Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare un modello di frattura di compressione vertebrale correlate all'osteoporosi del ratto nudo che possa essere valutati longitudinalmente in vivo utilizzando una semiautomatica microtomografia basati su tomografia quantitativa analisi strutturale.
Abstract
Fratture di compressione vertebrali correlate all'osteoporosi (OVCFs) sono un bisogno comune e clinicamente insoddisfatto con l'aumento di prevalenza come l'invecchiamento della popolazione mondiale. Modelli animali OVCF sono essenziali per lo sviluppo preclinico di strategie di ingegneria del tessuto traslazionale. Mentre attualmente esiste un numero di modelli, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per indurre difetti vertebrali altamente riproducibili multipli in un singolo ratto nudo. Una tomografia microtomografia semiautomatica longitudinale romanzo (µCT)-analisi strutturale quantitativa basata dei difetti vertebrali è anche dettagliato. Brevemente, i ratti erano imaged presso più tempo punti post-op. La scansione di giorno 1 è stata riorientata per una posizione standard, e un volume standard di interesse è stato definito. Scansioni successive µCT di ogni ratto sono stati registrati automaticamente alla scansione giorno 1 quindi lo stesso volume di interesse è stata poi analizzato per valutare per la formazione di nuovo osso. Questo approccio versatile può essere adattato ad una varietà di altri modelli dove analisi basate su formazione immagine longitudinale potrebbero beneficiare di preciso allineamento 3D semiautomatica. Presi insieme, questo protocollo descrive un sistema facilmente quantificabile e facilmente riproducibile per osteoporosi e ricerca. Il protocollo suggerito dura 4 mesi per indurre osteoporosi in ratti ovariectomizzati nudi e tra 2,7 e 4 h di generare, immagine e analizzare due difetti vertebrali, a seconda della dimensione del tessuto e attrezzature.
Introduction
Più di 200 milioni di persone nel mondo soffrono di osteoporosi1. Il sottostante patologica diminuzione nella densità minerale ossea (BMD) e microarchitettura ossea alterata aumentare la fragilità ossea e, di conseguenza, il rischio relativo di frattura2. L'osteoporosi è così prevalente e dannosa per la salute che l'OMS ha definito un problema importante di sanità pubblica. Inoltre, come la popolazione mondiale è previsto per età, l'osteoporosi è destinato a diventare ancora più comune.
Le fratture vertebrali osteoporotiche da compressione sono le più comuni fratture di fragilità, stimate a più di 750.000 all'anno negli Stati Uniti. Essi sono associati con la morbosità significativa e tanto come una mortalità più alta nove volte tasso3. Negli studi clinici, attualmente disponibili interventi chirurgici, come la vertebroplastica e Cifoplastica, sono stati trovati per non essere di più efficace di un finto trattamento4,5, lasciando solo gestione del dolore disponibile per questi pazienti. Poiché i trattamenti OVCF correnti sono limitati, è imperativo per sviluppare un modello animale che può replicare il disordine6,7,8. Tali modelli animali potrebbero facilitare sia l'indagine sui metodi di trattamento attuali e lo sviluppo di nuove terapie che si tradurranno in pratica clinica. L'osteoporosi è stata indotta e sostenuta in modelli animali attraverso la somministrazione di una dieta basso-calcio (LCD) in combinazione con l'ovariectomia1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. per modellare ulteriormente la perdita ossea associata OVCFs, difetti ossei vertebrali sono stati stabiliti in ratti immunocompetent osteoporotiche 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In questo lavoro, viene presentato un modello di difetto vertebrale dei ratti immunocompromessi con osteoporosi modellato. Questo nuovo modello consente di valutare le terapie basate sulle cellule che coinvolge le cellule staminali derivate da varie fonti e specie per la riparazione delle fratture difficili, ad esempio OVCFs.
Formazione immagine dell'osso è una parte cruciale della valutazione delle fratture e malattie delle ossa. Metodi di imaging avanzati sono stati sviluppati per la valutazione accurata dei cambiamenti strutturali dell'osso e rigenerazione strategie25. Fra loro, formazione immagine di µCT è emerso come un metodo non invasivo, facile da usare e poco costoso che fornisce immagini 3D ad alta risoluzione. Formazione immagine µCT presenta parecchi vantaggi sopra altre modalità nella valutazione di pazienti con osteoporosi, in quanto offre 3D ad alta risoluzione dell'osso microarchitettura26 che possono poi essere analizzati quantitativamente. Quest'ultimo può quindi essere utilizzato per confrontare gli effetti terapeutici dei trattamenti proposti. In vivo imaging µCT infatti un gold standard per la rigenerazione di difetti vertebrali monitoraggio1,16,27. Tuttavia, alcune pubblicazioni28,29,30,31 sono impiegati strumenti di registrazione automatizzati per ridurre al minimo l'utente-dipendenza, bias di interpolazione ed errore di precisione di µCT analisi basata su formazione immagine. Recentemente, siamo stati i primi ad utilizzare una procedura di registrazione per migliorare l'analisi della rigenerazione ossea in un osso standardizzato sub, come spiegato in questo protocollo32 .
