Summary
Målet med detta protokoll är att generera en naken råtta benskörhetsrelaterade vertebrala komprimering fraktur modell som kan vara längdriktningen utvärderade i vivo med en halvautomatiserad microcomputed tomografi-baserade kvantitativa strukturell analys.
Abstract
Benskörhetsrelaterade vertebrala kompressionsfrakturer (OVCFs) är ett vanligt och kliniskt otillfredsställda behov med ökande prevalens i världens befolkning åldras. OVCF djurmodeller är nödvändiga för den prekliniska utvecklingen av translationell tissue engineering strategier. Medan ett antal modeller finns för närvarande, beskriver det här protokollet en optimerad metod för att inducera flera mycket reproducerbara vertebrala defekter i en enda naken råtta. En roman längsgående halvautomatiserad microcomputed tomografi (µCT)-baserade kvantitativa strukturella analysen av vertebrala defekterna är också detaljerade. Kort, råttor var avbildade på flera tid punkter efter op. Dag 1 Skanna var omorienteras till standardpositionen och en standard volym av intresse definierades. Efterföljande µCT skanningar av varje råtta registrerades automatiskt till dag 1 avsöka så samma volym av intresse var sedan analyseras för att bedöma för ny benbildning. Detta mångsidiga tillvägagångssätt kan anpassas till en mängd andra modeller där längsgående imaging-baserad analys kunde dra nytta av exakt 3D halvautomatiserad anpassning. Sammantaget beskriver det här protokollet ett lätt kvantifierbara och enkelt reproducerbar system för osteoporos och ben forskning. Föreslagna protokollet tar 4 månader att inducera osteoporos i naken ovariectomized råttor och mellan 2,7 och 4 h att generera, bild och analysera två vertebrala defekter, beroende på vävnad storlek och utrustning.
Introduction
Mer än 200 miljoner människor i världen lider av benskörhet1. Den underliggande patologiska minskning av bentätheten (BMD) och förändrad ben mikroarkitektur öka ben skörheten och, följaktligen, den relativa risken för fraktur2. Osteoporos är så utbrett och skadliga för hälsan att WHO har definierat det som ett stort folkhälsoproblem. Dessutom eftersom världens befolkning väntas ålder, förväntas osteoporos bli ännu vanligare.
Osteoporotiska vertebrala kompressionsfrakturer är de vanligaste instabila frakturer, uppskattningsvis mer än 750 000 om året i USA. De är förknippade med betydande morbiditet och så mycket som en nio-gånger högre dödlighet Betygsätt3. I kliniska prövningar befanns för närvarande tillgängliga kirurgiska ingrepp, såsom vertebroplasty och kyphoplasty, vara ingen mer effektiv än en simulerad behandling4,5, lämnar endast smärtlindring finns till dessa patienter. Eftersom nuvarande OVCF behandlingar är begränsade, är det absolut nödvändigt att utveckla en djurmodell som kan replikera den sjukdom6,7,8. Sådana modeller kan underlätta både utredningen av nuvarande behandlingsmetoder och utvecklingen av nya terapier som kommer att översätta till klinisk praxis. Osteoporos har inducerad och ihållande i modell djur genom förvaltning av en låg-kalcium kost (LCD) i samband med ovariektomi1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. för att ytterligare modell av benförlust associerad med OVCFs, vertebrala ben defekter etablerades osteoporotiska immunkompetenta råttor 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I detta arbete presenteras en vertebrala defekt modell av Immuninkompetenta råttor med modellerade osteoporos. Denna nya modell kan användas för att bedöma cellbaserade terapier som involverar stamceller som härrör från olika källor och arter för reparation av utmanande frakturer, såsom OVCFs.
