Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Semiautomated langsgående Microcomputed CT-baseret kvantitative strukturel analyse af en nøgen rotte osteoporose Vertebral fraktur Model

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/55928
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4
1Skeletal Biotech Laboratory, Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Målet med denne protokol er at generere en nøgen rotte osteoporose vertebrale kompression fraktur model, der kan være på langs evalueres i vivo ved hjælp af en semiautomated microcomputed CT-baseret kvantitative strukturel analyse.

Abstract

Osteoporose vertebrale kompressionsfrakturer (OVCFs) er et fælles og klinisk uopfyldte behov med stigende udbredelse som verdens befolkning aldre. OVCF dyremodeller er afgørende for de prækliniske udvikling af translationel tissue engineering strategier. Mens en række modeller i øjeblikket findes, beskriver denne protokol en optimeret metode for at fremkalde flere meget reproducerbare vertebrale defekter i en enkelt nøgen rotte. En roman langsgående semiautomated microcomputed tomografi (µCT)-baseret kvantitative strukturel analyse af vertebrale fejl er også detaljeret. Kort, rotter blev afbildet på flere gang point post-op. Dag 1-scanningen blev omlagt til en standard position, og en standard mængde af interesse blev defineret. Efterfølgende µCT scanninger af hver rotte blev automatisk registreret til dag 1 scan så den samme mængde af interesse blev derefter analyseret for at vurdere for ny knogledannelse. Denne alsidige tilgang kan tilpasses til en række andre modeller, hvor langsgående imaging-baseret analyse kunne drage fordel af præcise 3D semiautomated justering. Tilsammen beskriver denne protokol en let kvantificerbare og let at reproducere system for osteoporose og knogle forskning. Den foreslog protokol tager 4 måneder til at fremkalde osteoporose i nøgen ovariectomized rotter og mellem 2,7 og 4 h at generere, billede og analysere to vertebrale defekter, afhængigt af væv størrelse og udstyr.

Introduction

Mere end 200 millioner mennesker verden over lider af osteoporose1. Den underliggende patologiske fald i mineralske knogletæthed (BMD) og ændrede knogle mikroarkitektur øge knogle skrøbelighed, og dermed den relative risiko for fraktur2. Osteoporose er så udbredt og til skade for sundhed, WHO har defineret det et alvorligt folkesundhedsproblem. Desuden, som verdens befolkning ventes at alder, osteoporose forventes at blive endnu mere udbredt.

Osteoporotiske vertebrale kompressionsfrakturer er de mest almindelige skrøbelighed frakturer, anslås til mere end 750.000 om året i USA. De er forbundet med betydelig morbiditet og så meget som en ni-gange højere dødelighed Vurder3. I kliniske forsøg, blev i øjeblikket tilgængelige kirurgisk indgreb, såsom vertebroplasty og kyphoplasty, fundet for at være nogen mere effektiv end en fingeret behandling4,5, forlader kun smertebehandling tilgængelige til disse patienter. Da nuværende OVCF behandlinger er begrænset, er det nødvendigt at udvikle en dyremodel, der kan kopiere lidelse6,7,8. Sådanne animal modeller kunne lette undersøgelsen af nuværende behandlingsmetoder og udviklingen af nye terapier, der vil oversætte i klinisk praksis. Osteoporose er blevet induceret og vedholdende i model dyr gennem administrationen af en lav-calcium kost (LCD) i forbindelse med ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. til yderligere model knogletab tilknyttet OVCFs, vertebrale knogledefekter blev etableret i osteoporotiske immunkompetente rotter 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I dette arbejde, er en vertebrale defekt model af immunkompromitterede rotter med modellerede osteoporose præsenteret. Denne nye model kan bruges til at vurdere cellebaserede behandlinger der omfatter stamceller afledt af forskellige kilder og arter med henblik på reparation af udfordrende frakturer, såsom OVCFs.

Knogle imaging er en afgørende del af evalueringen af frakturer og knoglesygdomme. Avanceret billedbehandling metoder blev udviklet til den præcise vurdering af strukturelle knogle ændringer og regenerering strategier25. Blandt dem fremstod µCT imaging som en non-invasiv, nem at bruge og billig metode, der giver høj opløsning 3D-billeder. µCT imaging har flere fordele sammenlignet med andre modaliteter i evaluering osteoporosepatienter, da det giver høj opløsning 3D knogle mikroarkitektur26 der kan derefter analyseres kvantitativt. Sidstnævnte kan derefter bruges til at sammenligne de terapeutiske virkninger af foreslåede behandlinger. Faktisk, i vivo µCT imaging er en guld standard for vertebrale defekt regenerering overvågning1,16,27. Men få publikationer28,29,30,31 har ansat automatiseret registrering værktøjer til at minimere bruger-afhængighed, interpolation bias og præcision fejl af µCT Imaging-baseret analyse. For nylig, var vi de første til at bruge en registreringsprocedure til at forbedre analysen af knogle regenerering i en standardiseret knogle void, som forklaret i denne protokol32 .

