Summary
O objetivo do presente protocolo é gerar um modelo de fratura de compressão vertebral osteoporose-relacionados do rato nude que pode ser avaliada no sentido longitudinal na vivo usando uma microcomputed semiautomated baseado em tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural.
Abstract
Fraturas por compressão vertebral relacionadas com osteoporose (OVCFs) são uma necessidade comum e clinicamente não satisfeita com o aumento da prevalência, como a população do mundo envelhece. Modelos animais de OVCF são essenciais ao desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecido translacional pré-clínicos. Enquanto um número de modelos existe atualmente, este protocolo descreve um método otimizado para induzir defeitos vertebrais altamente reprodutíveis múltiplos em um único rato nude. Uma tomografia computadorizada romance longitudinal semiautomated microcomputed (µCT)-com base quantitativa análise estrutural dos defeitos vertebrais também é detalhado. Brevemente, ratos foram fotografados em vários pontos de tempo no pós-operatório. O exame de dia 1 foi reorientado para uma posição padrão, e um volume padrão de interesse foi definido. Exames subsequentes µCT de cada rato foram registrados automaticamente para a digitalização de dia 1 para que o mesmo volume de interesse foi então analisado para avaliar para formação de osso novo. Esta abordagem versátil pode ser adaptada a uma variedade de outros modelos em análise baseada em imagem longitudinal poderia beneficiar de alinhamento preciso de semiautomated 3D. Tomados em conjunto, este protocolo descreve um sistema facilmente quantificável e facilmente reproduzível para pesquisa de osteoporose e osso. O protocolo sugerido demora 4 meses para induzir a osteoporose em ratos ovariectomizados nus e entre 2,7 e 4 h para gerar, de imagem e analisar dois defeitos vertebrais, dependendo do tamanho do tecido e equipamento.
Introduction
Mais de 200 milhões de pessoas no mundo sofrem de osteoporose1. O patológico subjacente à diminuição de densidade mineral óssea (DMO) e microarquitetura óssea alterada aumentar a fragilidade óssea e, consequentemente, o risco relativo de fratura2. A osteoporose é tão prevalente e prejudiciais à saúde que a OMS definiu uma preocupação de saúde pública. Além disso, como a população do mundo é esperada para a idade, osteoporose deverá tornar-se ainda mais comum.
Fraturas osteoporóticas vertebrais de compressão são as fraturas de fragilidade mais comuns, estimadas em mais de 750.000 por ano nos Estados Unidos. Eles são associados com morbidade significativa e tanto como uma mortalidade de nove vezes maior taxa3. Em ensaios clínicos, actualmente disponíveis intervenções cirúrgicas, tais como Vertebroplastia e kyphoplasty, foram encontradas para ser sem mais eficaz do que uma farsa tratamento4,5, deixando apenas dor de gestão disponível para estes pacientes. Desde tratamentos OVCF atuais são limitados, é imperativo desenvolver um modelo animal que pode se replicar o transtorno6,7,8. Tais modelos animais poderiam facilitar tanto a investigação de métodos de tratamento atual e o desenvolvimento de novas terapias que irá traduzir na prática clínica. Osteoporose tem sido induzida e sustentada em animais modelo através da administração de uma dieta de baixa-cálcio (LCD) em conjunto com o grupo osteopênico1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. para modelar ainda mais a perda óssea associada com OVCFs, defeitos ósseos vertebrais foram estabelecidos em ratos imunocompetentes osteoporóticas 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. Neste trabalho, é apresentado um modelo de defeito vertebral de ratos imunodeprimidos com osteoporose modelado. Este novo modelo pode ser usado para avaliar terapias baseadas em células envolvendo células-tronco derivadas de várias fontes e espécies para a reparação das fraturas desafiadoras, tais como OVCFs.
