Summary
Målet med denne protokollen er å generere en naken rotte osteoporose-relaterte ryggvirvel kompresjon brudd modell som kan langs evaluert i vivo med en semiautomated microcomputed tomografi-baserte kvantitative strukturelle analyser.
Abstract
Osteoporose-relaterte ryggvirvel kompresjon brudd (OVCFs) er vanlige og klinisk udekkede behov med økende utbredelsen som verden befolkningen aldre. OVCF dyremodeller er avgjørende for prekliniske utviklingen av translasjonsforskning tissue engineering strategier. Mens en rekke modeller finnes, beskriver denne protokollen en optimalisert metode for å indusere flere svært reproduserbar ryggvirvel defekter i en enkelt naken rotte. En roman langsgående semiautomated microcomputed tomografi (µCT)-basert kvantitative strukturell analyse av ryggvirvel feil er også beskrevet. Kort, rotter ble fotografert på flere tid poeng post-op. Dag 1 skanningen var reorientert til en standard posisjon, og et standardvolum rundt ble definert. Etterfølgende µCT skanninger av hver rotte ble automatisk registrert på dag 1 skanningen så samme volum av interesse ble deretter analyseres for å vurdere for nye bein-formasjonen. Denne allsidige kan tilpasses en rekke andre modeller der langsgående imaging-baserte analyser kan ha nytte av nøyaktig 3D semiautomated justering. Samlet beskriver denne protokollen en lett kvantifiserbare og å reprodusere system for osteoporose og bein. Det foreslåtte protokollen tar 4 måneder å indusere osteoporose i naken ovariectomized rotter og mellom 2.7 og 4 h å generere bilde og analysere to ryggvirvel defekter, avhengig av vev størrelsen og utstyr.
Introduction
Mer enn 200 millioner mennesker over hele verden, lider av osteoporose1. Den underliggende patologisk nedgang i beinmineraltetthet (BMD) og endret bein mikroarkitektur øke bein skjørhet og følgelig relativ risiko brudd2. Osteoporose er så utbredt og skadelig for helse at WHO har definert det en stor offentlig helse bekymring. Videre som verdens befolkning er forventet alder, forventes osteoporose å bli enda mer vanlig.
Osteoporotic ryggvirvel kompresjon brudd er de vanligste skjørhet frakturer, anslått til mer enn 750 000 i året i USA. De er tilknyttet betydelig sykelighet og så mye som en ni ganger høyere dødelighet3. I kliniske forsøk, ble for tiden tilgjengelig tiltak, som vertebroplasty og kyphoplasty, funnet for å være ingen mer effektiv enn en humbug behandling4,5, etterlot bare smerte ledelse tilgjengelig til disse pasientene. Siden gjeldende OVCF behandlinger er begrenset, er det viktig å utvikle en dyremodell som replikeres lidelse6,7,8. Slike dyr modeller kan lette både etterforskningen av gjeldende behandlingsmetoder og utviklingen av romanen terapi som vil oversette til klinisk praksis. Osteoporose er indusert og opprettholdes i modellen dyr gjennom administrasjonen av en lav-kalsium diett (LCD) sammen med ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. for å ytterligere modell bentap tilknyttet OVCFs, ryggvirvel bein mangler ble etablert i osteoporotic immunkompetente rotter 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I dette arbeidet vises en ryggvirvel feil modell av immunsupprimerte rotter med modellerte osteoporose. Denne nye modellen kan brukes til å vurdere celle-basert behandling med stamceller hentet fra ulike kilder og arter for reparasjon av utfordrende frakturer, som OVCFs.
Bein imaging er en viktig del av evalueringen av frakturer og bein sykdommer. Avansert tenkelig metoder ble utviklet for nøyaktig vurdering av strukturelle bein endringer og gjenfødelse strategier25. Blant dem, har µCT bildebehandling framstått som en ikke-invasiv, enkel å bruke og rimelig metode som gir høyoppløselig 3D-bilder. µCT bildebehandling har flere fordeler sammenlignet med andre modaliteter i evalueringen osteoporose pasienter, som det gir høy oppløsning 3D bein mikroarkitektur26 som så kan analyseres kvantitativt. Sistnevnte kan deretter brukes til å sammenligne terapeutiske effekter av foreslåtte behandlinger. I vivo µCT imaging er faktisk en gull-standard for ryggvirvel defekt regenerering overvåking1,16,27. Men har noen publikasjoner28,29,30,31 ansatt automatisert registrering verktøy å minimere den brukeren-avhengighet, interpolering bias og presisjon feil av µCT Imaging-basert analyse. Nylig var vi først til å bruke en registrering prosedyre for å forbedre analysen av bein gjenfødelse et standardisert bein veddemål, som forklart i denne protokollen32 .