Metoden beskrevet her kan bruges til at studere effekten af roman celle terapier for OVCFs, uhindret af vært T-celle respons, kan afvise allogene eller xenogene celler. Osteoporose er induceret hos unge rotter gennem ovariectomy (OVX) og 4 måneder på en LCD-skærm. Den unge alder af OVX rotter, kombineret med LCD, gav os mulighed at nå frem til en lav peak knoglemasse, efterligne postmenopausale osteoporose ved fører til irreversible knogletab. Dette kan forklares dels af det faktum, at under LCD og henne ved omkring 3 måneder i alder, rotter overgangen fra knoglen modellering til remodellering fase på den lændehvirvlerne33, hvilket øger sandsynligheden for, at opretholde osteoporose over tid. Ved hjælp af unge dyr gør denne model mere omkostningseffektive, som de koster mindre. Ikke desto mindre, det er begrænset af i sagens natur ikke tegner sig for de biologiske ændringer i den aldrende dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle dyreforsøg blev udført under en protokol, der er godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Cedars-Sinai Medical Center (protokol # 3609). Anæstesi blev administreret for alle billedbehandling og kirurgiske procedurer. Alle dyr har været opstaldet i overensstemmelse med godkendte IACUC protokoller.

Bemærk: den eksperimentelle design af denne protokol er vist i figur 1. Køb seks uger gamle rotter med deres æggestokke kirurgisk fjernet og fodrer dem LCD bestående af 0,01% calcium og 0,77% fosfat. Efter en periode på 4 måneder på en LCD-skærm, bore en kritisk størrelse vertebrale defekt i de fjerde og femte lumbal vertebrale organer (L4-L5). Efter kirurgi, image rotter på dag 1 og uge 2, 4, 8 og 12 efter defekt etablering. Find defekt margener på dag 1 scan, omlægge til en standard position og definere en cylindrisk volumen af interesse (VOI). Automatisk registrere de efterfølgende µCT scanninger (dvs. for uge 2, 4, 8 og 12) af hver rotte til positionen standard defineret for tilsvarende dag 1 scan. Anvende den dag 1 foruddefinerede VOI til registrerede scanninger. Vurdere volumen knogletæthed og tilsyneladende massefylde af VOIs.

1. induktion af osteoporose

  1. sætte seks uger gamle athymiske ovariectomized rotter på 4 måneder af LCD bestående af 0,01% calcium og 0,77% fosfat.
  2. Skifte tilbage til en normal kost.
    Bemærk: Disse rotter vil blive henvist til som " osteoporotiske rotter " herefter.

2. Vertebrale defekt Model

Bemærk: timingen er 40-50 min. pr. dyr.

