Summary
Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.
Abstract
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été l'une des méthodes de choix pour isoler les populations enrichies de cellules germinales testiculaires de mammifères. Actuellement, il permet de discriminer jusqu'à 9 populations de cellules germinales murines à haut rendement et à la pureté. Cette résolution élevée en matière de discrimination et de purification est possible en raison de changements uniques dans la structure et la quantité de la chromatine pendant la spermatogenèse. Ces motifs peuvent être capturés par cytométrie de flux de cellules germinales mâles colorées avec des colorants fluorescents liés à l'ADN tels que Hoechst-33342 (Hoechst). Voici une description détaillée d'un protocole récemment développé pour isoler les cellules germinales testiculaires de mammifères. En bref, des suspensions de cellules individuelles sont générées à partir du tissu testiculaire par dissociation mécanique, doublement colorées avec Hoechst et iodure de propidium (PI) et traitées par cytométrie en flux. Une stratégie de verrouillage en série, y compris le choix des cellules vivantes (PI négatif) avec une teneur différente en ADN (intensité Hoechst), iS utilisé lors du tri FACS pour discriminer jusqu'à 5 types de cellules germinales. Ceux-ci incluent, avec des puretés moyennes correspondantes (déterminées par évaluation microscopique): spermatogonie (66%), spermatocytes primaires (71%) et secondaires (85%) et spermatides (90%), séparés en rond (93%) et allongés (87%) sous-populations. L'exécution de l'ensemble du flux de travail est simple, permet d'isoler 4 types de cellules simultanément avec la machine FACS appropriée et peut être effectuée en moins de 2 h. Étant donné que le temps de traitement réduit est crucial pour préserver la physiologie des cellules ex vivo , cette méthode est idéale pour les études à haut débit en aval de la biologie des cellules germinales masculines. En outre, un protocole normalisé pour la purification multispécifique de cellules germinales de mammifères élimine les sources méthodologiques de variables et permet d'utiliser un seul ensemble de réactifs pour différents modèles animaux.
Introduction
Compte tenu de l'absence d'un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d'une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , car il fournit un rendement et une pureté élevés et surpasse d'autres méthodes d'isolement dans le nombre de types de cellules germinales qu'il peut identifier et Sélectionnez 6 , 7 , 8 . Le principe de l'analyse par cytométrie de flux est basé sur la détection de modèles de lumière différentielle suite à l'excitation du faisceau laser de cellules individuelles. À mesure que la cellule passe à travers le laser, elle reflète / diffuse la lumièreÀ tous les angles, proportionnel à la taille de la cellule (diffusion vers l'avant, FSC) et à la complexité intracellulaire (scatter latéral, SSC). Voir Ormerod 9 pour des informations détaillées sur la cytométrie en flux.
Les cellules germinales mâles subissent des modifications spécifiques de la teneur en ADN, la structure de la chromatine, la taille et la forme dans différents stades de la spermatogenèse. Ainsi, des populations de cellules distinctes peuvent être identifiées et séparées en combinant la diffusion de la lumière et la coloration de l'ADN avec des colorants fluorescents 10 , 11 . Plusieurs colorants peuvent être utilisés à cet effet (revus dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), tels que Hoechst-33342 (Hoechst) qui a été fréquemment utilisé dans l'analyse par cytométrie de flux de cellules testiculaires au cours de la dernière décennie 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN d'excitation avec la lumière UV, Hoechst émet une fluorescence bleue proportionnelle à la teneur en ADN cellulaire, alors que la fluorescence lointain reflète la variabilité dans la structure de la chromatine et la compaction 1 , 13 , 14 . En conséquence, les cellules germinales mâles dans différents stades de différenciation présentent des modèles spécifiques pendant FACS des suspensions de cellules individuelles colorées par Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Fait intéressant, en raison d'un mécanisme d'efflux de colorant qui n'est actif que pendant le stade spermatogoniale, l'intensité de la fluorescence Hoechst bleu n'est pas proportionnelle à la teneur en chromatine dans ces cellules, et elles se groupent en tant que population latérale pendant Ho-FACS 15 . De plus, la combinaison de la coloration Hoechst avec l'iodure de propidium (PI) non perméable permet aux utilisateurs de discriminer en direct (PI négatif) des cellules mortes (PI positives) pendant FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Cette stratégie a été précédemment utilisée dans les analyses cytométriques de flux de cellules germinales testiculaires et optimisée de manière approfondie dans la souris pour discriminer jusqu'à 9 types de cellules germinales, y compris les cellules dans 4 différents stades de la méiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Aux fins de ce travail, la coloration Hoechst présente trois avantages principaux. Tout d'abord, Ho-FACS a été appliqué avec succès à l'isolement des cellules germinales masculines dans les modèles de souris 1 , 2 , 12 et d'autres rongeurs tels que le rat et le cochon d'Inde 17 , 18 , 19 . Deuxièmement, Hoechst est un colorant perméable aux cellules et ne nécessite pas la perméabilisation de la membrane, de sorte qu'il préserveIntégrité des cellules. Enfin, aucun traitement par RNase n'est requis puisque Hoechst se lie préférentiellement aux séquences d'ADN 1 , 20 (ce qui signifie que l'ARN est conservé et, en plus de l'ADN et des protéines, peut être utilisé pour d'autres études moléculaires en aval du germe différenciation cellulaire.
Malgré la similitude dans la pléoïde de l'ADN et / ou la colorabilité observée dans les analyses de cytométrie de flux d'espèces de mammifères (revues dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), il existe une grande variabilité dans les protocoles décrits pour l'isolement masculin des cellules germinales par cytométrie de flux. Différentes études ont utilisé des protocoles spécifiques pour la dissociation des tissus et ont utilisé des colorants distincts liés à l'ADN (seul ou en combinaison) et des stratégies de fermeture de FACS dans différents organismes modèles, principalement la souris, le rat et le cochon d'inde. Par conséquent, la comparaison directe des données recueillies pour différentes espèces peut être affectée par le tabagismeDes artefacts techniques non issus de la variabilité entre les méthodologies. Il est important de noter que la conservation frappante de la dynamique de la chromatine dans la spermatogenèse des mammifères (2N-4N-2N-1N) suggère qu'un protocole standardisé pourrait être appliqué transversalement à une variété d'espèces de mammifères.