Metoden beskrevet her kan brukes til å studere effekten av romanen cellen terapi for OVCFs, uhindret av verten T-cell svar som kan avvise xenogeneic eller allogene celler. Osteoporose er indusert i unge rotter gjennom ovariectomy (OVX) og 4 måneder av en LCD. Den unge alderen av OVX rotter, kombinert med LCD tillatt, oss å nå en stille beinmasse, etterligne postmenopausal osteoporose av ledende irreversibel bentap. Dette kan forklares delvis av at, under LCD og i nærheten 3 måneder gammel, rotter overgangen fra benet modellering til remodeling fase ved det lumbal ryggvirvlene33, og dermed øke sannsynligheten for å opprettholde osteoporose over tid. Bruke små dyr gjør denne modellen mer kostnadseffektivt, som de koster mindre. Likevel, det er begrenset av iboende ikke regnskap for biologiske endringer i aldring dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dyreforsøk ble utført under en protokoll godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center (protokollen # 3609). Anestesi ble administrert for alle tenkelig og kirurgiske prosedyrer. Alle dyrene ble plassert i samsvar med godkjente IACUC protokoller.
Merk: eksperimentell design av denne protokollen er vist i figur 1. Kjøpe seks-uke-gamle rotter med deres eggstokkene kirurgisk fjernet og mate dem en LCD bestående av 0,01% kalsium og 0,77% fosfat. Etter en periode av 4 måneder av en LCD, bore en kritisk størrelse ryggvirvel defekt i fjerde og femte lumbal vertebrale organer (L4-L5). Etter operasjonen, bilde rotter på dag 1 og uker 2, 4, 8 og 12 etter defekt etablering. Finne feil marginene på dag 1 skanningen, reorientere til en standard posisjon og definere en sylindrisk volum av interesse (VOI). Automatisk register påfølgende µCT skanner (dvs. for uker 2, 4, 8 og 12) av hver rotta å standard posisjon definert for tilsvarende dag 1 skanningen. Bruk dagen 1 forhåndsdefinerte VOI til registrerte skanner. Vurdere volumet bentetthet og tilsynelatende tettheten av VOIs.
1. induksjon av osteoporose
- satte seks-uke-gamle athymic ovariectomized rotter på 4 måneder av en LCD bestående av 0,01% kalsium og 0,77% fosfat.
- Bytte tilbake til et normalt kosthold.
Merk: Disse rotter vil bli referert til som " osteoporotic rotter " heretter.
2. Ryggvirvel feil modell
Merk: timingen er 40-50 minutter per dyr.
- Autoclave alle kirurgiske verktøy før kirurgi.
- i flere operasjoner, sterilisere alle kirurgiske redskaper.
- Vask verktøyene og plassere dem i en sonicator bad for 5 min. plassere dem i en varm perle sterilisere satt til 250 ° C for 20 s. Tillat verktøy for å kjøle seg ned 5 min.
- Indusere anestesi.
- Stedet osteoporotic rotta inne induksjon kammeret knyttet til en bedøvelse maskinen med en sentral scavenging. Indusere anestesi bruker 5% isoflurane i 100% oksygen og vedlikeholde via forpart på 2-3% isoflurane. Bruke vet salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.
- Gjelder en tå-klype stimulans å sikre tilstrekkelig flyet av anestesi. Hvis ingen svar er angitt, starter prosedyren.
- Sted bedøvet rotta inne dorsal recumbency på en varmeputen (37 ° C) og strekke beina bruker magnetisk fixator retraksjon system ( figur 2A).
Merk: Temperaturen på oppvarming pad er viktig for forebygging av nedkjøling, siden en bedøvet rotten er kunne regulere sin kroppstemperatur. - Barbere mageområdet med en elektrisk barbermaskin. Vattpinnen det med jod-baserte antiseptisk og chlorhexidine gluconate 0,5% fulgt av 70% etanol.