  1. Autoklave alle kirurgiske værktøjer forud for kirurgi.
  2. For flere operationer, sterilisere alle kirurgiske værktøjer.
    1. Vaske værktøjerne og placere dem i en sonikator bad for 5 min. læg dem i en varm perle sterilizer sæt til 250 ° C i 20 s. Tillad værktøjer til at køle ned i 5 min.
  3. Inducere anæstesi.
    1. Sted osteoporotiske rotten i salen, induktion knyttet til en anæstesi maskine med en central skylleluften system. Fremkalde anæstesi ved hjælp af 5% isofluran i 100% ilt og vedligeholde via næsen kegle på 2-3% isofluran. Bruge vet salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
    2. Anvender en tå-knivspids stimulus at sikre passende fly af anæstesi. Hvis ingen svar bemærkes, indlede proceduren.
  4. Placere den bedøvede rotte i dorsal recumbency på en varmepude (37 ° C) og stræk lemmerne ved hjælp af en magnetisk fiksator retraktion system ( figur 2A).
    Bemærk: Temperaturen i den hede Afrivningsblok er vigtige for forebyggelse af hypotermi, da en bedøvede rotte er ude af stand til at regulere deres kropstemperatur.
  5. Barbere abdominale område ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Svaber det med jod-baserede antiseptisk og klorhexidin gluconat 0,5% efterfulgt af 70% ethanol.
  6. Indsprøjtes rotten med carprofen (5 mg/kg legemsvægt (BW), subkutane (SQ)) før du begynder den kirurgiske procedure.
  7. Bruge en steril skalpel til at skære huden. Begynde snit 1 cm under formet som et sværd proces og skære igennem midterlinjen (~ 5-8 cm) ( figur 2B).
  8. Bruge kirurgisk saks til at gøre et snit aponeurosis gennem linea alba adgang til bughulen ( figur 2 c).
  9. Afsløre bughulen bruger retraktorer ( figur 2D).
  10. Aflede tarmene til højre for rotten hen til afdække den abdominale aorta og venstre nyre ( figur 2E). Palpere lændehvirvelsøjlen før man går videre til at udsætte det. For at undgå dehydrering, bruge sterile gennemblødt gauzes med steril saltvandsopløsning til wrap de indre organer.
  11. Brug thermocautery at udsætte i lag den forreste del af lumbal vertebrale organer L4-5 og isolere dem fra de omkringliggende bindevæv og muskler ( figur 2F -G).
    Bemærk: Thermocautery skal bruges til at kontrollere blødning under dissektion.
  12. Bruge en steril vatpind mættet med sterilt saltvand til at fjerne blod og resterende væv fra L4 ryghvirvler. Bruge en steril Trephine drill bur (~ 2 mm i diameter) til at bore en 5 mm dyb knogle defekt i centrum af den eksponerede forreste del af vertebrale kroppen (figur 2 H-jeg).
    Bemærk: Anvend minimal pres til at bore gennem kun ventrale cortex og underliggende trabekulær knogle; undgå at bore gennem den dorsale cortex. Bemærk at ryghvirvler af osteoporotiske rotter er meget skrøbelige. Brug en vatpind til at rense defekten og pres til at stoppe blødninger, hvis stede.
  13. Gentag trin 2.11 på L5 ryghvirvel at skabe en total af 2 fejl pr. rotte ( figur 2J).
  14. Returnerer tarmen til bughulen.
  15. Bruger en vicryl syntetiske resorberbare kirurgiske sutur (3-0 vicryl ufarvede 27 " SH taper) i en kontinuerlig mønster til sutur aponeurosis ( figur 2 K).
  16. Lukke huden ved hjælp af en 4-0 monofilamenter nylon ikke-resorberbare sutur i en simpel afbrudt mønster ( figur 2 L).
  17. Anvender 100 µL af aktuel hud lim på huden suturer og mellem dem for at sikre fuldstændig lukning af huden.
  18. Indsprøjtes rotten med varm (37 ° C) laktat ringer ' s løsning (1CC/100 g BW, SQ) at forhindre hypotermi og dehydrering.
  19. Indsprøjtes rotten med buprenorphin (0,5 mg/kg BW, SQ) før operationen og hver 8-12 h for post-op smertelindring efter behov.
  20. Efterlad ikke dyret uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Også, ikke returnerer et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil det er fuldt tilbagebetalt.
  21. Efter at dyret er kommet på den hede afrivningsblok, vende tilbage til sit bur.
    Bemærk: Hus rotter individuelt (dvs., i separate bure) at forhindre rotte til rotte lemlæstelse af suturer og sår.
  22. Placere chow dyppet i vand i en petriskål stueetagen bur for et par dage post-op at hjælpe rotter nå fødevaren.
  23. Administrere carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24 timer efter operation for smertelindring hver 24 h resultatfilen.
  24. Fjerne hud suturer, mens dyret er under 2% isofluran anæstesi 10-14 dage efter operationen.

3. MicroCT Scanning

Bemærk: timingen er 30-40 min. pr. dyr.