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per studiare l'effetto delle terapie di cellula romanzo per OVCFs, unhindered dall'host di risposte a cellula T che potrebbero rifiutare le cellule allogeniche o xenogeniche. L'osteoporosi è indotto in ratti giovani attraverso l'ovariectomia (OVX) e 4 mesi di un LCD. La giovane età dei ratti OVX, combinato con il display LCD, ci ha permesso di raggiungere un basso picco di massa ossea, che imita l'osteoporosi postmenopausale conducendo alla perdita irreversibile dell'osso. Ciò può essere spiegato in parte dal fatto che, durante il display LCD e a circa 3 mesi di età, la transizione di ratti dall'osso modellazione al rimodellamento fase presso le vertebre lombari33, aumentando così la probabilità di mantenere l'osteoporosi nel tempo. Utilizzando animali giovani rende questo modello più conveniente, che costano meno. Tuttavia, è limitata intrinsecamente non tenendo conto i cambiamenti biologici all'animale di invecchiamento.
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Protocol
tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati nell'ambito di un protocollo approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) del Cedars-Sinai Medical Center (protocollo n. 3609). L'anestesia è stata amministrata per tutte le procedure chirurgiche e di imaging. Tutti gli animali sono stati alloggiati secondo protocolli approvati IACUC.
Nota: il disegno sperimentale del presente protocollo è illustrato nella Figura 1. L'acquisto di sei-settimana-vecchi ratti con loro ovaie chirurgicamente rimosso e dar loro da mangiare un LCD composto da fosfato di calcio e 0,77% 0.01%. Dopo un periodo di 4 mesi di un LCD, forare un difetto vertebrale dimensione critica i quarto e il quinto corpi vertebrali lombari (L4-L5). A seguito della chirurgia, della battuta i ratti il giorno 1 e settimane 2, 4, 8 e 12 dopo l'istituzione del difetto. Individuare difetti marginali sull'esplorazione del giorno 1, riorientare a una posizione standard e definire un volume cilindrico di interesse (VOI). Registrare automaticamente le scansioni successive µCT (cioè, per settimane 2, 4, 8 e 12) di ogni ratto alla posizione standard definita per la scansione di giorno 1 corrispondente. Applicare il giorno 1 predefiniti VOI le scansioni registrati. Valutare la densità di volume dell'osso e la densità apparente del VOIs.
1. induzione di osteoporosi
- messo sei-settimana-vecchio athymic ovariectomizzati ratti in 4 mesi di un LCD composto da fosfato di calcio e 0,77% 0.01%.
- Interruttore torna a una dieta normale.
Nota: Questi ratti saranno essere definiti come " osteoporotic ratti " seguito.
2. Vertebrale difetto modello
Nota: la sincronizzazione è 40-50 min per animale.
- Autoclave tutti chirurgica degli strumenti prima della chirurgia.
- Nel caso di interventi chirurgici multipli, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici.
- Lavare gli strumenti e metterli in una vasca da bagno sonicatore per 5 min metterli in un set di sterilizzatore tallone caldo a 250 ° C per 20 s. Consenti gli strumenti per raffreddare per 5 min.
- Indurre anestesia.
- Posto il ratto osteoporotico nella camera di induzione attaccato ad una macchina di anestesia con un sistema centrale di scavenging. Indurre l'anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100% e mantenere via cono di naso a 2-3% isoflurane. Usare pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Applicare uno stimolo di punta-pizzico per assicurare adeguato piano di anestesia. Se nessuna risposta è notata, avvia la procedura.
- Posto ratto anestetizzato in decubito dorsale su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) e allungare gli arti utilizzando un sistema di retrazione del fixator magnetico ( Figura 2A).
Nota: La temperatura del riscaldamento pad è importante per la prevenzione dell'ipotermia, poiché un ratto anestetizzato è in grado di regolare la sua temperatura corporea. - Radere la zona addominale utilizzando un rasoio elettrico. Tampone con base di iodio antisettico e clorexidina gluconato 0,5% seguito da etanolo al 70%.