- Injisere rotta med carprofen (5 mg/kg kroppsvekt (BW), subcutaneous (SQ)) før du starter den kirurgiske prosedyren.
- Bruke sterilt skalpell for å kutte huden. Begynner i snitt 1 cm nedenfor xiphoid prosessen og skjære gjennom midtlinjen (~ 5-8 cm) ( figur 2B).
- Bruke kirurgisk saks til å gjøre et snitt av aponeurosis gjennom linea alba til bukhulen ( figur 2C).
- Avsløre bukhulen bruker retractors ( figur 2D).
- Bøye tarmene til høyre for rotta å avsløre abdominal aorta og venstre nyre ( figur 2E). Palpate lumbalcolumna før du fortsetter å utsette det. For å unngå dehydration, bruke sterilt gjennomvåt gauzes med sterilt saltvann brytes de indre organene.
- Bruk thermocautery å avsløre i lag den fremre del av lumbal vertebrale organer L4-5 og isolere dem fra de omkringliggende bindevev og muskler ( figur 2F -G).
Merk: Thermocautery skal brukes til å kontrollere blødning under dissection. - Bruk en steril bomull swab mettet med bakteriefri saline for å fjerne blod og gjenværende vev fra ryggvirvlene L4. Bruk en steril Trephine bore bur (~ 2 mm i diameter) å bore en 5 mm dyp bein defekt i midten av den utsatte fremre del av ryggvirvel kroppen (figur 2 H-jeg).
Merk: Bruk minimal trykk å bore gjennom bare ventrale cortex og underliggende trabekulært Ben; unngå boring gjennom dorsal cortex. Merk at ryggvirvlene osteoporotic rotter er svært skjøre. Bruk en bomullspinne til å rengjøre feilen bruke press for å stoppe blødningen, hvis den finnes. - Gjenta trinn 2.11 på L5 vertebra opprette totalt 2 feil per rotten ( figur 2J).
- Tilbake tarmen til bukhulen.
- Bruker en vicryl syntetiske absorberbare kirurgisk Sutur (3-0 vicryl ufarvet 27 " SH taper) i et sammenhengende mønster å Sutur aponeurosis ( figur 2 K).
- Nær huden med en 4-0 monofilament nylon ikke-absorberbare Sutur i en enkelt avbrutt mønster ( figur 2 L).
- Gjelder 100 µL av aktuelle hudpleie lim på huden bildet og mellom dem for å sikre fullstendig nedleggelsen av huden.
- Injisere rotta med varm (37 ° C) lactated ringer ' s løsning (1CC/100 g BW, SQ) for å hindre nedkjøling og dehydrering.
- Injisere rotta med buprenorfin (0,5 mg/kg BW, SQ) før operasjonen og alle 8-12 h for post-op smertelindring behov.
- Ikke la dyret uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Også, ikke returnerer et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskapet av annet dyrene før det er helt gjenopprettet.
- Etter dyret har gjenopprettet på oppvarming pad, returnere den til buret sitt.
Merk: Huset rotter individuelt (dvs. inne separat burene) å hindre rotte-til-rotte lemlestelse av bildet og såret. - Plasserer chow dynket i vann i en Petriskål på bur gulvet for et par dager post-op å rotter nå maten.
- Administrere carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24 timer etter operasjonen for smertelindring hver 24 h behov.
- Fjerne hud bildet mens dyret er under 2% isoflurane anestesi 10-14 dager etter operasjon.
3. MicroCT skanning
Merk: timingen er 30-40 minutter per dyr.
- Dagen etter den kirurgiske prosedyren, plasserer osteoporotic rotta i induksjon kammeret knyttet til en bedøvelse maskinen med en sentral scavenging. Indusere anestesi bruker 5% isoflurane i 100% oksygen og vedlikeholde via forpart på 2-3% isoflurane.
- Scan rotta bruker en i vivo µCT skanner. Gjenta skanning for langsgående analyse av bein gjenfødelse.