  1. På dagen efter den kirurgiske procedure, placere osteoporotiske rotten i induktion salen knyttet til en anæstesi maskine med en central skylleluften system. Fremkalde anæstesi ved hjælp af 5% isofluran i 100% ilt og vedligeholde via næsen kegle på 2-3% isofluran.
  2. Scan rotte ved hjælp af en i vivo µCT scanner. Gentag scanning for den langsgående analyse af knogle regenerering.
    Bemærk: Sørg for, at alle dyr, der scannes ved hjælp af de samme indstillinger (dvs., X-ray energy, scanning medium, intensitet, voxel størrelse og billedopløsningen) og i en similar orientering. For eksempel: X-ray energy, 55 kVP; aktuelle, 145 µA; voxel størrelse, 35 µm; intervaller, 115 µm; og integration tid, 200 ms; med prøver i PBS. Henvise til Bouxtein et al. 34 for yderligere forklaringer og betragtninger, der er involveret i gnaver µCT scanning for en vurdering af knogle mikrostruktur. Ideelt, den højeste mulige scanningsopløsning vil blive anvendt for alle scanninger; dog højere opløsning scanninger kræver længere erhvervelse gange, generere store datasæt, og udsætter dyrene for flere ioniserende stråling. Sidstnævnte kan indføre uønskede virkninger, herunder forringet frakturheling. Derfor, afvejningen mellem yderligere data og scan tid bør overvejes nøje.

4. Vertebrale adskillelse

Bemærk: timingen er 20-30 min. pr. sample.

  1. Contour ryghvirvel af interesse, som vist i figur 3A-I. Sørg for at medtage alle dele af ryghvirvel mens bortset fra dele, som tilhører tilstødende ryghvirvler.
    1. Klik på " µCT evaluering program " og vælg stikprøven menuen.
    2. Contour hver skive ved hjælp af musen.
    3. Brug den " Z " bar at gå til det næste udsnit.
  2. Gemme kurvede ryghvirvel som en separat fil ( figur 3J -K) ved at klikke på " fil " → " Spar GOBJ " hver par skiver.

5. definition af VOI for langsgående kvantitative evaluering

Bemærk: de følgende trin afhænger af, om scanningen er fra dag 1 efter operationen (reference ryghvirvel) eller fra senere tid point ( målrette ryghvirvler).

  1. Reference ryghvirvel.
    Bemærk: Timingen er 20-30 min. pr. prøve.
    1. For Z-rotation, måle vinklen på margener ved hjælp af en XY-udsnit fra midten af defekten ( figur 4A -B).
      1. I Z-flyet, gå til området af ryghvirvel hvor defekten er de fleste klar og screen capture ryghvirvel.
      2. i en præsentation software, forberede en rektanglet-formede objekt, der vil passe ind i defekten.
      3. Rotere billedet af ryghvirvel, således at defekten vender opad og defekt margener er parallel med rektanglets sider.
      4. Måle rotationsvinklen (Højreklik på billedet → " Formater billede " → " størrelse ").
      5. Bruger den målte vinkel for at rotere ryghvirvel ( figur 4 c).
        1. Åbne et nyt vindue, DECterm (" Session manager " → " programmer " → " DECterm ").
        2. Køre " ipl ":
        3. Ipl > turn3d
        4. -input [i] >
        5. -output [ud] >
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
        7. -turnangle [0.000] > målte vinkel
        8. -img_interpol_option [1] >
    2. For X-rotation, måle vinklen på margener ved hjælp af en YZ-skive fra midten af defekten ( figur 4D -E). Brug den målte vinkel til at rotere ryghvirvel ( figur 4F).
      1. Klik på " YZ " i " uCT evaluering program " og gentage trin 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > isq
      3. -aim_name [i] >
      4. -isq_filename [default_file_name] > Indsæt ISQ fil mappe (f.eks. " DK0: [MICROCT. DATA. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -dim [-1-1 -1] >
    3. Flip den roterede ryghvirvel ved at ændre XY-fly til ZX-fly.
      1. Åbne et nyt vindue, DECterm (" Session manager " → " programmer " → " DECterm ").
      2. Køre " ipl ":
      3. Ipl > flip-
      4. -input [i] > ud
      5. -indgang [ud] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. Definerer VOI.
      1. Tegne en cirkulær konturen af defekten ved hjælp af en skive fra midten af defekten ved at vælge ikonet for cirkulære kontur i " uCT evaluering program " ( figur 6A). Kopi, som kontur og indsætte det på alle skiver i defekt ( fig. 6B).
        Bemærk: Da alle fejl, der blev oprettet ved hjælp af den samme procedure, analysere det samme antal skiver og efterfølgende, det samlede volumen (TV) på alle prøveeksemplarer.
  2. Mål ryghvirvel.
    Bemærk: Timingen er 10-20 min pr. prøve.
    1. Belastning af DICOM-filer både mål og reference ryghvirvler til hovedvinduet i billed analyse software.
      Bemærk: At undgå gråtoner værdiændringer, definere det samme output datatype som de oprindelige DICOM-filer i menuen belastning.
    2. Register til henvisningen ryghvirvel.
      1. Lanceringen den " 3D-Voxel registrering " modul og input reference ryghvirvel som den " Base volumen " og target ryghvirvel som den " Match volumen. " Klik " registrere " at registrere ryghvirvler ( Figur 5).
    3. Gemme den registrerede fil ved hjælp af de samme datatype og importere den til et µCT miljø.
    4. Gælder VOI.
      1. Anvend VOI defineret for referencen ryghvirvel til registrerede target ryghvirvel ved at klikke på " uCT evaluering program " → " fil " → " belastning GOBJ " og vælge GOBJ oprettet tidligere. Kontroller, at VOI og defekt er koncentrisk.