Ben bildbehandling är en viktig del av utvärdering av frakturer och benvävnad. Avancerade avbildningsmetoder har utvecklats för korrekt bedömning av strukturella ben förändringar och förnyelse strategier25. Bland dem, har µCT imaging framträtt som en icke-invasiv, lätt-till-använda och billig metod som ger högupplöst 3D-bilder. µCT imaging har flera fördelar över andra modaliteter i utvärdera patienter med osteoporos, eftersom den erbjuder högupplösta 3D ben mikroarkitektur26 som sedan kan analyseras kvantitativt. Den senare kan sedan användas för att jämföra de terapeutiska effekterna av föreslagna behandlingar. I vivo µCT imaging är faktiskt en guld-standard för vertebrala defekt regenerering övervakning1,16,27. Dock har några publikationer28,29,30,31 anställda automatisk registrering verktyg för att minimera den användaren-beroende, interpolation bias och precision fel av µCT Imaging-baserad analys. Nyligen var vi först med att använda ett registreringsförfarande för att förbättra analysen av ben förnyelse i ett standardiserat ben ogiltiga, som förklaras i detta protokoll nr32 .
Den metod som beskrivs här kan användas för att studera effekten av romanen cellterapi för OVCFs, obehindrat av värd T-cell svar som skulle avvisa allogena eller xenogena celler. Osteoporos är induceras hos unga råttor genom ovariektomi (OVX) och 4 månader för en LCD. Ung ålder av OVX råttorna, kombinerat med LCD får oss att nå en låg maximal benmassa, härma postmenopausal osteoporos av leder till oåterkalleliga benförlust. Detta kan delvis förklaras av det faktum att, under LCD-skärmen och på cirka 3 månader, råttor övergången från benet modellering till remodeling fas på ländkotorna33, vilket ökar sannolikheten för att upprätthålla osteoporos tid. Med unga djur gör denna modell mer kostnadseffektivt, eftersom de kostar mindre. Dock begränsas av sin natur inte redovisning av de biologiska förändringarna i den åldrande djuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla djurförsök har utförts enligt ett protokoll som godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center (protokoll nr 3609). Anestesi administrerades för alla tänkbar och kirurgiska ingrepp. Alla djur har varit inhysta i enlighet med godkända IACUC protokoll.
Obs: experimentell design i detta protokoll visas i figur 1. Köpa sex veckor gamla råttor med äggstockarna opereras bort och mata dem LCD bestående av 0,01% kalcium och 0,77% fosfat. Efter en period av fyra månader av en LCD, borra en kritisk-storlek vertebrala defekt i fjärde och femte lumbala ryggraden organ (L4-L5). Efter operation, bild råttorna på dag 1 och vecka 2, 4, 8 och 12 efter defekt etablering. Lokalisera defekten marginaler på dag 1 Skanna, omorientera till standardpositionen och definiera en cylindrisk volym av intresse (VOI). Registrera automatiskt efterföljande µCT skannar (dvs. för vecka 2, 4, 8 och 12) av varje råtta till standard position definieras för motsvarande dag 1 Skanna. Applicera den dag 1 fördefinierade VOI till registrerade skanningar. Bedöma volymen bentäthet och skenbar täthet av VOIs.
1. induktion av osteoporos
- sätta sex veckor gamla atymiska ovariectomized råttor på 4 månader av LCD bestående av 0,01% kalcium och 0,77% fosfat.
- Växla tillbaka till en normal kost.
Obs: Dessa råttor kommer att betecknas som " osteoporotiska råttor " härefter.
2. Vertebrala defekt modell
Obs: tidpunkten är 40-50 min per djur.
- Autoklav alla kirurgiska verktyg före operationen.
- i fråga om flera operationer, sterilisera alla kirurgiska verktyg.
- Tvätta verktyg och placera dem i ett någon sonikator bad för 5 min. Lägg dem i en het pärla autoklaven till 250 ° C för 20 s. Tillåt verktygen svalna i 5 min.
- Inducera anestesi.
- Plats osteoporotiska råtta i induktion kammaren bifogas en anestesi maskin med ett centralt rensning system. Inducera anestesi med 5% isofluran i 100% syre och underhåll via näsan konen på 2-3% isofluran. Använda vet salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Tillämpas en tå-nypa stimulans att säkerställa adekvat planet av anestesi. Om inget svar noteras, inleda förfarandet.
- Placera den sövda råttan i dorsala koordinationsrubbning på en värmedyna (37 ° C) och sträcka ut armar och ben med hjälp av en magnetisk fixeringsanordning returgående fas system ( figur 2A).
