Summary
このプロトコルの目的は、長手方向評価できる生体内で半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいて定量的構造解析を用いた裸ラット骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折モデルを生成することです。
Abstract
骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折 (OVCFs) は、世界の人口年齢として有病率の増加とともに共通と臨床的に満たされていない必要です。動物の OVCF モデルは、並進ティッシュ エンジニア リング戦略の前臨床開発に不可欠です。モデルの数が現在存在している間このプロトコルは単一の裸ラットで複数の再現性の高い椎体欠陥を誘導するための最適化手法について説明します。新規縦半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影 (µCT)-椎体欠陥に基づいて定量的構造解析はまた、詳細な。簡単に言えば、手術後に複数の時間ポイントでラットをイメージしました。1 日目のスキャンが標準位置に向きを変えると関心の標準的な量を定義しました。各ラットのそれに続く µCT スキャンは、関心の同じボリュームを新しい骨の形成の評価を分析したので 1 日目スキャンに自動的に登録されました。この柔軟なアプローチは、様々 な他のモデルの正確な 3 D 半自動線形から縦断的イメージングによる解析を恩恵に合わせることができます。一緒に取られて、このプロトコルでは、骨粗しょう症や骨の研究のための容易に定量化できると簡単に再現できるシステムをについて説明します。提案されたプロトコルは、2.7 と 4 h 生成、イメージ、および組織のサイズおよび装置によって 2 つの椎体欠陥を分析して裸の卵巣摘出ラットにおける骨粗鬆症を誘発する 4 ヶ月かかります。
Introduction
世界中で以上 2 億人は骨粗鬆症1に苦しんでいます。骨密度 (BMD) の低下基礎となる病理学的、変更された骨微細構造骨の脆弱性と、その結果、破壊2の相対リスクを増やします。骨粗鬆症は横行し、誰がそれを主要な公衆衛生問題に定義の健康に有害です。さらに、世界の人口を年齢どおり、骨粗しょう症がより一般的になると予想されます。
骨粗鬆症性椎体圧迫骨折が最も一般的な脆弱性骨折は、米国で年間 750,000 以上と推定です。9 倍より高い死亡率率は3として重要な罹患率と同じくらいに関連付けられます。臨床試験で現在亀背形成術、椎体形成術などの利用可能な外科的介入がないのより効果的なよりも偽治療4、5、これらの患者に利用できるだけ痛みの管理を離れることが判明。現在の OVCF 治療法が限られているので障害6,7、8をレプリケートすることができます動物のモデルを開発することが不可欠です。このような動物のモデルは、現在の治療法の研究と臨床に変換する新規治療法の開発を促進できます。骨粗鬆症を誘発されており卵巣1,9,10、11,と組み合わせて低カルシウム飼料 (LCD) の投与によるモデル動物で持続的な12,13,14,15. さらにモデルで OVCFs に関連付けられている骨は、椎体骨欠損は骨粗鬆症免疫ラット16,17,18,19、設立されました。 20,21,22,23,24。この作品は、モデル化された骨粗しょう症免疫不全ラットの椎骨の欠陥モデルが表示されます。この小説のモデルは、様々 なソースや OVCFs などの挑戦的な骨折の修復の種由来幹細胞を含む細胞ベースの治療を評価するために使用できます。
骨イメージングは、骨折や骨の病気の評価の重要な部分です。高度なイメージング法は、骨の構造変化と再生戦略25の正確な評価のため開発されました。その中でも、µCT イメージングは、高解像度の 3 D 画像を提供する非侵襲的な使いやすい、安価な方法として浮上しています。µCT イメージングには、高解像度 3 D 骨定量的分析できますマイクロアーキテクチャー26骨粗鬆症患者の評価に他の治療法にいくつかの利点があります。後者は、提案された治療法の治療効果を比較するし使用できます。確かに、µCT 画像生体内では、脊椎骨欠損再生1,16,27を監視のためのゴールド スタンダードです。ただし、いくつかの出版物28,29,30,31ユーザー依存関係、補間バイアス、および µCT の精度誤差を最小限に抑える自動登録ツールを採用しています。イメージングによる解析。最近では、登録手順を使用してこのプロトコル32で説明したように void、標準化された骨における骨再生の分析を向上させる最初ができました。