6. MicroCT analyse

Bemærk: timingen er 10-20 min pr. sample.

  1. Send VOI for evaluering ved hjælp af en µCT evaluering program ( figur 6).
    Bemærk: Sørg for at bruge de samme parametre, når du analyserer alle VOIs. Sørg for tærsklen, der er indstillet højt nok til at udelade baggrundsstøj med minimalt tab af knoglen. Hvis en røntgenfast biomateriale bruges, kan en række strategier bruges til at analysere knogledannelse. Hvis der er en forskel i densitet biomateriale og knogle væv, kunne biomateriale segmenteres ud af 35 , 36. Ellers efterforskerne kvalitativt kunne vurdere forskellene i knogledannelsen mellem eksperimentelle grupper.

7. Dødshjælp

  1. PPlace osteoporotiske rotten i salen, induktion knyttet til en anæstesi maskine. Fremkalde anæstesi ved hjælp af 5% isofluran i 100% ilt.
  2. Opretholde anesthesia via næsen kegle og udføre aktiv dødshjælp af incising brysthulen for at producere en bilateral pneumothorax 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol, kan et billede og kvantificere regenerering af n = 8 modellerede osteoporotiske vertebrale defekter på tværs af forskellige tidspunkter. Den anatomiske match fremstillet af registreringsproceduren giver mulighed for analyse af den samme VOI på alle tidspunkter. Dette resulterer i en meget nøjagtig langsgående 3D histomorphometric analyse, selv når margenerne i den oprindelige fejl ikke længere genkendelige. Vi brugte fem gang point (dag 1, uge 2, uge 4, uge 8 og uge 12) som et eksempel for de langsgående evaluering af knogle regenerering (figur 7). Regeneration kan vurderes, både af den kvalitative vurdering af 2D tværsnit og 3D-billeder (som illustreret i figur 7A) og ved en kvantitativ sammenligning af knogle mængde (BVD) og kvalitet (AD) (figur 7B). De følgende morfometrisk indeks kan bestemmes til nydannede knogle: (i) TV, herunder knogler og bindevæv diskenheder (TV, mm3); (ii) volumen af mineraliseret væv (BV, mm3); (iii) volumen knogletæthed (BV/TV); og (iv) knoglemineraltætheden (BMD, mg hydroxyapatit pr. cm3). Specifikt, blev minimal knogledannelse (5% stigning i volumen knogletæthed) observeret 2 uger efter defekt etablering. Efter to uger, blev ingen betydelige forskelle i knogledannelsen observeret i forhold til nyere tid point. Samlet, selv om der var en vis grad af knogledannelse, som toppede på omkring 10% af uge 8, det var minimal nok til at opretholde knoglen ugyldige over tid.