- Iniettare il ratto con carprofen (5 mg/kg di peso corporeo (BW), sottocutaneo (SQ)) prima di iniziare la procedura chirurgica.
- Utilizzare un bisturi sterile per tagliare la pelle. Iniziare l'incisione 1 cm sotto il processo xifoideo e tagliare attraverso la linea mediana (~ 5-8 cm) ( Figura 2B).
- Utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione del aponeurosis attraverso la linea alba per accedere alla cavità addominale ( Figura 2).
- Esporre nella cavità addominale utilizzando divaricatori ( Figura 2D).
- Deviare l'intestino a destra del ratto per esporre l'aorta addominale ed il rene di sinistra ( Figura 2E). Palpare il rachide lombare prima di procedere per esporla. Per evitare la disidratazione, utilizzare garze sterili imbevute con soluzione salina sterile per avvolgere gli organi interni.
- Thermocautery uso per esporre a strati l'aspetto anteriore dei corpi vertebrali lombari L4-5 e isolarli dal tessuto connettivo e muscoli circostanti ( Figura 2F -G).
Nota: Thermocautery deve essere utilizzato per controllare l'emorragia durante la dissezione. - Utilizzare un tampone di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica sterile per rimuovere il tessuto sangue e residui da vertebre L4. Utilizzare una sterile Trephine trapano fresa (~ 2 mm di diametro) per forare un difetto di 5 mm di profondità dell'osso nel centro della funzione esposta anteriore del corpo vertebrale (Figura 2 H-I).
Nota: Esercitare una pressione minima di drill-through solo la corteccia ventrale e osso trabecular sottostante; evitare di forare attraverso la corteccia dorsale. Si noti che le vertebre dei ratti osteoporotiche sono molto fragili. Utilizzare un tampone di cotone per pulire il difetto ed applicare pressione per fermare l'emorragia, se presente. - Ripetere il punto 2.11 sulla vertebra L5 per creare un totale di 2 difetti per ratto ( Figura 2J).
- Restituire l'intestino nella cavità addominale.
- Utilizzare una sutura chirurgica riassorbibile sintetica vicryl (3-0 vicryl undyed 27 " SH cono) in un modello continuo per suturare l'aponeurosi ( Figura 2 K).
- Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile di monofilo in nylon 4-0 in un semplice schema interrotto ( Figura 2 L).
- Applicare 100 µ l di adesivo topico della pelle sopra le suture di pelle e tra loro per assicurare la chiusura completa della pelle.
- Iniettare il ratto con ringer lattato tiepida (37 ° C) ' soluzione di s (1CC/100 g P.C., SQ) per prevenire la disidratazione e ipotermia.
- Iniettare il ratto con buprenorfina (0,5 mg/kg BW, SQ) prima della chirurgia e ogni 8-12 h per alleviare il dolore post-operatorio come necessario.
- Non lasciare incustodito l'animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Inoltre, non restituiscono un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.
- Dopo l'animale ha recuperato il termocuscino, restituirlo alla sua gabbia.
Nota: Casa ratti individualmente (cioè, in gabbie separate) per impedire la mutilazione di ratto a ratto delle suture e ferita. - Posto chow imbevuto in acqua in una capsula Petri al piano di gabbia per postoperatorio pochi giorni aiutare i topi a raggiungere il cibo.
- Amministrare carprofen (5 mg/kg BW, SQ) post-operatorio di 24h per alleviare il dolore ogni 24 ore, se necessario.
- Rimuovere i punti di sutura della pelle mentre l'animale è inferiore al 2% isoflurane anestesia 10-14 giorni dopo l'intervento.
3. MicroCT scansione
Nota: la sincronizzazione è 30-40 min per animale.
- Il giorno successivo la procedura chirurgica, porre il ratto osteoporotico nella camera induzione collegata a una macchina di anestesia con un sistema centrale di scavenging. Indurre l'anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100% e mantenere via cono di naso a 2-3% isoflurane.
- Scan ratto utilizzando uno scanner µCT in vivo. Ripetere la scansione per l'analisi longitudinale di rigenerazione dell'osso.