ここで説明する方法は OVCFs のための新しい細胞療法の効果を研究するため、異種または同種細胞を拒絶するかもしれない T 細胞応答のホストによって妨げられていません。骨粗しょう症は、幼若ラット卵巣摘出 (OVX) と LCD の 4 ヶ月間で誘導されます。LCD と組み合わせて OVX のラットの若い年齢の許可、不可逆的な骨の損失へ導くことによって閉経後骨粗鬆症を模倣した低ピーク骨量に到達します。これは部分的という事実によって、モデリングを改造する骨からラット転移の年齢の約 3 ヵ月、液晶中に腰椎33、上、骨粗しょう症を維持する可能性が高まる相説明できます。時間。若い動物を使用してこのモデルを作るよりコスト効率の高い、低コストに。それにもかかわらず、それは本質的にいない高齢動物の生物学的変化の会計によって制限されます。
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Protocol
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センター (プロトコル # 3609) によって承認されたプロトコルの下ですべての動物実験を行った。すべてのイメージングおよび外科手術の麻酔を投与されました。すべての動物は、承認された IACUC プロトコルに従って収容された
。注: このプロトコルの実験的なデザインは、 図 1 に示します。6 週齢のラットの卵巣を摘出手術餌を 0.01% 0.77% カルシウムとリン酸から成る LCD を購入します。液晶ディスプレイの 4 ヶ月の期間の後、第 4 と第 5 腰椎椎体 (L4-L5) の臨界サイズ椎体欠陥をドリルします。術後、1 日目と欠陥設立後 2、4、8、12 週間のラットをイメージします。1 日目のスキャンの欠陥余白を見つけて標準の位置、向きを変える興味 (VOI) の円柱形状ボリュームを定義します。(すなわち 2、4、8、12 週間) 対応する 1 日目スキャン用に定義された標準的な位置にそれぞれのラットのそれに続く µCT スキャンを自動的に登録します。登録スキャンする定義済み VOI の 1 日を適用します。骨体積密度と、ヴォイスの見掛け密度を評価します
。1 骨粗鬆症誘導
- 0.01% 0.77% カルシウムとリン酸から成る液晶ディスプレイの 4 ヶ月で 6 週齢無胸腺卵巣摘出ラットを置く。 。
- スイッチは、通常の食事に戻る
。 注: これらのラットと呼ばれるに " 骨粗鬆症ラット " 以下 。
2。椎骨の欠陥モデル
注: タイミングは動物ごとの 40-50 分
。- オートクレーブすべて手術は手術する前にツールします 。
- 複数手術の場合すべての手術器具を滅菌.
- 道具を洗って 5 分置いて 250 ° C、20 s. 許可する熱いビーズ滅菌セットで 5 分間クールダウンするためのツールのため、超音波発生装置のお風呂には置いて
- 誘発麻酔。
- 場所誘導室で骨粗鬆症のラットは、中央清掃システムと麻酔器に接続されています。100% 酸素で 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、2-3% イソフルランにノーズコーンを介して維持します。獣医軟膏を目に麻酔中の乾燥を防ぐために使用します 。
- には、麻酔の十分な平面を確保するためつま先ピンチ刺激が適用されます。応答が認められなかった場合は、手順を開始します 。
- 背臥床加熱パッド (37 ° C) の上の麻酔下ラットを置き、磁気創固定器のリトラクション システム ( 図 2 a) を使って手足を伸ばす
。 メモ: 麻酔したラットは、体温を調節することができるので加熱パッドの温度と低体温症の予防のために重要です 。
- は、電気シェーバーを使用して腹部領域を剃る。ヨウ素系消毒剤およびクロルヘキシジン グルコン酸 70% エタノール 0.5% でそれを綿棒します 。
- 注入ラット カルプロフェン (5 mg/kg 体重 (BW) 皮下 (SQ)) 手術の手順を開始する前にします 。
- は、生殖不能のメスを使って皮膚をカットできます。剣状突起下 1 cm の切開を開始し、正中線 (5 ~ 8 cm) ( 図 2 b) をカットします 。
- 外科はさみを使用して、リネアを通じて腱膜の切開腹腔内 ( 図 2) にアクセスするアルバ 。
- リトラクター ( 図 2 D) を用いた腹部キャビティを公開します 。
- は、腹部大動脈と左腎 ( 図 2 e) を公開するラットの右に腸をそらします。それを公開する前に腰椎を触診します。脱水症状を避けるためには、滅菌の浸したガーゼを滅菌生理食塩液を内臓をラップする使用します 。
- 層の L4 5 腰椎の椎体の前方の面を公開し、周囲の結合組織や筋肉から分離する使用 thermocautery ( 図 2F -G).