Figure 1
Figur 1: protokol Design. De vigtigste skridt i protokollen er skitseret. Første, ovariectomized nøgen rotter udsat for fire måneder af et lavt calcium kost (LCD) blev drevet ved at oprette standard kritiske mellemstore defekter i to lumbal vertebrale organer. Rotter blev afbildet på dag 1 og uge 2, 4, 8 og 12 post-op. Dag 1-scanningen blev omlagt til en standard position, og en cylindrisk VOI blev defineret ved hjælp af defekt margener. Efterfølgende µCT scanninger af hver rotte blev automatisk registreret til den standard placering defineret for tilsvarende dag 1 scan. Dag 1 foruddefinerede VOI blev derefter anvendt til registrerede scanninger. Volumen knogletæthed og tilsyneladende massefylde af VOI blev brugt til at vurdere nye knogledannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vertebrale defekt kirurgi. De vigtigste skridt i den kirurgiske generation af vertebrale defekter er illustreret. Først, rotter blev placeret på en varmepude (A). En midterlinjen indsnit foregik gennem huden (B) og derefter linea alba (C) at udsætte bughulen (D). Tarmene afspejledes for at udsætte den bageste bugvæggen (E), og lændehvirvelsøjlen blev udsat ved hjælp af thermocautery (pil, F-G). Defekter blev boret i fjerde (H, pil, der peger til drill; Jeg, pil, der peger til defekten) og femte (Jørgensen, pilene peger mod defekter) lumbal vertebrale organer. Endelig, aponeurosis (K) og huden (L) var sutureres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ryghvirvel adskillelse. De vigtigste skridt på tilretning af en ryghvirvel af interesse er vist. (A-jeg) Kurvede (grøn linje) repræsentative 2D skiver langs længden af en ryghvirvel er vist. En 3D repræsentation af fuld rygsøjlen (J) kan sammenlignes med de adskilte ryghvirvel (K). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Reference ryghvirvel positionering. Repræsentative udsnit i to planer, der er vist af en ryghvirvel før og efter rotation til en standard position. Først er ved hjælp af en repræsentant XY-Skive (A), vinklen (B, grøn) skulle rotere defekt (B, rød firkant) bliver parallel med y-aksen (B, gul) fast besluttet på og derefter bruges til at oprette det roterede billede (C ). Derefter er bruger en repræsentant YZ-Skive (D), vinkel (E, grøn) skulle rotere defekt (E, rød firkant) at blive parallel til z-aksen (E, gul) fast besluttet på og derefter bruges til at oprette det roterede billede (F ). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: målrette ryghvirvel registrering. Repræsentative skiver på tre planes af target ryghvirvel (markeret i grøn) og reference ryghvirvel (markeret med rødt) før (A-C) og efter (D-E) registrering er vist. Bemærk den gule farve, der angiver overlapning mellem target og reference ryghvirvler, og de hvide pile, der peger på grønne ben efter regenerering, med angivelse af knogledannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: VOI analyse. Repræsentative udsnit i to planer med kurvede mængden af interesse er vist. En cirkulær contour er placeret i midten af defekten i en repræsentant ZX-Skive (A). Efter Profilstyring alle ZX-skiver, kan komplet defekt volumen ses i XY-plan (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: langsgående analyse af vertebrale defekt regenerering. Kvalitative og kvantitative repræsentative knogle regenerering analyseresultater er vist. (A) A repræsentative vertebrale defekt på forskellige tidspunkter er afbildet i hvert panel som en frontal 3D billede (toppanelet) med knogledannelse i det tomrum, der er angivet i rød, en sagittal 2D billede (midterste panel) og en aksial 2D billede (nederste panel). Kvantitativ analyse af knogledannelse i brud blev udført. Bone volumen (B) og tilsyneladende massefylde (C) blev beregnet og sammenlignet ved hjælp af en gentagen måler to-vejs ANOVA med Bonferroni korrektion for flere sammenligninger. Fejllinjer udgør SEM. ***-p < 0,0001. Venligst klik på hendee at se en større version af dette tal.