Obs: Temperatur i vetekudde är viktigt för att förebygga hypotermi, eftersom en sövda råtta är oförmögen att reglera sin kroppstemperatur. - Raka buken med en rakapparat. Svabba det med jod-baserade antiseptisk och klorhexidin glukonat 0,5% följt av 70% etanol.
- Injicera råtta med karprofen (5 mg/kg kroppsvikt (BW), subkutan (SQ)) innan du påbörjar ingreppet.
- Använda en steril skalpell skära huden. Börja snittet 1 cm under den xiphoid processen och skär genom mittlinjen (~ 5-8 cm) ( figur 2B).
- Använd kirurgisk sax göra ett snitt av aponeurosis genom linea alba tillgång till bukhålan ( figur 2 c).
- Exponera bukhålan med upprullningsdon ( figur 2D).
- Avleda tarmar till höger om råttan att exponera bukaorta och vänster njure ( figur 2E). Palpera ländryggen innan du fortsätter att avslöja den. För att undvika uttorkning, använda sterila blötläggas Flor med steril koksaltlösning för att Linda de inre organen.
- Användning termokauterisering att exponera i lager den främre delen av ländryggen vertebrala organ L4-5 och isolera dem från de omgivande bindväv och muskler ( figur 2F -G).
Obs: Termokauterisering bör användas för att styra blödning under dissektion. - Använd en steril bomullspinne mättad med steril koksaltlösning för att avlägsna blod och kvarvarande vävnad från kotorna L4. Använd en steril Trephine borr bur (~ 2 mm i diameter) att borra ett 5 mm djupa ben defekt i mitten av den exponerade främre delen av ryggraden kroppen (figur 2 H-jag).
Obs: Applicera minimalt tryck att borra genom endast ventrala cortex och underliggande trabekulärt ben; undvika borrning genom den dorsala cortexen. Observera att kotorna av osteoporotiska råttor är mycket bräcklig. Använd en bomullstopp att rensa felet och utöva påtryckningar för att stoppa blödning, om närvarande. - Upprepa steg 2.11 på L5 kotan att skapa totalt 2 defekter per råtta ( figur 2J).
- Tillbaka tarmarna till bukhålan.
- Använda en vicryl syntetiska resorberbara kirurgiska suturer (3-0 vicryl ofärgade 27 " SH Kona) i en kontinuerlig mönster till sutur aponeurosis ( figur 2 K).
- Nära huden med hjälp av en 4-0 monofilament nylon icke-resorberbar sutur i ett enkelt avbruten mönster ( figur 2 L).
- Gäller 100 µL av aktuell hudlim ovanpå huden suturerna och mellan dem för att säkerställa fullständig nedläggning av huden.
- Injicera råtta med varmt (37 ° C) ringer ringer ' s lösning (1 ml/100 g Kroppsvikt, SQ) för att förhindra hypotermi och uttorkning.
- Injicera råtta med buprenorfin (0,5 mg/kg BW, SQ) före operationen och varje 8-12 h för postoperativa smärtlindring som behövs.
- Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Dessutom inte tillbaka ett djur som har genomgått operation för att företaget av andra djur tills det har återhämtat sig helt.
- Efter att djuret har återhämtat sig på värme pad, returnera den till sin bur.
Obs: Huset råttorna individuellt (dvs. i separata burar) att förhindra råtta-till-råtta stympning av suturer och såret. - Placera chow indränkt i vatten i en petriskål på golvet bur för ett par dagar efter op att hjälpa råttorna nå maten.
- Administrera karprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24 h efter operationen för smärtlindring varje 24 h efter behov.
- Ta bort huden suturerna medan djuret är under 2% isofluran anestesi 10-14 dagar efter operationen.
3. MicroCT skanning
Obs: tidpunkten är 30-40 min per djur.
- Dagen efter det kirurgiska ingreppet, placera osteoporotiska råtta i induktion kammaren bifogas en anestesi maskin med ett centralt rensning system. Inducera anestesi med 5% isofluran i 100% syre och underhålla via näsan konen på 2-3% isofluran.
- Skanna råtta med en in-vivo µCT skanner. Upprepa skanning för längsgående analys av bone regeneration.