Merk: Sørg for at alle dyrene er skannet med de samme innstillingene (dvs. X-ray energi, skanning medium, intensitet, voxel størrelsen og oppløsningen) og i en similar orientering. For eksempel: X-ray energi, 55 kVP; gjeldende, 145 µA; Voxel størrelse, 35 µm; trinn, 115 µm; og integrasjon tid, 200 ms; med eksemplene i PBS. Se Bouxtein et al. 34 for ytterligere forklaringer og betraktninger involvert i gnager µCT skanning for en vurdering av bein mikrostruktur. Ideelt sett brukes høyeste skanneoppløsningen tilgjengelig for alle skanner; imidlertid høyere oppløsning skanner krever lengre oppkjøpet tid, generere store datasett, og utsette dyr til mer ioniserende stråling. Sistnevnte kan presentere uønskede effekter, inkludert redusert brudd healing. Derfor at kompromisset mellom flere data og skanning bør nøye vurderes.
4. Ryggvirvel separasjon
Merk: timingen er 20-30 minutter per prøve.
- Contour vertebra av interesse, som vist i figur 3A-I. Kontroller at alle deler av vertebra mens utenom deler som hører til tilstøtende ryggvirvler.
- Klikk på " µCT evalueringsprogrammet " og velg prøven menyen.
- Contour hvert stykke ved hjelp av musen.
- Bruk det " Z " for å gå til den neste sektoren.
- Lagre formet vertebra som en egen fil ( figur 3J -K) ved å klikke på " filen " → " lagre GOBJ " hver par.
5. definisjon av VOI for langsgående kvantitativ vurdering
Merk: følgende, avhengig av om søket er fra dag 1 etter operasjonen (referanse vertebra) eller (den gang) poeng målrette vertebrae).
- Referanse vertebra.
Merk: Timingen er 20-30 minutter per prøve.- For Z-rotasjon, måle vinkelen på margene ved å bruke et XY-stykke fra midten av feilen ( figur 4A -B).
- På Z-flyet, gå til området på vertebra der feilen er mest tydelig og skjermen fange vertebra.
- i en presentasjon programvare, forberede et rektangel formet objekt som passer til feilen.
- Rotere bildet på vertebra slik at feilen vender oppover og feil marginene er parallell til sidene på rektanglet.
- Måle roteringsvinkelen (Høyreklikk på bildet → " formateringsbilde " → " størrelse ").
- Bruker målt vinkel for å rotere vertebra ( figur 4C).
- Åpne et nytt vindu for DECterm (" øktsbehandling " → " programmer " → " DECterm ").
- Kjøre " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -input [i] >
- -utdata [ut] >
- -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > målt vinkel
- -img_interpol_option [1] >
- For X-rotasjon, måle vinkelen på margene ved å bruke en YZ-sektoren fra midten av feilen ( Figur 4 d -E). Bruk målt vinkel for å rotere vertebra ( figur 4F).
- Klikk på " YZ " i " uCT evalueringsprogrammet " og gjenta trinn 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -aim_name [i] >
- -isq_filename [default_file_name] > sett filmappen ISQ (f.eks " DK0: [MICROCT. DATA. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -dim [-1-1 -1] >
- Flip rotert vertebra ved å endre XY-flyet til ZX-flyet.
- Åpne et nytt vindu for DECterm (" øktsbehandling " → " programmer " → " DECterm ").
- Kjøre " ipl ":
- Ipl > Vend
- -input [i] > ut
- -inngang [ut] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- Definere VOI.
- Tegne en sirkulær konturlinje av feilen benytter en skive av feilen ved å velge ikonet for sirkulær Arbeidsprofil i " uCT evalueringsprogrammet " ( figur 6A). Som kontur og lime det på alle sektorer i feilen ( figur 6B).
Merk: Siden alle feil ble opprettet med samme fremgangsmåte, analysere samme antall sektorer og, senere, det totale volumet (TV) for alle utvalg.
- Tegne en sirkulær konturlinje av feilen benytter en skive av feilen ved å velge ikonet for sirkulær Arbeidsprofil i " uCT evalueringsprogrammet " ( figur 6A). Som kontur og lime det på alle sektorer i feilen ( figur 6B).
- For Z-rotasjon, måle vinkelen på margene ved å bruke et XY-stykke fra midten av feilen ( figur 4A -B).
- Målet vertebra.
Merk: Timingen er 10-20 min per prøve.- Last av DICOM-filer av både målet og referanse ryggvirvlene å hovedvinduet i bildet analyseprogramvare.
Merk: Å unngå gråtone-verdien endres, definere samme utgang datatype som de opprinnelige DICOM-filene i Last menyen. - Register til referansen vertebra.
- Lanseringen den " 3D Voxel registrering " modul og referanse vertebra som den " Base volum " og målet vertebra som den " kampen volumet. " Klikk " registrere " registrere ryggvirvlene ( Figur 5).
- Lagre registrerte filen med de samme datatypen og importere den til et µCT miljø.
- Gjelder VOI.
- Bruk VOI definert for referanse vertebra til registrerte målet vertebra ved " uCT evalueringsprogrammet " → " fil " → " Last GOBJ " og velge GOBJ opprettet. Kontroller at VOI og defekt er konsentriske.
- Last av DICOM-filer av både målet og referanse ryggvirvlene å hovedvinduet i bildet analyseprogramvare.
6. MicroCT analyse
Merk: timingen er 10-20 min per prøve.
- Send VOI for evaluering i et µCT evaluering program ( figur 6).
Merk: Pass på å bruke de samme parameterne når analysere alle VOIs. Kontroller at terskelen er satt høyt nok til å utelate bakgrunnsstøy med minimale tap av bein. Hvis en kan lett identifiseres biomateriale brukes, kan en rekke strategier brukes til å analysere bein formasjon. Hvis det er forskjell i tetthet biomateriale og bein vev, kan biomateriale segmenteres ut 35 , 36. Ellers etterforskerne kan kvalitativt vurdere forskjellene i bein formasjon mellom eksperimentelle.
7. Eutanasi
- PPlace osteoporotic rotta inne induksjon kammeret knyttet til en bedøvelse maskin. Indusere anestesi bruker 5% isoflurane i 100% oksygen.
- Opprettholde anestesi via nesen kjegle og utføre Eutanasi av incising brystet hulrom å produsere en bilaterale pneumotoraks 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker denne protokollen, kan en image og kvantifisere fornyelse av n = 8 modellerte osteoporotic ryggvirvel defekter på ulike tidspunkt. Anatomisk kampen ved registreringen kan for analyse av den samme VOI på alle tidspunkt. Dette gir en svært nøyaktig langsgående 3D histomorphometric analyse, selv når margene i den opprinnelige feilen ikke er gjenkjennelig. Vi brukte fem tidspunkt (dag 1 uke 2, uke 4, uke 8 og uke 12) som et eksempel for langsgående vurdering av bein gjenfødelse (figur 7). Gjenfødelse kan evalueres etter kvalitativ vurdering av 2D tverrsnitt og 3D-bilder (som illustrert i figur 7A) og kvantitative sammenligning av bein kvantitet (BVD) og kvalitet (AD) (figur 7B). Følgende morphometric indeksene kan fastslås for nyopprettede bein: (i) TV, inkludert bein og bløtvev volumer (TV, mm3); (ii) volumet av mineralholdig vev (BV, mm3); (iii) volum bentetthet (BV/TV); og (iv) beinmineraltetthet (BMD, mg hydroxyapatite per cm3). Spesielt ble minimal bein dannelse (5% økning i volum bentetthet) observert 2 uker etter defekt etablering. Etter to uker, ble ingen betydelige forskjeller i bein formasjonen observert i forhold til senere tidspunkt. Samlet selv om det var noen grad av bein-formasjonen, som nådde ca 10% av uke 8, var det minimal nok å opprettholde bein ugyldige over tid.