Trin Problem Mulig årsag Løsning
2.3 Dyr gispende under anæstesi Overskydende isofluran levering Reducere koncentrationen af isofluran leveret til dyret.
Dyr reagerer til tå knivspids Utilstrækkelig isofluran levering Øge koncentrationen af isofluran.
2.7-2.12 Kraftig blødning Vaskulære skader Bruge en steril vatpind til at anvende pres eller cautery til at stoppe blødninger.
Dyret har åndedrætsbesvær Mellemgulvet var punkteret Aflive dyret for at forhindre kvælning.
Udsivning af tarmindhold Mave-tarmkanalen var punkteret Aflive dyret for at forhindre yderligere komplikationer. Undgå det ved at løfte aponeurosis fra underliggende tarmene før opskæring.
Blodet tappes fra webstedet boring Et blodkar var punkteret Anvend en steril vatpind indtil blødningen standser.
Dyret ryster pludselig under boring Øvelsen gik for dybt og beskadiget rygmarven Aflive dyret for at forhindre yderligere komplikationer.
Knogle defekt ser ufuldstændig Øvelsen gik ikke dybt nok Flyt borehovedet inde defekten og bore dybere
2.15-2.24 Sutur pauser Sutur var trukket for stramt Erstatte den hele sutur. Hvis bruddet sker ofte, skal du bruge en størrelse tykkere sutur.
Dyret er langsom til at inddrive fra anæstesi Dyret er hypotermiske Øge temperaturen på den hede afrivningsblok eller anvende en supplerende kilde til varme (fx varme lampe).
Suturer er åben Suturer var sat løst, eller dyret gjorde anstrengende aktivitet Genanvende suturer og anvende Dermabond direkte til suturer og indbyrdes.
3 Scannede billede vises med lav opløsning, støjende eller spredte Scanningsparametre skal justeres Justere parametrene for scanning protokollen. Henvise til Bouxsein et al. for flere retningslinjer for scanning.
Scannede billede vises sløret Dyret flyttes under scanningsprocessen RESCAN dyret. Hvis bevægelse fortsætter, øge isofluran koncentration.
5 Registrering af målet ryghvirvel var ikke vellykket Vertebrale adskillelse ikke var gjort ordentligt Recontour ryghvirvel: Sørg for, at alle dele af ryghvirvel er inkluderet, og udelukke enhver tilstødende strukturer.
Stor forskel i placeringen af ryghvirvler Flyt target ryghvirvel i den samme retning som reference ryghvirvel ved hjælp af rotationer og flip (trin 29A).
Analysere genkender ikke korrekt knogle strukturer Anvende en tærskel i modulet registrering at fjerne baggrundsstøjen fra bone prøver.
De registrerede ryghvirvler er forskellige Opret 3d-billeder af dine prøver og matcher de korrekte hvirvlerne på tværs af de forskellige tidspunkter.
6 Det samlede volumen (TV) er forskellige mellem prøver Enten et varierende antal skiver eller en anden kontur blev brugt Sørg for altid at bruge den samme kontur størrelse og det samme antal skiver.
Knogle mineral tæthed (BMD) værdi er unormale Utilstrækkelig kalibrering af microCT Kalibrere microCT for korrekte hydroxyapatit standarder

Tabel 1: fejlfinding. Potentielle problemer og løsninger præsenteres for de forskellige trin i protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osteoporose er den mest udbredte årsag til vertebrale kompressionsfrakturer forårsaget af en øget belastning på ryggen og dette resultat i sammenbrud af vertebrale kroppen. Men det er praktisk umuligt at generere en skade i en gnaver, der autentisk replikater en lignende vertebrale sammenbrud. I stedet, forskere skabe en cylindrisk tomrum i midten af vertebrale kroppen til at efterligne OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. da der er ingen konsistens i litteratur defekt størrelsesmæssigt, en kritisk størrelse defekt blev defineret som en, der ikke spontant heler helt uden en intervention inden for 3 måneder post-op16,17.

Selv om metoden til at kombinere ovariectomy med en LCD-skærm til hurtigt inducerer osteoporose var tidligere publicerede1,13, vi var de første til at vise, at anvende denne fremgangsmåde til athymiske rotter resulterer i en effektiv, hurtig, og irreversibel fald i vertebrale trabekulær knogle volumen og mineral density40. Dette er en reproducerbar små dyr model, der er uhindret af gnaver immunsystemet og der ikke gør har behov for tilsat immunosuppression, som bruges af andre24.

Vores kirurgisk protokol genereret flere identiske kritiske lumbal vertebrale fejl40. Dette resulterer i meget konsekvent og let sammenlignelige og kvantificerbare defekter på tværs af dyr. Vi mener, at defekter produceret ved hjælp af denne fremgangsmåde er overlegen i forhold til vertebrale defekt modeller genereret i caudale ryghvirvler1,19,41 , fordi den rotte hale er udsat for biomekaniske kræfter, der er markant forskellige fra dem, der involverer rotte columna lumbalis.

Kritiske trin i denne protokol omfatter undgå intra-operative hypotermi og tage forsigtighed når boring af skrøbelige ryghvirvler ovariectomized nøgen rotter efter en LCD-skærm. Efter skaber den vertebrale defekt, er det overvåges via en tidsmæssig rækkefølge i vivo µCT scanninger på indstillede tid point for den langsgående vurdering af knogle reparation. Opretholde de samme Scannerindstillinger er kritisk. Hvirvlerne er derefter Konturskårne og adskilt fra resten af scanningen. Profilstyring en identisk samlede volumen for alle scanninger af en ryghvirvel og undgå gråtoner værdiændringer er kritisk. Et kommercielt tilgængelige flere billede registrering algoritme letter udvinding af anatomisk tilsvarende baseline VOIs til alle efterfølgende tid point. Endelig, disse VOIs er analyseret for knogle volumen, tilsyneladende massefylde, osv. Det er kritisk at analysere alle VOIs ved hjælp af de samme parametre. Denne teknik giver en meget nøjagtig og ligetil langsgående 3D µCT analyse, ikke der bruger-afhængige.