注意: Thermocautery は解剖時の出血を制御する使用する必要があります 。
- は、L4 脊椎骨から血と残留組織を除去するのに滅菌生理食塩水で飽和した滅菌綿棒を使用します。滅菌トレフィン ドリル バール (~ 2 mm 径) を使用して椎体の露出の前方の面の中心に 5 mm の深い骨をドリル (図 2 H-私).
注: は、腹側皮質と基になる海綿骨のみにドリルスルーする最小限の圧力を適用します。背側皮質のドリルスルーは避けてください。骨粗鬆症ラットの骨は非常に壊れやすいことに注意してください。欠陥をきれいに存在する場合、出血を止めるための圧力を適用し綿棒を使用します 。
- ラット ( 図 2 j) あたり 2 欠陥の合計を作成する L5 の椎骨に 2.11 手順繰り返します 。
- 腹腔内に腸を返します 。
- 、Vicryl 合成手術用縫合糸を使用して (3-0 vicryl 非染め色 27 " SH テーパ) ( 図 2 K) 腱膜を縫合する連続的なパターンで 。
- 単純な中断パターン ( 図 2 L) に 4-0 モノフィラメント ナイロンの非吸収性縫合糸を使用して皮膚を閉じます 。
- 局所皮膚接着剤皮膚縫合糸の上に、皮膚の完全な閉鎖を確実にそれらの間の適用 100 μ L.
- 注入ラット (37 ° C) 暖かい一日リンガー ' 低体温症と脱水症を防ぐために s ソリューション (1 cc/100 g BW、SQ).
- 必要に応じて、ブプレノルフィン (0.5 mg/kg BW、SQ 前に手術と術後鎮痛のためのすべての 8-12 h とラットの挿入します 。
- 放置しないでください動物までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。また、それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返すありません 。
- 加熱パッドの上に動物が回復後、ケージに戻す
。 注: 個別にラットの家 (すなわち、 別のケージ) 縫合糸のラット-ラット傷を防ぐために、創傷します 。
- ラット食品に到達を支援するいくつかの日後 op のケージの床にシャーレに水に浸したチョウを配置します 。
- 必要に応じて、痛みを軽減するすべての 24 h のカルプロフェン (5 mg/kg BW、SQ) 24 h 後手術を管理します 。
- 動物は 2% の下、皮膚縫合を削除イソフルラン麻酔 10-14 日後操作します 。
3。:Microct スキャン
注: タイミングは動物ごとの 30-40 分
。- 手術の翌日には、中央清掃システムと麻酔マシンに接続された誘導室で骨粗鬆症のラットを置きます。100% 酸素で 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、2-3% イソフルランにノーズコーンを介して維持します 。
- は、ラット 体内 µCT スキャナーを使用してスキャンします。骨再生の縦断的分析のスキャンを繰り返します
。 注: すべての動物に (すなわち、 x 線エネルギー、メディア、強度、ボクセル サイズ、および画像の解像度をスキャン) の同じ設定を使用してスキャンすることを確認しもr 向き。たとえば: x 線エネルギー、55 kVP;現在、145 μ A;ボクセル サイズ、35 μ m です。115 μ m 単位積分時間、200 ms;PBS のサンプル。Bouxtein ら を参照してください。詳しい説明と齧歯動物の µCT 骨微細構造の評価のためのスキャンに関連する考慮事項の 34。理想的には、利用可能な最高のスキャン解像度はすべてのスキャンに使用されます。高解像度スキャン タイミング、大規模なデータ セットを生成しより多くの電離放射線に動物を公開します。後者減少骨折治癒など、望ましくない影響が生じる。したがって、追加のデータとスキャン時間の間のトレードオフを注意深く検討されるべき 。
4。脊椎分離
注: タイミングは 1 サンプルあたり 20-30 分
。- 図 3 a に示すように、興味の椎骨を輪郭-I. 隣接する椎骨に属するパーツを排除しながら、椎体のすべての部分を含めることを確認してください。
- をクリックして " µCT 評価プログラム " メニューからサンプルを選択します 。
- マウスを使用して各スライスを輪郭 。
- 使用の " Z " に次のスライスに行くバー 。
- 凸凹のある椎骨を付けて保存別のファイル ( 図 3J -K) をクリックして " ファイル " → " 保存 GOBJ " スライスのすべてのカップル
5 縦の定量的評価のためのボイの定義
注: スキャンが (参照椎) の手術後 1 日目や 2 回目以降ポイント (からかどうかに依存する次の手順。脊椎を対象).
- 参照椎骨
。 注: タイミングは 1 サンプルあたり 20-30 分です。- Z 回転の欠陥の中心から XY スライスを使用して余白の角度の測定 ( 図 4 a -B)。
- 椎体の欠陥がほとんどはっきりと画面キャプチャを椎体の領域に移動 Z 平面上 。
- プレゼンテーション ソフトウェアに欠陥が収まる四角形のオブジェクトを準備します 。
- 欠陥を上向きに直面するように椎体のイメージを回転させる欠陥余白が四角形の辺に平行と 。
- 回転の角度の測定 (画像を右クリックして → " 図の書式設定 " → " サイズ ").
- は、測定角度を使用 ( 図 4) 椎体を回転させる。
- DECterm 新しいウィンドウを開く (" セッション マネージャー " → " アプリケーション " → " DECterm ") です 。
- 実行 " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -入力 [で] >
- -[出力] >
- -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > 測定角度
- -img_interpol_option [1] >
- X 回転、欠陥の中心から YZ スライスを使用して余白の角度の測定 ( 図 4 -E)。測定角度を使用すると、( 図 4 階) 椎体を回転させる。
- をクリックして " YZ " で " uCT 評価プログラム " と 5.1.1.1-5.1.1.5.2 の手順を繰り返します 。
- Ipl > isq
- -[で] aim_name >
- isq_filename [default_file_name] > ISQ ファイル ディレクトリを挿入 (例えば、 " DK0: [:MICROCT。データ。GAZIT。MAXIM.80.DAY1]Z2102970。ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -薄暗い [-1-1-1] >
- ZX 平面に XY 平面を変更することによって回転の椎骨を反転します。
- DECterm 新しいウィンドウを開く (" セッション マネージャー " → " アプリケーション " → " DECterm ") です 。
- 実行 " ipl ":
- Ipl > 反転
- -[入力] 入力 > を
- -入力 [out] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- 、ボイを定義します。
欠陥の中心からの円形の輪郭のアイコンを選択してスライスを使用して欠陥の
- 円形を描く輪郭 " uCT 評価プログラム " ( 図 6 a)。輪郭や欠損 ( 図 6 b) すべてのスライスに貼り付けてコピーします
。 注: 以来、すべての欠陥は、同じ手順を使用して作成された、スライスと、その後すべてのサンプルの総体積 (テレビ) の同じ数を分析します 。
- 円形を描く輪郭 " uCT 評価プログラム " ( 図 6 a)。輪郭や欠損 ( 図 6 b) すべてのスライスに貼り付けてコピーします
- Z 回転の欠陥の中心から XY スライスを使用して余白の角度の測定 ( 図 4 a -B)。
- 対象椎骨
。 注: タイミングは 1 サンプルあたり 10 〜 20 分です。 ターゲットの画像解析ソフトのメイン ウィンドウへの参照椎- ロード、DICOM ファイル
。 注: グレースケール値の変更を避けるために、同じ定義ロード メニューにオリジナルの DICOM ファイルとしてデータ型を出力します 。
- レジスタ参照する椎骨。
- 発売、" 3次元ボクセル登録 " モジュールとして参照椎骨を入力し、" ベース ボリューム " とターゲット バーティブラ、" マッチ ボリューム " をクリック " 登録 " 椎骨を登録する (。図 5).
- 同じデータ型および µCT 環境にインポートを使って登録されているファイルを保存します 。
- 、ボイが適用されます。
クリックして登録された対象椎骨の参照椎骨に対して定義されている
- 適用、VOI " uCT 評価プログラム " → " ファイル " → " ロード GOBJ " し、以前に作成した GOBJ を選択します。ボイと欠陥が同心円であることを確認します 。
- ロード、DICOM ファイル
6。:Microct 分析
注: タイミングはサンプルごとの 10-20 分
。- 送信 µCT 評価プログラム ( 図 6) を使用して評価のボイ
。 注: すべてのヴォイスを分析する際に、同じパラメーターを使用するを確認します。しきい値が骨の損失を最小限にバック グラウンド ノイズを省略するには十分に高く設定されていることを確認します。放射線不透過性の生体材料を使用すると、骨形成を分析するさまざまな方法が使えます。生体材料と骨の組織の密度の違いがある場合、生体材料は 35 , 36 を分割可能性があります。それ以外の場合、調査官の骨形成実験群間の違い定性的評価でした 。
7。安楽死
- PPlace 誘導室で骨粗鬆症のラットは、麻酔器に接続されています。100% 酸素による 5% イソフルラン麻酔 。
- 鼻の円錐形によって麻酔を維持し、安楽死を実施両側気胸 37 を生成する胸腔内を切開しています 。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、1 つはイメージでき、n の再生を定量化する異なる時間ポイント間 8 モデル骨粗鬆症性椎体欠陥を =。登録手続きによって得られる解剖学的な一致はすべての時点で同じ VOI の分析のためできます。元の不具合の余白を認識しないときにも、非常に正確な縦 3 D 組織計量解析でこの結果します。骨再生 (図 7) の縦断的評価の例として (1 日目、2 週目、4 週目、8 週目、12 週) の 5 つの時間ポイントを使用しました。2D 断面の例のように図 7Aの) 3 D 画像の定性的評価と骨量 (BVD) と品質 (AD) (図 7 b) の量的な比較によって、再生を評価できます。新たに形成された骨の次の形態計測学的指標を定めることができる: (i) テレビ、骨と軟部組織のボリューム (テレビ、mm3); を含む(ii) 量の石灰化組織 (BV、mm3);(iii) 骨体積密度 (BV/TV);(iv) 骨密度 (BMD、cm3あたり mg ハイドロキシアパ タイト)。具体的には、最小限の骨形成 (骨体積密度は 5% 増) は欠陥設立後 2 週間を観察されました。2 週間後、骨の形成に有意差は認められなかった後時点と比較した場合。全体的にみて、週 8 で約 10% でピークに達し、骨形成の程度はあったが、十分な時間をかけて骨の void を維持するために最小限だった。
図 1: プロトコルのデザイン。プロトコルの主要な手順のとおりです。低カルシウム食 (LCD) の 4 ヶ月を受けるまず、卵巣摘出の裸ラットは 2 腰椎椎体に標準サイズの重大な欠陥を作成する時に作動しました。1 日目、2、4、8、12 週間後のオペアンプのラットをイメージしました。1 日目のスキャンが標準位置に向きを変えると円筒のボイは欠陥余白を使用して定義されました。各ラットのそれに続く µCT のスキャンは対応する 1 日目スキャン用に定義された標準的な位置に自動的に登録されていた。定義済み VOI の 1 日は登録済みのスキャンに適用されます。骨体積密度と、ボイの見掛け密度は、新しい骨の形成を評価するために使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 椎欠損手術。手術世代椎骨の欠陥の主な手順を示しています。まず、ラットは、加熱パッド (A) に置かれました。正中切開は皮膚 (B) し、リネアを通じて行われたアルバ (C) 腹腔内 (D) を公開します。腸は、後部の腹部壁 (E) を公開に反映したし、腰椎は thermocautery (矢印、 F G) を使用して公開されました。