Figur 1: protokollen Design. De viktigste trinnene i protokollen er beskrevet. Første, ovariectomized naken rotter utsatt for fire måneder av en lav kalsium diett (LCD) ble operert opprette standard kritisk størrelse defekter i lumbal vertebrale kropper. Rotter ble fotografert på dag 1 og uke 2, 4, 8 og 12 post-op. Dag 1 skanningen var reorientert til en standard stilling, og en sylindrisk VOI ble definert med defekt margene. Etterfølgende µCT skanninger av hver rotte ble automatisk registrert i standard posisjon definert for tilsvarende dag 1 skanningen. Dagen 1 forhåndsdefinerte VOI ble så brukt til registrerte skanner. Volum bentetthet og tilsynelatende tettheten av VOI ble brukt til å vurdere nye bein formasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ryggvirvel defekt kirurgi. De viktigste trinnene i kirurgiske generasjon ryggvirvel defekter er illustrert. Først ble rotter plassert på en varmeputen (A). En midtlinjen snitt ble gjort gjennom huden (B) og deretter linea alba (C) å avsløre bukhulen (D). Tarmen ble reflektert for å avsløre bakre bukveggen (E) og lumbalcolumna ble utsatt ved hjelp av thermocautery (pil, F-G). Feil ble boret i fjerde (H, pilen pekende på drill; Jeg, pilen peker til feilen) og femte (J, piler peker til feil) lumbal vertebrale organer. Til slutt, aponeurosis (K) og hud (L) var sutured. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vertebra separasjon. De viktigste trinnene i profilering av en vertebra av interesse vises. (A-jeg) Formet (grønn linje) representant 2D skiver langs lengden aksen av en vertebra vises. En 3D-representasjon av full ryggraden (J) kan sammenlignes med atskilt vertebra (K). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: referanse Vertebra posisjonering. Representant sektorer i to fly er vist av en vertebra før og etter rotasjon for en standard posisjon. Først er bruke en representant XY-del (A), vinkelen (B, grønn) for å rotere feilen (B, rød firkant) å bli parallelt med y-aksen (B, gul) bestemt og deretter brukt til å opprette det roterte bildet (C ). Deretter er bruker en representant YZ-SKIVE (D), vinkelen (E, grønne) for å rotere feilen (E, rød firkant) å bli parallell til z-aksen (E, gul) bestemt og deretter brukt til å opprette det roterte bildet (F ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: målrette Vertebra registrering. Representant skiver på tre plan av målet vertebra (markert i grønt) og referanse vertebra (merket i rødt) før (Vekselstrøm) og etter (D-E) registrering vises. Merk den gule fargen, som angir en overlapping mål og referanse ryggvirvler, og hvite pilene som peker til grønne bein etter gjenfødelse, indikerer bein formasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: VOI analyse. Representant sektorer i to fly med formet volumet av interesse vises. En sirkulær kontur er plassert i midten av feil i en representant ZX-del (A). Etter kontur alle ZX-skiver, kan komplett defekt volumet sees i XY-flyet (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: langsgående analyse av ryggvirvel defekt gjenfødelse. Kvalitativ og kvantitativ representant bein gjenfødelse analyseresultater vises. (A) A representant ryggvirvel defekt på ulike tidspunkt er avbildet i hvert panel som en frontal 3D image (toppanelet) med bein formasjon i tomrommet merket med rødt, et sagittal 2D-bilde (midten panel) og en aksial 2D-bilde (nedre panelet). Kvantitativ analyse av bein formasjon i porer ble utført. Bein volum tetthet (B) og tilsynelatende tetthet (C) var beregnes og sammenlignes ved hjelp av en gjentatt måler toveis VARIANSANALYSE med Bonferroni korreksjon for flere sammenligninger. Feilfeltene representerer SEM. ***-p < 0,0001. Klikk hennee for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Problem | Mulig årsak | Løsning |
| 2.3 | Dyr gisper under narkose | Overflødig isoflurane levering | Redusere konsentrasjonen av isoflurane levert til dyret. |
| Dyr svarer til tå knipe | Utilstrekkelig isoflurane levering | Øke konsentrasjonen av isoflurane. | |
| 2.7-2,12 | Kraftig blødning | Vaskulære skader | Bruk en steril bomull swab for å bruke press eller cautery å opphøre blø. |
| Dyret har pustevansker | Membranen ble punktert | Avlive dyrene å forhindre kvelning. | |
| Lekkasje av intestinal innholdet | Fordøyelsessystemet ble punktert | Euthanize dyret for å hindre ytterligere komplikasjoner. Forhindrer at den ved å løfte aponeurosis fra underliggende tarmen før du skjærer. | |
| Blod framgår borestedet | En blodåre ble punktert | Bruk en steril bomull swab til blødning stopper. | |
| Dyret rister plutselig boring | Drill gikk for dyp og skadet ryggmargen | Euthanize dyret for å hindre ytterligere komplikasjoner. | |
| Bein feilen ser ufullstendig | Drill gå ikke dypt nok | Omplasser drill hodet inne feilen og bore dypere | |
| 2,15-2,24 | Sutur pauser | Suture ble trukket for hardt | Sett det hele suture. Hvis bryte oppstår ofte, kan du bruke en størrelse tykkere Sutur. |
| Dyr er langsom å gjenopprette bedøvelsen | Dyret er hypothermic | Øke temperaturen på oppvarming pad, eller bruke en kilde til oppvarming (f.eks oppvarming lampe). | |
| Suturer er åpne | Bildet ble plassert løst, eller dyr gjorde anstrengende aktivitet | Bruke bildet og bruke Dermabond direkte til bildet og mellom dem. | |
| 3 | Skannet bilde vises med lav oppløsning, støyende eller spredt | Skanning må justeres | Justere parametere av skanning protokollen. Henvise til Bouxsein et al. for flere retningslinjer for skanning. |
| Skannet bilde vises uklare | Dyret flyttet under skanningen | Skann dyret. Hvis bevegelsen fortsetter, øke isoflurane konsentrasjon. | |
| 5 | Registrering av målet vertebra ikke var vellykket | Ryggvirvel separasjon var ikke gjort riktig | Recontour vertebra: Kontroller at alle deler av vertebra er inkludert, og ekskludere noen tilstøtende strukturer. |
| Store forskjellen i plasseringen av ryggsøylen | Omplasser målet vertebra inn i samme retning som referanse vertebra bruker rotasjoner og vende (trinn 29A). | ||
| Analysere gjenkjenner ikke riktig bein strukturer | Bruke en terskel i modulen registrering å fjerne bakgrunnsstøyen fra bein prøver. | ||
| Registrerte ryggvirvlene er forskjellige | Opprett 3d-bilder eksemplene og matche riktig ryggvirvlene over på ulike tidspunkt. | ||
| 6 | Det totale volumet (TV) skiller mellom eksempler | Enten et ulikt antall skiver eller en annen kontur ble brukt | Pass på å alltid bruke samme kontur størrelse og samme antall sektorer. |
| Ben mineral (BMD) tettheten er unormal | Utilstrekkelig kalibrering av microCT | Kalibrere microCT for riktig hydroxyapatite standarder |
Tabell 1: feilsøking. Potensielle problemer og løsninger er presentert for ulike trinn i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporose er mest utbredte årsaken til ryggvirvel kompresjon brudd skyldes en økt belastning på ryggraden og som resulterer i sammenbruddet av ryggvirvel kroppen. Men, er det praktisk talt umulig å generere en skade i en gnager som autentisk reproduserer en lignende ryggvirvel kollaps. I stedet opprette forskere et sylindrisk tomrom i midten av ryggvirvel kroppen å etterligne OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. siden det er ingen konsistens i litteraturen i feil størrelse, kritisk størrelse feil ble definert som en som ikke spontant leges fullstendig uten en intervensjon i 3 måneder post-op16,17.
Selv om metoden med å kombinere ovariectomy med en LCD som snarlig føre til osteoporose var tidligere publiserte1,13, vi var de første til å vise at bruk denne tilnærmingen til athymic rotter resultater i en effektiv, rask, og hvor nedgang i ryggvirvel trabekulært bein volum og mineral tetthet40. Dette er en reproduserbar liten-dyr modell som uhindret av gnager immunsystemet og at ikke gjør har behov for lagt immunsuppresjon, som brukes av andre24.
Våre kirurgisk protokollen generert flere identiske kritiske lumbal vertebrale defekter40. Dette resulterer i svært konsekvent og lett sammenlignbare og kvantifiserbare over dyrene. Vi tror at defekter produsert ved hjelp av denne tilnærmingen er overlegen ryggvirvel defekt modeller generert i caudal ryggvirvlene1,19,41 fordi rotte hale underlegges biomekaniske styrker som er signifikant forskjellig fra de som involverer rotte lumbalcolumna.
Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere unngå intra operative nedkjøling og ta forsiktighet ved boring skjøre ryggvirvlene ovariectomized naken rotter etter en LCD. Etter genererer ryggvirvel feilen, overvåkes via en timelige rekkefølgen i vivo µCT skanninger på angitt tidspunkt for langsgående vurdering av bein reparasjon. Opprettholde samme skanneinnstillingene er avgjørende. Ryggvirvlene deretter formet og skilt fra resten av skanningen. Kontur en identisk totalvolumet for alle skanninger av en vertebra og unngå gråtoner verdiendringer er avgjørende. En kommersielt tilgjengelig flere bilde registrering algoritmen forenkler utvinning av anatomisk tilsvarende planlagte VOIs til alle gang poeng. Til slutt, disse VOIs analyseres for bein volum, tilsynelatende tetthet, etc. Det er viktig å analysere alle VOIs med de samme parameterne. Denne teknikken gir en svært nøyaktig og enkel langsgående 3D µCT analyse som ikke bruker antallsavhengige.
Denne metoden kan brukes til noen langsgående bein defekt fornyelse analyse. Ryggvirvel defekt modellen brukes her er en praktisk modell for dette programmet, som bein strukturen er unikt og kan enkelt registrert til samme anatomisk posisjon. Imidlertid kan noen bein gjenfødelse analyseres under samme vilkår ved å skille riktig samme benet rundt hele langsgående skanner. Det er viktig å inkludere atskilt bone prøver med samme anatomiske funksjoner. Dette potensielle problemet, og andre er beskrevet i tabell 1, sammen med mulige årsaker og foreslåtte løsninger. Anatomisk kampen ved registreringen kan bare skje hvis prøvene inkludere samme anatomiske funksjoner. Registrering vil tillate brukeren å bruke den eksakte forhåndsdefinerte VOI av det første søket til alle gjenværende tid poeng, noe som resulterer i en svært nøyaktig 3D histomorphometric analyse over tid. Volum bentetthet og tilsynelatende tettheten av VOI kan brukes til å vurdere nye bein formasjon.
Mens potensielt allment gjeldende, er modellen presentert her ikke uten begrensninger. Bruk av athymic naken rotter kan betraktes som en begrensning, som det kan potensielt maskere noen immun-mediert prosesser som kan være av betydning for gjenfødelse. Andre er modellering osteoporose gjennom en kombinasjon av ovariectomy og en LCD-skjerm i unge rotter, som er publisert tidligere1,13, begrenset i sin evne til å etterligne biologi eldre pasienten befolkningen. Tredje ble OVCFs modellert av en kirurgisk prosedyre, som de bare andre dyrene ha osteoporose-relaterte frakturer primater42. Til slutt, mens rotta lumbalcolumna er det beste tilgjengelige modellen for menneskelig lumbalcolumna, der de fleste vertebrale frakturer utvikle-mangel på aksial vektbærende i gnager ryggraden er også om begrensning.
Denne protokollen er modulære og derfor lett kunne modifiseres forskerens behov. Athymic ovariectomized rotter kan for eksempel brukes til å studere andre osteoporose-relaterte frakturer. Bør forsker velger å bruke vår tilnærming til semiautomated bein fornyelse analyse, kan det brukes til eventuelle brudd modellen med langsgående strukturelle imaging, ikke nødvendigvis mikro-beregnet tomografi. Tilleggsinformasjon kan videre samles inn ved hjelp av flere tenkelig modaliteter som magnetisk resonans imaging samtidig.
OVCF modellen presentert i denne protokollen kan brukes å studere romanen terapeutiske tilnærminger til denne klinisk udekkede behov. Videre kan vår semiautomated analyse tilnærming med hell brukes til å utføre en tilsvarende analyse som er mindre bruker antallsavhengige og gir bedre nøyaktighet enn andre metoder16. Spesielt bemerkelsesverdig er at vi brukt kommersielt tilgjengelig visualisering og analyse programvare som kan brukes av noen forsker-programvare som støtter flere tenkelig modaliteter, for eksempel magnetisk resonans imaging og kjernefysiske bildebehandling. Derfor tror vi at denne metoden er svært generalizable og er bare begrenset av tilgjengeligheten av i vivo tenkelig evnene og registrering programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne forskningen ble støttet av et stipend fra California Institutt for regenerativ medisin (CIRM) (TR2-01780).
Acknowledgments
Forskningen ble støttet av et stipend fra California Institutt for regenerativ medisin (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