Obs: Se till att alla djur genomsöks med samma inställningar (dvs X-ray energi, skanning medium, intensitet, voxel storlek och upplösning) och i en likr orientering. Till exempel: X-ray energi, 55 kVP; ström, 145 µA; Voxel storlek, 35 µm; steg, 115 µm; och integration tid, 200 ms; med prover i PBS. Hänvisa till Bouxtein o.a. 34 för mer ytterligare förklaringar och överväganden inblandade i gnagare µCT scanning för en bedömning av ben mikrostruktur. Idealiskt, högsta scan tillgängliga upplösning skulle användas för alla skanningar; dock högre upplösning scanningar kräver längre anskaffningstid, generera stora datamängder och utsätta djuren för mer joniserande strålning. Den senare får införa oönskade effekter, inklusive minskad frakturläkning. Därför avvägningen mellan ytterligare data och scan tid noga övervägas.
4. Vertebrala Separation
Obs: tidpunkten är 20-30 min per prov.
- Contour kotan av intresse, som visas i figur 3A-I. se till att inkludera alla delar av kotan medan exklusive delar som hör till angränsande Kotor.
- Klicka på " µCT utvärdering program " och välj provet från menyn.
- Kontur varje segment med hjälp av musen.
- Användning av " Z " bar att gå till nästa skiva.
- Spara den konturerade kotan som en separat fil ( figur 3J -K) genom att klicka på " fil " → " Spara GOBJ " varje par skivor.
5. definitionen av VOI för längsgående kvantitativ utvärdering
Obs: följande steg beror på om genomsökningen är från dag 1 efter kirurgi (referens kotan) eller från den senare tid pekar ( rikta ryggkotor).
- Referens kotan.
Obs: Tidpunkten är 20-30 min per prov.- För Z-rotation, mäta vinkeln på marginalerna med ett XY-segment från mitten av defekten ( figur 4A -B).
- På Z-planet, gå till området av kotan där felet är mest tydlig och skärmen capture kotan.
- i en presentation programvara, förbereda en rektangel-formade objekt som passar in i defekten.
- Rotera bilden av kotan så att felet är vänd uppåt och defekt marginalerna är parallella sidor som rektangeln.
- Mäta rotationsvinkeln (Högerklicka på bilden → " Formatera bild " → " Storlek ").
- Använd den uppmätta vinkeln för att rotera kotan ( figur 4 c).
- Öppna ett nytt DECterm fönster (" Session manager " → " program " → " DECterm ").
- Kör " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -ingång [i] >
- -utdata [out] >
- -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > uppmätta vinkel
- -img_interpol_option [1] >
- För X-rotation, mäta vinkeln på marginalerna med en YZ-skiva från mitten av defekten ( figur 4 d -E). Använd den uppmätta vinkeln för att rotera kotan ( figur 4F).
- Klicka på " YZ " i " uCT utvärdering program " och upprepa steg 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -aim_name [i] >
- -isq_filename [default_file_name] > infoga ISQ filen katalogen (t.ex. " DK0: [MICROCT. DATA. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -dim [-1-1 -1] >
- Flip roterade kotan genom att ändra XY-planet till ZX-planet.
- Öppna ett nytt DECterm fönster (" Session manager " → " program " → " DECterm ").
- Kör " ipl ":
- Ipl > flip
- -ingång [i] > ut
- -ingång [out] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- Definiera VOI.
- Rita en cirkulär konturen av felet med en bit från centrum av felet genom att välja ikonen för cirkulär kontur i " uCT utvärderingsprogrammet " ( figur 6A). Kopia som contour och klistra in den på alla segment i defekten ( figur 6B).
Obs: Eftersom alla defekter har skapats med samma procedur, analysera samma antal skivor och därefter den totala volymen (TV) för alla typmodeller.
- Rita en cirkulär konturen av felet med en bit från centrum av felet genom att välja ikonen för cirkulär kontur i " uCT utvärderingsprogrammet " ( figur 6A). Kopia som contour och klistra in den på alla segment i defekten ( figur 6B).
- För Z-rotation, mäta vinkeln på marginalerna med ett XY-segment från mitten av defekten ( figur 4A -B).