4 (Hドリル; を指す矢印で掘削された欠陥私は、欠陥を指す矢印) と 5 番目 (J欠陥を指す矢印) 腰椎椎体。最後に、腱膜 (K) と皮 (L) が縫合されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脊椎分離します。興味の椎骨の輪郭の主要な手順を示します。(A-私)椎骨の長軸に沿って凸凹 (グリーン ライン) の代表的な 2D スライスが表示されます。完全な背骨 (J) の 3 D 表現は、分離椎骨 (K) と比較できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 脊椎の位置を参照します。標準的な位置に回転の前後に、椎骨の 2 つの面で代表的なスライスが表示されます。最初に、回転不良 (B赤の広場) (B、黄色) y 軸に平行になるために必要な代表的な XY スライス (A)、(B緑) の角度を使用してが決定されを使用して、回転するイメージ (C を作成).代表 YZ スライス (D) を使用すると、(E赤の広場) (E、黄色) z 軸に平行になる欠陥を回転に必要な角度 (E、緑) が決定しを使用して、回転するイメージ (F を作成).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 対象椎骨登録します。ターゲットの椎骨 (に示されている緑) と参照椎 (赤マーク) (A ~ C) の前に 3 つの平面で代表的なスライス前後 (D E) 登録が表示されます。ターゲットおよび参照の椎骨と緑の骨再生、骨形成を示す後ポイント白い矢印間の重複を示す黄色の色に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ボイ解析します。興味の凸凹のあるボリュームと 2 つの面で代表的なスライスが表示されます。円形の輪郭は、代表 ZX スライス (A) 欠陥の中心に配置されます。すべて ZX スライスの輪郭後、完全な欠陥の体積は、XY 平面 (B) で見ることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 椎欠損再生に関する縦断的分析します。質的および量的な代表的な骨再生解析結果が表示されます。様々 な時点で (A) A 代表的な椎体欠陥は各パネルに赤で表示された空間における骨形成を正面 3 D 画像 (上部パネル)、矢状 2D イメージ (中央のパネル)、および軸の 2次元画像 (底板) として描かれています。ボイドの骨形成の定量的解析を行った。ボリュームを骨密度 (B) と (C) 見かけ密度を求めたし、繰り返されるを使用して比較ボンフェローニの多重比較補正で双方向の分散を測定します。誤差範囲を表す SEM. * * *-p < 0.0001。彼女をクリックして下さいe この図の拡大版を表示します。
| 手順 | 問題 | 可能な理由 | ソリューション |
| 2.3 | 動物の麻酔下であえぐ | 過剰なイソフルラン配信 | 動物に配信されるイソフルランの濃度を減らします。 |
| ピンチをつま先への動物の応答 | 不十分なイソフルラン配信 | イソフルランの濃度を増やします。 | |
| 2.7 2.12 | 多量の出血 | 血管損傷 | 滅菌綿棒を使用して、圧力または焼灼止血に適用。 |
| 動物が呼吸困難 | 横隔膜がパンクだった | 窒息を防ぐために動物を安楽死させます。 | |
| 腸の内容物の漏れ | 消化管がパンクだった | さらに合併症を防ぐためには、動物を安楽死させます。切断する前に基になる腸から腱膜を持ち上げることによってそれを防ぐ。 | |
| 掘削地点から血液が出てくる | 血管がパンクだった | 出血停止まで滅菌綿棒を適用します。 | |
| 動物を掘削中に突然振る | ドリル深すぎると脊髄を損傷 | さらに合併症を防ぐためには、動物を安楽死させます。 | |
| 骨欠損が不完全に見える | ドリルは十分に深く行かなかった | 欠陥内部ドリルヘッドの位置を変更しより深く掘り下げる | |
| 2.15 2.24 | 縫合改 | 縫合糸がきつく引っ張られました。 | 全体の縫合を交換してください。速報が頻繁に発生した場合サイズの厚い縫合糸を使用します。 |
| 動物が麻酔から回復するが遅い | 動物は体温 | 加熱パッドの温度が上昇したり、暖房 (例えば加熱ランプ) の追加のソースを適用します。 | |
| 縫合しております。 | 縫合糸が緩く、置かれたまたは動物か精力的な活動 | 再縫合糸と縫合糸に直接およびそれらの間にタルミを適用します。 | |
| 3 | 低解像度、ノイズの多いまたは散乱のスキャンした画像が表示されます。 | スキャンのパラメーターを調整する必要 | スキャンのプロトコルのパラメーターを調整します。スキャンするための詳細なガイドラインは、Bouxsein らするを参照してください。 |
| スキャンした画像がぼやけて表示されます。 | スキャン プロセス中に移動動物 | 動物を再スキャンします。動きが引き続き発生する場合は、イソフルラン麻酔濃度を高めます。 | |
| 5 | 対象椎骨の登録は成功しませんでした。 | 脊椎分離が適切に行われていません。 | 椎骨を recontour: 椎体のすべての部分が含まれ、および任意の隣接する構造を除外するかどうかを確認します。 |
| 椎骨の位置の差が大きい | 回転を使用して参照の椎体と同じ向きに対象椎骨の位置を変更し、(ステップ 29 a) を反転します。 | ||
| 分析骨構造を正しく認識できません。 | 骨標本からのバック グラウンド ノイズを削除する登録モジュールにしきい値を適用します。 | ||
| 登録されている椎骨が異なる | あなたのサンプルの 3 d 画像を作成し、異なる時間ポイント間正しい脊椎を一致させます。 | ||
| 6 | 総量 (テレビ) はサンプル間で異なる | スライス数が異なる、または異なる輪郭を使用しました。 | 常に同じ輪郭サイズとスライスの同じ数を使用することを確認します。 |
| 骨のミネラル密度 (BMD) の値が異常 | :Microct の不十分な校正 | 正しいハイドロキシアパ タイト規格の:microct を調整します。 |
表 1: トラブルシューティングします。潜在的な問題と解決策は、プロトコルの異なる手順について掲載されています。
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Discussion
骨粗しょう症は、脊椎の椎体の崩壊、その結果負荷の増大による脊椎圧迫骨折の最も一般的な原因です。ただし、本物と同様の脊椎骨崩壊を複製する齧歯動物で傷害を生成する実質的に不可能です。研究者が OVCFs16,17,18,19,20,21,24を模倣する椎体の中央に円筒空洞を作成する代わりに、,38,39. 重要なサイズの欠陥が自然に治癒しない完全に 3 ヵ月後のオペアンプ16,17内介入なし 1 つとして定義された欠陥サイズの面で文学に一貫性がない、ので。
急速に骨粗鬆症を誘発する液晶と卵巣摘出を結合する方法は以前に公開した1,13歳、効率的、迅速に無胸腺ラットにこのアプローチを適用することを示す第 1 ができましたし、椎体海綿骨量とミネラル密度40の不可逆的な減少。これは、齧歯動物の免疫システムによって妨害されていない再現性のある小動物モデルとが追加されていないことがの必要性免疫抑制、24他で使用されています。
私たちの外科手術には、複数の重要な腰椎椎体欠陥の同じ40が生成されます。これは動物間で高い一貫性と簡単に匹敵するおよび定量化の欠陥の結果します。欠陥生成のこのアプローチを使用して、脊椎損傷モデルのラットの尾は、生体力学的力を受けるために、胸椎1,19,41で生成する優れたと考えていますラット腰椎を含むものと大幅に異なる。
このプロトコルの中で重要なステップは、LCD 後裸卵巣摘出ラットの壊れやすい脊椎を掘削時に術中の低体温症と注意を撮影を避けることなど。椎体の欠陥を生成した後に体内の µCT スキャン骨修復の縦断的評価の設定時点での一時的な順序を介して監視されます。同じスキャン設定を維持することが重要です。椎骨は凸凹し、スキャンの残りの部分から分離します。椎骨のスキャンをすべての同一容量の輪郭とグレースケール値の変更を避けることが重要です。市販複数イメージ登録アルゴリズムを容易に抽出の 2 回目以降のすべてのポイントに対応する解剖学的基準ヴォイス。最後に、これらのヴォイスは、見掛け密度などの骨量について分析します。同じパラメーターを使用してすべてのヴォイスを分析するが重要です。この手法は、ユーザー依存ではない高精度・簡単な縦 3 D µCT 分析を提供します。
このメソッドは、任意の縦骨欠損再生解析に適用でした。ここで使用される椎体欠陥モデルは、その骨の構造がユニークな同じ解剖学的位置を簡単に登録することができますにこのアプリケーションの便利なモデル。ただし、任意の骨再生は正しく縦スキャン全体の関心の同じ骨を分離することで同じ条件で分析でした。分離骨サンプルと同じ解剖学的機能を含めることが不可欠です。この潜在的な問題は、他が考えられる原因と推奨される解決方法と共に表 1のとおりです。登録手続きによって得られる解剖学的な一致は、サンプルに同じ解剖学的特徴が含まれている場合にのみ実行できます。登録ユーザーは時間の経過とともに精度の高い 3 D 組織計量解析の結果、すべての残りの時間ポイントに最初のスキャンの正確な定義済み VOI を適用できるようになります。骨体積密度と、ボイの見掛け密度は、新しい骨の形成を評価するために使用できます。
潜在的に広く適用できる、ここで提示されたモデルはありません制限なしです。無胸腺裸ラット使用見なすことができれば制限、それは可能性があります再生に重要である可能性がありますいくつかの免疫プロセスをマスク可能性があります。第二に、以前に発行された1,13として卵巣摘出と幼若ラットは、LCD の組み合わせにより骨粗鬆症のモデリングとすると、高齢者の患者人口の生物学を模倣する能力が限られます。第三に、外科手術によっては、骨粗鬆症に起因する骨折を持っているだけ、他の動物が霊長類42OVCFs をモデル化しました。最後に、ラット腰椎は人間の腰椎の最高の使用可能なモデル-ほとんどの椎体骨折が開発-齧歯動物の背骨の軸荷重の不足はまた制限。
このプロトコルはモジュール式なので可能性があります簡単に変更研究者のニーズに。たとえば、無胸腺の卵巣摘出ラットを利用して他骨粗鬆症に起因する骨折が検討される可能性があります。研究者は半自動・骨再生解析へのアプローチを使用してください、それはない必ずしもマイクロ コンピューター断層撮影画像、縦の構造を使用して任意の破壊モデルに適用でした。さらに、同時に磁気共鳴画像法などの画像診断装置を追加を使用して追加情報が収集します。
このプロトコルで提示した OVCF モデルは、この臨床的に満たされていない必要性に新しい治療法を勉強される可能性があります。さらはあまりユーザーに依存し、他のメソッド16より高い精度を提供します、同様の分析を実行する私たちの半自動解析アプローチを正常に使用できます。特に注目すべきは任意の研究者によって使用することができます市販の可視化と解析ソフトウェアを用いて事実-核磁気共鳴画像法などの画像診断装置を追加をサポートするソフトウェア。したがって、この方法は高い汎化可能な生体内イメージング機能と登録ソフトウェアの可用性に限られますことと考えています。
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Disclosures
本研究は、再生医学 (CIRM) (TR2-01780) カリフォルニア研究所からの助成金によって支えられました。
Acknowledgments
研究は、再生医学 (CIRM) (TR2-01780) カリフォルニア研究所からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
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