L'objectif de cette étude était de développer un flux de travail unique applicable à différentes espèces de mammifères, en combinant et en adaptant les techniques 2 , 20 précédemment publiées. La normalisation d'une méthode de traitement des tissus a été obtenue en effectuant une dissociation mécanique afin de surmonter la nécessité d'effectuer des ajustements propres aux espèces nécessaires à la digestion enzymatique 5 . Il est à noter que la dissociation mécanique du tissu testiculaire des rongeurs s'est révélée supérieure à la digestion enzymatique des tissus 20 et Ho-FACS des suspensions de cellules individuelles générées par les deux méthodes.Des résultats comparables 5 . En tant que preuve de principe, ce protocole décrit les paramètres utilisés pour isoler jusqu'à 5 populations de cellules germinales: la spermatogonie (SPG); Les spermatocytes primaires (SPC I) et les spermatocytes secondaires (SPC II) et les spermatides (SPD) - round (rSPD) et allongement (eSPD). Fait important, il est facile à mettre en œuvre dans le laboratoire, les principales exigences étant le système de dissociation des tissus et l'accès à un trieur de cellules équipé d'un laser UV. Ce flux de travail ( Figure 1 ) est rapide et direct et permet l'isolement simultané de 4 populations de cellules germinales à partir de tissu testiculaire frais en moins de 2 h. Le temps de traitement réduit est essentiel pour maintenir l'intégrité cellulaire pour d'autres procédures en aval. En outre, sa performance réussie dans 5 espèces différentes suggère qu'il pourrait être largement appliqué dans le clade de mammifères, ce qui en fait la méthode idéale pour isoler les cellules germinales pour des études comparatives de mammifères masculins reproducteurs biolOgy.
Ce protocole est composé de trois sections majeures, en dehors des étapes préparatoires: (1) la dissociation mécanique du tissu testiculaire et (2) la coloration des cellules testiculaires avec Hoechst et PI, suivie par (3) le triage FACS de cellules spermatogènes pertinentes. Une fois recueillies, ces populations enrichies de différentes cellules germinales testiculaires de mammifères peuvent être utilisées pour une large gamme d'applications. Ce protocole décrit une méthode de dissociation «unique pour tous» pour purifier les cellules germinales mâles de différentes espèces de mammifères différentes. Selon le type d'étude que les utilisateurs souhaitent effectuer avec les cellules germinales isolées, d'autres supports ou tampons peuvent être utilisés. Les étapes suivantes du protocole consistent à générer des suspensions monocellulaires à partir d'un testicule murin entier.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont respecté les règlements du comité des études animales de l'Université de Washington à St. Louis.
1. Préparations pour le protocole de dissociation mécanique
- Pré-mouiller une cartouche de désagrégation de tissu jetable de 50 μm pour la dissociation d'un testicule murin entier.
REMARQUE: cette cartouche jetable de désagrégation de tissu contient des micro-lames conçues pour couper des tissus et un treillis métallique immobile avec environ 100 trous hexagonaux. Différentes tailles de maille pour cartouche de désagrégation tissulaire sont disponibles pour adapter ce protocole en fonction des espèces et des types de cellules souhaités. Des cartouches de 50 μm ont été utilisées pour toutes les espèces de mammifères mentionnées dans cet article.- Chargez 1 mL de phénol glacé rouge sans 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sur la cartouche de désagrégation tissulaire jetable de 50 μm.
REMARQUE: le rouge phénol peut interférer avec la détection de fluorescence rougePendant les FACS. - Aspirer 1x DMEM de la cartouche de désagrégation tissulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue.
- Chargez 1 mL de phénol glacé rouge sans 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sur la cartouche de désagrégation tissulaire jetable de 50 μm.
- Activez le système de désagrégation des tissus en appuyant sur le bouton "ON". Ce système ne nécessite pas un «échauffement».
- Préchauffez trois filtres jetables de 40 μm avec de la glace à l'abri du DMEM. Placez chaque filtre jetable de 40 μm sur un tube conique de 50 ml. Pipettez 1 mL de 1x DMEM et laissez passer le liquide.
- Préparer une boîte de Petri 100 mm x 15 mm pour la collecte de tissus testiculaires. Pipetter 500 μL de 1x DMEM sur la boîte de Petri.
2. Préparation du tissu testiculaire pour le protocole de dissociation mécanique
- Dissectez une souris mâle pour éliminer soigneusement les testicules entiers frais ou les fragments testiculaires (si vous rencontrez d'autres espèces de mammifères) avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces chirurgicales.
REMARQUE: Assurez-vous que les tissus sont exempts de graisse et de nécrose. Fr Les tissus testiculaires génèrent une qualité de suspension supérieure à une cellule supérieure à celle des tissus congelés.- Transférer des testicules / fragments recueillis dans la boîte de Petri 100 mm x 15 mm préparée contenant 500 μL de 1x DMEM.
- Rincer doucement le tissu dans 1x DMEM pour éliminer les globules rouges (si présent).
- Retirez délicatement la tunica albuginea. L'épaisseur de la tunica albuginea variera selon les différentes espèces.
- Prenez une extrémité du testicule avec une pince.
- Percez l'autre extrémité du testicule avec un scalpel tout en maintenant l'extrémité du testicule avec une pince de l'étape précédente.
- Rincez les tubules testiculaires à l'aide d'un scalpel tout en maintenant l'extrémité du testicule avec une pince à partir de l'étape 2.2.1.
- Couper les tubules testiculaires en morceaux de ~ 2-3 mm 3 en utilisant un scalpel.
3. Obtention des suspensions monocellulaires par dissociation mécanique des tissus testiculaires
"Les résultats des étapes de dissociation décrites ci-dessous sont pour un testicule de souris chez l'adulte. Les volumes de tissus testiculaires provenant de souris juvéniles ou non murines devraient être ajustés en conséquence. Les animaux juvéniles ne contiennent pas tous les stades des cellules germinales. La composition des tissus testiculaires change pendant les saisons de reproduction par rapport à la saison non associée.- Transférer les petites pièces de tubules testiculaires dans la cartouche de désagrégation de tissu pré-mouillée de 50 μm en utilisant une pince et ajouter 1 mL de 1x DMEM.
- Chargez la cartouche de désagrégation des tissus dans le système de désagrégation des tissus et procédez pendant 5 minutes en tournant le bouton du mode "veille" au mode "courir".
- Retirez la cartouche de désagrégation tissulaire du système de désagrégation des tissus et éliminez la suspension cellulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue.
- Aspirez quelques fois pour éliminer tout liquide de la cartouche de désagrégation des tissus. ne pasTous les 1 ml peuvent être récupérés à partir de la cartouche de désagrégation tissulaire.
- Passer la suspension cellulaire aspirée à travers deux filtres pré-mouillés de 40 μm. Filtrer deux fois pour supprimer tous les agrégats cellulaires.
- Placez un filtre pré-mouillé de 40 μm dans un tube conique de 50 ml. Ajouter directement des cellules aspirées dans la seringue sur le filtre de 40 μm. Pipette la suspension à une seule cellule avec une pipette jetable.
- Retirez le filtre pré-mouillé usagé de 40 μm et placez un autre filtre pré-mouillé de 40 μm dans le tube conique de 50 ml. Pipettez la suspension monocellulaire collectée sur le filtre propre de 40 μm.
- Recueillir la suspension filtrée à une seule cellule avec une pipette jetable propre.
- Pipettez la suspension de cellule filtrée vers la cartouche de désagrégation de tissu de 50 μm et procédez pendant encore 5 minutes dans un système de désagrégation de tissu.
- Récupérer tout le liquide de la désagrégation tissulaireSur la cartouche.
4. Coloration avec Hoechst et Iodure de Propidium (PI)
- Transférer la suspension cellulaire récupérée de la cartouche de désagrégation tissulaire de 50 μm à un tube propre de 1,5 mL. On récupérera environ 1-1,5 ml de suspension monocellulaire.
- Diviser la suspension monocellulaire récupérée en quatre tubes de 1,5 mL ou 5 mL.
- Pour les trois premiers tubes, pipeter 150 μL de suspension monocellulaire et repose pipette de suspension monocellulaire dans le dernier des quatre tubes (environ 550 μL de suspension monocellulaire).
REMARQUE: Le montant de la suspension à une seule cellule dans le dernier tube peut varier en fonction de l'efficacité de la récupération de la suspension cellulaire à l'étape 3.6.
- Pour les trois premiers tubes, pipeter 150 μL de suspension monocellulaire et repose pipette de suspension monocellulaire dans le dernier des quatre tubes (environ 550 μL de suspension monocellulaire).
- Réglez le premier tube des quatre tubes comme un contrôle non contrôlé pour la session FACS.
- Préparer des suspensions de cellules colorées à un seul colorant (PI ou Hoechst) comme témoins. Ajouter 2,5 μL de Hoechst ou 1 μL de PI à chaque tube (deuxième et thiRd).
- Préparez un tube double taché. Ceci sera utilisé pour collecter des sous-populations de cellules germinales. Ajouter 2,5 μL de Hoechst et 1 μL de PI au dernier tube.
NOTE: Hoechst a une durée de conservation de 2-3 mois. L'utilisation de stocks de colorants plus anciens entraînera des modifications importantes lors de la session FACS. - Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. Placez les échantillons dans un tube rotatif ou inversez les tubes de 1,5 mL toutes les 5-10 minutes.
- Filtrer la suspension de cellules avec un filtre pré-mouillé de 40 μm et garder la solution filtrée sur de la glace et dans le noir jusqu'à la session FACS.
REMARQUE: L'étape de filtration est nécessaire pour prévenir les touffes cellulaires pour FACS. En outre, le traitement avec la DNase (voir la figure 1 ) ou le sel dipotassique d'acide 2-Naphthol-6,8-disulfonique (NDA 20 ) peut être utilisé pour limiter l'agglutination cellulaire. Des périodes d'attente prolongées affecteront le signal fluorescent détecté pendant les FACS et peuvent entraîner une augmentation de la mort cellulaire.5. Paramétrage de la cellule activée par fluorescence (FACS) et purification des cellules testiculaires
- Préparez les tubes collecteurs FACS.
- Enduire 5 ml de tubes à base ronde en polypropylène ou 1,5 mL avec 400 μL de FBS pour la collecte des cellules. Décanter l'excès de FBS après le revêtement.
- Ajouter le milieu de collecte FACS (1x DMEM + 10% de sérum bovin fœtal, FBS) aux tubes: 1 mL pour tubes de 5 mL ou 100 μL pour tubes de 1,5 mL.
- Configurez les conditions de tri appropriées dans le trieur et le logiciel.
REMARQUE: D'autres machines de tri de cellules et logiciels d'analyse peuvent être utilisés avec les stratégies de configuration et de verrouillage similaires décrites ci-dessous. Les conditions décrites ici ont été adaptées de Gaysinskaya et Bortvin 2 , Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 , et Getun, et al. 4- Chargez un laser ultraviolet avec 463/2Filtre passe-bande de 5 nm pour détecter le Hoechst blue et le filtre passe-bande LP de 680 nm pour détecter le rouge Hoechst et pour détecter le PI.
- Utilisez un miroir dichroïque 555DLP pour distinguer le bleu de la fluorescence rouge.
- Utiliser une buse de 70 μm et trier les cellules à une vitesse de 1000-2000 cellules / seconde.
NOTE: L'efficacité de tri est directement influencée par le débit. Des débits élevés (> 3500 événements / s) augmentent la vitesse de tri mais entraînent une contamination des populations. Voir référence 12 pour plus d'informations.
- Réglez les portes en utilisant des échantillons de contrôle.
- Charger et exécuter l'échantillon non étagé.
- Exclure les débris cellulaires basés sur le modèle FSC vs SSC. Les débris cellulaires apparaîtront dans le quadrant inférieur gauche de l'intrigue. Réglez arbitrairement le seuil pour les débris cellulaires par l'utilisateur ou le technicien du trieur de cellule.
- Portez sur des cellules individuelles en ajustant le seuil pour FSC et la largeur d'impulsion. Les différents trieurs de cellules ont différentes façons de distinguerGuild singlets. Comme la largeur d'impulsion reflète les cellules de temps pour transiter le laser, les cellules individuelles ont des valeurs inférieures par rapport aux agrégats multicellulaires. Le seuil de réglage sur un tracé pour FSC vs largeur d'impulsion peut être utilisé pour sélectionner des singlets.
- Réglez des tensions optimales du tube photomultiplicateur (PMT).
- Utiliser des cellules colorées non colorées et colorées uniques pour établir le seuil du signal de fluorescence PI ou Hoechst.
REMARQUE: Il est important d'optimiser les tensions PTM de base pour les cellules d'intérêt afin d'établir la plage de fluorescence appropriée pour chaque colorant. Ceci est essentiel pour une détection et une sensibilité optimales du signal. Les cellules témoins tachées et non colorées sont utilisées pour établir une gamme de cellules colorées négativement et positivement avec des colorants PI et / ou Hoechst et minimiser le bruit dans les signaux. Pour d'autres explications sur l'optimisation de la tension PMT à l'aide de cellules témoins, reportez-vous à Gaysinskaya et Bortvin 2 - Porte sur cellule en directS basé sur la coloration PI (PI négatif) et la trame FSC. Les cellules mortes seront positives pour la fluorescence PI.
- Définir la porte de contenu en ADN en traçant un histogramme des nombres de cellules basés sur la fluorescence bleue Hoechst. 3 pics avec des concentrations croissantes de fluorescence Hoechst bleu devraient apparaître, représentant des cellules haploïdes (1C), diploïdes (2C) et tétraploïdes (4C). Réglez 3 portes, une pour chaque pic.
- Observez au moins 500 000 événements sur le plan FSC vs SSC avant de procéder à un déclenchement sur les populations de cellules germinales.
- Portent différentes populations de cellules germinales.
- Mélanger l'échantillon taché Hoechst / PI.
- Définissez les trois premières portes parentales communes à toutes les populations.
- Exclure les débris cellulaires en fonction de la trame FSC vs SSC. Sélectionnez les caractères individuels en fonction de la trame FSC vs largeur d'impulsion. Sélectionnez les cellules vivantes en fermant les cellules PI négatives.
- Définir la porte de la spermatogonie.
- Plot PI cellules négatives basées sur la fluorescence bleue et rouge HoechstIntensités. La spermatogonie apparaît comme une population latérale (voir la figure 1 ).
- Définir des portails pour les populations de cellules germinales restantes. REMARQUE: Reportez-vous à la figure 1 et à la figure 2 supplémentaire pour les détails visuels.
- Plot PI cellules négatives dans la porte de contenu d'ADN.
- Pour les spermatides, utilisez le pic avec la plus faible fluorescence Hoechst (1C).
- Pour les spermatocytes II, garez le pic avec une fluorescence Hoechst intermédiaire (2C).
- Pour les spermatocytes I, garez le pic avec la plus grande fluorescence Hoechst (4C).
- Tracer l'intensité de fluorescence bleue et rouge de Hoechst pour affiner les populations de spermatocytes et de spermatozoïdes à partir des portes de contenu d'ADN.
- Collectez les portes de sous-population sélectionnées dans les tubes de collecte précédemment préparés. Chaque testicule prendra en moyenne 45 minutes à 1,5 h pour collecter environ 0,5 à 6,0 x 10 6 cellules pour chaque sous-population.
NOTE: Exposition prolongée des cellules à Hoechst maDéplacement légèrement de l'emplacement des populations avec le temps. Rafraîchir les paramètres après 20-30 min de FACS. Le rendement maximal pour chaque sous-population dépendra de l'efficacité de l'étape de dissociation.
6. Evaluation microscopique des cellules purifiées
- Les cellules recueillies par centrifugation à 500-600 xg à 4 ° C pendant 10 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de solution tampon phosphate glaciaire 1x (PBS) ou 1x DMEM.
REMARQUE: Le volume de ré-suspension peut être ajusté en fonction du nombre de cellules triées et de la concentration finale souhaitée. - Pipettez 40 μL de cellules lavées sur une glissière de verre propre et placez une lamelle.
- Fixer les cellules restantes avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) et stocker des cellules fixes à 4 ° C dans l'obscurité pour référence ultérieure.
- Pipetter 100 μL 4% de PFA directement dans les tubes de collecte.
- En bref, tourbillonner les tubes ou la pipette quelques fois pour assurer un bon mélange de la suspension cellulaire.
- Visualisez les diapositives préparées dans un microscope équipé d'une lampe UV pour détecter la fluorescence Hoechst sous un objectif 63X. Reportez-vous à la section Résultats - Évaluation morphologique des populations de cellules germinales classées - pour plus de détails sur la façon d'identifier les types spécifiques de cellules germinales.
- Préparez les tubes collecteurs FACS.
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Representative Results
Suspensions cellulaires simples de la dissociation mécanique du tissu testiculaire
La figure 2 compare les suspensions de cellules individuelles obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire de souris dans différentes conditions. Les échantillons obtenus en traitant du tissu frais, non colorés ( Figure 2A ) ou colorés avec Hoechst ( Figure 2B ), montrent la présence de cellules individuelles à différents stades de différenciation et, de façon importante, la structure cellulaire semble être conservée, y compris les flagelles de spermatozoïdes. Bien que de l'agglutination et des débris aient été observés dans les échantillons colorés, ce qui a été réduit en ajoutant DNase après la dissociation ( Figure 2D ), ces résultats indiquent que la coloration Hoechst ne modifie pas de manière significative la qualité des suspensions de cellules individuelles. Fait intéressant, une cellule cellulaireDes sécrétions peuvent également être obtenues à partir de tissus congelés pour la souris ( Figure 2C ) et d'autres espèces de mammifères - rat, chien, cochon d'inde et mini-cochon ( figure complémentaire 1 ) par dissociation mécanique. Divers types de cellules sont visibles et identifiables dans ces échantillons; Cependant, le traitement des tissus congelés semble entraîner une augmentation de la mort et de l'agglomération, et un rendement cellulaire globalement plus faible. En tant que tel, il est fortement recommandé de préparer des suspensions de cellules individuelles à partir de tissus frais pour d'autres applications en aval.
La qualité des suspensions de cellules individuelles préparées à partir de tissus testiculaires frais de souris, de rat, de chien, de cochon d'inde et de mini-cochon a été évaluée pendant Ho-FACS ( tableau 1 ). Après l'exclusion des débris cellulaires, 95,7-98,4% des cellules sont des singlets, et de ces 86,5 à 93,8% sont vivants, comme le montre la quantification des cellules PI négatives (voir Protocole ). Ces résultatsTs indiquent que la dissociation mécanique est une méthode fiable pour préparer des suspensions de cellules individuelles pour la cytométrie de flux à partir de tissus testiculaires de différentes espèces de mammifères.
Ho-FACS pour isoler les cellules germinales du tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères
Après une dissociation mécanique, les suspensions de cellules individuelles sont colorées avec Hoechst et PI et traitées par FACS. Comme mentionné ci-dessus, la coloration Hoechst permet la discrimination des cellules à différents stades de différenciation basée sur la quantité et la structure de la chromatine, tandis que la coloration par PI des cellules non perméabilisées sépare les cellules vivantes des cellules mortes. Par conséquent, après avoir filtré les débris cellulaires et les agrégats multicellulaires, la porte PI sélectionne les cellules avec des membranes intactes (PI négatif, figure 1 ). Les cellules vivantes sont ensuite analysées en fonction de la fluorescence Hoechst: le bleu est proportionnel au contenu de l'ADN et augmente le rougeLa fluorescence reflète moins la chromatine condensée et les variations structurelles. En tant que tel, on s'attend à ce que les cellules germinales mâles de différentes étapes se regroupent dans des régions spécifiques de cytogrammes complétant la fonction de fluorescence Hoechst bleu / rouge ( figure 3A ).
En effet, les parcelles Ho-FACS générées pour les différentes espèces montrent la présence de populations cellulaires distinctes basées sur la fluorescence Hoechst ( Figure 3B- 3C ). Bien que ces parcelles soient suffisantes pour discriminer les populations de cellules germinales, une porte d'ADN (C) peut être définie 2 pour limiter la contamination croisée. Cette grille est générée par un histogramme du nombre de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence bleue Hoechst. Pour toutes les espèces, trois pics peuvent être détectés et représentent des cellules avec 1C, 2C et 4C ( figure 1 et figures supplémentaires 2-5 ). Notamment, comme previLes spermatogonies sont une population secondaire et ne peuvent être fermées de manière fiable en fonction des histogrammes de la teneur en ADN. Par conséquent, cette population est fermée après l'exclusion des cellules mortes, selon les diagrammes de fluorescence bleu / rouge Hoechst ( figure 1 ). Cette stratégie est représentée sur la figure 1 pour le rat et les figures supplémentaires 2-5 pour les espèces restantes. Il est important de noter que, comme la fluorescence Hoechst seule peut discriminer les différents types de cellules germinales, les portes de contenu PI et ADN sont facultatives. Ils ont été inclus dans cette stratégie pour sélectionner des cellules vivantes et réduire la contamination croisée, respectivement. Comme résumé dans le tableau 1 , la quantification des cellules dans la porte de contenu d'ADN reflète la proportion relative de cellules dans différents stades de la spermatogenèse. Comme prévu, les cellules 1C sont les plus abondantes et représentent les populations de spermatites, suivies des cellules 2C (SPC II) et des cellules 4C (SPC I). ImportaCe modèle est conservé à travers les espèces et de petites différences peuvent refléter la variabilité interspécifique dans les cellules germinales et les cycles de l'épithélium séminifère 21 .
Après Ho-FACS, l'intégrité de la cellule peut être évaluée à l'aide d'une coloration au bleu de trypan. La proportion de cellules vivantes après 1 h de FACS variait de 27% (SCP I) à 67% (SPD) pour la souris, ce qui indique que la durée du tri et l'exposition à Hoechst augmentent la mort cellulaire. Pour les utilisateurs qui cherchent à culture, les cellules triées, la concentration de Hoechst et la durée de Ho-FACS doivent être ajustées pour améliorer la survie cellulaire. Néanmoins, des données de séquençage d'ARN ont été générées pour des cellules isolées isolées en utilisant cette méthode (Jung et al ., Non publiées), ce qui indique que ces cellules sont appropriées pour des études moléculaires sur la biologie des cellules germinales. Cet ensemble de données a été utilisé pour détecter la contamination potentielle des populations de cellules germinales avec des cellules somatiques ( Figure 6 supplémentaire
Évaluation morphologique des populations de cellules germinales classées
Comme les cellules germinales subissent des changements morphologiques drastiques tout au long de la spermatogenèse, il est possible d'estimer la pureté des populations isolées par microscopie. Comme référence, la figure 4 illustre la morphologie générale de différents types de cellules germinales chez 4 espèces de mammifères (de Lima et al., 5 ). La distribution et la condensation de la chromatine, ainsi que la taille et la forme de la cellule, montrent des motifs uniques et bien caractérisés dans différents types de cellules. SPG ont une hétérochromatine pericentrique distincte, qui tache fortement pour Hoechst, et sont petites et rondes (Spg dans la figure 4B ). Les spermatocytes sont des cellules granulées plus grandes. Les noyaux de SPC I sont facilement identifiables, avec une variation de la chromatineNs caractéristiques des cellules méiotiques (Spc I dans la figure 4B ), alors que le SPC II est binucléé ou en diakinesis (Spc II dans la figure 4B ). Enfin, les SPD sont de petites cellules haploïdes de forme ronde ou allongée (Spd dans la figure 4B ). Notamment, les RSPD sont similaires à SPG en taille et en forme, mais clairement distingués par la présence de chromocenters localisés. Sur la base de ces caractéristiques, les populations de cellules triées ont été évaluées pour l'enrichissement de types cellulaires spécifiques ( tableau 1 ). Les populations de SPD et SPC II ont été très enrichies pour le type d'intérêt de la cellule, alors que SPC I et SPG ont montré un certain degré de contamination avec d'autres types de cellules, en particulier pour les échantillons de cobaye et de mini cochon. Fait intéressant, pour l'échantillon de chien, la stratégie de fermeture était suffisante pour discriminer les spermatides allongées à partir des sondes allongées ( Figure 3C ; Figure 3 supplémentaire ; Tableau 1
Figure 1: Flux de travail de l'isolement Ho-FACS de cellules germinales masculines de mammifères. Cette image illustre le protocole général pour l'isolement des cellules germinales de cellules germinales de mammifères, avec des données représentatives de l'application de ce protocole aux testicules de rat. Ho: Hoechst. De Lima, et al. 5 avec permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: suspensions de cellules simples générées par la dissociation mécanique de Tissu testiculaire de souris. Les échantillons obtenus à partir de tissus frais ( AB ) montrent une variété de types de cellules germinales intactes et très peu de débris. Par rapport aux cellules non colorées ( A ), on a observé une certaine agglomération cellulaire pour les suspensions de cellules colorées par Hoechst ( B ), ce qui peut être réduit en ajoutant DNase (concentration finale de 10 μg / mL) à l'échantillon immédiatement après la dissociation ( D ). Le tissu testiculaire congelé peut également être utilisé pour obtenir des suspensions de cellules individuelles par dissociation mécanique ( C ). Cependant, il semble que le processus de congélation et de décongélation instantanée avant la dissociation des tissus entraîne plus de débris, la mort cellulaire et le rendement globalement moins cellulaire. Après la dissociation (voir protocole), les échantillons ont été filés pendant 10 min à 4 ° C et remis en suspension dans 1x DMEM avant de monter les glissières. Barres noires = 50 μm. Images obtenues à l'aide d'un microscope optique droit vertical équipé d'une lampe UV.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Ho-FACS de cellules germinales de mammifères. Des populations spécifiques présentent des motifs uniques de fluorescence Hoechst pendant FACS ( A ). Comme la fluorescence Hoechst bleu reflète les variations dans les grappes de teneur en chromatine de haploïde ( C ); Les cellules diploïdes (2C) et tétraploïdes (4C) sont situées dans des zones du diagramme FACS avec une fluorescence Hoechst bleue croissante. Les parcelles générées en fonction de la fluorescence bleue / rouge Hoechst montrent des grappes de populations de cellules distinctes pour les différentes espèces de mammifères testées ( BC ). SPG: spermatogonie; SPC I: spermatocytes primaires; Pre-Lep: spermatocytes pré-leptotène; Lep: spermatocytes au leptotène; Trempe: spermatocytes Diplotene; SPCII: spermatocytes secondaires; SPD: spermatides; ESPD: spermatides allongées; RSPD: spermatites rondes. Adapté de Lima, et al. 5 avec permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Morphologie des cellules germinales dans différents stades de développement à partir de quatre espèces de mammifères. Cette figure montre des sections de tissu testiculaire colorées avec Hoechst (A) et l'aspect général de différents types de cellules germinales mâles triés par Ho-FACS (B) à partir de rat, cochon d'Inde, chien et mini-cochon. Comme la taille de la cellule, la forme et la conformation de la chromatine varie considérablement tout au long de la spermatogenèse, celles-ci peuvent être utilisées pour affecter des cellules à différents stades de différenciation. La spermatogonie (Spg) est petite et ronde cAvec une hétérochromatine pericentrique distincte et présentant une forte intensité de fluorescence Hoechst. Les spermatocytes sont les plus grandes cellules germinales et montrent des conformations variables de la chromatine. Les noyaux des spermatocytes primaires (Spc I) présentent des variations de chromatine caractéristiques des cellules méiotiques, tandis que les spermatocytes secondaires (Spc II) sont binucléés ou en diakinesis. Les spermatides (Spd) ont une forme ronde ou allongée, selon le stade de la spermiogenèse et sont de petites cellules haploïdes. Bien que les spermatides rondes et la spermatogonie soient de taille et de forme similaires, la première peut être distinguée par la présence de chromocenters localisés. Des diapositives ont été préparées pour chaque type de cellule trié après Ho-FACS et ont été visualisées dans un microscope confocal: objectif de grossissement 63X, avec (panneau inférieur) ou sans transmission de lumière blanche (panneau supérieur). De Lima, et al. 5 avec permission. S'il vous plaîtCliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| % De cellules dans la porte de contenu en ADN | Pureté des populations de cellules germinales classées (%) | |||||||||||
| Espèce | % Tchèques | % Cellules en direct | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | RSpd | ESpd | |
| Souris | 98.4 | 92.5 | 34,7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| Rat | 95,7 | 93,8 | 37,7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Cochon d'Inde | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Chien | 97,9 | 86,5 | 16.4 | 3 | 0,5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Pig | 95,9 | 93,2 | 26,9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Obtenu par dissociation enzymatique et ferméBasé sur les paramètres FSC et SSC (de Lima et al., 2016, avec autorisation) | ||||||||||||
Tableau 1: Statistiques de Ho-FACS des suspensions de cellules germinales masculines obtenues par dissociation mécanique.