Denne metode kan anvendes på enhver langsgående knogle defekt regenerering analyse. Den vertebrale defekt model bruges her er en bekvem model for denne ansøgning, som dens knoglebygning er unikt og let kan registreres den samme anatomiske holdning. Men nogen knogle regenerering kunne analyseres under de samme betingelser ved korrekt at adskille det samme ben af interesse i hele længderetningen scanninger. Det er bydende nødvendigt at medtage adskilt bone prøver med de samme anatomiske funktioner. Dette potentielle problem og andre er beskrevet i tabel 1, sammen med mulige årsager og forslag til løsninger. Den anatomiske match fremstillet af registreringsproceduren kan kun forekomme, hvis prøverne indeholder samme anatomiske funktioner. Registrering vil tillade brugeren at anvende den nøjagtige foruddefinerede VOI af den første scan til alle resterende tid point, hvilket resulterer i en meget nøjagtig 3D histomorphometric analyse over tid. Knogle volumen og tilsyneladende massefylde i VOI kan bruges til at vurdere nye knogledannelse.

Mens potentielt almindeligt gældende, er model præsenteres her ikke uden begrænsninger. Brugen af athymiske nøgen rotter overvejes en begrænsning, som det kunne potentielt maske nogle immun-medieret processer, der kan være af betydning for regenerering. For det andet er modellering osteoporose gennem en kombination af ovariectomy og LCD hos unge rotter, som tidligere publicerede1,13, begrænset i sin evne til at efterligne den ældre patientgruppe biologi. For det tredje blev OVCFs modelleret af en kirurgisk procedure, som de kun andre dyr at have osteoporose frakturer er primater42. Endelig, mens rotten columna lumbalis er den bedste tilgængelige model for den menneskelige columna lumbalis — hvor de fleste vertebrale frakturer udvikle — manglen aksial vægtbærende i gnavere rygsøjlen er også en begrænsning.

Denne protokol er modulopbygget og derfor kan let modificeret til forskerens behov. For eksempel, kunne den athymiske ovariectomized rats bruges til at studere andre osteoporose frakturer. Bør en forsker vælger at bruge vores tilgang til semiautomated knogle regenerering analyse, kunne det anvendes på enhver fraktur model ved hjælp af langsgående strukturelle imaging, ikke nødvendigvis mikro-beregnet tomografi. Derudover kunne yderligere oplysninger indsamles af samtidigt ved hjælp af yderligere Billeddannende modaliteter som magnetisk resonans.

Den OVCF model præsenteret i denne protokol kan bruges til at studere roman terapeutiske tilgange til denne klinisk udækket behov. Desuden vores semiautomated analyse tilgang med held kan anvendes til at udføre en lignende analyse, der er mindre bruger-afhængige og giver bedre nøjagtighed end andre metoder16. Særligt bemærkelsesværdigt er det faktum, at vi brugt kommercielt tilgængelige visualisering og analyse software, der kan bruges af enhver forsker-software, der understøtter yderligere billeddiagnostiske modaliteter, såsom magnetisk resonans billeddannelse og nukleare billeddannelse. Vi mener derfor, at denne metode er meget generaliserbart og er kun begrænset af tilgængeligheden af i vivo billeddannelse kapaciteter og registrering software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Denne forskning blev støttet af en bevilling fra California Institute for regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).

Acknowledgments

Forskningen blev støttet af en bevilling fra California Institute for regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
  2. Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
  3. Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
  4. Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
  5. Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
  6. Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
  7. Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
  8. Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
  9. Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
  10. Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
  11. Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
  12. Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
  13. Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
  14. Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
  15. Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
  16. Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
  17. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
  18. Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
  19. Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
  20. Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
  21. Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
  22. Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
  23. Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
  24. Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
  25. Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
  26. Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
  27. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  28. Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
  29. de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
  30. Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
  31. Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
  32. Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
  33. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
  34. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  35. de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
  36. Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
  37. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
  38. Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
  39. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
  40. Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
  41. Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  42. Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).

Tags

Bioteknologi sag 127 osteoporose microcomputed tomografi fraktur nøgen rotte semiautomated ryghvirvel
Semiautomated langsgående Microcomputed CT-baseret kvantitative strukturel analyse af en nøgen rotte osteoporose Vertebral fraktur Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., … More

Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter