini Domuz numuneleri için, diğer hücre tipleriyle bir derece kontaminasyon gösterdi. İlginç bir şekilde, köpek örneği için geçiş stratejisi yuvarlaklığın uzayan spermatidlerden ayrım yapmak için yeterliydi ( Şekil 3C ; İlave Şekil 3 ; Tablo 1
Şekil 1: Memeli erkek germ hücrelerinin Ho-FACS izolasyonunun iş akışı. Bu resim memeli germ hücrelerinin germ hücresi izolasyonu için genel protokolü ve bu protokolün sıçan testisine uygulanmasından gelen temsili verileri göstermektedir. Ho: Hoechst. Lima ve ark. 5 izinli. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Tek hücreli süspansiyonlar mekanik ayrışma ile üretilir Fare testis dokusu. Taze dokudan elde edilen numuneler ( AB ) çeşitli bozulmamış germ hücresi türleri ve çok az döküntü gösterir. Lekensız hücrelere kıyasla ( A ), çözülme işleminden hemen sonra numuneye ( D ) DNaz (son konsantrasyon 10 ug / mL) eklenerek azaltılabilen Hoechst lekeli hücre süspansiyonları ( B ) için bazı hücre topaklanması gözlendi. Dondurulmuş testiküler doku, mekanik ayrışma ( C ) ile tekli hücre süspansiyonları elde etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, doku ayrışımından önce flaş dondurma ve çözme işlemi daha fazla artık, hücre ölümü ve genel olarak daha az hücresel verimle sonuçlanmaktadır. Ayrıldıktan sonra (bkz. Protokol) örnekler 4 ° C'de 10 dakika döndürülmüş ve slaytlar monte edilmeden önce 1x DMEM'de tekrar süspanse edilmiştir. Siyah çubuklar = 50 μm. Bir UV lamba ile donatılmış dikey beyaz ışık mikroskopu kullanılarak elde edilen görüntüler.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Memeli germ hücrelerinin Ho-FACS'si. Belirli popülasyonlar, FACS ( A ) sırasında Hoechst flüoresansının benzersiz modellerini sunar. Hoechst mavi flüoresans, haploid ( C ) kromatin içerik kümelerindeki değişimleri yansıtıyor; Diploid (2C) ve tetraploid (4C) hücreleri, artan Hoechst mavisi flüoresansı ile FACS arsa alanlarında bulunur. Hoechst mavisi / kırmızı fluoresansın bir fonksiyonu olarak üretilen arsalar test edilen farklı memeli türleri için farklı hücre popülasyonlarının kümelerini gösterir ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: Birincil spermatositler; Pre-Lep: Pre-Leptoten spermatositler; Lep: Leptoten spermatositler; Dip: Diploten spermatositler; SPCII: Sekonder spermatositler; SPD: Spermatidler; ESPD: uzayan spermatidler; RSPD: yuvarlak spermatidler. Lima ve diğerleri tarafından uyarlanmıştır . 5 izinli. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Dört memeli türün farklı gelişim aşamasındaki germ hücrelerinin morfolojisi. Bu şekil, Hoechst (A) ile lekelenmiş testis dokularının bölümlerini ve fare, kobay, köpek ve mini domuzdan Ho-FACS (B) ile sıralanmış farklı erkek germ hücresi tiplerinin genel yönünü göstermektedir. Hücrenin büyüklüğü, şekli ve kromatin konformasyonu spermatogenez boyunca dramatik bir şekilde değiştikçe, hücreleri farklılaşmanın aşamalarına atamak için kullanılabilir. Spermatogonia (Spg) küçük ve yuvarlak cBelirgin perisentrik heterokromatin ile çiçek açar ve yüksek yoğunlukta Hoechst flüoresansı sergiler. Spermatositler en büyük germ hücreleridir ve değişken kromatin konformasyonlarını gösterir. Primer spermatositlerin (Spc I) çekirdeği mayotik hücrelerin karakteristik kromatin varyasyonlarına, ikincil spermatositlerin (Spc II) ise binucleated veya diakinezis'e sahiptir. Spermatidler (Spd), spermiogenezin evresine bağlı olarak yuvarlak veya uzunlamasına şekildedir ve küçük haploid hücrelerdir. Yuvarlak spermatidler ve spermatogonia boyut ve şekil bakımından birbirine benzemekle birlikte, lokalize chromosenterler varlığı ile ayırt edilebilmektedir. Slaytlar, Ho-FACS'den sonra her bir sıralı hücre tipi için hazırlandı ve bir konfokal mikroskopta görüntülendi: 63X büyütme lensi, (alt panel) veya beyaz panelli olmayan (üst panel) beyaz ışık iletimi. Lima, et al. 5 izinli. LütfenBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
| DNA içeriği kapısında% hücreler | Sıralanmış germ hücresi popülasyonlarının saflığı (%) | |||||||||||