- Target kotan.
Obs: Tidpunkten är 10-20 min per prov.- Belastning på DICOM filer både mål och referens kotorna till huvudfönstret för analys bildbehandlingsprogram.
Obs: Att undvika gråskala värdeförändringar, definiera samma utgång datatyp som den ursprungliga DICOM-filer i menyn load. - Register till referens kotan.
- Lanseringen den " 3-D Voxel registrering " modul och ingång referens kotan som den " bas volym " och målet kotan som den " Match volym. " Klicka " registrera " att registrera kotorna ( Figur 5).
- Spara den registrerade fil använder samma data typ och importera den till en µCT miljö.
- Gäller VOI.
- Tillämpa VOI definierats för referens kotan till registrerade målet kotan genom att klicka " uCT utvärdering program " → " fil " → " belastning GOBJ " och välja den GOBJ skapade tidigare. Kontrollera att VOI och defekt är koncentriska.
- Belastning på DICOM filer både mål och referens kotorna till huvudfönstret för analys bildbehandlingsprogram.
6. MicroCT analys
Obs: tidpunkten är 10-20 min per prov.
- Skicka VOI för utvärdering med hjälp av en µCT utvärdering program ( figur 6).
Obs: Se till att använda samma parametrar när du analyserar alla VOIs. Kontrollera att tröskeln har angetts tillräckligt hög för att utelämna bakgrundsljud med minimal förlust av benmassa. Om en röntgentät biomaterial används, kan ett antal strategier användas för att analysera benbildning. Om det finns en skillnad i densitet mellan biomaterial och ben vävnad, kunde biomaterial segmenteras ut 35 , 36. Utredarna kunde annars kvalitativt bedöma skillnaderna i benbildning mellan experimentella grupper.
7. Dödshjälp
- PPlace osteoporotiska råtta i induktion kammaren bifogas en anestesi maskin. Inducera anestesi med 5% isofluran i 100% oxygen.
- Underhålla anestesi via näsan konen och utföra eutanasi genom öppning av brösthålan för att producera en bilateral pneumothorax 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med detta protokoll, kan en bild och kvantifiera regenerering av n = 8 modellerade osteoporotiska vertebrala defekter över olika tidpunkter. Anatomiska matchen erhålls genom registreringsförfarandet möjliggör analys av den samma VOI vid alla tidpunkter. Detta resulterar i en mycket noggrann längsgående 3D Histomorfometriska analyser, även när marginalerna i den ursprungliga defekten inte längre igenkännlig. Vi använde fem punkter (dag 1, vecka 2, vecka 4, vecka 8 och vecka 12) som ett exempel för längsgående utvärdering av bone regeneration (figur 7). Förnyelse kan utvärderas såväl av den kvalitativa utvärderingen av 2D tvärsnitt och 3D-bilder (som illustreras i figur 7A) kvantitativ jämförelse av ben kvantitet (BVD) och kvalitet (AD) (figur 7B). Följande morfometriska index kan bestämmas för nybildade benet: (i) TV, inklusive ben och mjukvävnad volymer (TV, mm3); (ii) volym av mineraliserad vävnad (BV, mm3); (iii) volym bentäthet (BV/TV); och (iv) bentäthet (BMD, mg hydroxyapatit per cm3). Specifikt, observerades minimal benbildning (5% ökning av bentätheten volym) 2 veckor efter defekt etablering. Efter två veckor observerades inga signifikanta skillnader i benbildning jämfört med senare tidpunkter. Även om det fanns en viss benbildning, vilket nådde cirka 10% av vecka 8 som, var det sammantaget nog minimal för att bibehålla benet ogiltiga över tid.