Figure complémentaire: suspensions de cellules simples obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire congelé. La dissociation mécanique permet la génération de suspensions de cellules individuelles à partir de tissus testiculaires de différentes espèces de mammifères sans avoir besoin de protocoles spécifiques aux espèces. Différents panneaux montrent les suspensions cellulaires obtenues pour 4 espèces de mammifères. Les échantillons ont été obtenus par dissociation mécanique du tissu testiculaire congelé et colorés avec Hoechst. SPG: spermatogonie; SPC I: spermatocytes primaires; SPC II: spermatocytes secondaires; SPD: Spermite; SPZ: spermatozoïdes. Les diapositives ont été visualisées dans une confoca L microscope avec (panneau inférieur) ou sans (panneau supérieur) transmission de lumière blanche. Barres d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure 2 supplémentaire: Stratégie de gating pour la séparation des cellules germinales mâles vivantes par Ho-FACS des suspensions de cellules monoclonales à testicules de souris. Les cellules vivantes (PI négatif) sont triées selon la fluorescence Hoechst. La spermatogonie (SPG) est identifiée en traçant directement des intensités de fluorescence Hoechst-bleu et rouge. Une porte de contenu en ADN est utilisée pour trier les cellules en fonction de la fluorescence bleue Hoechst: haploïde (C); Diploïde (2C) et tétraploïde (4C). Les cellules dans chaque pic de l'histogramme sont ensuite triées en traçant la fonction de la fluorescence Hoechst bleu et rouge. SPG: spermatogonie; SPD: spermatides; SPC II: spermatocytes secondaires; SPC I: spermatocytes primaires.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure 3 supplémentaire: Stratégie de gating pour la séparation des cellules germinales mâles vivantes par Ho-FACS de suspensions cellulaires monocellulaires de chien. Les cellules vivantes (PI négatif) sont triées selon la fluorescence Hoechst. La spermatogonie (SPG) est identifiée en traçant directement des intensités de fluorescence Hoechst-bleu et rouge. Une porte de contenu en ADN est utilisée pour trier les cellules en fonction de la fluorescence bleue Hoechst: haploïde (C); Diploïde (2C) et tétraploïde (4C). Les cellules dans chaque pic de l'histogramme sont ensuite triées en traçant la fonction de la fluorescence Hoechst bleu et rouge. Le pic contenant des cellules haploïdes peut être subdivisé selon la gamme de l'intensité bleue Hoechst et représente deux sous-populations de spermatides: spermatides allongées (porte C ') et spermatides rondes (portail C' '). SPG: spermatogonie; ESPD: spermatides allongées; RSPD: spermatites rondes; SPC II:Spermatocytes secondaires; SPC I: spermatocytes primaires. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure 4 supplémentaire: Stratégie de gating pour la séparation des cellules germinales mâles vivantes par Ho-FACS de suspensions testiculaires à une seule cellule de guinée. Les cellules vivantes (PI négatif) sont triées selon la fluorescence Hoechst. La spermatogonie (SPG) est identifiée en traçant directement des intensités de fluorescence Hoechst-bleu et rouge. Une porte de contenu en ADN est utilisée pour trier les cellules en fonction de la fluorescence bleue Hoechst: haploïde (C); Diploïde (2C) et tétraploïde (4C). Les cellules dans chaque pic de l'histogramme sont ensuite triées en traçant la fonction de la fluorescence Hoechst bleu et rouge. SPG: spermatogonie; SPD: spermatides; SPC II: spermatocytes secondaires; SPC I: spermatocytes primaires. Cliquez ici pour faireWnloader ce fichier.
Figure 5 complémentaire: Stratégie de gating pour la séparation des cellules germinales mâles vivantes par Ho-FACS de suspensions de cellules monoclonales mini-porc. Les cellules vivantes (PI négatif) sont triées selon la fluorescence Hoechst. La spermatogonie (SPG) est identifiée en traçant directement des intensités de fluorescence Hoechst-bleu et rouge. Une porte de contenu en ADN est utilisée pour trier les cellules en fonction de la fluorescence bleue Hoechst: haploïde (C); Diploïde (2C) et tétraploïde (4C). Les cellules dans chaque pic de l'histogramme sont ensuite triées en traçant la fonction de la fluorescence Hoechst bleu et rouge. SPG: spermatogonie; SPD: spermatides; SPC II: spermatocytes secondaires; SPC I: spermatocytes primaires. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure 6 supplémentaire: Examen du contaminant des cellules somatiquesDans les populations triées Ho-FACS. T-distribué vecteur stochastique voisin (t-SNE) parcelle d'environ 600 transcriptome à une seule cellule à partir de trois portes de sous-population FACS (AB). Sur le diagramme t-SNE, chaque point représente la position unique d'une seule cellule dans un espace transcriptome et chaque cellule est étiquetée avec son origine de la porte de sous-population FACS (A). Quantification visuelle des marqueurs spécifiques du type cellulaire sur le complot T-SNE d'une seule cellule FACS (B). La contamination des cellules somatiques est estimée à moins de 5% et n'est pas spécifique à une porte de population Ho-FACS. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Compte tenu de la dynamique de la chromatine hautement conservée pendant la spermatogenèse chez les mammifères, l'objectif de ce travail était de développer un protocole pour isoler les cellules germinales masculines dans différents stades de différenciation de différents tissus testiculaires de mammifères ( figure 1 ). L'un des principaux obstacles à l'application d'un flux de travail unique à différents modèles animaux est la nécessité d'ajustements spécifiques aux espèces, en particulier en ce qui concerne les protocoles de dissociation des tissus. Les méthodes actuelles reposent principalement sur la digestion des tissus enzymatiques et les protocoles varient souvent même dans les espèces 12 . Pour résoudre ce problème, le protocole décrit ici montre l'application de la dissociation mécanique des tissus pour obtenir des suspensions de cellules individuelles à partir d'échantillons testiculaires de différentes espèces de mammifères. Les résultats indiquent que la dissociation mécanique du tissu testiculaire frais avec ce système fonctionne bien ( figure 2A- 2B 20 . Fait important, la coloration Hoechst ne semble pas affecter de manière significative la qualité des suspensions de cellules simples. Bien que plus d'agglomération cellulaire soit visible dans les échantillons colorés ( Figure 2B ), le traitement avec DNase ( Figure 2D ) ou NDA 20 peut aider à prévenir ce problème. Les rapports précédents suggèrent que la dissociation mécanique du tissu testiculaire est meilleure ou aussi efficace que la digestion des tissus enzymatiques 5 , 20 . Conformément, les données présentées ici indiquent que la dissociation mécanique est une méthode fiable pour obtenir des suspensions de cellules individuelles à partir du tissu testiculaire pour le traitement Ho-FACS.
L'incubation avec Hoechst est une étape cruciale car elle influence le signal détecté lors de la cytométrie en flux. De longues périodes de coloration fournissent une meilleure discrimination des types de cellules germinales maisPeut être toxique, entraînant une mort cellulaire et des changements dans la programmation intracellulaire 22 . Les utilisateurs ayant l'intention d'établir des cultures de cellules germinales avec cette méthode devraient évaluer l'effet génotoxique de l'exposition prolongée à Hoechst 3 , 22 et déterminer la concentration et le temps de coloration adéquats. Ici, 30 minutes de coloration étaient suffisantes pour assurer une séparation fiable des populations de cellules germinales ( Figure 3B- 3C ). La durée de la coloration peut être réduite à 10 minutes, comme l'ont montré Rodriguez-Casuriaga et al. 20 , et devraient être évalués par les utilisateurs pour les espèces d'intérêt.