| Türler | % Singletler | Canlı hücreler% | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | rSpd | ESPD | |
| Fare | 98.4 | 92.5 | 34,7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87,5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| Sıçan | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Gine domuzu | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Köpek | 97.9 | 86.5 | 16.4 | 3 | 0.5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Domuz | 95.9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Enzimatik ayrışma ile elde edilmiş ve kapılıFSC ve SSC parametrelerine dayanarak (Lima ve diğerleri 2016'dan, izin alınarak) | ||||||||||||
Tablo 1: Mekanik çözülme ile elde edilen erkek germ hücresi süspansiyonlarının Ho-FACS istatistiği.
Tamamlayıcı Şekil 1: Dondurulmuş testiküler dokunun mekanik olarak ayrılmasıyla elde edilen tek hücre süspansiyonları. Mekanik ayrışma, türlere özgü protokollere gerek kalmaksızın farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan tek hücre süspansiyonlarının üretilmesine izin verir. Farklı paneller, 4 memeli türü için elde edilen hücre süspansiyonlarını göstermektedir. Örnekler, dondurulmuş testis dokusunun mekanik olarak ayrılmasıyla elde edildi ve Hoechst ile boyandı. SPG: Spermatogonia; SPC I: Birincil Spermatosit; SPC II: İkincil Spermatosit; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Slaytlar bir confoca içinde görselleştirildi L mikroskop ile (alt panel) veya beyaz panelli olmayan (üst panel) beyaz ışık iletimi. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: Fare testiküler tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS ile canlı erkek germ hücrelerinin ayrılması için geçiş stratejisi. Canlı hücreler (PI negatif), Hoechst flüoresansına göre sıralanır. Spermatogonia (SPG), doğrudan Hoechst-mavi ve kırmızı floresans yoğunlukları çizerek tanımlanır. Bir DNA içerik kapısı Hoechst mavi flüoresans temelinde hücreleri sıralamak için kullanılır: haploid (C); Diploid (2C) ve tetraploid (4C). Histogramın her pikindeki hücreler, daha sonra, Hoechst mavisi ve kırmızı flüoresans fonksiyonunun çizilmesi ile sıralanır. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatidler; SPC II: Sekonder spermatositler; SPC I: Birincil spermatositler.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 3: Köpek testiküler tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS ile canlı erkek germ hücrelerinin ayrılması için geçiş stratejisi. Canlı hücreler (PI negatif), Hoechst flüoresansına göre sıralanır. Spermatogonia (SPG), doğrudan Hoechst-mavi ve kırmızı floresans yoğunlukları çizerek tanımlanır. Bir DNA içerik kapısı Hoechst mavi flüoresans temelinde hücreleri sıralamak için kullanılır: haploid (C); Diploid (2C) ve tetraploid (4C). Histogramın her pikindeki hücreler, daha sonra, Hoechst mavisi ve kırmızı flüoresans fonksiyonunun çizilmesi ile sıralanır. Haploid hücreleri içeren zirve, Hoechst mavisi yoğunluğunun aralığına göre alt bölümlere ayrılabilir ve spermatidlerin iki alt popülasyonunu temsil edebilir: uzayan spermatidler (kapısı C ') ve yuvarlak spermatidler (kapısı C "). SPG: Spermatogonia; ESPD: uzayan spermatidler; RSPD: yuvarlak spermatidler; SPC II:Sekonder spermatositler; SPC I: Birincil spermatositler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 4: Kobay testiküler tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS ile canlı erkek germ hücrelerinin ayrılması için geçiş stratejisi. Canlı hücreler (PI negatif), Hoechst flüoresansına göre sıralanır. Spermatogonia (SPG), doğrudan Hoechst-mavi ve kırmızı floresans yoğunlukları çizerek tanımlanır. Bir DNA içerik kapısı Hoechst mavi flüoresans temelinde hücreleri sıralamak için kullanılır: haploid (C); Diploid (2C) ve tetraploid (4C). Histogramın her pikindeki hücreler, daha sonra, Hoechst mavisi ve kırmızı flüoresans fonksiyonunun çizilmesi ile sıralanır. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatidler; SPC II: Sekonder spermatositler; SPC I: Birincil spermatositler. Yapmak için lütfen tıklayınızBu dosyayı boşaltın.