Figur 1: protokoll Design. De viktigaste stegen i protokollet beskrivs. Första, ovariectomized naken råttor som utsätts för fyra månader av en låg kalcium kost (LCD) opererades vid att skapa standard kritiska-stora defekter i två lumbala ryggraden organ. Råttorna var avbildad på dag 1 och vecka 2, 4, 8 och 12 efter op. Dag 1 Skanna var omorienteras till standardpositionen och en cylindrisk VOI definierades med hjälp av defekt marginalerna. Efterföljande µCT skanningar av varje råtta registrerades automatiskt till läget standard definieras för motsvarande dag 1 Skanna. Dag 1 fördefinierade VOI tillämpades sedan registrerade skanningar. Den volym bentäthet och skenbar täthet av VOI användes för att bedöma ny benbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: vertebrala defekt kirurgi. De viktigaste stegen i den kirurgiska generationen av vertebrala defekter är illustrerade. Först, råttor placerades på en värmedyna (A). En mittlinjen snitt gjordes genom huden (B) och sedan linea alba (C) att exponera bukhålan (D). Tarmarna återspeglades för att exponera den bakre bukväggen (E) och ländryggen var utsatt med termokauterisering (pil, F-G). Defekter borrades under fjärde (H, pil som pekar till borren; Jag, pil som pekar till felet) och femte (J, pilar som pekar på defekter) lumbala ryggraden organ. Slutligen var den aponeurosis (K) och hud (L) sys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kotan Separation. De viktigaste stegen i kontureringen av en Kota av intresse visas. (A-jag) Konturskurna (gröna linjen) representativa 2D skivor längs längd axeln av en Kota visas. En 3D-representation av hela ryggraden (J) kan jämföras med separerade kotan (K). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: referera kotan positionering. Representativa skivor i två plan visas av en Kota före och efter rotation till standardpositionen. Först använder en representant XY-slice (A), vinkeln (B, grön) behövs för att rotera defekten (B, Röda torget) blir parallell med y-axeln (B, gul) bestäms och sedan används för att skapa den roterade bilden (C ). Sedan använda en representant YZ-slice (D), den vinkel (E, gröna) som behövs för att rotera defekten (E, Röda torget) för att bli parallell till z-axeln (E, gul) bestäms och sedan används för att skapa den roterade bilden (F ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: rikta kotan registrering. Representativa skivor på tre plan av målet kotan (markerade i grönt) och referens kotan (markerade i rött) innan (A-C) och efter (D-E) registrering visas. Observera den gula färgen, som anger överlappning mellan målet och referens svanskotor och de vita pilarna som pekar på gröna ben efter regenerering, som anger benbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: VOI analys. Representativa skivor i två plan med skålade volymen av intresse visas. En cirkulär kontur är placerad i mitten av en representant ZX-slice (A) defekt. Efter contouring alla ZX-skivor, kan kompletta defekt volymen ses i XY-planet (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: längsgående analys av vertebrala defekt regenerering. Kvalitativa och kvantitativa representativa bone regeneration analysresultaten visas. (A) A representativa vertebrala defekt vid olika tidpunkter är avbildad i varje panel som en frontal 3D-bild (övre panelen) med benbildning i det tomrum som anges i rött, en sagittal 2D-bild (mellersta panelen) och en axiell 2D-bild (nedre panelen). Kvantitativ analys av benbildning i tomrummen utfördes. Bone volym densitet (B) och skenbar densitet (C) beräknades och jämfört med en upprepad åtgärder tvåvägs ANOVA med Bonferroni korrigering för multipla jämförelser. Felstaplar representera SEM. ***-p < 0,0001. Vänligen klicka på hennee för att visa en större version av denna siffra.
| Steg | Problemet | Möjlig orsak | Lösning |
| 2.3 | Djur som kippar under narkos | Överskjutande isofluran leverans | Minska koncentrationen av isofluran levereras till djuret. |
| Djur reagerar på tå nypa | Otillräcklig isofluran leverans | Öka koncentrationen av isofluran. | |
| 2,7-2.12 | Rikliga blödningar | Kärlskador | Använd en steril bomullspinne för att applicera tryck eller diatermi att stoppa blödning. |
| Djuret har andningssvårigheter | Membranet var punkterade | Avliva djuret för att förhindra kvävning. | |
| Läckage av tarminnehåll | Mag-tarmkanalen var punkterade | Avliva djuret för att förhindra ytterligare komplikationer. Förhindra det genom att lyfta aponeurosis från underliggande tarmarna innan kapning. | |
| Blod tappas från borrplatsen | Ett blodkärl var punkterade | Applicera en steril bomullspinne tills blödningen stannar. | |
| Djur skakar plötsligt under borrningen | Borren gick för djupt och skadat ryggmärgen | Avliva djuret för att förhindra ytterligare komplikationer. | |
| Ben defekten ser ofullständig | Borren går inte tillräckligt djupt | Flytta borrhuvudet inuti defekten och borra djupare | |
| 2.15-2.24 | Sutur raster | Suturen dras för hårt | Ersätta hela suturen. Om avbrottet inträffar ofta, Använd en storlek tjockare sutur. |
| Djuret är långsam att återhämta sig från anestesi | Djuret är nerkylda | Höja temperaturen i Värmedyna eller applicera ytterligare en källa till värme (t.ex. värme lampa). | |
| Suturer är öppna | Suturerna placerades löst, eller djuret gjorde ansträngande aktivitet | Återapplicera suturerna och tillämpa Dermabond direkt till suturerna och dem emellan. | |
| 3 | Skannade bilden visas med låg upplösning, bullriga eller spridda | Genomsökningsparametrar behöver justeras | Justera parametrarna för skanning protokollet. Hänvisa till Bouxsein et al. mer riktlinjer för skanning. |
| Skannade bilden visas suddig | Djuret flyttas under skanningen | Rescan djuret. Om rörelsen fortsätter, öka isofluran koncentration. | |
| 5 | Registrering av målet kotan inte var framgångsrika | Vertebrala separation var inte görs på rätt sätt | Recontour kotan: Kontrollera alla delar av kotan ingår och utesluta någon närliggande strukturer. |
| Stor skillnad i positionering av Kotor | Flytta målet kotan i samma riktning som referens kotan med rotationer och flip (steg 29A). | ||
| Analysera inte korrekt erkänna de ben strukturerna | Tillämpa ett tröskelvärde i modulen registrering ta bort bakgrundsljud från Ben prover. | ||
| Registrerade kotorna är olika | Skapa 3d-bilder av dina prover och matcha rätt kotorna över olika tidpunkter. | ||
| 6 | Den totala volymen (TV) är olika mellan prover | Antingen ett olika antal skivor eller en annan kontur användes | Se till att alltid använda samma kontur storlek och samma antal skivor. |
| Bone mineral density (BMD) värde är onormal | Otillräcklig kalibrering av microCT | Kalibrera microCT för rätta hydroxyapatit standarder |
Tabell 1: Felsökning. Potentiella problem och lösningar presenteras för olika steg i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoporos är den vanligaste orsaken till vertebrala kompressionsfrakturer orsakade av en ökad belastning på ryggraden och som leder till kollaps av ryggraden kroppen. Det är dock omöjligt att generera en skada i en gnagare som autentiskt replikerar en liknande vertebrala kollaps. Forskare skapa i stället ett cylindriskt tomrum i mitten av ryggraden kroppen att efterlikna OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. eftersom det finns ingen konsekvens i litteraturen defekt storleksmässigt, en kritisk storlek defekt definierades som en som inte spontant läka helt utan ett ingripande inom 3 månader efter op16,17.
Även om metoden att kombinera ovariektomi med LCD att snabbt framkalla osteoporos var tidigare publicerade1,13, vi var de första att visa att tillämpa detta synsätt på atymiska råttor resulterar i en effektiv, snabb, och oåterkallelig minskning av vertebrala trabekulärt ben volym och mineral densitet40. Detta är en reproducerbar små-djur-modell som är obehindrat av gnagare immunsystemet och som inte har ett behov av läggs immunsuppression, som används av andra24.
Våra kirurgiska protokollet genererade flera identiska kritiska lumbala ryggraden defekter40. Detta resulterar i mycket konsekvent och enkelt jämförbara och kvantifierbara fel över djuren. Vi tror att defekter som produceras med hjälp av denna metod är överlägsna vertebrala defekt modeller genereras i kaudala Kotor1,19,41 eftersom råttan svansen utsätts för biomekaniska krafter som är avsevärt skiljer sig från de som involverar råtta ländryggen.