Nota: Assicurarsi che tutti gli animali sono analizzati utilizzando le stesse impostazioni (cioè, energia a raggi x, scansione medio, l'intensità, voxel dimensioni e risoluzione dell'immagine) e in un similaorientamento di r. Ad esempio: energia dei raggi x, kVP 55; corrente, 145 µA; dimensione del voxel, 35 µm; incrementi, 115 µm; e tempo di integrazione, 200 ms; con gli esempi in PBS. Fare riferimento a Bouxtein et al. 34 per ulteriori spiegazioni e considerazioni coinvolti nel roditore µCT scansione per una valutazione della microstruttura dell'osso. Idealmente, la massima risoluzione di scansione disponibile sarebbe stata usata per tutte le scansioni; Tuttavia, scansioni ad alta risoluzione richiedono tempi più lunghi di acquisizione, generano grandi insiemi di dati ed espongono gli animali a più radiazione ionizzante. Quest'ultimo può introdurre effetti indesiderati, tra cui la guarigione della frattura in diminuzione. Pertanto, deve essere considerato attentamente il compromesso tra dati aggiuntivi e scansione tempo.
4. Vertebrale separazione
Nota: la tempistica è 20-30 min per esempio.
- Contorno della vertebra di interesse, come dimostrato in Figura 3A-I. Assicurati di includere tutte le parti della vertebra escludendo parti che appartengono a vertebre adiacenti.
- Fare clic su " programma di valutazione µCT " e selezionare il campione dal menu.
- Contorno ogni fetta con il mouse.
- Uso il " Z " barra per passare alla prossima sezione.
- Salvare la vertebra sagomata come un file separato ( Figura 3J -K) facendo clic sul " File " → " salvare GOBJ " ogni paio di fette.
5. definizione dei VOI per valutazione quantitativa longitudinale
Nota: I seguenti passaggi dipendono se la scansione è dal 1 ° giorno dopo la chirurgia (vertebra di riferimento) o dal momento successivo punti ( vertebre di destinazione).
- Vertebra riferimento.
Nota: La sincronizzazione è 20-30 min per campione.- Per Z-rotazione, misurare l'angolo dei margini utilizzando una XY-fetta al centro del difetto ( Figura 4A -B).
- Sul Z-aereo, andare nella zona della vertebra dove il difetto è più chiaro e schermo cattura la vertebra.
- In un software di presentazione, preparare un oggetto a forma di rettangolo che si adatta nel difetto.
- Ruotare l'immagine della vertebra, tale che il difetto sia rivolta verso l'alto e i margini del difetto sono paralleli ai lati del rettangolo.
- Misurare l'angolo di rotazione (tasto destro del mouse sull'immagine → " formato immagine " → " Dimensione ").
- Utilizzare l'angolo misurato per ruotare la vertebra ( Figura 4).
- Aprire una nuova finestra di DECterm (" Session manager " → " applicazioni " → " DECterm ").
- Eseguire " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -ingresso [in] >
- -uscita [out] >
- -turnaxis_angles [0.000 90,000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > angolo misurato
- -img_interpol_option [1] >
- Per X-rotazione, misurare l'angolo dei margini utilizzando una YZ-fetta al centro del difetto ( Figura 4 -E). Utilizzare l'angolo misurato per ruotare la vertebra ( Figura 4F).
- Fare clic su " YZ " in " programma di valutazione uCT " e ripetere i passaggi 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -aim_name [in] >
- -isq_filename [default_file_name] > inserire la directory del file ISQ (ad es., " DK0: [MICROCT. DATI. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -dim [-1 -1-1] >
- Flip la vertebra ruotata modificando il piano XY al piano ZX.
- Aprire una nuova finestra di DECterm (" Session manager " → " applicazioni " → " DECterm ").
- Eseguire " ipl ":
- Ipl > flip
- -ingresso [in] > fuori
- -ingresso [out] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- Definire il VOI.
- Draw una circolare contorno del difetto utilizzando una fetta al centro del difetto selezionando l'icona contorno circolare in " programma di valutazione uCT " ( Figura 6A). Copia di contorno e incollarlo su tutte le fette nel difetto ( Figura 6B).
Nota: Dal momento che tutti i difetti sono stati creati utilizzando la stessa procedura, analizzare lo stesso numero di fette e, successivamente, il volume totale (TV) per tutti i campioni.
- Draw una circolare contorno del difetto utilizzando una fetta al centro del difetto selezionando l'icona contorno circolare in " programma di valutazione uCT " ( Figura 6A). Copia di contorno e incollarlo su tutte le fette nel difetto ( Figura 6B).
- Per Z-rotazione, misurare l'angolo dei margini utilizzando una XY-fetta al centro del difetto ( Figura 4A -B).
- Vertebra target.
Nota: La sincronizzazione è 10-20 min per campione.- Carico il DICOM file di destinazione e le vertebre di riferimento alla finestra principale del software di analisi immagine.