Tamamlayıcı Şekil 5: Canlı erkek germ hücrelerinin mini-domuz testiküler tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS ile ayrılması için geçiş stratejisi. Canlı hücreler (PI negatif), Hoechst flüoresansına göre sıralanır. Spermatogonia (SPG), doğrudan Hoechst-mavi ve kırmızı floresans yoğunlukları çizerek tanımlanır. Bir DNA içerik kapısı Hoechst mavi flüoresans temelinde hücreleri sıralamak için kullanılır: haploid (C); Diploid (2C) ve tetraploid (4C). Histogramın her pikindeki hücreler, daha sonra, Hoechst mavisi ve kırmızı flüoresans fonksiyonunun çizilmesi ile sıralanır. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatidler; SPC II: Sekonder spermatositler; SPC I: Birincil spermatositler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 6: Somatik hücre kontaminasyonunun incelenmesiIyonu Ho-FACS'de sıralanmıştır. Üç adet FACS alt popülasyon kapısından (AB) yaklaşık 600 tek hücre transkriptomunun t-dağıtılmış stokastik komşu gömme (t-SNE) arsa. T-SNE arsa üzerinde, her bir nokta, bir transkriptom boşluğundaki tek bir hücrenin benzersiz konumunu temsil eder ve her hücre, FACS alt popülasyon kapısı kökeni (A) ile etiketlenir. FACS tek hücreli t-SNE arsa üzerindeki hücre tipi spesifik belirteçlerin görsel kantifikasyonu (B). Somatik hücrelerden kaynaklanan kontaminasyonun% 5'ten az olduğu tahmin edilmektedir ve bir Ho-FACS nüfus kapısına özgü değildir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memelilerde spermatogenez sırasında yüksek oranda korunmuş olan kromatin dinamikleri göz önüne alındığında, bu çalışmanın amacı, farklı memeli testis dokularından farklılaşan farklı evrim safhalarında erkek germ hücrelerini izole etmek için bir protokol geliştirmekti ( Şekil 1 ). Farklı hayvan modellerine tek bir iş akışının uygulanmasının önündeki en büyük engellerden biri, özellikle doku ayrışma protokolleri açısından türlere özel ayarlamalara ihtiyaç duyulmasıdır. Mevcut yöntemler çoğunlukla enzimatik doku sindirimine dayanır ve protokoller genellikle türler içinde bile değişir 12 . Bu sorunun üstesinden gelmek için, burada açıklanan protokol, farklı memeli türlerinin testis numunelerinden tek hücre süspansiyonları elde etmek için mekanik doku disosiyasyonunun uygulanmasını göstermektedir. Sonuçlar, taze testis dokusunun bu sistem ile mekanik ayrışmasının iyi performans gösterdiğini göstermektedir ( Şekil 2A -2B 20 . Önemlisi, Hoechst boyaması, tek hücre süspansiyonlarının kalitesini önemli ölçüde etkilemez gibi görünmektedir. Lekelenmiş numunelerde ( Şekil 2B ) daha fazla hücre yığınlaması görülmesine rağmen, DNaz ( Şekil 2D ) veya NDA 20 ile tedavi bu sorunun önlenmesine yardımcı olabilir. Testiküler dokunun mekanik ayrışmasının enzimatik doku sindirimine göre daha iyi veya etkili olduğunu ileri süren raporlar 5 , 20 . Buna göre, burada sunulan veriler mekanik ayrışmanın, Ho-FACS işlemi için testis dokusundan tek hücre süspansiyonu elde etmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Hoechst ile kuluçka önemli bir adımdır çünkü akış sitometrisi sırasında tespit edilen sinyali etkiler. Uzun sürede boyama, germ hücre tiplerinin daha iyi ayrımcılığını sağlar, ancakhücre içi programlama 22 hücre ölümü