Selon l'hypothèse, quatre populations de cellules germinales peuvent être constamment détectées - SPG, SPC I, SPC II et SPD - sur la base des variations de chromatine des cellules germinales des différentes espèces testées ( Figure 3B -3C Tableau 1 ) et supportent la stratégie de gating adoptée dans ce flux de travail ( Figure 1 ) pour différentes espèces de mammifères ( figures supplémentaires 2- 5 ). Il est néanmoins souhaitable que les utilisateurs optimisent le déclenchement selon les espèces et les populations d'intérêt afin de réduire la contamination croisée détectée pour certaines populations (tableau 1). Cela peut être réalisé par des périodes d'incubation plus longues pendant la coloration18 , débit réduit 2 et dimensions de porte réduite. SPG sont plus difficiles à isoler car ils sont le type de cellule le plus rare dans les testicules et aussi en raison de l'effacement du colorant au cours du temps 1 , 15 . Bien qu'il soit possible de détecter des populations SPG distinctes par Ho-FACS, comme le montrent ici, les études portant uniquement sur la biologie des cellules souches bénéficieront d'une technique plus stricte telle que le triage cellulaire à activation magnétique (MACS 23 ). Notamment, les sous-populations de SPD (eSPD et rSPD) peuvent être clairement distinguées pour le Chien mais pas pour d'autres espèces ( Figure 3C et Supplementary Figure 3). Potentiellement, ces sous-populations peuvent être résolues en ajustant les paramètres de verrouillage, comme l'ont décrit les auteurs pour la souris 5 . Cytogrammes générés pour la taille et la granularité des cellules (FSC VS SSC), avant de tracer la fonction de Hoechst bleu / rouge fluorescéNce, distingue l'allongement (faible FSC + SSC), des sous-populations spermatidaires rondes (FSC + SSC). La séparation des sous-populations de spermatites rondes et allongées permettrait une étude plus approfondie de la spermiogenèse, apportant de nouvelles idées sur des événements moléculaires spécifiques survenant lors de la différenciation des spermatozoïdes. En outre, comme décrit pour la souris 1 , 2 , 12 , il est possible d'obtenir une nouvelle résolution des étapes méiotiques, en ajustant les portes FACS. Une telle approche profiterait largement aux études comparatives sur les événements méiotiques. Bien que l'intégrité des cellules soit perturbée au cours de Ho-FACS, les données de séquençage d'ARN à une seule cellule obtenues pour les cellules triées avec cette méthode (Jung et al. , Inédits ; Supplémentaire Figure 6 ) indiquent qu'il s'agit d'une approche fiable pour obtenir des cellules pour des études moléculaires de cellules germinales la biologie. Néanmoins, les utilisateurs ont l'intention d'effectuer des tests de reproduction, tels que rL'injection de spermatides (ROSI), en utilisant des cellules isolées par Ho-FACS, doit évaluer la viabilité des cellules triées et souhaiter explorer d'autres méthodes 24 , 25 .
En résumé, ce travail décrit une méthode standardisée pour isoler les cellules germinales testiculaires de différents mammifères, construire et ajouter des raffinements sur les techniques établies précédemment 2 , 12 , 20 . Une telle standardisation permet l'utilisation d'un ensemble de réactifs et d'un flux de travail unique sur différentes espèces de mammifères, ce qui facilite la génération de données pour des études comparatives sur la biologie des germes. En outre, la dissociation mécanique des tissus surmonte l'obstacle des ajustements spécifiques aux espèces qui peuvent introduire une variabilité méthodologique qui est presque impossible à prendre en compte. En outre, la réduction du temps d'exécution et de la manipulation restreint les perturbations de l' ex vivo celLa physiologie lombaire à un minimum. À cet égard, Ho-FACS est significativement plus rapide par rapport aux autres méthodes d'isolement des cellules germinales, telles que STA-PUT et élutriation 6 , 7 . De plus, la séparation simultanée de 4 populations de germes dans la même expérience n'est possible que par FACS. Compte tenu des propriétés du colorant Hoechst, la structure cellulaire et les espèces d'ARN sont préservées et, par conséquent, les cellules peuvent être utilisées pour d'autres études moléculaires en aval. Il est important de noter que, puisque Ho-FACS repose sur les attributs de la chromatine pour discriminer les types de cellules germinales, la performance réussie de ce flux de travail dans 5 espèces différentes confirme fortement son application à d'autres mammifères. Les résultats présentés ici suggèrent que la spermatogenèse pourrait être un processus unique de différenciation cellulaire qui pourrait être abordé dans de nombreuses espèces de mammifères en utilisant un seul protocole. En tant que tel, dans l'ère "omics" et la biologie des systèmes, cette technologie fournit les moyens d'une application évolutiveSur les questions de la biologie des cellules germinales masculines, y compris des études sur l'épigénétique, la régulation et la diversité des protéines tout au long de la spermatogenèse.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l'hôpital Hillside Animal (St. Louis, MO) pour les testicules de chien; Jason Arand et le laboratoire du Dr Ted Cicero à l'Université de Washington à St. Louis (WashU) pour fournir des testicules de rat et Brianne Tabers pour aider à la collecte; Jared Hartsock et Dr. Salt's Lab à WashU pour les testicules de guinée; Et le Dr Michael Talcott à la Division de la médecine comparée chez WashU pour les testicules miniatures de porc. Les auteurs reconnaissent également le Alvin J. Siteman Cancer Center à la Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St. Louis, MO, pour l'utilisation de Siteman Flow Cytometry Core, qui a fourni un service de tri cellulaire. The Siteman Cancer Center est soutenu en partie par la subvention de soutien NCI Cancer Center # P30 CA91842.
Cette recherche a été financée par une bourse de doctorat de FCT [SFRH / BD / 51695/2011 à ACL], des subventions des National Institutes of Health des États-Unis [R01HD078641 et R01MH101810 à DFC] et un contrat de recherche FCT [IF / 01262/2014 à AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
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