Kritiska steg inom detta protokoll omfatta undvika intraoperativ hypotermi och ta försiktighet när borrning ovariectomized naken råtta bräckliga svanskotor efter en LCD. Efter genererar vertebrala felet, är det övervakas via en temporal ordnar i vivo µCT skanningar inställda tidpunkter för längsgående bedömning av ben reparation. Underhålla samma skanningsinställningarna är kritisk. Kotorna är sedan Konturskurna och åtskilda från resten av genomsökningen. Contouring en identisk total volym för alla skanningar av en Kota och undvika gråskala värdeförändringar är kritisk. En kommersiellt tillgänglig flera bild registrering algoritm underlättar utvinning av anatomiskt motsvarande originalplan VOIs till alla efterföljande tidpunkter. Slutligen analyseras dessa VOIs för benvolym, skenbar densitet, etc. Det är viktigt att analysera alla VOIs med samma parametrar. Denna teknik ger en mycket exakt och enkel längsgående 3D µCT analys som inte är användare-beroende.
Denna metod kan tillämpas på någon längsgående ben defekt regenerering analys. Den vertebrala defekt-modellen som används här är en praktisk modell för denna tillämpning, som dess benstomme är unik och kan enkelt registrera samma anatomiska position. Dock kunde några ben regenerering analyseras på samma villkor genom att korrekt separera samma ben av intresse i hela längsgående skanningar. Det är absolut nödvändigt att inkludera separerade ben prover med samma anatomiska funktioner. Detta potentiella problem och andra beskrivs i tabell 1, tillsammans med möjliga orsaker och föreslagna lösningar. Anatomiska matchen erhålls genom registreringsförfarandet kan endast ske om proverna har samma anatomiska funktioner. Registreringen gör att användaren att tillämpa den exakta fördefinierade VOI i den första sökningen till alla återstående tidpunkter, vilket resulterar i en mycket noggrann 3D Histomorfometriska analyser över tid. Volym bentäthet och skenbar täthet av VOI kan användas för att bedöma ny benbildning.
Även potentiellt allmänt tillämpliga, är den modell som presenteras här inte utan begränsningar. Användning av atymiska naken råtta kunde anses vara en begränsning, det potentiellt kunde dölja vissa immunmedierade processer som kan vara av betydelse för regenerering. Andra är modellering osteoporos genom en kombination av ovariektomi och LCD hos unga råttor som tidigare publicerade1,13, begränsad i sin förmåga att härma biologi av den äldre patientgruppen. Det tredje var OVCFs modelleras genom ett kirurgiskt ingrepp, som endast andra djur att ha benskörhetsrelaterade frakturer är primater42. Slutligen, medan råtta ländryggen är den bästa tillgängliga modellen för mänskliga ländryggen — där de flesta kotfrakturer utveckla — avsaknaden av axial viktbärande i gnagare ryggraden är också en begränsning.
Detta protokoll är modulärt och därför kan enkelt ändras till forskarens behov. Atymiska ovariectomized råttor kunde till exempel användas för att studera andra osteoporosrelaterade frakturer. Bör en forskare väljer att använda vår inställning till halvautomatiserad bone regeneration analys, skulle det kunna tillämpas på någon fraktur modell med längsgående strukturella imaging, inte nödvändigtvis mikro-datortomografi. Dessutom kan ytterligare information samlas samtidigt med ytterligare avbildningsmetoder som magnetisk resonanstomografi.
Den OVCF modellen presenteras i detta protokoll kan användas för att studera nya terapeutiska metoder detta kliniskt otillfredsställda behov. Dessutom kan vår halvautomatiserad analys metod användas framgångsrikt att utföra en liknande analys som är mindre beroende av användaren och ger bättre noggrannhet än andra metoder16. Särskilt anmärkningsvärt är det faktum att vi använt kommersiellt tillgängliga visualisering och analys programvara som kan användas av alla forskare — programvara som stöder ytterligare avbildningsmetoder, såsom magnetisk resonanstomografi och Kärn avbildning. Därför anser vi att denna metod är mycket generaliserbara och är endast begränsad av tillgången på i vivo imaging funktioner och registrering programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denna forskning stöds av ett bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).
Acknowledgments
Forskningen stöddes av ett bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