ve değişikliklere neden zehirli olabilir. Bu yöntemle germ hücresi kültürleri kurmayı düşünen kullanıcılar, Hoechst 3 , 22'ye uzun süre maruz kalmanın genotoksik etkisini değerlendirecek ve yeterli konsantrasyon ve zamanı belirleyecektir. Burada, germ hücresi popülasyonlarının güvenilir bir şekilde ayrılması için 30 dakika boyama yeterliydi ( Şekil 3B -3C ). Boyama süresi Rodriguez-Casuriaga ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi potansiyel olarak 10 dakikaya düşürülebilir . 20 ve ilgi türleri için kullanıcılar tarafından daha da değerlendirilmelidir.
Hipotez olarak, test edilen farklı türlerden germ hücrelerinin kromatin varyasyonlarına dayanan dört germ hücresi popülasyonu sürekli olarak tespit edilebilir - SPG, SPC I, SPC II ve SPD ( Şekil 3B -3C Tablo 1 ) ve farklı memeli türleri için bu iş akışında ( Şekil 1 ) kullanılan geçiş stratejisini desteklemektedir ( Ek Şekil 2- 5 ). Bununla birlikte, kullanıcıların, popülasyonların bazıları için tespit edilen çapraz kontaminasyonu azaltmak için kapılamayı türlere ve popülasyonlara göre optimize etmeleri önerilir (Tablo 1). Bu, boyama sırasında daha uzun inkübasyon süreleri ile sağlanabilir18 , düşük akış hızı 2 ve azaltılmış kapı boyutları. SPG, testiste en nadir hücre türü oldukları için ve ayrıca zamanla 1 , 15 boyunca boya akışı nedeniyle izole etmek daha zorlayıcıdır. Burada gösterildiği gibi, farklı SPG popülasyonlarını Ho-FACS ile tespit etmek mümkün olmakla birlikte, sadece kök hücre biyolojisine odaklanan çalışmalar Manyetik-Aktive Hücre Ayırma (MACS; 23 ) gibi daha sıkı bir teknikten fayda sağlayacaktır. Dikkat çekici bir şekilde, SPD'nin (eSPD ve rSPD) alt popülasyonları Köpek için açık bir şekilde ayırt edilebilir ancak diğer türler için ayrılamaz ( Şekil 3C ve Ek Şekil 3). Potansiyel olarak, bu alt popülasyonlar, fare 5 için yazarlar tarafından tarif edildiği gibi kapılama ayarlarını ayarlayarak çözülebilir. Hoechst mavi / kırmızı fluoresce fonksiyonunu çizmeden önce hücre büyüklüğü ve taneciklilik (FSC VS SSC) için üretilen sitogramlarNce, artan (düşük FSC + SSC), yuvarlak (yüksek FSC + SSC) spermatid alt popülasyonlarından ayırır. Yuvarlak ve uzayan spermatid alt popülasyonlarının ayrılması, spermi farklılaşması sırasında ortaya çıkan spesifik moleküler olaylara yeni kavrayışlar getiren, spermiyogenezin derinlemesine araştırılmasına olanak tanır. Ayrıca, fare 1 , 2 , 12 için tarif edildiği gibi, FACS geçitlerini ayarlayarak mayotik evrelerde daha fazla çözünürlük elde etmek mümkündür. Bu yaklaşım, mayotik olayların karşılaştırmalı çalışmalarına büyük ölçüde fayda sağlayacaktır. Ho-FACS sırasında hücre bütünlüğü bozulsa da, bu yöntemle sıralanmış hücreler için elde edilen tek hücre RNA dizilimi verileri (Jung ve diğerleri yayınlanmamış , Ek Şekil 6 ), bunun germ hücresi moleküler çalışmaları için hücrelerin elde edilmesi için güvenilir bir yaklaşım olduğunu göstermektedir Biyoloji. Bununla birlikte, üreme tahlillerini yapmak isteyen kullanıcılar, örneğin rHo-FACS tarafından izole edilen hücreleri kullanarak ound spermatid enjeksiyonu (ROSI), sıralanmış hücrelerin yaşayabilirliğini değerlendirmeli ve alternatif yöntemler 24 , 25'i keşfetmek isteyebilir.