Nota: Per evitare modifiche del valore in scala di grigi, definire lo stesso output tipo di dati come i file DICOM originali nel menu carico. - Registro al riferimento della vertebra.
- Lancio il " 3D Voxel registrazione " modulo e ingresso della vertebra di riferimento come il " Base Volume " e la vertebra di destinazione come il " partita Volume. " scegliere " registro " per registrare le vertebre ( Figura 5).
- Salvare i file registrati utilizzando gli stessi dati digitare e importarlo in un ambiente di µCT.
- Applicare il VOI.
- Applica la VOI definite per la vertebra di riferimento alla vertebra destinazione registrati cliccando " programma di valutazione uCT " → " File " → " carico GOBJ " e selezionando i GOBJ creato in precedenza. Verifica che i VOI e difetto sono concentrici.
- Carico il DICOM file di destinazione e le vertebre di riferimento alla finestra principale del software di analisi immagine.
6. MicroCT analisi
Nota: la tempistica è 10-20 min per esempio.
- Invia il VOI per valutazione utilizzando un programma di valutazione µCT ( Figura 6).
Nota: Assicurarsi di utilizzare gli stessi parametri quando si analizzano tutte le VOIs. Assicurarsi che la soglia è impostata abbastanza alta per omettere il rumore di fondo con una perdita minima di osso. Se viene utilizzato un biomateriale radiopaco, un certo numero di strategie potrebbe essere utilizzato per analizzare la formazione dell'osso. Se c'è una differenza di densità fra il tessuto dell'osso e biomateriali, il biomateriale poteva essere segmentato fuori 35 , 36. In caso contrario, gli investigatori qualitativamente potrebbero valutare le differenze nella formazione dell'osso fra gruppi sperimentali.
7. L'eutanasia
- PPlace ratto osteoporotico nella camera di induzione attaccato ad una macchina di anestesia. Inducono anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100%.
- Mantenere l'anestesia tramite cono di naso ed eseguire l'eutanasia di pungere la cavità toracica per produrre un pneumotorace bilaterale 37.
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Representative Results
Usando questo protocollo, è possibile immagine e quantificare la rigenerazione di n = 8 difetti vertebrali osteoporotici modellati attraverso diversi momenti. La corrispondenza anatomica ottenuta mediante la procedura di registrazione permette l'analisi dei VOI stessi tutti gli intervalli di tempo. Questo provoca un'analisi istomorfometriche 3D longitudinale altamente accurato, anche quando i margini del difetto originale non sono più riconoscibili. Abbiamo usato i cinque punti di tempo (giorno 1, 2a settimana, settimana 4, settimana 8 e 12 ° settimana) come esempio per la valutazione longitudinale della rigenerazione dell'osso (Figura 7). Rigenerazione può essere valutato sia dalla valutazione qualitativa delle sezioni 2D e 3D immagini (come illustrato in figura 7A) il confronto quantitativo della quantità di osso (BVD) e qualità (AD) (figura 7B). I seguenti indici morfometrici possono essere determinati per osso formato di recente: (i) TV, inclusi i volumi di osso e tessuti molli (TV, mm3); (ii) volume di tessuto mineralizzato (BV, mm3); (iii) dell'osso densità di volume (BV/TV); e la densità minerale ossea (iv) (BMD, idrossiapatite di mg per cm3). In particolare, formazione minima di osso (aumento del 5% nella densità ossea volume) è stata osservata 2 settimane dopo l'istituzione del difetto. Dopo due settimane, sono state osservate differenze significative nella formazione dell'osso rispetto ad intervalli di tempo successivi. Nel complesso, anche se c'era un certo grado di formazione dell'osso, che ha raggiunto il 10% circa di 8 settimane, è stato abbastanza minima per mantenere l'osso sub nel tempo.