Imagem de osso é uma parte crucial da avaliação das fraturas e doenças ósseas. Métodos de imagem avançados foram desenvolvidos para a avaliação precisa das alterações estruturais do osso e de estratégias de regeneração25. Entre eles, a imagem de µCT tem emergido como um método não-invasivo, fácil de usar e barato que fornece imagens 3D de alta resolução. Imagem de µCT tem várias vantagens sobre outras modalidades na avaliação de pacientes de osteoporose, pois oferece 3D de alta resolução de osso microarquitetura26 que podem então ser analisados quantitativamente. Este último então pode ser usado para comparar os efeitos terapêuticos dos tratamentos propostos. Com efeito, na vivo imagem µCT é um padrão-ouro para a regeneração do defeito vertebral monitoramento de16,1,27. No entanto, poucas publicações28,29,30,31 têm empregado ferramentas de registo automatizado para minimizar o erro de precisão de µCT, viés de interpolação e usuário-dependência análise baseada em imagem. Recentemente, fomos os primeiros a usar um processo de registo para melhorar a análise da regeneração óssea em um osso padronizada vazio, conforme explicado no presente protocolo32 .
O método descrito aqui pode ser usado para estudar o efeito das terapias celulares romance OVCFs, desimpedido pelo host respostas de células T que podem rejeitar xenogénicas ou alogênico de células. Osteoporose é induzida em ratos jovens através de ovariectomia (OVX) e 4 meses de um LCD. A tenra idade dos ratos OVX, combinado com o LCD, nos permitiu alcançar uma massa óssea de pico baixo, imitando a osteoporose pós-menopausa por levando a perda óssea irreversível. Isto pode ser explicado em parte pelo fato de que, durante o LCD e a cerca de 3 meses de idade, a transição de ratos de modelagem para remodelar o osso fase nas vértebras lombares33, aumentando assim a probabilidade de manutenção a osteoporose está na hora. Usar animais jovens torna este modelo mais custo-eficaz, como custam menos. No entanto, é limitada pela inerentemente não contabilizar as alterações biológicas do animal de envelhecimento.
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Protocol
todas as experiências em animais foram realizadas sob um protocolo aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) do Cedars-Sinai Medical Center (protocolo # 3609) e institucional Cuidado Animal. A anestesia foi administrada para todos os procedimentos cirúrgicos e de imagem. Todos os animais estavam alojados em conformidade com protocolos aprovados IACUC.
Nota: O desenho experimental do presente protocolo é mostrado na Figura 1. Comprar ratos de seis semanas de idade com seus ovários cirurgicamente removido e alimentá-los um LCD consistindo de fosfato de cálcio e 0,77% de 0,01%. Após um período de 4 meses de um LCD, perfure um defeito vertebral de tamanho crítico na quarto e quinto lombares corpos vertebrais (L4-L5). Após a cirurgia, os ratos da imagem no dia 1 e semanas 2, 4, 8 e 12 após o estabelecimento do defeito. Localizar o defeito margens sobre o exame de dia 1, reorientar-se para uma posição padrão e definir um volume cilíndrico de interesse (VOI). Registre automaticamente os exames subsequentes µCT (i.e., semanas 2, 4, 8 e 12) de cada rato para a posição padrão definido para a pesquisa correspondente do dia 1. Aplicam-se no dia 1 predefinidos VOI para os exames cadastrados. Avaliar a densidade dos ossos volume e densidade aparente das VOIs.
1. indução da osteoporose
- colocar ratos de seis semanas de idade modelo ovariectomia em 4 meses de um LCD consistindo de fosfato de cálcio e 0,77% 0.01%.
- Interruptor de volta a uma dieta normal.
Nota: Estes ratos serão referidos como " ratos osteoporóticos " daqui por diante.
2. Modelo de defeito vertebral
Nota: O momento é de 40-50 min por animal.
- Autoclave tudo cirúrgico antes da cirurgia de ferramentas.
- No caso de múltiplas cirurgias, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos.
- Lavar as ferramentas e colocá-los em um banho do sonicador para 5 min. Coloque-os em um conjunto de esterilizador de grânulo quente a 250 ° C, para 20 s. permitir as ferramentas para esfriar por 5 min.
- Induzir anestesia.
- Lugar o rato osteoporótica na câmara de indução anexado a uma máquina de anestesia, com um sistema central de eliminação. Induzir anestesia usando 5% de isoflurano em 100% de oxigênio e manter através do cone de nariz em 2-3% de isoflurano. Use o vet pomada sobre os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
- Aplicar um estímulo de dedo-pinch para garantir um plano adequado de anestesia. Se nenhuma resposta é observada, dar início ao procedimento.
- Coloque o rato anestesiado em prostração dorsal em uma almofada de aquecimento (37 ° C) e esticar os membros usando um sistema de retração do fixador magnético ( Figura 2A).