Özetle, bu çalışma, testiküler germ hücrelerini farklı memelilerden izole etmek, önceden kurulmuş teknikler 2 , 12 , 20 üzerinde iyileştirmeler oluşturmak ve eklemek için standartlaştırılmış bir yöntemi açıklamaktadır. Bu standartlaştırma, germ hücresi biyolojisinin karşılaştırmalı çalışmaları için veri üretilmesini kolaylaştıran, farklı reçetelerin ve farklı memeli türlerinde tek bir iş akışı kullanılmasına izin verir. Ayrıca, mekanik doku ayrışması, neredeyse olanaksız olan metodolojik değişkenliği getirebilecek türlere özgü düzenlemelerin engelini aşar. Ek olarak, yürütülme süresinin ve manipülasyonun azaltılması ex vivo celLular fizyolojisini minimuma indirir. Bu bağlamda, Ho-FACS, STA-PUT ve elütriasyon 6 , 7 gibi diğer germ hücresi izolasyon yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha hızlıdır. Dahası, aynı deneyde 4 mikrop popülasyonunun aynı anda ayrılması ancak FACS tarafından mümkündür. Hoechst boyasının özellikleri göz önüne alındığında, hücre yapısı ve RNA türleri korunur ve bu nedenle hücreler daha aşağı moleküler çalışmalar için kullanılabilir. Önemlisi, Ho-FACS, germ hücresi türlerini ayırt etmek için kromatin özelliklerine dayandığı için, bu iş akışının 5 farklı türün başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi, diğer memelilere uygulanmasını kuvvetle desteklemektedir. Burada sunulan sonuçlar, spermatogenezin tek bir protokol kullanarak birçok memeli türünde ele alınabilecek eşsiz bir hücre farklılaşması süreci olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, "omiks" ve sistem biyolojisi çağında, bu teknoloji evrimsel bir uygulamanın araçlarını sağlarRoper, spermatogenez boyunca epigenetik, regülasyon ve protein çeşitliliği çalışmaları da dahil olmak üzere, erkek germ hücre biyolojisi soruları üzerine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar köpek testisleri için Hillside Hayvan Hastanesine (St. Louis, MO) teşekkür eder; Jason Arand ve Dr. Ted Cicero'nun sıçan testisleri sağlamak için Washington Üniversitesi'nde (WashU) bulunan laboratuarı ve koleksiyona yardımcı olmak için Brianne Tabers; Jared Hartsock ve Washwell'de bulunan Dr Salt'ın Laboratuvarı, kobay testisleri için; Ve Minyatür domuz testisleri için WashU'da Karşılaştırmalı Tıp Bölgesinde Dr. Michael Talcott. Yazarlar ayrıca, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Stnes Barnes-Yahudi Hastanesi'ndeki Alvin J. Siteman Kanser Merkezi'ni personel tarafından işletilen hücre sıralama hizmetini veren Siteman Akış Sitometri Çekirdeği'nin kullanımı için kabul ediyorlar. Siteman Kanser Merkezi kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Grant # P30 CA91842 tarafından desteklenmektedir.
Bu araştırma, FCT doktora bursu [SFRH / BD / 51695 / 2011'den ACL'ye], Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüsünden [R01HD078641 ve R01MH101810'dan DFC] ve bir FCT araştırma sözleşmesi [IF / 01262/2014 - AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