Figura 1: protocollo Design. Vengono delineati i passaggi chiave nel protocollo. In primo luogo, ovariectomizzati nudi ratti sottoposti a quattro mesi di una dieta bassa del calcio (LCD) sono stati azionati su creare difetti critici di dimensioni standard in due corpi vertebrali lombari. I ratti erano imaged il giorno 1 e settimane 2, 4, 8 e 12 post-op. La scansione di giorno 1 è stata riorientata per una posizione standard, e a VOI cilindrico è stato definito usando i margini del difetto. Scansioni successive µCT di ogni ratto sono stati registrati automaticamente alla posizione standard definita per la scansione di giorno 1 corrispondente. Il giorno 1 predefiniti VOI quindi è stato applicato per le scansioni registrate. La densità di volume dell'osso e la densità apparente dei VOI sono stati usati per valutare la nuova formazione dell'osso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: chirurgia vertebrale difetto. Sono illustrati i passaggi principali nella generazione chirurgica dei difetti vertebrali. In primo luogo, i ratti sono stati disposti su un rilievo di riscaldamento (A). Un'incisione del midline è stata effettuata attraverso la pelle (B) e poi la linea alba (C) per esporre la cavità addominale (D). Gli intestini sono riflessi per esporre la parete addominale posteriore (E), e la colonna lombare è stato esposto utilizzando thermocautery (freccia, F-G). I difetti sono stati perforati nel quarto (H, freccia che punta verso il trapano; Io, la freccia che punta verso il difetto) e quinto (J, frecce che puntano a difetti) corpi vertebrali lombari. Infine, sono state suturate le aponeurosi (K) e la pelle (L). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vertebra separazione. Vengono illustrati i passaggi chiavi in contornatura di una vertebra di interesse. (A-io) Sono mostrati sagomato (linea verde) rappresentante fette 2D lungo l'asse di lunghezza di una vertebra. Una rappresentazione 3D del rachide completo (J) può essere paragonata alla vertebra separato (K). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: riferimento Vertebra posizionamento. Rappresentante fette su due piani sono mostrati di una vertebra, prima e dopo la rotazione per una posizione standard. In primo luogo, utilizzando un rappresentante XY-fetta (A), l'angolo (B, verde) necessaria per ruotare il difetto (B, Piazza rossa) a diventare parallelo all'asse y (B, giallo) è determinato e quindi utilizzato per creare l'immagine ruotata (C ). Quindi, utilizzando una rappresentante YZ-fetta (D), l'angolo (Everde) necessaria per ruotare il difetto (E, Piazza rossa) a diventare parallela all'asse z (Egiallo) è determinato e quindi utilizzato per creare l'immagine ruotata (F ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: destinazione Vertebra registrazione. Rappresentante fette a tre piani della destinazione vertebra (contrassegnato in verde) e la vertebra di riferimento (segnati in rosso) prima (A-C) e dopo (D-E) registrazione sono mostrati. Notare il colore giallo, che indica la sovrapposizione tra le vertebre di riferimento e di destinazione e le frecce bianche che puntano a verde dell'osso dopo la rigenerazione, che indica la formazione dell'osso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: analisi VOI. Rappresentante fette su due piani con il volume sagomato di interesse sono indicati. Un contorno circolare è posizionato al centro del difetto in un rappresentante ZX-fetta (A). Dopo tutte le ZX-fette di contorno, il volume di difetto completo può essere visto nel piano XY (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: analisi longitudinale di rigenerazione di difetti vertebrali. Sono mostrati i risultati dell'analisi qualitativa e quantitativa dell'osso rappresentante rigenerazione. (A), A difetto vertebrale rappresentativo a vari tempi è raffigurato in ogni pannello come un immagine 3D frontale (pannello superiore) con formazione dell'osso nel vuoto indicato in rosso, un'immagine 2D sagittale (pannello centrale) e un'immagine 2D assiale (pannello inferiore). È stata eseguita l'analisi quantitativa di formazione dell'osso nei vuoti. Volume di osso (B) e densità apparente (C) sono state calcolate e confrontate mediante un ripetute misure ANOVA a due vie con la correzione di Bonferroni per i confronti multipli. Le barre di errore rappresentano SEM. * * *-p < 0,0001. Per favore clicca quie per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Passaggi | Problema | Motivo possibile | Soluzione |
| 2.3 | Animale senza fiato in anestesia | Consegna di isoflurano in eccesso | Ridurre la concentrazione di isoflurane consegnata all'animale. |
| Animale risponde alla punta pizzico | Isoflurano insufficiente consegna | Aumentare la concentrazione di isoflurane. | |
| 2.7-2.12 | Forte sanguinamento | Danno vascolare | Utilizzare un tampone di cotone sterile per applicare pressione o cauterio per fermare l'emorragia. |