Nota: A temperatura do aquecimento pad é importante para a prevenção da hipotermia, desde um rato anestesiado é incapaz de regular sua temperatura de corpo. - Raspar a região abdominal usando um barbeador elétrico. Amostra com gluconato de anti-séptico e clorexidina à base de iodo 0,5%, seguido por etanol a 70%.
- Injetar o rato com o carprofeno (5 mg/kg de peso corporal (BW), subcutânea (SQ)) antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
- Usar um bisturi estéril para cortar a pele. Começar a incisão de 1 cm abaixo do processo xifoide e corte através da linha mediana (~ 5-8 cm) ( Figura 2B).
- Use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão da aponeurose através da linea alba para acessar a cavidade abdominal ( Figura 2).
- Expor a cavidade abdominal utilizando retractores ( Figura 2D).
- Desviar os intestinos para o direito do rato para expor a aorta abdominal e o rim esquerdo ( Figura 2E). Palpe a coluna lombar antes de prosseguir para expô-la. Para evitar a desidratação, use gazes estéreis com solução salina estéril para envolver os órgãos internos.
- Thermocautery de uso para expor em camadas na face anterior dos corpos vertebrais lombares L4-5 e isolá-los do tecido conjuntivo circundante e os músculos ( Figura 2F -G).
Nota: Thermocautery deve ser usado para controlar o sangramento durante a dissecção. - Usar um cotonete estéril saturado com solução salina estéril para remover tecido sangue e residual da vértebra L4. Use uma broca de broca trefina estéril (~ 2 mm de diâmetro) para perfurar um defeito de 5 milímetros de profundidade de osso no centro do aspecto anterior do corpo vertebral exposto (Figura 2 H-eu).
Nota: Aplique pressão mínima para perfurar apenas o córtex ventral e osso trabecular subjacente; Evite perfurar através do córtex dorsal. Note que as vértebras osteoporóticas ratos são muito frágeis. Use um cotonete para limpar o defeito e aplique pressão para parar o sangramento, se presente. - Repita o passo 2.11 na vértebra L5 para criar um total de 2 defeitos por rato ( Figura 2J).
- Retorno do intestino para a cavidade abdominal.
- Usar uma sutura vicryl sintética absorvível cirúrgica (3-0 vicryl undyed 27 " SH conicidade) em um padrão contínuo de suturar a aponeurose ( Figura 2 K).
- Fechar a pele usando uma sutura não absorvível de nylon 4-0 monofilamento em um padrão simples interrompido ( Figura 2 L).
- Aplicam-se 100 µ l de adesivo de pele tópica sobre as suturas de pele e entre eles para garantir o encerramento total da pele.
- Injetar o rato alimentado a soro morno (37 ° C) ' s solução (1CC/100g BW, SQ) para prevenir a hipotermia e desidratação.
- Injetar o rato com buprenorfina (0,5 mg/kg BW, SQ) antes da cirurgia e a cada 8-12 h para alívio da dor pós-operatória, conforme necessário.
- Não abandone o animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Além disso, não retornam um animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.
- Depois que o animal se recuperou na rampa de aquecimento, devolvê-lo à sua jaula.
Nota: Os ratos da casa individualmente (ou seja, em gaiolas separadas) para evitar a mutilação do rato-de-rato das suturas e ferir. - Coloque chow embebido em água em um prato de Petri no piso da gaiola para alguns dias depois da operação ajudar os ratos a chegar a comida.
- Administrar carprofeno (5 mg/kg BW, SQ) 24 h depois da cirurgia para alívio da dor cada 24 h, conforme necessário.
- Remover as suturas de pele, enquanto o animal está abaixo dos 2% isoflurano anestesia 10-14 dias pós operação.
3. Digitalização MicroCT
Nota: O momento é de 30-40 min por animal.
- No dia seguinte ao procedimento cirúrgico, colocar o rato osteoporótica na câmara de indução, ligada a uma máquina de anestesia, com um sistema central de eliminação. Induzir a anestesia usando 5% de isoflurano em 100% de oxigênio e manter através do cone de nariz em 2-3% de isoflurano.
- Digitalização usando um scanner na vivo µCT o rato. Repita a verificação para a análise longitudinal da regeneração óssea.
Nota: Certifique-se de que todos os animais são digitalizados usando as mesmas configurações (ou seja, energia de raios-x, digitalização, meio, intensidade, tamanho de voxel e resolução da imagem) e em uma similaorientação de r. Por exemplo: energia de raios-x, 55 kVP; corrente, 145 µA; tamanho de VOXEL, 35 µm; incrementos, 115 µm; e o tempo de integração, 200 ms; com as amostras em PBS. Referir-Bouxtein et al. 34 para mais explicações e considerações envolvidas em roedores µCT digitalização para uma avaliação da microestrutura do osso. Idealmente, a mais alta resolução de varredura disponível seria usada para todos os exames; no entanto, exames de alta resolução exigem tempos de aquisição mais, geram grandes conjuntos de dados e expõem os animais a mais radiações ionizantes. Este último pode apresentar efeitos indesejados, incluindo a consolidação da fratura diminuiu. Portanto, a compensação entre dados adicionais e o tempo de verificação deverão ser cuidadosamente considerada.
4. Separação vertebral
Nota: O momento é de 20-30 min por exemplo.
- Contorno da vértebra de interesse, como demonstrado na Figura 3A-I. Certifique-se de incluir todas as peças da vértebra excluindo partes que pertencem a vértebras adjacentes.
- Clique em " programa de avaliação de µCT " e selecionar a amostra no menu.
- Contorno cada fatia usando o mouse.
- Uso o " Z " bar para ir para a próxima fatia.
- Salve a vértebra contorneada como um arquivo separado ( Figura 3J -K) clicando no " arquivo " → " GOBJ salvar " cada duas fatias.
5. Definição da VOI para avaliação quantitativa Longitudinal
Nota: as etapas a seguir dependem se o exame é de 1 dia após a cirurgia (vértebra de referência) ou do tempo subsequentes pontos ( alvo de vértebras).
- Vértebra referência.
Nota: O momento é de 20-30 min por amostra.- Z-rotação, medir o ângulo das margens usando uma XY-fatia do centro do defeito ( Figura 4A -B).
- No Z-plano, vá para a área da vértebra onde o defeito é mais clara e tela captura vértebra.
- Em um software de apresentação, preparar um objeto em forma de retângulo que caiba o defeito.
- Girar a imagem da vértebra de tal forma que o defeito virada para cima e as margens do defeito são paralelas aos lados do retângulo.
- Medir o ângulo de rotação (botão direito do mouse sobre a imagem → " formato imagens " → " tamanho ").
- Usar o ângulo medido para girar a vértebra ( Figura 4).
- Abrir uma nova janela de DECterm (" Gerenciador de sessão " → " aplicações " → " DECterm ").
- Executar " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -entrada [em] >
- -saída [out] >
- -turnaxis_angles [0.000 90,000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > ângulo medido
- -img_interpol_option [1] >
- Para X-rotação, medir o ângulo das margens usando uma YZ-fatia do centro do defeito ( Figura 4 -E). Use o ângulo medido para girar a vértebra ( Figura 4F).
- Clique em " YZ " em " programa de avaliação da uCT " e repita etapas 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -aim_name [em] >
- -isq_filename [default_file_name] > inserir o diretório de arquivo do CEI (por exemplo, " DK0: [MICROCT. DADOS. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. CEI ")
- -pos [0 0 0] >
- -dim [-1-1 -1] >
- Flip girada vértebra, alterando o plano XY para o ZX-avião.
- Abrir uma nova janela de DECterm (" Gerenciador de sessão " → " aplicações " → " DECterm ").
- Executar " ipl ":
- Ipl > virar
- -entrada [em] > fora
- -entrada [saída] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- Define o VOI.
- Desenhar uma circular contorno do defeito usando um pedaço do centro do defeito, selecionando o ícone de contorno circular em " programa de avaliação da uCT " ( figura 6A). Cópia que contorno e colá-lo em todas as fatias do defeito ( Figura 6B).
Nota: Uma vez que todos os defeitos foram criados usando o mesmo procedimento, analisar o mesmo número de fatias e, posteriormente, o volume total (TV) para todas as amostras.
- Desenhar uma circular contorno do defeito usando um pedaço do centro do defeito, selecionando o ícone de contorno circular em " programa de avaliação da uCT " ( figura 6A). Cópia que contorno e colá-lo em todas as fatias do defeito ( Figura 6B).
- Z-rotação, medir o ângulo das margens usando uma XY-fatia do centro do defeito ( Figura 4A -B).
- Vértebra alvo.
Nota: O momento é de 10-20 min por amostra.- Carga a DICOM arquivos de destino e as vértebras de referência para a janela principal do software de análise de imagem.
Nota: Para evitar alterações de valor de tons de cinza, definir o mesmo tipo de saída dados como os originais arquivos DICOM no menu carga. - Registrar a referência de vértebra.
- Lançamento o " 3D Voxel registo " módulo e entrada da vértebra de referência como o " Base Volume " e a vértebra alvo como o " combinam Volume. " clique " registrar " para registrar as vértebras ( Figura 5).
- Salvar o arquivo registrado usando os mesmos dados digite e importação-lo para um ambiente de µCT.
- Aplicar o VOI.
- Aplicar a VOI definidos para a vértebra de referência para a vértebra alvo registrado clicando " programa de avaliação da uCT " → " arquivo " → " GOBJ de carga " e selecionando o GOBJ criado anteriormente. Verifique o VOI e defeito são concêntricos.
- Carga a DICOM arquivos de destino e as vértebras de referência para a janela principal do software de análise de imagem.
6. Análise de MicroCT
Nota: O momento é de 10-20 min por exemplo.
- Enviar o VOI para avaliação utilizando um programa de avaliação de µCT ( Figura 6).
Nota: Certifique-se de usar os mesmos parâmetros quando analisando todos VOIs. Certifique-se que o limite é definido alto o suficiente para omitir o ruído de fundo com mínima perda de osso. Se for usado um biomaterial radiopaco, um número de estratégias pode ser usado para analisar a formação óssea. Se houver uma diferença de densidade entre o biomaterial e osso tecido, o biomaterial poderia ser segmentado por 35 , 36. Caso contrário, os investigadores qualitativamente poderiam avaliar as diferenças na formação de osso entre grupos experimentais.
7. Eutanásia
- lugar o rato osteoporótica na câmara de indução ligado a uma máquina de anestesia. Induzir anestesia usando 5% de isoflurano em oxigênio a 100%.
- Manter a anestesia através do cone de nariz e realizar eutanásia por incisão no tórax para produzir um pneumotórax bilateral 37.
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Representative Results
Usando este protocolo, pode-se imagem e quantificar a regeneração de n = 8 modelados osteoporóticos vertebrais defeitos através de pontos de tempo diferentes. O jogo anatômico obtido pelo processo de registo permite a análise do mesmo VOI em todos os pontos de tempo. Isso resulta em uma análise histomorfométrica 3D longitudinal altamente precisos, mesmo quando as margens do defeito original já não são reconhecíveis. Usamos cinco pontos de tempo (dia 1, semana 2, semana 4, semana 8 e semana 12) como um exemplo para a avaliação longitudinal da regeneração óssea (Figura 7). Regeneração pode ser avaliada pela avaliação qualitativa de secções transversais 2D e 3D imagens (como ilustrado na Figura 7A) e pela comparação quantitativa da quantidade de osso (BVD) e qualidade (AD) (Figura 7B). Os seguintes índices morfométricos podem ser determinados por osso recém-formado: (i) TV, incluindo volumes de osso e tecido mole (TV, mm3); (ii) volume de tecido mineralizado (BV, mm3); (iii) osso densidade de volume (BV/TV); e (iv) a densidade mineral óssea (DMO, hidroxiapatita mg por cm3). Especificamente, formação óssea mínima (5% de aumento na densidade de volume ósseo) observou-se 2 semanas após o estabelecimento do defeito. Depois de duas semanas, não houve diferença significativa na formação óssea foram observada quando comparado com os pontos de tempo mais tarde. No geral, embora tenha havido algum grau de formação de osso, que atingiu um pico de cerca de 10% por semana 8, foi mínimo suficiente para manter o osso vazio ao longo do tempo.
Figura 1: protocolo Design. São descritas as principais etapas do protocolo. Em primeiro lugar, ovariectomizados nus ratos submetidos a quatro meses de uma dieta baixa de cálcio (LCD) foram operados para criar defeitos críticos de tamanho padrão em dois corpos vertebrais lombares. Os ratos foram fotografados no dia 1 e pós-operatório semanas 2, 4, 8 e 12. A verificação de dia 1 foi reorientada para uma posição padrão, e uma cilíndrica VOI foi definida usando as margens do defeito. Exames µCT subsequentes de cada rato registraram-se automaticamente para a posição padrão definida para a pesquisa correspondente do dia 1. No dia que 1 VOI predefinido aplicou-se então para os exames cadastrados. A densidade de volume do osso e densidade aparente do VOI foram usados para avaliar a formação de osso novo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cirurgia do defeito Vertebral. As principais etapas na geração cirúrgica de defeitos vertebrais são ilustradas. Primeiro, os ratos foram colocados sobre uma almofada de aquecimento (A). Uma incisão foi feita através da pele (B) e, em seguida, a linea alba (C) para expor a cavidade abdominal (D). Os intestinos foram refletidos para expor a parede abdominal posterior (E), e a coluna lombar foi exposta usando thermocautery (seta, F-G). Defeitos foram perfurados na quarta (H, seta a apontar para a broca; Eu, a seta apontando para o defeito) e quinta (J, setas apontando para defeitos) corpos vertebrais lombares. Finalmente, a aponeurose (K) e a pele (L) foram suturados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: separação de vértebra. As principais etapas no contorno de uma vértebra de interesse são mostradas. (A-eu) Contornos (linha verde) representante fatias 2D ao longo do eixo de comprimento de uma vértebra são mostradas. Uma representação em 3D da coluna total (J) pode ser comparada da vértebra separada (K). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: referência a vértebra posicionamento. Fatias representativas em dois aviões são mostradas de uma vértebra, antes e após a rotação para uma posição padrão. Primeiro, usar um representante XY-fatia (A), o ângulo (B, verde) necessário para rodar o defeito (B, Praça vermelha) tornar-se paralelo ao eixo y (B, amarela) é determinado e usado para criar a imagem girada (C ). Em seguida, usando uma representante YZ-fatia (D), o ângulo (E, verde) necessário para rodar o defeito (E, Praça vermelha) tornar-se paralelo ao eixo z (E, amarelo) é determinado e usado para criar a imagem girada (F ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: alvo vértebra registro. Fatias representativas em três planos da vértebra alvo (marcado em verde) e vértebra de referência (marcado em vermelho) antes de (A-C) e depois de registro (D-E) são mostrados. Observe a cor amarela, indicando a sobreposição entre o alvo e referência de vértebras e as brancas setas que apontam para osso verde após a regeneração, indicando a formação óssea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: análise VOI. Fatias representativas em dois aviões com o volume de contorno de interesse são mostradas. Um contorno circular está posicionado no centro do defeito em um representante ZX-fatia (A). Após todos os ZX-fatias de contorno, o volume de defeito completo pode ser visto no plano XY (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: análise Longitudinal da regeneração do defeito Vertebral. Resultados da análise qualitativa e quantitativa de osso representativa regeneração são mostrados. (A), A representante defeito vertebral em vários pontos de tempo é retratado em cada painel, como uma imagem 3D frontal (painel superior) com formação de osso no vazio indicada em vermelho, uma imagem 2D sagital (painel central) e uma imagem 2D axial (painel inferior). Foi realizada análise quantitativa da formação óssea em espaços vazios. Volume de osso densidade (B) e a densidade aparente (C) foram calculados e comparados usando um repetidas medidas ANOVA de duas vias com correção de Bonferroni para comparações múltiplas. As barras de erro representam SEM. * * *-p < 0,0001. Por favor clique em lae para ver uma versão maior desta figura.
| Passos | Problema | Possível motivo | Solução |
| 2.3 | Animal ofegante sob anestesia | Entrega de isoflurano em excesso | Reduza a concentração de isoflurano entregado ao animal. |
| Animal responde aos pés pitada | Entrega de isoflurano insuficiente | Aumente a concentração de isoflurano. | |
| 2.7-2.12 | Sangramento intenso | Dano vascular | Use um cotonete estéril para aplicar pressão ou cauterização para parar o sangramento. |
| O animal tem dificuldade para respirar | O diafragma foi perfurado | Eutanásia do animal para evitar asfixia. | |
| Vazamento do conteúdo intestinal | O trato gastrointestinal foi perfurado | Eutanásia do animal para evitar mais complicações. Impedi-lo, levantando a aponeurose longe subjacentes intestinos antes de cortar. | |
| Sangue emerge o local de perfuração | Um vaso sanguíneo foi perfurado | Aplica um cotonete estéril até parar de sangrar. | |
| Animal de repente treme durante a perfuração | A broca foi funda demais e danificou a medula espinhal | Eutanásia do animal para evitar mais complicações. | |
| O defeito ósseo parece incompleto | A broca não foi funda o suficiente | Reposicionar a cabeça da broca dentro o defeito e perfurar mais fundo | |
| 2.15-2.24 | Quebras de sutura | A sutura foi puxada demasiado firmemente | Substitua a sutura toda. Se quebra ocorre frequentemente, use uma sutura de tamanho mais espessa. |
| Animal é lento para se recuperar da anestesia | O animal está com hipotermia | Aumentar a temperatura do aquecimento pad ou aplicar uma fonte adicional de aquecimento (lâmpada de aquecimento, por exemplo). | |
| As suturas estão abertas | As suturas foram colocadas à vontade, ou o animal fez atividade extenuante | Reaplicar as suturas e aplicar Dermabond diretamente para as suturas e entre eles. | |
| 3 | Imagem digitalizada é exibida com baixa resolução, barulhenta ou dispersa | Varredura de parâmetros devem ser ajustados | Ajuste os parâmetros do protocolo de digitalização. Consulte a Bouxsein et al para mais orientações para a digitalização. |
| Imagem digitalizada aparece embaçada | O animal moveu-se durante o processo de digitalização | Examinar o animal. Se o movimento continua, aumente a concentração de isoflurano. | |
| 5 | O registo da vértebra alvo não foi bem sucedido | Separação vertebral não foi feita corretamente | Recontornar da vértebra: Certifique-se de todas as partes da vértebra são incluídas e excluem quaisquer estruturas adjacentes. |
| Grande diferença no posicionamento das vértebras | Reposicionar a vértebra alvo na mesma orientação como a vértebra de referência usando rotações e flip (etapa 29A). | ||
| Analisar corretamente não pode reconhecer as estruturas ósseas | Aplica um limite no módulo de registro para remover o ruído de fundo de amostras de osso. | ||
| As vértebras registradas são diferentes | Criar imagens 3d de suas amostras e combinar as vértebras corretas através de pontos de tempo diferentes. | ||
| 6 | O volume total (TV) é diferente entre as amostras | Utilizou-se um número diferente de fatias ou um contorno diferente | Certifique-se de usar sempre o mesmo tamanho de contorno e o mesmo número de fatias. |
| Valor de (BMD) a densidade mineral óssea é anormal | Calibragem inadequada de microCT | Calibrar a microCT para os padrões corretos de hidroxiapatita |
Tabela 1: solução de problemas. Potenciais problemas e soluções são apresentadas para diferentes etapas do protocolo.
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Discussion
A osteoporose é a causa mais prevalente de fraturas de compressão vertebral, causada por um aumento da carga sobre a coluna vertebral e que resultam no colapso do corpo vertebral. No entanto, é praticamente impossível gerar uma lesão em um roedor que autenticamente replica um colapso vertebral semelhante. Em vez disso, os pesquisadores criar um cilíndrico vazio no centro do corpo vertebral para imitar OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. desde que não há nenhuma consistência na literatura em termos de tamanho do defeito, um defeito de tamanho crítico foi definido como um que não espontaneamente cicatriza totalmente sem uma intervenção dentro de 3 meses pós-operatório16,17.
Embora o método de combinação de ovariectomia com um LCD para induzir rapidamente a osteoporose foi publicado anteriormente1,13, fomos os primeiros a mostrar que aplicando essa abordagem resulta de ratos do modelo em uma eficiente, rápida, e diminuição irreversível no osso trabecular vertebral volume e mineral densidade40. Este é um modelo pequeno-animal reprodutível que está desimpedido pelo sistema imunológico de roedor e que é que não uma necessidade adicionou imunossupressão, como usado por outros24.
Nosso protocolo cirúrgico gerado múltiplas idênticos defeitos críticos de vertebral lombar40. Isso resulta em defeitos altamente consistentes e facilmente comparáveis e quantificáveis através de animais. Acreditamos que defeitos produzidos usando essa abordagem são superiores aos modelos de defeito vertebral gerados em vértebras caudais de19,1,41 , porque o rabo de rato é submetido a forças biomecânicas que são significativamente diferentes dos que envolvem a coluna lombar do rato.
Passos críticos neste protocolo incluem evitar hipotermia intra-operatória e tomar cuidado quando perfura as vértebras frágeis de ratos nus ovariectomizadas após um LCD. Depois de gerar o defeito vertebral, ele é monitorado através de uma sequência temporal de na vivo µCT scans em pontos de tempo definido para a avaliação longitudinal do reparo ósseo. Manter as mesmas configurações de digitalização é crítico. As vértebras são contorneadas e separadas do resto da varredura. Um volume total idêntico para todos os scans de uma vértebra de contorno e evitando alterações de valor de tons de cinza são críticos. Um comercialmente disponíveis vários algoritmo de registo de imagens facilita a extração de base anatômica correspondente VOIs para todos os pontos de tempo subsequente. Finalmente, estes VOIs são analisadas para volume ósseo, densidade aparente, etc. É fundamental analisar todos VOIs usando os mesmos parâmetros. Esta técnica fornece uma análise altamente precisos e simples µCT 3D longitudinal que não é dependente do usuário.
Esse método pode ser aplicado a qualquer análise de regeneração do defeito ósseo longitudinal. O modelo de defeito vertebral usado aqui é um modelo conveniente para esta aplicação, como a sua estrutura óssea é única e pode ser facilmente registrada para a mesma posição anatômica. No entanto, qualquer regeneração óssea poderia ser analisada sob as mesmas condições, separando corretamente o mesmo osso de interesse durante os exames longitudinais. É imperativo para incluir amostras de ossos separados com as mesmas características anatômicas. Este problema potencial e outros são descritos na tabela 1, juntamente com possíveis razões e soluções sugeridas. O jogo anatômico obtido pelo processo de registo só pode ocorrer se os exemplos incluem as mesmas características anatômicas. O registo permite ao usuário aplicar o VOI predefinido exata da primeira varredura para todos os restantes pontos de tempo, resultando em uma análise histomorfométrica 3D altamente precisos ao longo do tempo. Volume da densidade óssea e densidade aparente do VOI podem ser usados para avaliar a formação de osso novo.
Enquanto potencialmente amplamente aplicável, o modelo apresentado aqui não é sem limitações. O uso de ratos nude modelo poderia ser considerado uma limitação, ele potencialmente pode mascarar alguns processos imune-mediada que podem ser de importância para a regeneração. Em segundo lugar, modelagem osteoporose através de uma combinação de ovariectomia e um LCD em ratos jovens, como publicado anteriormente1,13, é limitada em sua capacidade de imitar a biologia da população de pacientes idosa. Em terceiro lugar, OVCFs foram modelados por um procedimento cirúrgico, como os outros animais ter fraturas relacionadas a osteoporose são primatas42. Finalmente, enquanto o rato da coluna lombar é o melhor modelo disponível para coluna lombar humano — onde a maioria das fraturas vertebrais desenvolvem — a falta de peso axial do rolamento na coluna roedor também é uma limitação.
Este protocolo é modular e, portanto, poderia ser facilmente modificado para as necessidades do pesquisador. Por exemplo, os ratos do modelo ovariectomia poderiam ser usados para estudar outras fraturas relacionadas a osteoporose. Um pesquisador deve escolher usar nossa abordagem para análise de regeneração óssea semiautomated, poderia ser aplicada para qualquer modelo de fratura usando estrutural longitudinal de imagem, não necessariamente microtomografia computadorizada. Além disso, informações adicionais podem ser reunidas usando simultaneamente adicionais modalidades de imagem como ressonância magnética.
O modelo OVCF apresentado no presente protocolo pode ser usado para estudar novas abordagens terapêuticas para essa necessidade clinicamente insatisfeita. Além disso, nossa abordagem de análise de semiautomated pode ser usada com sucesso para executar uma análise semelhante, que é menos dependente do usuário e fornece a melhor precisão do que outros métodos de16. Particularmente notável é o fato de que usamos comercialmente disponível software de visualização e análise que pode ser usado por qualquer pesquisador — software que suporta modalidades de imagem adicionais, tais como a imagem latente de ressonância magnética e imagem nuclear. Portanto, acreditamos que esse método é altamente generalizado e só é limitado pela disponibilidade de na vivo recursos de imagem e software de registro.
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Disclosures
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do Instituto da Califórnia para medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Acknowledgments
A pesquisa foi apoiada por uma concessão do Instituto da Califórnia para medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
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