| L'animale ha difficoltà a respirare | Il diaframma è stato perforato | Eutanasia animale per evitare il soffocamento. | |
| Fuoriuscita del contenuto intestinale | Il tratto gastrointestinale è stato perforato | Eutanasia animale per evitare ulteriori complicazioni. Prevenirlo sollevando l'aponeurosi dal sottostante intestino prima del taglio. | |
| Sangue emerge dal sito di perforazione | È stato punto un vaso sanguigno | Applicare un tampone di cotone sterile fino al sanguinamento si ferma. | |
| Animale scuote improvvisamente durante la perforazione | Il trapano è andato troppo in profondità e danneggiato il midollo spinale | Eutanasia animale per evitare ulteriori complicazioni. | |
| Il difetto osseo sembra incompleto | Il trapano non andata abbastanza in profondità | Riposizionare la testa del trivello dentro il difetto e foratura profonda | |
| 2.15-2.24 | Interruzioni di sutura | La sutura è stata tirata troppo strettamente | Sostituire l'intera sutura. Se la rottura si verifica spesso, utilizzare una sutura più spessa di dimensioni. |
| Animale è lento a recuperare dall'anestesia | L'animale è ipotermico | Aumentare la temperatura del riscaldamento pad o applicare un'ulteriore fonte di riscaldamento (es. lampada di riscaldamento). | |
| Le suture sono aperte | Le suture sono state collocate liberamente, o l'animale ha fatto attività faticose | Riapplicare le suture e applicare del Dermabond direttamente per le suture e tra di loro. | |
| 3 | Immagine acquisita viene visualizzata con una risoluzione bassa, rumoroso o sparse | Parametri di scansione devono essere regolato | Regolare i parametri del protocollo scansione. Fare riferimento a Bouxsein et per altre linee guida per la scansione. |
| Immagine acquisita appare sfocata | L'animale si trasferì durante il processo di scansione | Ripetere l'analisi l'animale. Se il movimento continua, aumentare la concentrazione di isoflurane. | |
| 5 | La registrazione della vertebra di destinazione non ha avuto successo | Vertebrale separazione non è stato fatto correttamente | Recontour la vertebra: assicurarsi che tutte le parti della vertebra sono incluse ed escludono qualsiasi strutture adiacenti. |
| Grande differenza nel posizionamento delle vertebre | Riposizionare la vertebra di destinazione nello stesso orientamento della vertebra di riferimento utilizzando rotazioni e flip (passo 29A). | ||
| Analizzare non riconosce correttamente le strutture ossee | Applicare una soglia nel modulo di registrazione per rimuovere il rumore di fondo da campioni di ossa. | ||
| Le vertebre registrate sono diverse | Creare immagini 3d dei vostri campioni e abbinare le vertebre corrette attraverso i punti di tempo diversi. | ||
| 6 | Il volume totale (TV) è diverso tra i campioni | È stato utilizzato un diverso numero di fette o un contorno diverso | Assicurarsi di utilizzare sempre la stessa dimensione di contorno e lo stesso numero di fette. |
| Valore di densità minerale (BMD) dell'osso è anormale | Taratura inadeguata di microCT | Calibrare la microCT per gli standard di idrossiapatite corretta |
Tabella 1: risoluzione dei problemi. Possibili problemi e soluzioni sono presentati per i diversi passaggi nel protocollo.
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Discussion
L'osteoporosi è la causa più prevalente delle fratture vertebrali da compressione causata da un aumento del carico sulla colonna vertebrale e che provocano il collasso del corpo vertebrale. Tuttavia, è praticamente impossibile generare una ferita in un roditore che autenticamente replica un simile crollo vertebrale. Invece, i ricercatori creano un vuoto cilindrico al centro del corpo vertebrale per imitare OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. poiché non vi è alcuna coerenza nella letteratura in termini di dimensione del difetto, un difetto critico e medie è stato definito come uno che non guariscono spontaneamente completamente senza un intervento entro 3 mesi post-op16,17.
Anche se il metodo di combinare l'ovariectomia con un LCD per indurre rapidamente l'osteoporosi era precedentemente pubblicati1,13, siamo stati i primi a mostrare che l'applicazione di questo approccio ai risultati di ratti athymic in un efficiente, rapido, e irreversibile diminuzione vertebrale dell'osso trabecular volume e minerale densità40. Si tratta di un modello riproducibile di piccoli animali che è senza ostacoli dal sistema immunitario del roditore e che non hanno bisogno di aggiunto immunosoppressione, come utilizzato da altri24.
Il nostro protocollo chirurgico generato più identici difetti vertebrali lombari critico40. Ciò provoca difetti altamente coerenti e facilmente comparabili e quantificabili attraverso gli animali. Noi crediamo che difetti prodotti utilizzando questo approccio sono superiori ai difetti vertebrali modelli generati in vertebre caudali1,19,41 , perché la coda di topo è sottoposto a forze biomeccaniche che sono significativamente diverse da quelle che coinvolgono il rachide lombare di ratto.
Fasi critiche all'interno di questo protocollo includono evitando l'ipotermia intraoperatoria e tenendo cautela quando le vertebre fragili dei ratti ovariectomizzati nudi di perforazione dopo un LCD. Dopo aver generato il difetto vertebrale, è monitorato tramite una sequenza temporale di in vivo µCT scansioni a intervalli di tempo impostato per la valutazione longitudinale della riparazione ossea. Mantenendo le stesse impostazioni di scansione è fondamentale. Le vertebre sono quindi sagomate e separate dal resto della scansione. Che contorna un volume totale identico per tutte le scansioni di una vertebra ed evitare modifiche di valore in scala di grigi sono critici. Un commercialmente disponibili più algoritmo di registrazione dell'immagine facilita l'estrazione di previsione anatomicamente corrispondente VOIs a tutti i punti di tempo successivi. Infine, questi VOIs sono analizzati per volume osseo, densità apparente, ecc. È fondamentale per analizzare tutte le VOIs utilizzando gli stessi parametri. Questa tecnica fornisce un'analisi estremamente accurato e semplice longitudinale µCT 3D che non è utente-dipendente.
Questo metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi analisi di rigenerazione del difetto longitudinale dell'osso. Il modello di difetto vertebrale utilizzato qui è un modello conveniente per questa applicazione, come la sua struttura ossea è unico e può essere facilmente registrato nella stessa posizione anatomica. Tuttavia, qualsiasi rigenerazione dell'osso potrebbe essere analizzata sotto le stesse condizioni separando correttamente l'osso stesso di interesse durante le scansioni longitudinale. È imperativo per includere campioni separati dell'osso con le stesse caratteristiche anatomiche. Questo potenziale problema e gli altri sono descritte in tabella 1, con le possibili cause e soluzioni suggerite. La corrispondenza anatomica ottenuta mediante la procedura di registrazione può avvenire solo se gli esempi includono le stesse caratteristiche anatomiche. La registrazione consentirà all'utente di applicare l'esatto VOI predefiniti della prima scansione a tutti i rimanenti punti di tempo, risultante in un'analisi istomorfometriche 3D estremamente preciso nel tempo. Densità di volume osseo e densità apparente dei VOI può essere utilizzati per valutare la nuova formazione dell'osso.
Mentre potenzialmente ampiamente applicabile, il modello qui presentato non è senza limitazioni. L'uso di topi nudi athymic potrebbe essere considerato una limitazione, come esso potrebbe mascherare alcuni processi immuno-mediata che possono essere di importanza alla rigenerazione. In secondo luogo, modellazione osteoporosi attraverso una combinazione di ovariectomia e uno schermo LCD in giovani ratti, come precedentemente pubblicati1,13, è limitato nella sua capacità di imitare la biologia della popolazione di pazienti anziana. In terzo luogo, OVCFs sono stati modellati da una procedura chirurgica, come gli altri animali solo avere fratture correlate all'osteoporosi sono primati42. Infine, mentre il topo lombare della colonna vertebrale è il migliore modello disponibile per la colonna vertebrale lombare umana — dove si sviluppano la maggior parte delle fratture vertebrale — la mancanza di peso assiale del cuscinetto nella spina dorsale del roditore è anche una limitazione.
Questo protocollo è modulare e pertanto può essere facilmente modificato alle esigenze del ricercatore. Ad esempio, i topi athymic ovariectomizzati potrebbero essere usati per studiare altre fratture correlate all'osteoporosi. Se un ricercatore sceglie di utilizzare il nostro approccio alla analisi di rigenerazione dell'osso semiautomatica, potrebbe essere applicato a qualsiasi modello di frattura utilizzando strutturale longitudinale di imaging, non necessariamente micro-tomografia computerizzata. Inoltre, ulteriori informazioni potrebbero essere raccolti utilizzando contemporaneamente ulteriori modalità di imaging come la risonanza magnetica.
Il modello OVCF presentato in questo protocollo potrebbe essere utilizzato per lo studio di nuovi approcci terapeutici per questa esigenza insoddisfatta clinicamente. Inoltre, il nostro approccio di analisi semiautomatica può essere utilizzato con successo per eseguire un'analisi simile che è meno dipendente dall'utente e fornisce la migliore precisione di altri metodi16. Particolarmente degno di nota è il fatto che abbiamo usato software di visualizzazione e l'analisi disponibile in commercio che può essere utilizzato da qualsiasi ricercatore — software che supporta ulteriori modalità di imaging, imaging a risonanza magnetica e imaging nucleare. Pertanto, riteniamo che questo metodo è altamente generalizzabile ed è limitato solo dalla disponibilità di software di registrazione e funzionalità di imaging in vivo .
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Disclosures
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Acknowledgments
La ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
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